Artykuł metodologiczny

Retrowirusowe celowanie genów za pośrednictwem CRISPR/Cas9 w badaniu różnicowania Th17 in vitro

1.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/66966

⸱

15 listopada 2024

 ,  ,  ,  , 
1Shanghai Immune Therapy Institute, Renji Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, 2Zhejiang University-University of Edinburgh Institute (ZJU-UoE Institute), Zhejiang University School of Medicine, Zhejiang University, 3Institute of Immunology and Department of Rheumatology, Sir Run Run Shaw Hospital, Zhejiang University School of Medicine

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Przedstawiamy protokół retrowirusowej transdukcji przewodnikowego RNA do pierwotnych limfocytów T od transgenicznych myszy Cas9, zapewniając efektywną alternatywę dla edycji genów w badaniu różnicowania Th17.

Streszczenie

T, które wytwarzają IL-17A, znane jako komórki Th17, odgrywają kluczową rolę w obronie immunologicznej i są związane z zaburzeniami autoimmunologicznymi. Limfocyty T CD4 mogą być stymulowane antygenami i dobrze zdefiniowanymi koktajlami cytokin in vitro, aby naśladować różnicowanie komórek Th17 in vivo. Przeprowadzono szeroko zakrojone badania nad mechanizmami regulacji różnicowania Th17 przy użyciu testu polaryzacji Th17 in vitro.

Konwencjonalne metody polaryzacji Th17 zazwyczaj polegają na pozyskiwaniu naiwnych limfocytów T CD4 od genetycznie modyfikowanych myszy w celu zbadania wpływu określonych genów na różnicowanie i funkcję Th17. Metody te mogą być czasochłonne i kosztowne, a wpływ na nie mogą mieć czynniki zewnętrzne komórek zwierząt nokautujących. Tak więc protokół wykorzystujący retrowirusową transdukcję przewodnikowego RNA w celu wprowadzenia nokautu genu w pierwotnych mysich limfocytach T CRISPR / Cas9 służy jako bardzo przydatne podejście alternatywne. W artykule przedstawiono protokół różnicowania naiwnych pierwotnych limfocytów T w komórki Th17 po retrowirusowym celowaniu genowym, a także późniejsze metody analizy cytometrii przepływowej do oznaczania skuteczności infekcji i różnicowania.

Wprowadzenie

Komórki Th17, unikalny podzbiór komórek pomocniczych T CD4+, są niezbędne do zwalczania zewnątrzkomórkowych bakterii i grzybów oraz odgrywają znaczącą rolę w różnych chorobach autoimmunologicznych1,2,3. Pojawiające się dowody sugerują, że komórki Th17 wykazują niejednorodność, funkcjonując zarówno w warunkach patogennych, jak i niepatogennych, na które wpływ mają czynniki środowiskowe i genetyczne. Wyjaśnienie procesów regulacyjnych, które kontrolują różnicowanie komórek Th17, plastyczność i heterogeniczność, ma kluczowe znaczenie dla rozwoju bardziej skutecznych strategii immunoterapeutycznych.

Genetycznie modyfikowane zwierzęta były szeroko wykorzystywane do odkrywania kluczowych regulatorów różnicowania i funkcji komórek Th17. Wykorzystanie genetycznie modyfikowanych zwierząt wiąże się z całkowitą manipulacją in vivo, zapewniając autentyczność i systematyczne badanie ich roli w warunkach fizjologicznych lub modelach chorób. Niemniej jednak wysokoprzepustowe badania przesiewowe z tym podejściem są w dużej mierze niepraktyczne. Testy polaryzacji in vitro stanowią alternatywę dla badania różnicowania komórek Th17. Wykazano, że interleukina 6 (IL-6) w połączeniu z transformującym czynnikiem wzrostu β1 (TGFβ1) sprzyja rozwojowi niepatogennych komórek Th17, podczas gdy IL-6, IL-1β i IL-23 są zaangażowane w napędzanie różnicowania patogennych komórek Th17 (pTh17)4,5.

Pojawienie się technologii CRISPR/Cas9 ułatwiło precyzyjną edycję genomu na określonych podstawach. W połączeniu z transdukcją retrowirusową, podejście to zapewnia silną, wydajną i ekonomiczną metodę genetyczną do badań przesiewowych i funkcjonalnego badania potencjalnych regulatorów w komórkach Th176,7. W tym badaniu udoskonaliliśmy procedurę transdukcji retrowirusowej w systemie polaryzacji Th17. Korzystając z systemu retrowirusowego, zainfekowaliśmy wstępnie ustalone aktywowane naiwne limfocyty T z ekspresją Cas9 od myszy. Komórki transdukowano za pomocą konstruktów przewodnika RNA (gRNA) napędzanych przez promotor U6, wraz z genami kodującymi fluorescencyjne białka reporterowe pod kontrolą promotora EF1a, aby ułatwić nokaut genu docelowego. Następnie transdukowane limfocyty T hodowano w określonych warunkach cytokin w celu wywołania różnicowania w komórki Th17. Warto zauważyć, że wyeliminowanie RoRγt znacznie zmniejszyło produkcję IL-17A w porównaniu z grupą kontrolną. Skuteczność tego systemu zależy od zoptymalizowanych warunków produkcji i transdukcji retrowirusa dla aktywowanych pierwotnych limfocytów T, zapewniając szybkie i praktyczne podejście do badania określonych genów w różnicowaniu i funkcji Th17.

Protokół

Wszystkie procedury zostały zatwierdzone przez Komitet Etyki ds. Dobrostanu Zwierząt Doświadczalnych, Szpital Renji, Szkoła Medyczna Uniwersytetu Jiao Tong w Szanghaju i są zgodne z wytycznymi instytucji.

1. Produkcja retrowirusowa

  1. Przygotowanie konstruktu retrowirusowego
    1. Użyj narzędzia CRISPick (https://portals.broadinstitute.org/gppx/crispick/public), aby zaprojektować sgRNA dla RORγt knockout8. Określ genom referencyjny jako mysi GRCm38 i wybierz sekwencję PAM jako NGG (dla SpyoCas9, Hsu (2013) tracrRNA) w oparciu o system prowadzący CRISPRko. Zweryfikuj nazwę genu docelowego lub inne formaty genów docelowych i prześlij prawidłowe dane wejściowe, aby uzyskać kandydatów na sgRNA. Ustawiając inne parametry na wartości domyślne, ustaw cel sgRNA na RORγt (Rorc, Gene ID: 19885), aby zakłócić różnicowanie Th17 i wybierz niecelujące sgRNA (skrót sgNT, sekwencja: GCGAGGTATTCGGCTCCGCGG) z mysich bibliotek GeCKO v2.
      UWAGA: To narzędzie oferuje szereg klikalnych opcji projektowania przewodnikowych RNA, co pozwala na wygodne dostosowanie do określonych wymagań.
      1. Wprowadź nazwę genu docelowego w polu wyszukiwania w kolumnie Szybkie wyszukiwanie genów. System wyświetli identyfikator genu i pełną nazwę genu docelowego, aby zapewnić dokładną selekcję.
        UWAGA: Dostępne są dodatkowe opcje walidacji różnych docelowych formatów genów.
    2. Wybierz jeden sgRNA ukierunkowany na sekwencję Rorc (skrót sgRorc) zgodnie z wysoką połączoną rangą i kolejnością wyboru, aby uniknąć niedocelowych dopasowań i zwiększyć skuteczność na celu (sekwencja sgRorc: GTCATCTGGGATCCACTACG). Zsyntetyzować dwa oligonukleotydy dla sgRorc i sgNT: dla oligo czołowego dołączyć sekwencję "gttttagagctagaaatagcaagttaaaat" na końcu 5' każdej sekwencji prowadzącej; W przypadku odwróconego oligo, należy dołączyć sekwencję "tttcgtcctttccacaagatatataaagc" na końcu 3' każdej sekwencji prowadzącej.
      UWAGA: Zazwyczaj istnieje wiele opcji dla sekwencji sgRNA. Konieczne jest wybranie 2 lub 3 sekwencji sgRNA ukierunkowanych na ten sam genotyp, aby ocenić ich skuteczność nokautu. W naszych wstępnych eksperymentach do porównania wybrano dwa gRNA ukierunkowane na Rorc (sekwencja sgRNA1: GTCATCTGGGATCCACTACG; sekwencja sgRNA2: CTTGAGTATAGTCCAGAACG). Wyniki eksperymentalne wskazują, że gRNA przedstawione w obecnej metodzie (sekwencja sgRNA1) wykazuje wyższą skuteczność nokautowania między tymi dwoma.
    3. Amplifikuj sekwencje kodujące sgRorc i sgNT za pomocą polimerazy DNA w PCR z powyższymi starterami i sklonuj je do wektora pMX-U6-MCS (między regionami promotora U6 a rusztowaniem gRNA) w ramce z białkiem fluorescencyjnym mCherry, odpowiednio9. Ustawić układ reakcyjny (50 μl) zgodnie z tabelą 1. Te startery składają się z sekwencji sgRNA (3'), która może wprowadzić sgRNA do wektora, oraz segmentu sekwencji wektorowej (5'), która może wzmocnić fragment wektora o pełnej długości. Dodatkowo zaprojektuj startery do przodu i do tyłu z zakładką około 18 pz w regionie sgRNA (ale nie w pełni zachodzącą na siebie), ułatwiając montaż zlinearyzowanego wektora klonowania podczas procesu ligacji.
      UWAGA: Należy uzyskać zlinearyzowany fragment wektora w miejscu sekwencji sgRNA ze starterami metodą PCR o wielkości około 5,551 kd.
    4. Oczyść konstrukt za pomocą zestawu do ekstrakcji żelu i okrąż go za pomocą zestawu do klonowania. Użyj produktów rekombinacji do testów transformacji.
    5. Wybierz pojedyncze klony z płytek i zweryfikuj sekwencje kodujące sgRorc lub sgNT za pomocą sekwencjonowania pierwszej generacji, przy użyciu startera promotora U6 (sekwencja: ATGGACTATCATATGCTTACCGTA).
    6. Wybierz żądany pojedynczy klon do amplifikacji w bulionie LB. Ekstrakcja wysokiej jakości plazmidowego DNA z komórek bakteryjnych za pomocą zestawu plazmidów wolnych od endotoksyn.
      UWAGA: Upewnij się, że roztwór plazmidu ma wysoką jakość. Zalecamy, aby stężenie roztworu plazmidu wynosiło co najmniej 1 μg/μL.
  2. Przygotowanie komórek pakujących
    1. Przygotować komórki Platinum-E (Plat-E) zgodnie z następującą procedurą: hodowla komórek Plat-E za pomocą zmodyfikowanej pożywki Eagle's Medium (pożywka DMEM) firmy Dulbecco zawierającej 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS), 100 jednostek/ml penicyliny i 0,1 mg/ml streptomycyny w 10-centymetrowym naczyniu hodowlanym. W poniższym
      będzie on określany jako pożywka do hodowli komórkowych.br / UWAGA: Aby uzyskać odpowiednią wydajność transfekcji, zalecamy użycie komórek w logarytmicznej fazie wzrostu o liczbie pasażowej mniejszej niż 15
      2. .
    2. Podziel pełną płytkę 10 cm komórek Plat-E (~2,6 × 107 komórek) w odpowiednim stosunku do nowej 10 cm szalki 1 dzień przed transfekcją, aby osiągnąć zlewność komórek około 80% następnego dnia, co jest optymalnym warunkiem do transfekcji. Przeprowadzić pasażowanie komórek dla nowej 10 cm szalki w stosunku 1:3 (nasiona ~ 8 ×10 6 komórek w nowym 10 cm naczyniu dzień przed transfekcją).
      UWAGA: Współczynnik podziału zależy od warunków wzrostu komórek, przy czym wyższą wydajność transfekcji można osiągnąć w komórkach wykazujących silny wzrost. Wykonujemy pasażowanie komórek dla 10 cm naczynia w proporcji 1:3. W przypadku różnych naczyń do hodowli komórkowych, takich jak szalka o średnicy 6 cm, zalecamy wysianie 1,5 × 106 komórek Plat-E dzień przed transfekcją.
  3. Transfekcja
    1. Na godzinę przed transfekcją należy zastąpić pożywkę do hodowli komórkowych 8 ml zredukowanej pożywki surowicy bez czerwieni fenolowej 5% FBS, ale bez penicyliny-streptomycyny, ponieważ może to zakłócać działanie odczynnika do transfekcji. Przed użyciem podgrzać zredukowaną pożywkę serum do temperatury 37 °C.
    2. Przygotować mieszaninę transfekcyjną zawierającą mieszaninę 1 i mieszaninę 2: mieszanina 1 zawiera 18 μg plazmidowego DNA (pMXs-U6-MCS-sgNT-mCherry/pMXs-U6-MCS-sgRorc-mCherry) i 6 μg ekotropowego wektora retrowirusowego pCL (pCL-Eco) w 1 000 μl zredukowanej pożywki surowicy. Mieszanina 2 zawiera 48 μl odczynnika do transfekcji w 1 000 μl zredukowanej pożywki surowicy. Dodaj mix 2 kropla po kropli do mieszanki 1 i delikatnie i dokładnie wymieszaj. Inkubować kompleks przez 15-20 minut w temperaturze 20-25 °C.
    3. Ostrożnie wlej mieszaninę do komórek Plat-E, delikatnie obracając płytkę, aby zapewnić równomierne rozprowadzenie. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C w temperaturze poniżej 5% CO2 przez 6–12 godzin.
    4. Zastąp pożywkę 10 ml świeżej pożywki do hodowli komórkowych i kontynuuj inkubację komórek w temperaturze 37 °C, 5% CO2 przez 48 godzin.
    5. Oceń skuteczność transfekcji w komórkach Plat-E, wykrywając znacznik wektora retrowirusowego, służący jako proxy, za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej lub cytometrii przepływowej.
      UWAGA: Silny sygnał fluorescencji mCherry (fluorescencja dodatnia przekracza 80%) wykryto w znacznej części komórek Plat-E transfekowanych wektorem pMX-U6-MCS, co wskazuje na udaną transfekcję.
    6. Zebrać supernatant kultury zawierający wirusa i odwirować w stężeniu 1 500 × g przez 10 minut w celu usunięcia fragmentów komórek. Podwielokrotnić supernatant wirusa 1 ml na fiolkę i przechowywać w temperaturze -80 °C.
      UWAGA: Filtracja jest alternatywną metodą usuwania resztek komórek. Zalecamy stosowanie filtra strzykawkowego o wielkości porów 0,45 μm i membranie polieterosulfonowej (PES), aby zminimalizować zatrzymywanie cząstek wirusa na membranie filtracyjnej.

2. Zakażenie retrowirusowe aktywowanych limfocytów T CD4 + i różnicowanie Th17

  1. Przygotowanie i aktywacja pierwotnych naiwnych limfocytów T CD4 +
    1. Pokryj każdą studzienkę 24-dołkowej płytki do hodowli komórkowej 2 μg/ml anty-CD3e i 4 μg/ml anty-CD28 w sterylnych 500 μl PBS, owiń płytkę parafilmem, aby zapobiec parowaniu i zanieczyszczeniu, a następnie inkubuj płytkę w temperaturze 4 °C przez noc (lub 37 °C przez 1-2 godziny przed posiewem limfocytów T CD4+) w dniu poprzedzającym wyizolowanie naiwnych limfocytów T CD4+.
      UWAGA: Ten krok jest potrzebny do przeprowadzenia stymulacji płytki dla mysich limfocytów T przed wykonaniem transdukcji wirusa.
    2. Następnego dnia poddać eutanazji 6-8-tygodniowe myszy z ekspresją Cas9 (myszy R26-CAG-Cas9) przez uduszenie CO2 i wysterylizować je 70% etanolem.
    3. Zbierz śledzionę myszy i umieść ją w PBS z 2% FBS i 100 μM EDTA (bufor FACS).
    4. Zmielić śledzionę ze sterylizowanym mielonym szkłem (matowa strona) w buforze FACS, homogenizować tkankę do zawiesiny jednokomórkowej i przefiltrować zawiesinę komórkową przez sitko komórkowe 70 μm do probówki o pojemności 50 ml.
      UWAGA: Pamiętaj, aby delikatnie i konsekwentnie zmielić chusteczkę, aby była wilgotna. Gwałtowne mielenie tkanki może dramatycznie wpłynąć na przeżycie komórek.
    5. Obracać zawiesinę komórek śledziony o masie 800 × g przez 5 minut. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad komórek w 2 ml buforu do lizy krwinek czerwonych. Pozostaw w temperaturze pokojowej na 5 minut, a następnie dodaj bufor FACS, aby osiągnąć całkowitą objętość 15 ml. Odwirować splenocyty w stężeniu 800 × g przez 5 minut.
    6. Ponownie zawiesić splenocyty i przefiltrować je przez sitko komórkowe o wielkości 40 μm. Dostosuj końcową objętość do 1 ml w celu izolacji limfocytów T CD4 +.
    7. Wyizoluj limfocyty T CD4 + za pomocą dostępnych w handlu zestawów odczynników, postępując zgodnie z instrukcjami zawartymi w instrukcji.
    8. Oznaczyć limfocyty T CD4 + mieszaniną przeciwciał fluorescencyjnych (CD4, CD25, CD44 i CD62L) w temperaturze 4 °C przez 30 minut, przemyć komórki buforem FACS i wyizolować naiwne limfocyty T CD4 + za pomocą sortera komórek przepływowych. Spowoduje to uzyskanie limfocytów T CD4 + CD25-CD62Lo wysokiej zawartościCD44i niskiej naiwności.
    9. Usunąć supernatant stymulacyjny związany z płytką z 24-dołkowej płytki do hodowli komórkowej (przygotowanej w kroku 2.1.1) i przepłukać każdą studzienkę dwukrotnie 500 μl PBS. Płytka 1 x 106 naiwnych limfocytów T CD4 + w 1 ml pożywki do hodowli limfocytów w studzience 24-dołkowej płytki do hodowli komórek. Inkubować komórki w inkubatorze komórkowym.
      UWAGA: Pożywka do hodowli limfocytów zawiera 10% FBS, 100 jednostek/ml penicyliny i 0,1 mg/ml streptomycyny, 1 mM pirogronianu sodu, 10 mM HEPES i 50 μM β-ME w pożywce RPMI 1640.
  2. Zakażenie retrowirusowe
    1. Po 18-24 godzinach zbierz każdą studzienkę aktywowanych komórek do probówki o pojemności 1,5 ml. Odwirować przy sile 800 × g przez 5 minut i odrzucić supernatant.
    2. Zawiesić osad komórkowy w 1 ml mieszaniny infekcyjnej (10 μg/ml bromku heksadimetryny, 10 mM HEPES w supernatance wirusa) i dodać 1 ml mieszaniny do nowego dołka na 48-dołkowej płytce do hodowli komórkowej. W międzyczasie zachowaj wystarczającą liczbę komórek jako negatywną (nietransdukowaną) kontrolę.
      UWAGA: Możliwe jest posiadanie mniej niż 1 x 106 aktywowanych naiwnych limfocytów T CD4 + na studzienkę, ale nie zaleca się używania mniej niż 0,5 x 106 komórek na studzienkę. Ponadto żadne komórki nie powinny być wysiewane w dołkach obwodowych 48-dołkowej płytki hodowlanej.
    3. Owinąć płytkę parafilmem i odwirować przy 800 x g przez 90 minut w temperaturze 32 °C. Ustawić przyspieszanie i zwalnianie na poziomie 3. Po odwirowaniu usunąć parafilm, inkubować komórki w inkubatorze przez 4 godziny i kontynuować etapy różnicowania.
  3. Różnicowanie zakażonych komórek w komórki Th17
    1. Przygotuj komórki prezentujące antygen (APC) podczas infekcji retrowirusowej. Najpierw uzyskaj splenocyty od myszy typu dzikiego, postępując zgodnie z instrukcjami z kroków 2.1.2 do 2.1.4. Zawiesić splenocyty za pomocą 1 ml pożywki do hodowli limfocytów z 50 μg/ml mitomycyny w probówce o pojemności 15 ml. Inkubować splenocyty w temperaturze 37 °C w temperaturze 5% CO2 przez 1 godzinę.
    2. Godzinę później dodać PBS do oznaczenia 15 ml, aby umyć splenocyty, odwirować przy 800 x g przez 5 minut, wyrzucić supernatant, ponownie zawiesić splenocyty z 1 ml pożywki do hodowli limfocytów i policzyć liczbę komórek. Ogniwa APC zostały przygotowane z sukcesem.
    3. Po 4 godzinach inkubacji komórek (jak w kroku 2.2.3) zebrać transdukowane limfocyty T CD4+ w probówkach o pojemności 1,5 ml i odwirować przy 800 x g przez 5 minut. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić zakażone komórki w 600 μl PBS w celu przemycia. Wirować przy 800 x g przez 5 minut i odrzucić supernatant.
    4. Umieścić 0,5 × 106 transdukowanych limfocytów T CD4 + w 1 ml pożywki do hodowli limfocytów z 1,5 x 106 komórkami APC w studzience 24-dołkowej płytki do hodowli komórek. Suplement z 2 μg/ml anty-CD3e, 2 μg/ml anty-CD28 i koktajlem różnicowania komórek Th17, który zawiera 10 μg/ml anty-IFNγ, 10 μg/ml anty-IL-12/IL23 p40, 10 μg/ml anty-IL4, 2,5-3 ng/ml hTGF-β i 20-30 ng/ml IL-6. Hoduj komórki przez 2 dni.
    5. Zebrać każdą studzienkę komórek do probówek o pojemności 1,5 ml, odwirować przy 800 x g przez 5 minut i odrzucić supernatant. Odświeżyć nowy 1 ml pożywki do hodowli limfocytów tylko za pomocą 3 ng/ml TGF-β i 30 ng/ml IL-6. Umieść komórki w nowym dołku z 24-dołkową płytką do hodowli komórkowej na przedłużony okres hodowli. Przeanalizuj komórki 2 dni po zmianie pożywki.

3. Ocena efektywności transdukcji i wyników różnicowania

  1. Po dwóch dniach zmiany pożywki zebrać komórki i odwirować przy 800 × g przez 5 minut, a następnie odrzucić supernatant. Traktować zróżnicowane komórki 50 ng/ml 12-mirystynianu 13-octanu forbolu (PMA), 500 ng/ml jonomycyny i 5 μg/ml brefeldyny A w 500 μl pożywki do hodowli limfocytów w nowym dołku 24-dołkowej płytki do hodowli komórkowej w inkubatorze o temperaturze 37 °C przez 4 godziny. Pobrać połowę komórek do analizy metodą cytometrii przepływowej i poddać drugiej połowie komórek lizie bufor do ekstrakcji RNA do analizy qPCR.
  2. Do analizy metodą cytometrii przepływowej
    1. Zbierz komórki do probówek o pojemności 1,5 ml. Dodać 1 ml buforu FACS do probówek i odwirować w stężeniu 800 × g przez 5 minut w celu przemycia komórek.
    2. Zawiesić osad komórkowy mieszaniną przeciwciał fluorescencyjnych (CD4 i barwnik do utrwalania żywotności w 100 μl PBS) i barwić komórki w temperaturze 4 °C przez 30 minut.
    3. Przemyć komórki 300 μl PBS i utrwalić je 300 μl 2% formaldehydu buforowanego fosforanem (FA) w temperaturze 4 °C przez co najmniej 60 minut.
    4. Godzinę później przemyć komórki PBS, ponownie zawiesić je 600 μl 1x buforu permeabilizacyjnego i odwirować przy 800 × g przez 5 minut.
    5. Wyrzucić supernatant i zabarwić anty-IL-17A w 100 μl 1x buforu permeabilizacji przez 60 minut w temperaturze pokojowej lub 4 °C przez noc.
    6. Następnego dnia przemyj komórki 1x buforem permeabilizacji i ponownie zawieś je w 200 μl PBS. Przeanalizuj komórki za pomocą cytometrii przepływowej10. Zapoznaj się z sekcją Reprezentatywne wyniki.
  3. W przypadku analizy qPCR należy wyekstrahować RNA zgodnie z instrukcjami zestawu do ekstrakcji RNA. Odwrotna transkrypcja RNA do cDNA w celu przechowywania lub późniejszej analizy qPCR. Projekt tych starterów powinien być zgodny z ogólnymi zasadami projektowania starterów qPCR, a jednocześnie być ukierunkowany na region obejmujący oczekiwane miejsce indel, w którym nastąpiło rozszczepienie za pośrednictwem gRNA. Jakiekolwiek zmniejszenie wydajności wzmocnienia lub utrata sygnału w tym miejscu może służyć jako wskaźnik udanego nokautu. Startery qPCR są następujące:
    Rorc F: TCCACTACGGGGTTATCACCT; R: AGTAGGCCACATTACACTGCT.
    IL17a F: TCAGCGTGTCCAACACTGAG; R: CGCCAAGGGAGTTAAAGACTT.

Wyniki

W badaniu sklonowano sekwencje kodujące sgRNA celującego w Rorc oraz sgRNA niecelujące do wektora pMX-U6-MCS z fluorescencyjnym białkiem mCherry (Rysunek 1A,B). Produkcja retrowirusów została przeprowadzona zgodnie z protokołem przedstawionym na Rysunku 2. Transfekcję rozpoczęto w dniu 0, a zbiór retrowirusów nastąpił w dniu 2. Wydajność transfekcji można sprawdzić, mierząc intensywność fluorescencji mCherry (Rysunek 1C). Przed zbiorem wirusa wyizolowano i aktywowano naiwne limfocyty T CD4+. Tak aktywowane limfocyty T CD4+ zainfekowano metodą spin-infekcji, a następnie kontynuowano etapy różnicowania zgodnie z opisem. Na koniec wydajność transdukcji oraz wyniki różnicowania oceniono za pomocą analizy cytometrii przepływowej i analizy qPCR.

Rysunek 3 przedstawia strategię bramkowania zastosowaną do sortowania naiwnych limfocytów T CD4+ . Po wybraniu głównej populacji komórek oraz komórek pojedynczych (jak pokazano w dwóch pierwszych bramkach na Rysunku 3), bramkowano komórki FVD- CD4+, aby odróżnić limfocyty T CD4 spolaryzowane do komórek Th17 od APC. Ostatecznie poziom IL-17A produkowanego przez limfocyty T CD4 reprezentuje wydajność różnicowania Th17, co wskazuje na wydajność nokautu. Procent komórek mCherry-dodatnich odzwierciedla wydajność infekcji retrowirusowej, natomiast wydajność nokautu jest wskazywana przez procent komórek IL-17A-dodatnich. Aby zwiększyć żywotność komórek i zminimalizować czas sortowania, splenocyty wzbogacono przy użyciu zestawu do izolacji limfocytów T CD4+ myszy, co pozwoliło uzyskać wydajność wzbogacenia przekraczającą 90%.

Wydajność infekcji retrowirusowej, wskazywana przez obecność komórek mCherry-dodatnich, wynosi zazwyczaj około 40% (Rysunek 4A). Choć wydajność infekcji można zwiększyć poprzez zagęszczenie wirusa, podejście to odbywa się kosztem wydłużenia czasu trwania eksperymentu i wyższych kosztów. W naszych badaniach zainfekowane komórki hodowane bez koktajlu różnicującego komórki Th17 służyły jako ujemna kontrola różnicowania Th17, oznaczona jako Th0. Jako kontrolę dodatnią zastosowano niecelujące sgRNA, określone jako sgNT. Do edycji genów wykorzystano gRNA celujące w gen RORγt (sgRNA-Rorc), co znacząco obniżyło wydajność różnicowania Th17 (Rysunek 4A). Interwencja ta doprowadziła również do istotnego spadku poziomów ekspresji Rorc oraz IL-17a (Rysunek 4B).

Schematy DNA plazmidowego i ekspresja mCherry w transfekowanych komórkach PhaT-E; eksperyment wizualizacji genów.
Rycina 1: Przykład sgRNA podklonowanego do wektora retrowirusowego oraz wydajność transfekcji. Jako konstrukt wyjściowy zastosowano wektor pMX-U6-MCS. Rusztowanie (scaffold) gRNA wraz z sekwencjami sgRNA (część pomarańczowa) nakierowanymi na (A) sekwencję kontrolną (scrambled) oraz (B) Rorc, zostały wstawione w regionie downstream względem promotora U6 (część zielona jako sekcja do sekwencjonowania z primerami U6). Położenia primerów zawierających sgRNA oraz miejsc wiązania primerów do sekwencjonowania są zaznaczone poniżej kolistego wektora. Pełne nazwy skrótów na plazmidzie są następujące. Skróty: AmpR = oporność na ampicylinę, karbenycylinę i pokrewne antybiotyki; LTR = długa powtórka końcowa (long terminal repeat); MMLVψ = sygnał pakowania wirusa białaczki mysiej Moloneya; gag = ucięty gen gag wirusa białaczki mysiej Moloneya (MMLV), pozbawiony kodonu start. (C) Obrazowanie mikroskopowe mCherry w komórkach Plat-E transfekowanych DNA plazmidowym. Pasek skali: 500 px. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Schemat procesu transfekcji; aktywacja limfocytów T, infekcja wirusowa, analiza FACS w celu różnicowania.
Rysunek 2: Schematyczna ilustracja protokołu. Dzień przed transfekcją należy dostosować gęstość komórek Plat-E do odpowiedniego zakresu. Następnego dnia (dzień 0) należy przeprowadzić transfekcję i wymienić medium po 12 h. W dniu 1 należy wyizolować i aktywować naiwne limfocyty T z myszy wykazujących ekspresję Cas9. Następnie (dzień 2) należy zebrać nadsącz z hodowli zawierający wirusy i połączyć go z aktywowanymi limfocytami T w celu transdukcji retrowirusowej. Zainfekowane komórki są następnie różnicowane w komórki Th17 przez 3–4 dni i analizowane za pomocą FACS. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Analiza cytometrii przepływowej, od limfocytów do naiwnych limfocytów T, wykresy FSC vs SSC, proces bramkowania komórek.
Rysunek 3: Strategia bramkowania dla sortowania naiwnych limfocytów T CD4. Barwienie powierzchniowe przeprowadzono na wzbogaconych limfocytach T CD4 w celu oznakowania CD4, CD25, CD44 i CD62L. Zastosowano następującą strategię bramkowania: początkowo limfocyty wyznaczono na podstawie parametrów rozproszenia światła w przód (forward scatter) i rozproszenia bocznego (side scatter). Następnie, przy użyciu FSC-H i FSC-W, zidentyfikowano pojedyncze komórki. Komórki CD4+CD25- wyznaczono w celu wykluczenia limfocytów T regulatorowych (Tregs). Na koniec zidentyfikowano naiwne limfocyty T CD44lowCD62Lhigh. Izolowane naiwne limfocyty T CD4+ zebrano do dalszych eksperymentów. Skróty: FSC = forward scatter; SSC = side scatter. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Schematy cytometrii przepływowej, wykres; analiza ekspresji genów; różnicowanie komórek Th17, mCherry, Rorc.
Rycina 4: Przykład udanej transdukcji aktywowanych limfocytów T i różnicowania Th17. (A) Efektywność różnicowania Th17 jest znacząco zmniejszona po edycji za pomocą gRNA RORγt (bramkowanie populacji mCherry+ IL-17a+). (B) Względna ekspresja mRNA Rorγt i IL-17a w komórkach Th0 (komórki zainfekowane hodowane bez koktajlu do różnicowania komórek Th17), sgNT (niespecyficzne sgRNA) oraz sgRNA-Rorc (sgRNA celujące w gen RORγt). ***p < 0,001 (nieparzysty dwustronny test t Studenta; dane przedstawiono jako średnia ± SEM).Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Komponenty reakcji PCRProgram PCR
KomponentObjętość (μL)KrokTemp.CzasCykl
2 × Phanta Mix (Dye Plus)25195 ºC3 min1
ddH2O2020295 ºC15 s
Starter-F (10 μM)2356 ºC15 s
Starter-R (10 μM)2472 ºC5 min 30 sPrzejdź do kroku 2
35 ×
Matryca (~30 ng)1572 ºC5 min1
612 ºC∞

Tabela 1: Składniki reakcji PCR oraz program PCR dla konstrukcji wektora gRNA.

Dyskusja

Edycja genomu CRISPR/Cas9 poprzez dostarczanie retrowirusowe jest solidną metodą badania ról pomocniczych limfocytów T. Protokół ten oferuje szybkie i skuteczne podejście do badania określonych genów zaangażowanych w różnicowanie i funkcję Th17. Aby osiągnąć optymalne wyniki, należy dokładnie wykonać kilka krytycznych kroków. Po pierwsze, w celu zwiększenia skuteczności nokautu genów, gRNA powinny być starannie wyselekcjonowane. Biorąc pod uwagę ryzyko efektów off-target w edycji genów CRISPR/Cas9, rozsądne jest wybranie 2-3 gRNA z wysokimi wynikami, jak określono w sekcji 1.1.1 protokołu, do dalszych eksperymentów11,12. Po drugie, wysokie miano wirusa jest niezbędne do udanej infekcji. Właściwa konserwacja linii komórek pakujących Plat-E ma kluczowe znaczenie. Komórki powinny osiągnąć około 80% konfluencji w dniu transfekcji, ponieważ zarówno nieodpowiednia, jak i nadmierna liczba komórek może pogorszyć miano wirusa. Jeśli komórki Plat-E są niedostępne, kotransfekcja ludzkich embrionalnych komórek 293T nerki z wektorem pCL-Eco może również wytwarzać wysokie miana wirusa13,14. Utrzymanie wysokiego stężenia plazmidu wynoszącego co najmniej 1 μg/μl jest ważne dla osiągnięcia wysokiego miana wirusa. Konieczne jest zebranie zawiesiny wirusa, zanim zmieni kolor na cytrynowożółty, ponieważ wirus wykazuje wrażliwość na zmiany pH. Dlatego pH pożywki hodowlanej powinno być dokładnie regulowane w odpowiednim zakresie. Wirus powinien być przechowywany w temperaturze -80 ºC w celu zachowania jego integralności i chroniony przed powtarzającymi się cyklami zamrażania i rozmrażania15.

Po trzecie, aby osiągnąć wysoką skuteczność infekcji, komórki pierwotne muszą być odpowiednio aktywowane. Niewystarczająca aktywacja komórkowa znacząco pogarsza skuteczność infekcji wirusowych16. Przed infekcją wirusową stan aktywacji limfocytów T należy potwierdzić pod mikroskopem, ponieważ aktywowane komórki wykazują znacznie większy rozmiar niż komórki inaktywowane. Warto zauważyć, że nasz protokół różnicowania Th17 został specjalnie zoptymalizowany dla myszy C57BL/6, więc może być konieczne dostosowanie dla innych szczepów myszy. Po czwarte, aby osiągnąć pożądane wyniki różnicowania Th17, kluczowe jest utrzymanie optymalnych warunków komórkowych. Podczas infekcji wirowej ważne jest, aby umieścić komórki w studzienkach w pobliżu środka, aby pomóc w utrzymaniu żywotności komórek. Po zakażeniu wirowym inkubacja komórek przez 4 godziny (krok protokołu 2.2.4) ma kluczowe znaczenie dla ich regeneracji. Ponadto podczas przenoszenia komórek ważne jest delikatne pipetowanie dla utrzymania ich żywotności. Różne warunki stymulacji mogą wpływać na różnicowanie Th17. W tym eksperymencie włączenie komórek prezentujących antygen do systemu różnicowania znacznie zwiększyło efektywność różnicowania w porównaniu ze stymulacją płytkową anty-CD3e i anty-CD28. Wreszcie, ważne jest, aby upewnić się, że wszystkie użyte cytokiny pozostają funkcjonalne podczas transportu i przechowywania. Cytokiny mogą szybko stracić stabilność w powtarzających się cyklach zamrażania i rozmrażania lub niewłaściwych roztworach do rozpuszczania. Leczenie zimnem i równe podwielokrotności są konieczne, aby cytokiny zachowały funkcje podczas wszystkich procedur.

Ten protokół generowania specyficznych komórek Th17 z nokautem genu ma kilka ograniczeń. Po pierwsze, trudno jest osiągnąć pełną wydajność transdukcji w pierwotnych mysich limfocytach T. Niektóre komórki mogą nie ulec zamierzonemu nokautowi genu podczas różnicowania Th17. Po drugie, pierwotne limfocyty T mają ograniczoną długość życia in vitro. Po około tygodniu komórki te mają tendencję do obumierania, co stanowi wyzwanie dla kolejnych eksperymentów. Po trzecie, nasz protokół opiera się na transgenicznych myszach Cas9, a kiedy próbowaliśmy włączyć sekwencję Cas9 do plazmidu rdzeniowego, spowodowało to znaczne zmniejszenie miana wirusa. Wreszcie, zauważamy, że protokół ten nie jest odpowiedni do analizy funkcji genów zaangażowanych we wczesnych stadiach naiwnej aktywacji limfocytów T CD4 + , ponieważ komórki te muszą być aktywowane przed transdukcją retrowirusową.

Pomimo swoich ograniczeń, protokół ten został z powodzeniem zastosowany w różnych badaniach, ułatwiając eksplorację kluczowych regulatorów genetycznych zaangażowanych w różnicowanie Th17. Umożliwia ocenę zmian w efektywności różnicowania Th17 po nokautowaniu genów docelowych w aktywowanych limfocytach T. Ponadto protokół ten jest odpowiedni do oceny innych aspektów funkcji komórek Th17, w tym proliferacji komórek, przeżycia, stabilności czynnika transkrypcyjnego, wydzielania cytokin i odpowiedzi immunologicznych. Co więcej, nasze laboratorium wykazało jego skuteczność w transdukcji retrowirusowej i różnicowaniu indukowanych limfocytów T regulatorowych (iTreg). Chociaż nie wszystkie typy limfocytów T zostały przetestowane, protokół ten może mieć również zastosowanie w innych podzbiorach, takich jak limfocyty T Th1, Th2 i CD8 + . Ogólnie rzecz biorąc, technika ta służy jako cenne narzędzie do przeprowadzania nokautów genów w komórkach odpornościowych, oferując znaczny potencjał w odkrywaniu krytycznych sygnałów genetycznych, które regulują funkcje odpornościowe.

Oświadczenia

Autorzy stwierdzają, że nie ma konfliktu interesów.

Podziękowania

Dziękujemy Dou Liu, Dongliang Xu i Pinpin Hou z głównego ośrodka Instytutu Terapii Immunologicznej w Szanghaju za ich wsparcie w korzystaniu z tych instrumentów. Praca ta była wspierana przez National Natural Science Foundation of China Grants 31930038, U21A20199, 32100718 i 32350007 (dla Linrong Lu); 32100718 (do Xuexiao Jin); Innowacyjny zespół badawczy renomowanych lokalnych uniwersytetów w Szanghaju SHSMU-ZLCX 20211600 (do Linrong Lu); Wewnętrzny program inkubacyjny RJTJ24-QN-076 (do Zejin Cui). Rysunek 2 został przygotowany za pomocą Figdraw.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,5 M EDTA (pH 8,0)SolarbioE1170
100 mm Naczynie do hodowli komórek i tkanekBIOFILTCD010100
1 M Hepes (wolne kwasy, sterylne)SolarbioH1090
24-dołkowa płytka do hodowli komórkowych i tkankowychNEST702002
48-dołkowa płytka do hodowli komórkowych i tkankowychNEST748002
Brefeldin Roztwór (1,000x)BioLegend420601
Przeciwciało anty-mysie CD4 Brilliant Violet 650 (RM4-5)Przeciwciało100546
CD3e (145-2C11), klasa funkcjonalna, eBioscienceInvitrogen16-0031-82
Przeciwciało monoklonalne CD44 (IM7), PE, eBioscienceInvitrogen12-0441-83
Przeciwciało monoklonalne CD62L (L-Selectin) (MEL-14), APC, eBioscienceInvitrogen17-0621-82 
Licznik komórekNexcelom BioscienceCellometer Auto 2000
Cell Strainer (40 μ m)biosharpBS-40-CS
Sitko do komórek (70 μ m)biosharpBS-70-CS
 EPPENDORF5425  R
Wirówka eppendorf5810 R
ChamQ SYBR Color qPCR Master MixVazymeQ411-02
Jednoetapowy zestaw do klonowania ClonExpress IIVazymeC112
DH5α Competent CellsSangon BiotechB528413
Direct-zol RNA MiniprepZYMO RESEARCHR2050
DMEM MediumBasalMediaL110KJ
EasySep Mysz CD4 + Zestaw do izolacji komórek TSTEMCELL19852
eBioscience Fixable Viability Dye eFluor 660Invitrogen65-0864-18
EndoFree Mini zestaw plazmidowy IITIANGENDP118-02
ExFect Odczynnik do transfekcjiVazymeT101-01
Płodowa surowica bydlęca, Premium PlusGibcoA5669701
FITC Przeciwciało przeciw mysiej IL-17A (TC11-18H10.1)BioLegend506907
Roztwór formaldehyduMacklinF864792
HiScript IV RT SuperMix do qPCR?+wycieraczka gDNA?VazymeR423-01
JonomycynaBeyotimeS1672
Mitomycyna CMaokang Biotechnology7/7/1950
Mysz GRCm38NCBI RefSeq v.108.20200622
OPTI-MEM Obniżona surowica MediumGibco31985070obniżona surowica
Blue anty-mysie przeciwciało CD4 (RM4-5)BioLegend
PE/Cyjanina7 przeciwciało anty-mysie CD25 (PC61)BioLegend102015
PE/Cyjanine7 anty-mysie przeciwciało CD4 (GK1.5)BioLegend100422
Penicylina-Streptomycyna (10 000 U/mL)Gibco15140122
PMA/TPA BeyotimeS1819
R26-CAG-Cas9 Centrum Organizmów Modelowych w SzanghajuNr kat. NM-KI-00120
Rekombinowane ludzkie białko TGF-beta 1 (z ekspresją CHO), CFR& D Systems11409-BH
Rekombinowana mysia IL-6PeproTech216-16
Analizator komórek badawczychBD BiosciencesBD LSRFortessa
Research Cell SorterSONYMA900
RPMI 1640 MediumBasalMediaL210KJ
SimpliAmp Thermal Cycler System PCRApplied BiosystemsA24811
Roztwór pirogronianu sodu (100 mM)Sigma-AldrichS8636
Ultra-LEAF Oczyszczone przeciwciało przeciw myszom CD28 (37.51)BioLegend102121
Ultra-LEAF Oczyszczone przeciwciało przeciw myszom IFN-γ Przeciwciało (XMG1.2)BioLegend505847
Ultra-LEAF Oczyszczone przeciwciało przeciw mysiej IL-4 (11B11)BioLegend504135
Ultra-LEAF Oczyszczone przeciwciało przeciw mysim IL-12/IL-23 p40 (C17.8)BioLegend505309
β-Merkaptoetanol (50 mM)SolarbioM8211
monoklonalne BioLegend Pacific 100531Myszy

Bibliografia

  1. Wu, B., Wan, Y. Molecular control of pathogenic th17 cells in autoimmune diseases. Int Immunopharmacol. 80, 106187(2020).
  2. Dong, C. Th 17 cells in development:: An updated view of their molecular identity and genetic programming. Nat Rev Immunol. 8 (5), 337-348 (2008).
  3. Patel, D. D., Kuchroo, V. K. Th17 cell pathway in human immunity: Lessons from genetics and therapeutic interventions. Immunity. 43 (6), 1040-1051 (2015).
  4. Ghoreschi, K., et al. Generation of pathogenic Th17 cells in the absence of TGF-β signalling. Nature. 467 (7318), 967-U144 (2010).
  5. Lee, Y., et al. Induction and molecular signature of pathogenic th17 cells. Nat Immunol. 13 (10), 991-999 (2012).
  6. Yang, H., et al. One-step generation of mice carrying reporter and conditional alleles by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 154 (6), 1370-1379 (2013).
  7. Yang, H., Wang, H., Jaenisch, R. Generating genetically modified mice using CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Nat Protoc. 9 (8), 1956-1968 (2014).
  8. Doench, J. G., et al. Optimized sgrna design to maximize activity and minimize off-target effects of crispr-cas9. Nat Biotechnol. 34 (2), 184-191 (2016).
  9. Holst, J., et al. Generation of t-cell receptor retrogenic mice. Nat Protoc. 1 (1), 406-417 (2006).
  10. Ordonez, P., Bishop, K. N., Stoye, J. P., Groom, H. C. T. Analysis of SAMHD1 restriction by flow cytometry in human myeloid U937 cells. J Vis Exp. (172), (2021).
  11. Akcakaya, P., et al. In vivo CRISPR editing with no detectable genome-wide off-target mutations. Nature. 561 (7723), 416-419 (2018).
  12. Bae, S., Park, J., Kim, J. -S. Cas-OFFinder: A fast and versatile algorithm that searches for potential off-target sites of cas9 rna-guided endonucleases. Bioinformatics. 30 (10), 1473-1475 (2014).
  13. Singh, Y., Garden, O. A., Lang, F., Cobb, B. S. Retroviral transduction of helper T cells as a genetic approach to study mechanisms controlling their differentiation and function. J Vis Exp. (117), e54698(2016).
  14. Naviaux, R. K., Costanzi, E., Haas, M., Verma, I. M. The pCL vector system: Rapid production of helper-free, high-titer, recombinant retroviruses. J Virol. 70 (8), 5701-5705 (1996).
  15. Cante-Barrett, K., et al. Lentiviral gene transfer into human and murine hematopoietic stem cells: Size matters. BMC Res Notes. 9, 312-312 (2016).
  16. Zhong, S., Malecek, K., Perez-Garcia, A., Krogsgaard, M. Retroviral transduction of T-cell receptors in mouse T-cells. J Vis Exp. (44), 2307(2010).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Transdukcja retrowirusowalimfocyty T CD4cytometria przep ywowapolaryzacja in vitroROR gamma Tpojedyncze przewodnie RNAregulacja immunologiczna
Retrowirusowe celowanie genów za pośrednictwem CRISPR/Cas9 w badaniu różnicowania Th17 in vitro
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.