Opisujemy użycie chromatografii cienkowarstwowej, bezpośredniego testu bioautografii i chromatografii cieczowej ze spektrometrią mas do identyfikacji naturalnych produktów mikrobiologicznych, które wykazują antagonizm wobec patogenów grzybowych, używając patogenu Sclerotinia sclerotiorum i biopestycydowych izolatów Bacillus jako systemu modelowego.
Artykuł metodologiczny
Identyfikacja produktów naturalnych pod kontrolą biologiczną za pomocą chromatografii cienkowarstwowej - bioautografia bezpośrednia
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Chromatografia cienkowarstwowa-bezpośrednia bioautografia (TLC-DB) jest dobrze znanym testem biologicznym używanym do oddzielania i identyfikowania produktów naturalnych (NP), które są antagonistyczne wobec docelowego patogenu. Jest to szybka, niedroga i prosta opcja izolacji i identyfikacji nanocząsteczek pod kontrolą testów biologicznych, która opiera się na separacji za pomocą TLC w połączeniu z bezpośrednim zastosowaniem docelowego patogenu w celu zbadania bioaktywności. Jest zwykle używany do analizy bioaktywnych ekstraktów roślinnych, wykrywania aktywności hamującej wobec bakterii, grzybów i enzymów. Biorąc to pod uwagę, ma ogromny potencjał w odkrywaniu bakteryjnych nanocząsteczek roślinnych, w szczególności w zakresie oceny bakteryjnych nanocząsteczek w porównaniu z istotnymi patogenami rolniczymi, co jest cenne dla odkrywania i opracowywania nowych biopestycydów dla przemysłu rolniczego. Co więcej, jest to przestrajalny protokół, który może być stosowany do innych docelowych patogenów lub źródeł nanocząsteczek w programach badawczych dotyczących odkrywania i identyfikacji związków bioaktywnych. W niniejszym artykule opisano modelowy system wykrywania i identyfikacji nanocząsteczek biopestycydów za pomocą TLC-DB z Bacillus spp. i patogenem rolniczym Sclerotinia sclerotiorum.
Wprowadzenie
Grzybowe patogeny rolnicze powodują znaczne straty w jakości i plonach upraw na całym świecie, przyczyniając się do wyzwań ekonomicznych i logistycznych w zakresie stabilnego, globalnego systemu produkcji żywności1,2. Szkody wyrządzane przez patogeny można zapobiegać poprzez hodowlę odmian odpornych na infekcje oraz stosowanie zintegrowanych systemów zarządzania uprawami, w tym płodozmianu i praktyk gospodarki gruntami w celu zahamowania proliferacji patogenów3,4. Choć metody te ograniczają straty w uprawach, zazwyczaj równolegle stosuje się chemiczne środki ochrony roślin, aby aktywnie zwalczać struktury rozrodcze grzybów w polu i dalej zapobiegać uszkodzeniom oraz spadkom plonów. Mimo swojej skuteczności, stosowanie chemicznych pestycydów wiąże się z wieloma wadami, w tym z niszczeniem okolicznych ekosystemów, spadkiem żyzności gleby, ryzykiem dla zdrowia ludzi oraz rozwojem oporności patogenów, co w konsekwencji prowadzi do konieczności stosowania coraz wyższych dawek środków ochrony roślin każdego roku5,6,7.
Produkty do zwalczania szkodników i patogenów oparte na drobnoustrojach od dawna są uważane za potencjalne alternatywy lub uzupełnienie dla syntetycznych pestycydów. Od początku XX wieku Bacillus thuringiensis jest szeroko stosowany w celu zwalczania szkodników i patogenów w rolnictwie w formie zapraw do nasion, oprysków liści oraz bezpośrednich zabiegów glebowych8. Produkty te nazwano biopestycydami i definiuje się je jako naturalnie występujące mikroorganizmy lub substancje biochemiczne, które mogą zabijać, tłumić lub zmniejszać żywotność docelowego szkodnika lub patogenu. Biopestycydy mogą kontrolować wzrost patogenu za pomocą różnych mechanizmów, ale najczęściej robią to poprzez wydzielanie metabolitów wtórnych9. Metabolity wtórne, często nazywane produktami naturalnymi, nie biorą udziału w metabolizmie podstawowym, lecz są wytwarzane jako korzyść ewolucyjna, aby wyprzedzić inne mikroorganizmy w konkurencji10.
Biopestycydy oferują wiele zalet w porównaniu do ich syntetycznych odpowiedników. Stanowią one niskie ryzyko toksyczności dla środowiska, fauny i ludzi w zestawieniu z syntetycznymi produktami do zwalczania szkodników9,10. Ponieważ większość biopestycydów występuje naturalnie w środowisku od tysiącleci, istnieją w nim szlaki biodegradacji metabolitów mikrobiologicznych, co ogranicza możliwość zanieczyszczenia gleby lub ekosystemu oraz skraca czas retencji, który sprawia, że pestycydy syntetyczne są tak niszczycielskie dla środowiska11. Dodatkowo wiele biopestycydów stosowanych w celu ograniczania infekcji patogenami wykazuje również właściwości stymulujące wzrost roślin, co może zwiększyć biodostępność składników odżywczych i indukować systemiczną odporność roślin12.
Najczęściej biopestycydy stosuje się w formie inokulum mikrobiologicznego, a NP są wydzielane przez żywe mikroorganizmy in situ12,13. W takim przypadku zidentyfikowanie źródła aktywności biopestycydy ma ogromną wartość. Pozwala to na zrozumienie mechanizmu działania biopestycydy, pomaga w procesie patentowania ochrony mikroorganizmu oraz może mieć znaczący wpływ naukowy, jeśli ich struktury są nowatorskie. Co najważniejsze, identyfikacja bioaktywnego źródła pozwala określić możliwości formułowania końcowego produktu biopestycydowego. Jeśli sam NP jest aktywny, mikroorganizm może posłużyć jako fabryka biomolekuł do wielkoskalowej produkcji biopestycydów. Ponadto wiele NP badanych pod kątem biokontroli wykazuje potencjał do zastosowań w medycynie ludzkiej, co czyni je jeszcze bardziej wartościowymi ekonomicznie8.
Analizy z wykorzystaniem bezpośredniej bioautografii w chromatografii cienkowarstwowej (TLC-DB) stanowią niedrogą i prostą metodę izolacji oraz identyfikacji metabolitów o działaniu biopestycydowym w oparciu o ich aktywność biologiczną. Choć technika ta jest powszechnie stosowana do rozdziału i testowania aktywności biologicznej fitochemikaliów z surowych ekstraktów roślinnych, posiada ona również duży potencjał w analizie ekstraktów mikrobiologicznych.14TLC umożliwia szybkie i niedrogie rozdzielanie nanocząsteczek w surowym ekstrakcie mikrobiologicznym, a po naniesieniu zawiesiny patogenu w odpowiednim podłożu, strefy zawierające aktywne metabolity są łatwo widoczne. Strefy te można zeskrobać z płytki i poddać ekstrakcji w celu analizy chemicznej za pomocą ultra-wydajnej chromatografii cieczowej sprzężonej ze spektrometrią mas (UPLC-MS), aby zidentyfikować znane metabolity. Metabolity, które nie odpowiadają wcześniej opisanym związkom, mogą zostać wyizolowane w większych ilościach. poprzez chromatografia cieczowa w celu przeprowadzenia badań nad wyjaśnianiem struktury z wykorzystaniem takich technik, jak spektroskopia magnetycznego rezonansu jądrowego i krystalografia rentgenowska15.
Artykuł ten opisuje system modelowy służący do odkrywania i identyfikacji biopestycydowych nanocząsteczek (NPs) przy użyciu metody TLC-DB z wykorzystaniem gatunków Bacillus oraz patogenu roślinnego Sclerotinia sclerotiorum. Rysunek 1 przedstawia schematyczny przegląd procedury TLC-DB.
Rysunek 1: Schematyczny przegląd kroków 4-7 procedury TLC-DB. Aby wyświetlić większą wersję tego rysunku, kliknij tutaj.
Protokół
Szczegóły dotyczące odczynników i sprzętu użytego w tym badaniu są wymienione w Tabeli Materiałów.
1. Wybór kandydatów do kontroli biologicznej mikrobiologicznej
- Korzystając z testów na płytkach konkurencji, wybierz izolaty drobnoustrojów, które wykazują antagonizm wobec patogenu będącego przedmiotem zainteresowania.
UWAGA: Wybrano dziewięć izolatów Bacillus, które wykazywały antagonizm wobec S. sclerotiorum, w tym gatunki Bacillus atrophaeus, mojavensis i subtilis, w celu zademonstrowania tego protokołu.
2. Przygotowanie podłoża
- Przygotuj agar z dekstrozą ziemniaczaną (PDA), rozpuszczając 39 g pożywki na litr wody.
- Przygotuj agar Pseudomonas F, dodając 45 g pożywki na litr wody.
- Przygotuj bulion z dekstrozy ziemniaczanej (PDB) z 1% agarem, dodając 24 g pożywki i 0,24 g agaru na litr wody.
- Przygotuj bulion drożdżowo-glukozowo-manganowy (YGM). Stworzyć roztwór buforowy składający się z 2,5 g KH2PO4 i 2,5 g K2HPO4 w 100 ml wody oraz roztworu soli składającego się z 0,58 gMnSO4. H20, 0,5 g NaCl i 0,05 g FeSO4,7H 20 w 100 ml wody.
- Następnie dodać 1 g ekstraktu drożdżowego, 1,25 g dekstrozy, 400 ml wody, 5 ml roztworu buforowego, 5 ml roztworu soli i 90 ml wody, aby upewnić się, że sole metali nie wytrącają się w roztworze.
- Wysterylizuj pożywkę w autoklawie, wlej agar do płytek Petriego o wymiarach 100 x 15 mm i pozwól wszystkim ostygnąć do temperatury pokojowej przed użyciem.
3. Przygotowanie patogenu
- Wyhodować pięć płytek Sclerotinia sclerotiorum na PDA (przygotowanym w kroku 2.1) i inkubować w temperaturze 25 °C przez 3 dni.
4. Przygotowanie naturalnego ekstraktu z produktu
- Hodować każdy izolat bakteryjny na agarze Pseudomonas F (przygotowanym w kroku 2.2) i rosnąć, aż zaobserwuje się poszczególne kolonie.
- Subkulturuj pojedyncze kolonie bakteryjne w 25 ml pożywki YGM w wirówce lub probówkach hodowlanych i inkubuj z wytrząsaniem przez 3 dni.
- Przenieść 5 ml podwielokrotności każdego ekstraktu do 1 litra YGM i inkubować w tych samych warunkach przez kolejne 3 dni.
- Odwirować każdą kulturę przy 3000 x g przez 15 minut w temperaturze 25 °C w celu osadzenia komórek.
- Zdekantować i trzykrotnie przepłukać supernatant octanem etylu w celu ekstrakcji metabolitów z pożywki hodowlanej.
- Połączyć i wysuszyć warstwę octanu etylu każdego z nich za pomocą odparowania rotacyjnego.
- Ponownie rozpuść ekstrakt w minimalnej ilości metanolu, przenieś go do małej fiolki scyntylacyjnej i ponownie wysusz przez odparowanie obrotowe.
UWAGA: Jeśli ekstrakt wyschnie do postaci oleistej lub żywicznej, należy go liofilizować, aby uzyskać suchy proszek, który można dokładnie zważyć.
5. Przygotowanie płytki TLC
- Przygotuj płytkę TLC o wymiarach 20 cm x 20 cm, rysując linię 2 cm od dołu i 2 cm od góry płytki. Na dolnej linii umieść dziewięć kropek w odległości 2 cm od siebie. Nad górną linią umieść cztery kropki w odległości 4 cm od siebie.
- Rozpuścić 5 mg każdego ekstraktu w 15 μl metanolu i nanieść pipetą 5 μl każdego ekstraktu na dziewięć kropek zaznaczonych na dolnej linii. Pozostawić każde miejsce ekstraktu do wyschnięcia na płytce TLC i nanieść kolejną porcję 5 μl na to samo miejsce. Powtarzaj, aż cały materiał zostanie załadowany na płytkę TLC.
- Rozwinąć płytkę TLC w zbiorniku do wywoływania, używając roztworu dichlorometanu i metanolu w stosunku 1:2, aż rozpuszczalnik osiągnie linię oznaczoną w odległości 2 cm od górnej krawędzi płytki (około 45 min).
- Po rozwinięciu należy wyjąć płytkę TLC i nałożyć serię kontroli pozytywnych na cztery kropki zaznaczone powyżej linii rozpuszczalnika. Stosuje się cztery stężenia tej samej kontroli. W przypadku S. scl., 0,5 μg/ml, 5 μg/ml, 50 μg/ml i 500 μg/ml higromycyny B są kontrolami pozytywnymi.
- Zanim cały rozpuszczalnik odparuje z płytki, umieść ją w wysterylizowanym etanolem pudełku na płytki TLC.
6. Bezpośredni test bioautograficzny
- Materiały do użycia w teście należy umieścić w autoklawie (szklane elementy opryskiwacza chromatograficznego, metalowa szpatułka, cztery arkusze ręcznika papierowego, celuloza lub bibuła filtracyjna, woda i pożywka) w dużej zlewce pokrytej folią aluminiową.
UWAGA: Materiały papierowe (ręcznik papierowy, papier celulozowy) należy zawinąć w folię aluminiową, aby uniknąć zamoczenia w autoklawie. - Podłącz źródło powietrza, manometr i rozpylacz chromatograficzny za pomocą rurki PTFE sterylizowanej etanolem. Podłączyć filtr HEPA między opryskiwaczem chromatograficznym a manometrem.
- Zebrać matę grzybni z pięciu płytek patogenów za pomocą sterylnej metalowej szpatułki do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml za pomocą sterylnej szpatułki.
UWAGA: Użyj małej objętości płynnego bulionu, aby pomóc usunąć grzybnię, jeśli to konieczne, i przenieś za pomocą sterylnej pipety. - Dodać 25 ml PDB wzbogaconego agarem i sterylnymi kulkami szklanymi do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml i wirować przez 5 minut, aby rozbić matę grzybni.
- Przenieść zawiesinę grzybni do rozpylacza chromatograficznego za pomocą sterylnej strzykawki z końcówką igły, aby upewnić się, że duże kawałki grzybni nie zatkają rozpylacza chromatograficznego.
- Umieść wcześniej opracowane płytki TLC na sterylnych ręcznikach papierowych w okapie z przepływem laminarnym, aby zmniejszyć kontakt dłoni z płytką podczas nakładania zawiesiny podłoża.
- Zwiększ ciśnienie powietrza do około 4 barów i nałóż trzy warstwy zawiesiny na płytkę TLC, pozwalając płytce całkowicie wyschnąć między aplikacjami.
UWAGA: Uznano, że optymalna ilość to trzy warstwy. Mniej niż to, a patogen nie ma wystarczającej ilości pożywki do wzrostu. Co więcej, podłoże jest zbyt gęste, co może nie pozwolić na kontakt patogenu z aktywnymi metabolitami. - Dodaj 500 ml sterylnej wody do wysterylizowanego plastikowego pudełka na talerze i umieść wysterylizowane złożone arkusze celulozy lub bibułę filtracyjną z każdej strony, aby zatrzymać wilgoć.
- Umieścić wypełnioną płytkę do oznaczania na czterech pustych szalkach Petriego w pudełku.
- Inkubować test przez 3 dni do 1 tygodnia lub do momentu, gdy równa warstwa grzybni będzie rosła równomiernie na płytce TLC, z wyjątkiem okolic kontroli pozytywnych i strefy inhibicji (ZOI).
7. Analiza spektrometrii mas metodą chromatografii cieczowej
- Zobrazuj ukończony test za pomocą fotografii.
- Oblicz współczynnik retencji dla każdej strefy hamowania, dzieląc odległość od dolnej linii do ZOI przez odległość od dolnej linii do górnej linii.
- Zeskrob krzemionkę ze stref inhibicji i umieść ją w probówkach do mikrowirówek.
- Dodaj 500 μl metanolu do każdej probówki i odwiruj, aby wyekstrahować metabolity z krzemionki.
- Wirować przy 8 500 x g w temperaturze 20 °C przez 10 minut i przenieść supernatant do małej fiolki.
- Odparować do sucha przez odparowanie obrotowe lub pod strumieniem azotu.
- Zawiesić ekstrakt w 50 μl metanolu w fiolce LC.
- Przeanalizuj metabolity w strefie inhibicji przez LC-MS i porównaj je z metabolitami w surowym ekstrakcie, aby określić, które metabolity w surowym ekstrakcie są odpowiedzialne za hamowanie patogenu16.
- Korzystając z rodzaju i gatunku mikroorganizmu źródłowego oraz mas zidentyfikowanych w ZOI, przeszukaj literaturę i odpowiednie bazy danych, takie jak Antibase i Dictionary of Natural Products, aby zidentyfikować metabolity.
Wyniki
Po rozdzieleniu ekstraktów drobnoustrojowych za pomocą TLC, metabolity powinny rozprzestrzenić się pionowo wzdłuż płyty TLC. W świetle widzialnym może być trudno dostrzec metabolity, które nie absorbują w tym zakresie. Dlatego obrazowanie w świetle UV może pomóc w wizualizacji rozdzielenia metabolitów, co przedstawiono na Rysunku 2A,B. Po okresie inkubacji patogen powinien rosnąć równomiernie na całej płycie, z wyjątkiem obszarów kontroli pozytywnych oraz stref inhibicji, w których znajdują się aktywne metabolity, co pokazano na Rysunku 2C.
Rysunek 2: Rozdział ekstraktów drobnoustrojowych metodą TLC. (A) Wywołana płytka TLC zawierająca dziewięć ekstraktów z Bacillus, obrazowana w świetle widzialnym oraz (B) w świetle UV o długości fali 320 nm przed naniesieniem inokulum grzybowego. (C) Zakończony test bioautografii z obserwowanym wzrostem patogenu na całej płytce, z wyjątkiem obszarów zahamowania wzrostu wokół kontroli pozytywnych, oraz strefy inhibicji (ZOI) każdego ekstraktu. Aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku, kliknij tutaj.
Metabolity wyekstrahowane ze stref zahamowania analizuje się za pomocą LC-MS i porównuje z ekstraktem surowym, aby zidentyfikować produkty naturalne (NP) odpowiedzialne za antagonizm wobec patogenu. Metabolity uznaje się za identyczne, jeśli wykazują ten sam czas retencji i te same gatunki jonów molekularnych. Po zidentyfikowaniu aktywnych metabolitów można przeprowadzić hodowlę seryjną bakterii w celu wyizolowania interesujących aktywnych metabolitów do dalszych badań nad ich strukturą chemiczną lub analiz biologicznych.
Dyskusja
TLC-DB jest cennym i ugruntowanym narzędziem badawczym NP oraz prostą i niedrogą alternatywą dla metod izolacji pod kontrolą mikropłytek17. Wymaga minimalnego czasu i zasobów materiałowych w porównaniu z testami mikropłytkowymi, które wymagają separacji metabolitów przy użyciu technik chromatografii cieczowej. Jest to bardzo wszechstronny test, który może być stosowany do wykrywania przeciwbakteryjnych, przeciwgrzybiczych, przeciwpasożytniczych i przeciwutleniających NP oprócz inhibitorów enzymów 18,19,20,21,22,23. Chociaż najczęściej stosowana do wykrywania i identyfikacji bioaktywnych fitochemikaliów, ta sama metoda może być stosowana w przypadku bakteryjnych nanocząsteczek, jak zbadano w tym protokole18. Ponadto protokół można zoptymalizować pod kątem stosowania z różnymi źródłami nanocząstek i docelowymi patogenami, aby pomóc w odkrywaniu i ocenie nowych bioaktywnych nanocząsteczek.
Pożywka używana do rozwoju bakterii i rozpuszczalnik używany do ekstrakcji mogą mieć ogromny wpływ na wyniki odkrywania naturalnych produktów. Pożywka stosowana w tym protokole jest zoptymalizowana pod kątem bakterii wytwarzających cykliczne lipopeptydy, w tym Pseudomonas i Bacillus spp. Ale inne podłoża i źródła składników odżywczych powinny być brane pod uwagę podczas badania innych rodzajów. Można zdecydować się na uzupełnienie TLC-DB przy użyciu tego samego mikroorganizmu hodowanego w różnych pożywkach w celu oceny pełnego zakresu różnorodności metabolitów z jednego izolatu lub zastosować identyczne warunki wzrostu dla szerszego zakresu izolatów. Wybór rozpuszczalnika ekstrakcyjnego ma również wpływ na wykrywane produkty naturalne. Ogólnie przyjmuje się, że większość bioaktywnych nanocząsteczek ma niską lub umiarkowaną polarność, co sprawia, że octan etylu jest odpowiednim wyborem ze względu na niską temperaturę wrzenia, co ułatwia jego usunięcie. Jeśli jednak ktoś chce zbadać również frakcje polarne i niepolarne, można przeprowadzić wielokrotne ekstrakcje innymi rozpuszczalnikami. Alternatywnie, ekstrakt bezkomórkowy może być liofilizowany i wykorzystany w teście, aby zobaczyć wszystkie metabolity uwalniane do pożywki. Jednak często konieczne będzie załadowanie większej ilości materiału na płytkę TLC, aby uwzględnić składniki wysuszonych mediów w liofilizowanym materiale. Podobnie, jeśli ta metoda jest stosowana z innym patogenem, takim jak inokulum, użyte podłoże i warunki inkubacji muszą być zoptymalizowane, aby uzyskać 5 płytek agarowych grzybni użytych do testu TLC-DB.
TLC-DB jest korzystna w porównaniu z bioautografią kontaktową i zanurzeniową, ponieważ wykorzystuje najcieńszą warstwę agaru i inokulum, minimalizując zależność od dyfuzji metabolitów do warstwy agaru, co może pozwolić na mniejsze ilości naturalnych produktów w celu indukowania hamowania patogenu17. Wcześniej opublikowane wyniki przy użyciu metod bioautograficznych TLC wykorzystały zawiesinę zarodników patogenu do zakończenia testu17. Chociaż pozwala to na precyzyjną kontrolę stężenia zawiesiny, indukowanie zarodnikowania niektórych grzybów może być niezwykle trudne i czasochłonne24. Modyfikacja ta znacznie upraszcza test i pozwala na jego wykonanie przy użyciu patogenów grzybowych, które są trudne do zarodnikowania i mogły być wcześniej unikane w przypadku tej metody.
Masa ekstraktu bakteryjnego użytego w teście może mieć wpływ na wyniki. Jeśli na płytkę TLC zostanie nałożona zbyt mała ilość ekstraktu, możliwe jest, że minimalne stężenie hamujące związku aktywnego nie zostanie przekroczone, a bioaktywność nie zostanie wykryta. W rezultacie, w niektórych przypadkach, jak widać na rysunku 1 i rysunku 2, warto przeciążyć płytkę TLC, pogarszając separację i umożliwiając łatwe wykrycie aktywności. Podobnie, ładunek patogenu rozpylany na płytkę nie może być zbyt niski, ponieważ nie zostanie nałożona wystarczająca ilość podłoża, aby wspomóc wzrost patogenu. Metodę tę można łatwo dostosować, aby dostosować ją do różnych ekstraktów bakteryjnych i patogenów, a ilości ekstraktu mikrobiologicznego i inokulum określone w protokole zapewniły wykrywanie bioaktywności wielu patogenów i ekstraktów mikrobiologicznych. Jeżeli po zakończeniu testu nie zaobserwuje się żadnych stref inhibicji, może to wskazywać na jedno z poniższych. Po pierwsze, czynne metabolity mogą nie być obecne w zastosowanym ekstrakcie ze względu na niekompatybilne podłoża stosowane do wzrostu bakterii lub ze względu na aktywność bakterii, która nie jest wynikiem produkcji NP. Test dyfuzji krążkowej z ekstraktem można przeprowadzić, aby potwierdzić lub zaprzeczyć istnieniu aktywnych nanocząsteczek w ekstrakcie. Jeśli test dyfuzji krążka nie wykaże supresji patogenu, można przetestować inne pożywki w celu ustalenia, czy inne warunki wytwarzają bioaktywne nanocząsteczki. Jeśli test dyfuzji krążkowej wskazuje, że ekstrakt hamuje patogen, może być konieczne nałożenie większej masy ekstraktu bakteryjnego na płytkę TLC, w którym to przypadku można spróbować przeprowadzić inny test.
Porównanie metabolitów w ZOI z surowym ekstraktem ma zasadnicze znaczenie dla identyfikacji aktywnych nanocząsteczek. W teście metabolity z surowego ekstraktu mogą być metabolizowane lub modyfikowane przez patogen, co można zaobserwować za pomocą LC-MS. W związku z tym tylko metabolity, które występują zarówno w ekstrakcie surowym, jak i w ZOI, można uznać za NP wytwarzane przez badane bakterie. Jeśli nie można skorelować metabolitów wyekstrahowanych z ZOI z metabolitami w ekstrakcie surowym, można przygotować płytkę TLC, jak opisano w kroku 5. Nie kończąc testu bioautografii, należy wyekstrahować metabolity z płytki TLC w tym samym czasie retencji, który obserwuje się w zakończonym teście. Powinno to pozwolić na łatwiejszą korelację między metabolitami w ZOI a surowym ekstraktem, powodując supresję patogenów.
Jedną z wad TLC-DB jest to, że rozdzielczość TLC jest znacznie mniejsza niż osiągana przy użyciu tradycyjnych technik przesiewowych mikrostudzienek, które wymagają chromatografii cieczowej do separacji. W związku z tym często zdarza się, że wiele metabolitów występuje w strefie hamowania, w której niektóre metabolity mogą nie przyczyniać się do bioaktywności. Problem ten może być dodatkowo spowodowany praktyką przeciążania płytki TLC w celu wyraźniejszej obserwacji bioaktywności. Ostatnie prace zostały opublikowane przy użyciu wysokowydajnego TLC (HP-TLC), który znacznie poprawia rozdzielczość i może pozwolić na automatyzację rozwoju TLC, która jest niemożliwa w przypadku korzystania z konwencjonalnej TLC 14,21,22,23. Płytki mogą być również opracowywane w drugim wymiarze (2D-TLC) w celu dalszego oddzielania metabolitów o podobnym czasie retencji. Biorąc to pod uwagę, należy ocenić, czy zwiększony koszt czasu i materiałów jest opłacalny kompromisem dla zwiększenia rozdzielczości uzyskanej z HP- i 2D-TLC25.
Oświadczenia
Dr Susan Boyetchko zmarła przed złożeniem tej pracy (8 lutego 2023 r.). Wszyscy pozostali autorzy oświadczyli, że nie mają konfliktu interesów.
Podziękowania
Serdecznie dziękujemy Agriculture and Agri-Food Canada za finansowanie, dzięki któremu te badania były możliwe (projekty J-001843 i J-002021). Dziękujemy Brettowi van Heyningenowi za nakręcenie materiału wideo do tego protokołu. Chcielibyśmy również podziękować byłym doktorantom (Jennifer Vacon i Markowi Nabuursowi) za ich spostrzeżenia na temat metod opisanych w tym manuskrypcie.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Pipeta jednokanałowa 0,5-5 ml | VWR | CA11020-004 | |
| 10 mL Opryskiwacz do chromatografii cienkowarstwowej | VWR | KT422530-0010 | |
| Płytki Petriego 100 x 15 mm | VWR | 89038-970 | |
| 100-1000 µ L końcówki do pipet | VWR | 76322-164 | |
| 100-1000 µ Pipeta jednokanałowa L | VWR | 76169-240 | |
| 15 ml sterylne probówki wirówkowe | VWR | CA21008-918 | |
| L szklana butelka | Millipore Sigma | CLS13951L | Musi być bezpieczna w autoklawie |
| 1 ml sterylna strzykawka z igłą | Thomas Scientific | 8935L75 | Zalecana jest odłączana |
| igła 2 ml Probówka do mikrowirówek | VWR | 87003-298 | |
| Sterylne probówki wirówkowe 50 ml | VWR | CA21008-940 | |
| 5 ml końcówki do pipet | VWR | CA11020-008 | |
| 7 ml fiolki do scyntylacji | VWR | 76538-962 | |
| 95% etanol | Thermo Fisher Scientific | A412-500 | |
| Autoklaw | Cole-Parmer | UZ-01850-34 | 8 L, 115 VAC |
| Agar bakteriologiczny | VWR | 97064-336 | |
| pojemnik | Thomas Scientific | 1216H91 | |
| D-Glukoza | VWR | BDH9230-500G | |
| Dichlorometan ≥ 99,8% ACS | VWR | BDH1113-4LG | |
| Octan etylu ≥ 99,8% ACS | VWR | BDH1123-4LG | |
| Bibuła filtracyjna | VWR | CA28297-846 | |
| Kulki szlifierskie | VWR | 12621-148 | |
| Hygromycyna B | VWR | CA80501-074 | |
| Siarczan żelaza sześciowodny | VWR | 97061-542 | |
| Okap laminarny | CleanTech | 1000-6-A | |
| LC-MS | System Waters | LITR10064178 | UPLC/MS/MS TQD |
| Liofilizator | Labconco | 700201000 | Kolektor temperatury -50 ° C |
| Hydrat siarczanu manganu | VWR | CAAA10807-14 | |
| Metanol ≥ 99,8% ACS | VWR | BDH2018-5GLP | |
| Ręcznik papierowy | VWR | 89402-824 | |
| Agar ziemniaczany z dekstrozą | VWR | CA90000-758 | |
| Rosół z dekstrozy ziemniaczanej | VWR | CA90003-494 | |
| Fosforan potasu dwuzasadowy | VWR | 470302-246 | |
| Fosforan potasu jednozasadowy | VWR | 470302-252 | |
| Manometr 6mm Union Straight 0-10 bar (0-145 psi) | Tameson | F25U6 | |
| Pseudomonas F Agar | VWR | 90003-352 | Znany również jako Flo Agar |
| PTFE Rurka | Sigma Aldrich | 58697-U | 1/16 cala średnica wewnętrzna |
| Chlorek sodu | VWR | BDH9286-500G | |
| Szpatułka | VWR | 82027-490 | |
| Sterylne pętle do inokulacji z igłą | VWR | 76534-512 | |
| Folia aluminiowa | Thomas Scientific | 1086F24 | Można kupić w supermarkecie |
| TLC Żel krzemionkowy 60 RP-18 F254S 25 Talerze szklane 20 X 20 cm | Thomas Scientific | 1205Q12 | |
| Pompa próżniowa | Labconco | 1472100 | 98 l/min |
| Vortex | VWR | 76549-928 | Musi pomieścić probówki wirówkowe o pojemności 15 ml i 50 ml |
| Whatman in-line HEPA-VENT | Millipore Sigma | WHA67235000 | 10 filtrów, wlot / wylot 1/4 do 3/8 cala |
| VWR | 97063-370 |
Bibliografia
- Fisher, M. C., et al. Emerging fungal threats to animal, plant and ecosystem health. Nature. 484 (7393), 186-194 (2012).
- Savary, S., et al. The global burden of pathogens and pests on major food crops. Nat Ecol Evol. 3 (3), 430-439 (2019).
- Lin, B. B. Resilience in agriculture through crop diversification: Adaptive management for environmental change. BioSci. 61 (3), 183-193 (2011).
- Piquerez, S. J., Harvey, S. E., Beynon, J. L., Ntoukakis, V. Improving crop disease resistance: Lessons from research on arabidopsis and tomato. Front Plant Sci. 5, 671(2014).
- Damalas, C., Koutroubas, S. Current status and recent developments in biopesticide use. Agriculture. 8 (1), 13(2018).
- Syed Ab Rahman, S. F., Singh, E., Pieterse, C. M. J., Schenk, P. M. Emerging microbial biocontrol strategies for plant pathogens. Plant Sci. 267, 102-111 (2018).
- Tudi, M., et al. Exposure routes and health risks associated with pesticide application. Toxics. 10 (6), 335(2022).
- Santos, E. N., et al. Bacillus thuringiensis: From biopesticides to anticancer agents. Biochimie. 192, 83-90 (2022).
- Kumar, J., Ramlal, A., Mallick, D., Mishra, V. An overview of some biopesticides and their importance in plant protection for commercial acceptance. Plants. 10 (6), 1185(2021).
- Marrone, P. Pesticidal natural products - status and future potential. Pest Manag Sci. 75 (9), 2325-2340 (2019).
- Ayilara, M. S., et al. Biopesticides as a promising alternative to synthetic pesticides: A case for microbial pesticides, phytopesticides, and nanobiopesticides. Front. Microbiol. 14, 1040901(2023).
- Abdelaziz, A. M., et al. Biocontrol of soil borne diseases by plant growth promoting rhizobacteria. Trop. Plant Pathol. 48 (2), 105-127 (2023).
- Zhao, Z., Liu, D., Ruan, L., Wang, T., Liang, Z. Antifungal mechanism of Bacillus amyloliquefaciens SC-B15 and its application in cereal mildewproof and grape preservation. Food Biosci. 56, 103287(2023).
- Jamshidi-Aidji, M., Dimkic, I., Ristivojevic, P., Stankovic, S., Morlock, G. Effect-directed screening of bacillus lipopeptide extracts via hyphenated high-performance thin-layer chromatography. J Chromatogr A. 1605, 460366(2019).
- Prichystal, J., Schug, K. A., Lemr, K., Novak, J., Havlicek, V. Structural analysis of natural products. Anal Chem. 88 (21), 10338-10346 (2016).
- De Souza, C. G., et al. Simultaneous quantification of lipopeptide isoforms by UPLC-MS in the fermentation broth from Bacillus subtilis CNPMS22. Anal Bioanal Chem. 410 (26), 6827-6836 (2018).
- Dewanjee, S., Gangopadhyay, M., Bhattacharya, N., Khanra, R., Dua, T. Bioautography and its scope in the field of natural product chemistry. J Pharm Anal. 5 (2), 75-84 (2015).
- Choma, I., Jesionek, W. TLC-direct bioautography as a high throughput method for detection of antimicrobials in plants. Chromatography. 2 (2), 225-238 (2015).
- Attia, R., et al. Thin-layer chromatography-bioautographic method for the detection of arginase inhibitors. J Sep Sci. 43 (12), 2477-2486 (2020).
- Legerska, B., Chmelova, D., Ondrejovic, M. TLC-bioautography as a fast and cheap screening method for the detection of alpha-chymotrypsin inhibitors in crude plant extracts. J Biotechnol. 313, 11-17 (2020).
- Agatonovic-Kustrin, S., Doyle, E., Gegechkori, V., Morton, D. W. High-performance thin-layer chromatography linked with (bio)assays and FTIR-ATR spectroscopy as a method for discovery and quantification of bioactive components in native Australian plants. J Pharm Biomed Anal. 184, 113208(2020).
- Hilaire, V., et al. New method for screening anti-leishmania compounds in plants extracts by HPTLC-bioautography. J Chromatogr B. 1188, 123061(2022).
- Stankovic, J., et al. HPTLC-direct bioautography-guided isolation of isogeranic acid as the main antibacterial constituent of Artemisia santonicum essential oil. J Serb Chem Soc. 84 (12), 1355-1365 (2019).
- Su, Y., Qi, Y., Cai, L. Induction of sporulation in plant pathogenic fungi. Mycology. 3, 195-200 (2012).
- Wedge, E., Nagle, D. A new 2D-TLC bioautography method for the discovery of novel antifungal agents to control plant pathogens. J Nat Prod. 63, 1050-1054 (2000).
Przedruki i uprawnienia
