Artykuł metodologiczny

Elektroporacja na bazie porowatego podłoża z monitorowaniem transepitelalnej impedancji elektrycznej

1.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/66971

⸱

27 września 2024

 ,  ,  , 
1Department of Mechanical and Materials Engineering, University of Nebraska-Lincoln, 2Department of Biomedical Engineering, Michigan State University, 3Institute for Quantitative Health Science and Engineering (IQ), Michigan State University

W tym artykule

Podsumowanie

Elektroporacja porowatego podłoża (PSEP) łączy spójne, wysokowydajne dostarczanie z wysoką żywotnością ogniw. Wprowadzenie pomiarów transnabłonkowej impedancji elektrycznej (TEEI) zapewnia wgląd w pośrednie procesy PSEP i pozwala na dostarczanie bez etykietowania. W tym artykule omówiono metodę jednoczesnego przeprowadzania eksperymentów z dostarczaniem PSEP i analizy pomiarów TEEI.

Streszczenie

Elektroporacja porowatego podłoża (PSEP) to nowa metoda elektroporacji, która zapewnia wysoką przepustowość i stałe dostarczanie. Podobnie jak wiele innych rodzajów dostarczania wewnątrzkomórkowego, PSEP w dużej mierze opiera się na markerach fluorescencyjnych i mikroskopii fluorescencyjnej w celu określenia pomyślnego dostarczenia. Aby uzyskać wgląd w pośrednie etapy procesu elektroporacji, opracowano platformę PSEP ze zintegrowanym monitorowaniem transepitelialnej impedancji elektrycznej (TEEI). Komórki są hodowane w dostępnych na rynku wkładkach z porowatymi błonami. Po 12-godzinnym okresie inkubacji, aby umożliwić wytworzenie w pełni zlewającej się monowarstwy komórek, wkładki umieszcza się w pożywkach transfekcyjnych znajdujących się w dołkach urządzenia PSEP. Monowarstwy komórek są następnie poddawane zdefiniowanemu przez użytkownika kształtowi fali, a wydajność dostarczania jest potwierdzana za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Ten przepływ pracy można znacznie usprawnić dzięki pomiarom TEEI między mikroskopią pulsacyjną a fluorescencyjną w celu zebrania dodatkowych danych na temat procesu PSEP, a te dodatkowe dane TEEI są skorelowane ze wskaźnikami dostarczania, takimi jak wydajność dostarczania i opłacalność. W tym artykule opisano protokół wykonywania pomiarów PSEP z TEEI.

Wprowadzenie

Elektroporacja jest techniką, w której komórki poddawane są działaniu pola elektrycznego, co prowadzi do powstania tymczasowych porów w błonie komórkowej, przez które mogą przenikać ładunki, w tym białka, RNA i DNA1,2. Najpowszechniej stosowaną wersją jest elektroporacja masowa (BEP). BEP wykonuje się poprzez napełnienie kuwety elektrolitem zawierającym miliony komórek, poddanie elektrolitu wysokiemu napięciu i umożliwienie przeniknięcia ładunku do komórek poprzez dyfuzję lub endocytozę1. BEP oferuje wiele zalet, w tym wysoką przepustowość oraz dostępność licznych systemów komercyjnych. Istnieją jednak ograniczenia w dostarczaniu ładunków za pomocą BEP. Niespójne rozmieszczenie komórek względem elektrod oraz ekranowanie pola elektrycznego przez sąsiednie komórki powodują znaczną zmienność ekspozycji na pole elektryczne podczas BEP3,4. Wysokie napięcie wymagane do BEP ma również znaczący negatywny wpływ na żywotność komórek5. Od czasu jej wprowadzenia w 2011 roku6 rośnie zainteresowanie metodą elektroporacji zwaną elektroporacją na podłożu porowatym (PSEP), choć czasami nazywa się ją innymi nazwami, takimi jak elektroporacja lokalna oraz nano- lub mikro-elektroporacja1,7,8. W przeciwieństwie do zawiesiny komórkowej stosowanej w BEP, PSEP przeprowadza się na komórkach przylegających do porowatego podłoża. Stan adherentny jest nie tylko preferowany dla większości ludzkich linii komórkowych9, ale pory w podłożu skupiają również prąd elektryczny, lokalizując potencjał elektryczny przezbłonowy (TMP) w specyficznych regionach błony komórkowej10,11. Ta lokalizacja pozwala na znaczne obniżenie stosowanego napięcia, co zmniejsza uszkodzenia i zwiększa żywotność komórek. Połączenie tych efektów pomaga kontrolować powstawanie porów w błonie komórkowej, co skutkuje bardziej spójnym i efektywnym dostarczaniem ładunku1,5,12.

W niedawnym badaniu wprowadzono urządzenie PSEP z sześciodołową, pozłacaną macierzą elektrod do mocowania dostępnych komercyjnie wkładek z membran porowatych13 (Rycyna 1A,B), co było praktyką wprowadzoną po raz pierwszy przez Vindis i wsp.14. Urządzenie to umożliwia aplikację impulsów oraz pomiar impedancji elektrycznej przez monowarstwę komórek, znaną jako transepitelialna impedancja elektryczna (TEEI), w czasie rzeczywistym13. Interfejs użytkownika urządzenia pozwala na pełną kontrolę nad kształtem fali i polaryzacją elektroporacji. Co istotne, pomiary impedancji w czasie rzeczywistym mogą być wykorzystane do przewidywania efektów dostarczania bez konieczności stosowania kosztownych odczynników lub markerów fluorescencyjnych, co jest koncepcją znaną jako dostarczanie bezmarkerowe (label-free delivery)15.

Platforma PSEP składa się z dwóch głównych niestandardowych komponentów elektrycznych: korpusu urządzenia, w którym znajdują się generator impulsów i sprzęt pomiarowy TEEI, oraz macierzy elektrod, w której umieszczone są porowate podłoża i zachodzi elektroporacja. Schematy całej niestandardowej elektroniki oraz komponentów drukowanych w 3D znajdują się w serwisie GitHub: https://github.com/YangLabUNL/PSEP-TEEI. Do prawidłowego funkcjonowania platformy, poza niestandardową elektroniką, wymagany jest komputer. Dedykowane oprogramowanie wymaga MATLAB (wersja 2021a lub nowsza) do uruchomienia oraz programu Microsoft Excel do przechowywania i dostępu do danych w celu ich analizy. Program steruje niestandardową elektroniką i zapewnia graficzny interfejs użytkownika (GUI) do regulacji ustawień. Programy te zostały również udostępnione w serwisie GitHub: https://github.com/YangLabUNL/PSEP-TEEI.

Wstępne dane sugerują, że proces ten jest możliwy w przypadku różnych typów komórek przylegających (Rysunek 1C), jednak w niniejszym artykule omówiono jedynie przygotowanie komórek A431 przy użyciu parametrów, które zostały uznane za optymalne dla tej linii komórkowej przez Brooks i współpracowników13. Ponadto, ze względu na cytotoksyczność ładunku w postaci jodku propidyny (PI), przeprowadzono dwa eksperymenty: pierwszy z zastosowaniem medium do transfekcji o wysokim stężeniu PI w celu ilościowego określenia wydajności dostarczania, a drugi z użyciem wyłącznie medium hodowlanego w celu pomiaru TEEI w dłuższych przedziałach czasowych. W eksperymentach tych zastosowano identyczne przebiegi impulsów elektroporacyjnych, co pozwoliło na korelację wyników (Rysunek 1D).

Badanie impedancji komórkowej: schemat elektrod, konfiguracja PCB, wykresy TEEI w funkcji czasu oraz wzrostu TEEI w funkcji wydajności.
Rycina 1: Schemat montażu matrycy elektrod i dane podstawowe. (A) Model CAD wkładki wewnątrz dołka matrycy elektrod. (B) Model CAD matrycy elektrod. (C) Wzrost impedancji wywołany przez PSEP dla wybranych linii komórkowych, n = 3 na linię komórkową. Słupek błędu: błąd standardowy średniej. (D) Dane korelacji wydajności dostarczania vs. wzrostu TEEI. Wydajność dostarczania obliczono, dzieląc liczbę komórek znakowanych zarówno w obrazach PI, jak i kalceiny z eksperymentów dostarczania, przez całkowitą liczbę komórek zidentyfikowanych za pomocą Hoechst. Liczbę komórek określono przy użyciu niestandardowego rurociągu CellProfiler, n = 6 na napięcie. Słupek błędu: (oś x i y) błąd standardowy średniej. Rycina ta została powielona z Brooks et al.13 za zgodą autorów. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Protokół

Szczegóły dotyczące odczynników i sprzętu użytego w badaniu są wymienione w Tabeli Materiałów.

1. Przygotowanie odczynników i hodowla komórkowa

  1. Przygotować pożywkę do hodowli komórkowych, dodając 50 ml płodowej surowicy bydlęcej (FBS) i 5 ml penicyliny-streptomycyny do 500 ml pojemnika ze zmodyfikowanym podłożem Eagle (DMEM) firmy Dulbecco. Wyprodukować jedenaście podwielokrotności po 50 ml w celu zmniejszenia ryzyka zanieczyszczenia i przechowywać w lodówce w temperaturze 4 °C.
  2. Utworzyć 1 ml fibronektyny w ludzkim osoczu o stężeniu 25 μg/ml w roztworze podstawowym soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) zgodnie z instrukcjami producenta.
  3. Stworzyć 15 ml 0,1 mg/ml jodku propidyny w roztworze podstawowym DMEM, aby umożliwić eksperymenty z różnymi stężeniami ładunku.
  4. Hodować komórki A431 w kolbie T75 zawierającej 12 ml przygotowanej pożywki do hodowli komórkowych. Komórki pasażowano co 1-2 dni, aby utrzymać 50% konfluencję.

2. Przygotowanie próbki

  1. Powłoka fibronektyny
    1. Wybierz dwanaście wkładek i dwie płytki 24-dołkowe. Umieść wkładki w jednej płytce dołkowej, tworząc dwa rzędy po sześć. Odłóż drugą płytkę dołka na później.
    2. Stwórz 1,300 μl 1 μg/ml roztworu fibronektyny, mieszając 52 μl roztworu podstawowego fibronektyny i 1,248 μl PBS w probówce o pojemności 1,5 ml.
    3. Rozprowadzić 100 μl roztworu fibronektyny do każdej wkładki. Inkubować wkładki w płytce studzienkowej w temperaturze 37 °C przez 3 godziny.
  2. Regulacja stężenia komórek w celu uzyskania optymalnej gęstości komórek
    1. Około 1 godzinę przed zakończeniem inkubacji fibronektyny należy wyjąć kolbę T75 z komórkami A431 z inkubatora w celu ekstrakcji komórek.
    2. Wyjąć pożywkę z kolby za pomocą aspiratora i przemyć 5 ml PBS. Usuń PBS w ten sam sposób i dodaj 3 ml trypsyny. Inkubować przez 3-4 minuty przed stukaniem w bok kolby w celu całkowitego odłączenia komórek.
    3. Dodać 6 ml pożywki do hodowli komórkowych do kolby, energicznie mieszając pipetą w celu odłączenia pozostałych komórek, a następnie przenieść zawartość do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml. Wirować przy 100 x g i temperaturze 20 °C przez 5 min.
    4. Usuń pożywkę do hodowli komórkowych i trypsynę z probówki wirówkowej za pomocą aspiratora, uważając, aby nie naruszyć osadu komórkowego. Dodać 1 ml pożywki do probówki wirówkowej i pipetować tam iz powrotem (bez wytwarzania pęcherzyków), aby rozbić osad komórkowy i ponownie zawiesić komórki.
    5. Odpipetować 10 μl zawiesiny komórek, 40 μl pożywki do hodowli komórkowych i 50 μl barwnika błękitu trypanowego do probówki o pojemności 200 μl, używając pipety do dokładnego wymieszania.
    6. Usunąć 10 μl mieszaniny barwników i wstrzyknąć ją do hemocytometru. Policzyć komórki, stosując 10% rozcieńczenie mieszaniny barwników, aby oszacować całkowitą liczbę komórek w probówce wirówkowej o pojemności 15 ml.
      UWAGA: W przypadku tego protokołu przyjmij stężenie 5 000 000 komórek/ml.
    7. Pomnóż żądaną gęstość wysiewu przez powierzchnię membrany wkładki, podziel przez zliczone komórki/ml w zawiesinie i pomnóż przez 1,000, aby obliczyć wymagane mikrolitry zawiesiny komórek na wkładkę.
      1. Aby znaleźć całkowitą wymaganą ilość zawiesiny komórek, pomnóż tę liczbę przez 10 (aby zapewnić wystarczającą ilość komórek na 9 próbek, ponieważ 3 z 12 wstawek będą kontrolami bezkomórkowymi) i zaokrąglij w górę do najbliższej liczby całkowitej. W tym przypadku do tego eksperymentu wymagane jest łącznie 135 μl zawiesiny komórek.
    8. Stwórz 2 000 μl dostosowanego roztworu komórkowego, mieszając wcześniej obliczone 135 μl zawiesiny komórek z 1 865 μl pożywki do hodowli komórkowych w oddzielnej probówce wirówkowej o pojemności 15 ml.
  3. Komórki wysiewające
    1. Usuń nadmiar fibronektyny z każdej wkładki po zakończeniu inkubacji fibronektyny.
    2. Umyj wkładki dwukrotnie, dodając do każdej wkładki 100 μl sterylnej wody destylowanej. Usuń wodę zgodnie z tą samą kolejnością, w jakiej została dodana, aby zapewnić stały czas mycia między wkładkami.
    3. Ponownie umyć wkładkę, dodając 100 μl pożywki do hodowli komórkowych do każdej wkładki. Wyjmij nośnik zgodnie z tą samą kolejnością, w jakiej został dodany, aby zapewnić stały czas prania między wkładkami.
    4. Wkładki do próbek komórek
      1. Komórki nasienne przez pipetowanie 200 μl dostosowanego roztworu komórkowego do każdej wkładki. Aby zapewnić stałą konfluencję między wkładkami, wymieszaj roztwór komórkowy w probówce wirówkowej przed rozprowadzeniem i ponownie wymieszaj w każdej wkładce po rozprowadzeniu.
    5. Wkładki kontroli ujemnej
      1. Odpipetować 200 μl pożywki do hodowli komórkowych do każdej wkładki. Aby zachować spójność z wkładkami do próbek komórek, użyj pipety, aby wymieszać pożywkę do hodowli komórkowych w każdej wkładce.
  4. Etykietowanie i inkubacja
    1. Narysuj linię dzielącą drugą płytkę dołka na dwie kolumny o szerokości trzech dołków (w przypadku warunków prowadzonych w trzech dołkach) za pomocą trwałego markera. Podziel każdą kolumnę na wiersze. Oznacz każdy region w siatce odpowiednimi parametrami.
    2. Dodaj 1 ml pożywki do hodowli komórkowych do każdej studzienki, aby otrzymać wkładkę do eksperymentu. Przenieść wkładki z płytki studzienki przygotowawczej do odpowiedniego miejsca na oznakowanej płytce studzienki doświadczalnej i inkubować w temperaturze 37 °C przez co najmniej 12 godzin.

3. Procedura eksperymentalna

  1. Eksperyment z wyświetlaniem
    1. Odpipetować 1,5 ml roztworu PI o stężeniu 0,1 mg/ml do każdego dołka w układzie elektrod. Umieść wkładkę w każdym dołku w układzie elektrod, dopasowując nóżki wkładki do rowków wyrównujących tak, aby wkładka była równo z górną powierzchnią studni (Rysunek 1A,B).
    2. Przykręć górną elektrodę na płytce drukowanej (PCB) do górnej części dołków matrycy elektrod i podłącz matrycę elektrod do urządzenia PSEP.
    3. Umieścić zestaw elektrod w inkubatorze o temperaturze 37 °C na co najmniej 1 godzinę, aby umożliwić wyrównanie temperatury.
    4. Kliknij menu rozwijane obok "Membrana" w lewym górnym rogu graficznego interfejsu użytkownika i kliknij GBO 400 nm. Powtórz ten krok dla "Elektrolitu", "Komórek", "Gęstości wysiewu komórek" i "Czas trwania ogniwa", wybierając odpowiednio DMEM, A431, 200 i 12.
      UWAGA: Wartości te służą wyłącznie do celów archiwizacyjnych i nie mają wpływu na działanie urządzenia. Upewnij się, że dostosowałeś te wartości w razie potrzeby do prawidłowego śledzenia danych.
    5. Wpisz 1 w polu edycji Czas trwania impulsu (min) po prawej stronie GUI, aby zmienić domyślny czas pomiaru po impulsie na 1 min. Pozostaw wszystkie inne ustawienia w stanie domyślnym.
      UWAGA: Domyślne parametry impulsu tworzą przebieg prostokątny o napięciu 30 woltów, 20 Hz, czasie trwania 1 ms i 200 impulsach. Domyślne parametry pomiaru TEEI to 0,5 V i 100 Hz, 1 000 Hz, 10 000 Hz i 100 000 Hz.
    6. Kliknij przycisk Uruchom i wprowadź odpowiednie nazwy dla studni 1-3 i 4-6, gdy zostaniesz o to poproszony. Kliknij OK, aby rozpocząć eksperyment.
    7. Wyjmij matrycę elektrod z inkubatora i przenieś wkładki z powrotem do pierwotnych miejsc w płytce studzienki doświadczalnej po zakończeniu wykonywania programu.
    8. Zmieszać 2 μl Hoechst 33342 i 5 μl kalceiny AM ze 123 μl pożywki do hodowli komórkowych w probówce o pojemności 200 μl.
    9. Delikatnie odpipetować 10 μl roztworu barwienia do każdej wkładki po impulsie i umieścić wkładki z powrotem w inkubatorze na 5 minut.
    10. Przenieś płytkę studzienkową do uchwytu płytki mikroskopu fluorescencyjnego z obiektywem o 5-krotnym powiększeniu. Obraz z wykorzystaniem jasnego pola i fluorescencji każdej plamy. Wyśrodkuj wkładkę nad obiektywem przed wyzwoleniem aparatu.
      UWAGA: Długości fal wzbudzenia dla PI, kalceiny AM i Hoechst 33342 wynoszą odpowiednio 558 nm, 495 nm i 353 nm. Długości fal emisji wynoszą odpowiednio 575 nm, 519 nm i 465 nm.
  2. Eksperyment pomiarowy TEEI
    1. Odpipetować 1,5 ml pożywki do hodowli komórkowych do każdego dołka w układzie elektrod. Umieść wkładki próbki komórek w studzienkach 1-3, a wkładki kontrolne w studzienkach 4-6, dopasowując nóżki wkładki do rowków wyrównujących tak, aby wkładka była równo z górną powierzchnią studzienki.
    2. Przykręć płytkę PCB górnej elektrody do górnej części dołków matrycy elektrod i podłącz matrycę elektrod do urządzenia PSEP.
    3. Umieścić zestaw elektrod w inkubatorze o temperaturze 37 °C na co najmniej 1 godzinę, aby umożliwić wyrównanie temperatury.
    4. Kliknij menu rozwijane obok "Membrana" w lewym górnym rogu graficznego interfejsu użytkownika i kliknij GBO 400 nm. Powtórz ten krok dla "Elektrolitu", "Komórek", "Gęstości wysiewu komórek" i "Czas trwania ogniwa", wybierając odpowiednio DMEM, A431, 200 i 12.
      UWAGA: Wartości te służą wyłącznie do celów archiwizacyjnych i nie mają wpływu na działanie urządzenia. Upewnij się, że dostosowałeś te wartości w razie potrzeby do prawidłowego śledzenia danych.
    5. Pozostaw wszystkie pozostałe ustawienia w stanie domyślnym.
      UWAGA: Domyślne parametry impulsu tworzą przebieg prostokątny o napięciu 30 woltów, 20 Hz, czasie trwania 1 ms i 200 impulsach. Domyślne parametry pomiaru TEEI to 0,5 V i 100 Hz, 1 000 Hz, 10 000 Hz i 100 000 Hz.
    6. Kliknij przycisk Uruchom i wprowadź odpowiednie nazwy dla studni 1-3 i 4-6, gdy zostaniesz o to poproszony. Kliknij OK, aby rozpocząć eksperyment.
    7. Wyjmij matrycę elektrod z inkubatora i przenieś wkładki z powrotem do pierwotnych miejsc w płytce studzienki doświadczalnej po zakończeniu wykonywania programu.
    8. Wymieszać 2 μl Hoechst 33342, 5 μl kalceiny AM i 10 μl PI ze 113 μl pożywki do hodowli komórkowych w probówce reakcyjnej o pojemności 200 μl.
    9. Odpipetować 10 μl roztworu barwienia do każdej wkładki po impulsie i umieścić wkładki z powrotem w inkubatorze na 5 minut.
    10. Przenieś płytkę studzienkową do uchwytu płytki fluorescencyjnego mikroskopu obrazowego z soczewką obiektywową 5x. Obraz z wykorzystaniem jasnego pola i fluorescencji każdej plamy. Wyśrodkuj wkładkę nad obiektywem przed uruchomieniem aparatu.
      UWAGA: Długości fal wzbudzenia dla PI, kalceiny AM i Hoechst 33342 wynoszą odpowiednio 558 nm, 495 nm i 353 nm. Długości fal emisji wynoszą odpowiednio 575 nm, 519 nm i 465 nm.

4. Analiza danych

  1. Analizowanie danych obrazu za pomocą potoku CellProfiler
    1. Użyj niestandardowego przepływu pracy CellProfiler dostępnego w witrynie GitHub:https://github.com/YangLabUNL/PSEP-TEEI, aby przetworzyć obrazy eksperymentu dostarczania i pomiaru TEEI.
  2. Analiza TEEI
    1. Kliknij zakładkę Analiza w graficznym interfejsie użytkownika.
    2. Przełącz wskaźnik typu impedancji na TEEI u dołu graficznego interfejsu użytkownika.
    3. Kliknij strzałkę w lewym górnym polu, aby wyświetlić wszystkie nazwy eksperymentów w pliku danych. Wybierz wszystkie dane próbki komórki z eksperymentu pomiarowego TEEI.
    4. Kliknij strzałkę w następnym polu po prawej stronie, aby wyświetlić wszystkie nazwy eksperymentów w pliku danych. Wybierz wszystkie dane wkładki kontrolnej z pomiaru TEEI.
    5. Kliknij Uruchom. Pojawi się podstawowa figura zawierająca wybrane dane próbki komórki przy najniższej częstotliwości pomiaru.
    6. W polu opcji próbki po prawej stronie graficznego interfejsu użytkownika kliknij strzałkę, aby wyświetlić wszystkie wybrane dane wstawiania. Wartości odstające można usunąć, wybierając odpowiednie dane i klikając Usuń poniżej.
      UWAGA: Wszystkie dane, które zostały usunięte z analizy przez ostatnie kliknięcie przycisku Usuń, można odzyskać za pomocą przycisku Cofnij.
    7. Kliknij Gotowe, aby przejść do następnego rysunku, gdy żądane dane zostaną pokazane na rysunku.
    8. Powtórzyć kroki 4.2.6 i 4.2.7 dla pozostałych danych próbki komórki i danych kontrolnych. Gdy ostateczny zestaw danych zostanie potwierdzony przez kliknięcie przycisku "Gotowe", pojawi się pełna liczba analiz.
    9. Zapisz figurę analizy.

Wyniki

Przedstawiony protokół ustanawia metodę wykorzystania pomiarów TEEI do badania procesów pośrednich elektroporacji oraz formułowania przewidywań dotyczących dostarczania, konkretnie dla linii komórkowej A431 i ładunku PI. Chociaż modyfikacje tego protokołu są omówione w dalszej części artykułu, należy teraz zaznaczyć, że mimo możliwości zmiany konkretnych wartości, ogólne trendy odpowiedzi pozostają spójne. Na przykład dane TEEI spadające poniżej początkowej linii bazowej odpowiadają śmierci komórek, natomiast maksymalny wzrost wartości TEEI powyżej minimum odpowiada wydajności dostarczania13. Te ogólne trendy i ich implikacje zostaną omówione poniżej.

Jak pokazano na Rysunku 2A, podczas korzystania z platformy PSEP mogą wystąpić różne trendy pomiarów TEEI i obrazowania komórek. Idealnym wynikiem niniejszego protokołu jest uzyskanie krzywej podobnej do zoptymalizowanych danych dla komórek zdrowych przedstawionych na Rysunku 2Ai. Jest to uznawane za wynik optymalny, ponieważ nie występuje spadek poniżej linii bazowej, co wskazuje na znikomy lub całkowity brak śmierci komórek. Dodatkowo zoptymalizowana krzywa dla komórek zdrowych wykazuje największy wzrost TEEI od wartości minimalnej, co świadczy o wysokiej wydajności dostarczania13. Wnioski te są potwierdzone obrazowaniem monowarstwy komórek po zastosowaniu PSEP, które wykazuje pomijalną śmierć komórek oraz zdrową, w pełni konfluentną monowarstwę komórkową (Rysunek 2Aiii). Co więcej, udany eksperyment dostarczania z użyciem identycznych kształtów fal PSEP można scharakteryzować za pomocą obrazów przedstawionych na Rysunku 2B. Prawidłowe zastosowanie kształtu fali elektroporacji oraz odpowiednie stężenie ładunku skutkują wysokim stopniem spójności dostarczania i żywotności komórek.

Stan zdrowia i stopień konfluencji monowarstwy komórek są kluczowe dla poprawnego zastosowania przewidywań dostarczania substancji opartych na TEEI16,17. Nawet przy zoptymalizowanym przebiegu sygnału, niezdrowa lub niepełna monowarstwa komórek prowadzi do osłabionej odpowiedzi TEEI, co zilustrowano na zoptymalizowanych danych dla komórek niezdrowych na Rysunku 2Aii. Należy jednak zauważyć, że obrazy dla tego wyniku (Rysunek 2Avi) nadal odpowiadają interpretacji odpowiedzi TEEI przedstawionej przez Brooksa i współpracowników13. Brak spadku poniżej linii bazowej wskazuje na niemal zerową śmiertelność komórek (Rysunek 2C,D). Ponadto zmniejszony wzrost względem wartości minimalnej odpowiada negatywnemu wpływowi na wydajność dostarczania, ponieważ mniejsza liczba komórek w monowarstwie ogranicza całkowite dostarczanie PI (Rysunek 2C,D).

W przypadku zastosowania niezoptymalizowanego przebiegu fali możliwe jest zaobserwowanie jeszcze bardziej znaczących spadków odpowiedzi TEEI. W zależności od całkowitej energii oraz czasu jej przyłożenia, niezoptymalizowane przebiegi fal mogą dawać wyniki wahające się od zmniejszonej wydajności po niemal całkowitą anihilację monowarstwy komórkowej (Rysunek 2Ai,iii,v). Zarówno krzywe niezoptymalizowane, jak i bardzo niezoptymalizowane wykazują znaczny spadek w stosunku do wartości bazowej, co wskazuje na istotną śmierć komórek. Jednakże coraz bardziej niezoptymalizowane przebiegi fal utrudniają regenerację komórek, co skutkuje obniżoną wydajnością dostarczania.

Wydajność dostarczenia obliczono, dzieląc liczbę komórek znakowanych zarówno PI, jak i calceiną w obrazach z eksperymentów dostarczania przez całkowitą liczbę komórek zidentyfikowanych za pomocą Hoechst. Śmiertelność obliczono, dzieląc liczbę komórek znakowanych PI w eksperymentach pomiaru TEEI przez całkowitą liczbę komórek zidentyfikowanych za pomocą Hoechst. Liczbę komórek dla obu parametrów określono przy użyciu niestandardowego potoku analizy CellProfiler.

Wykresy TEEI w funkcji czasu i napięcia wraz z obrazami z mikroskopii fluorescencyjnej; analiza stanu zdrowia komórek.
Rycina 2: Krzywe odpowiedzi TEEI i obrazowanie dla typowych warunków. (A) (i) Dane odpowiedzi TEEI ilustrujące procentową zmianę TEEI dla warunków zoptymalizowanych i niezoptymalizowanych. (ii) Porównanie odpowiedzi TEEI pomiędzy zdrowymi a niezdrowymi monowarstwami w zoptymalizowanych warunkach kształtu fali. (iii-v) Reprezentatywne obrazy potencjalnych wyników dla zoptymalizowanych i niezoptymalizowanych warunków kształtu fali, wykazujące śmierć komórek (czerwony) i żywe komórki (zielony). (vi) Reprezentatywne obrazowanie niezdrowej monowarstwy po zastosowaniu zoptymalizowanych warunków kształtu fali, wykazujące śmierć komórek (czerwony) i żywe komórki (zielony). (B) Obrazy wykazujące pomyślne dostarczenie PI (czerwony), żywe komórki (zielony) oraz lokalizację jąder (niebieski). Wszystkie obrazy zostały rozjaśnione dla przejrzystości. Paski skali: 1000 µm. (C) Spadek TEEI od poziomu bazowego przed PSEP do minimum po PSEP oraz wzrost od minimum po PSEP do szczytu po PSEP dla podanych napięć. (D) Procenty efektywności dostarczania i śmierci komórek dla podanych napięć. Słupki błędów reprezentują SEM (n = 6). (C,D) powielone z Brooks et al.13 za zgodą autorów. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Dyskusja

Rysunek 2C pokazuje, że TEEI wzrasta od minimum i maleje od linii bazowej dla każdego napięcia falowego PSEP. Wzrost TEEI tworzy łuk paraboliczny, osiągając szczyt około 20 woltów przed redukcją, podczas gdy spadek TEEI od wartości wyjściowej rośnie wykładniczo wraz ze wzrostem napięcia. Wydajność dostarczania i procenty śmierci na rysunku 2D odzwierciedlają te trendy, przy czym wydajność dostarczania rośnie parabolicznie, osiągając szczyt około 30 woltów, a śmierć rośnie wykładniczo wraz ze wzrostem napięcia falowego.

Jedną z hipotez dotyczących mechanizmu leżącego u podstaw wzrostu TEEI jest elektroosmoza za pośrednictwem ujemnie naładowanych mikrokanałów substratu, zjawisko spowodowane przyłożeniem pola elektrycznego18,19. Niezależnie od tego, czy odpowiedź TEEI jest spowodowana bodźcem mechanicznym wynikającym z pęcznienia komórki spowodowanego przepływem płynu elektroosmotycznego, czynnikiem, o którym wiadomo, że występuje w przypadku elektroporacji20, czy też bodźcem elektrycznym samego kształtu fali, jasne jest, że zdrowie i kompletność monowarstwy ma kluczowe znaczenie dla osiągnięcia odpowiedniego spadku napięcia na błonie komórkowej wymaganego do elektroporacji. Z tego powodu najbardziej krytycznymi krokami w tej metodzie są te dotyczące wysiewu komórek i zapewnienia prawidłowego tworzenia monowarstwy komórek. Można to potwierdzić poprzez obrazowanie monowarstwy komórki i wyjściową wartość TEEI. W przypadku komórek A431 średni TEEI wynosi około 7 Ω·cm², podczas gdy HEK293T komórek średnio 5 Ω·cm² (ryc. 2Aii), prawdopodobnie z powodu różnic morfologicznych powodujących różnice w obszarze połączenia komórka-komórka.

Ze względu na pole elektryczne wymagane do elektroporacji porowatego podłoża nastąpi elektroliza, powodująca korozję elektrod12,21. Było to szczególnie widoczne w przypadku dolnej elektrody, ponieważ w tym eksperymencie została ona naładowana dodatnio, aby dostarczyć dodatnio naładowane PI. Poprzez eksperymenty ustalono, że dolna płytka drukowana może być użyta około 20 razy, zanim znaczące negatywne skutki będą wymagały wymiany13. Aby oczyścić matrycę elektrod do ponownego użycia, usuń pozostałą hodowlę komórkową lub pożywkę transfekcyjną z komór za pomocą aspiratora. Napełnij każdą komorę w trzech czwartych 70% etanolem i umieść płytkę PCB górnej elektrody na tablicy elektrod, tak aby górne elektrody były zanurzone. Pozostaw etanol w układzie elektrod na co najmniej 10 minut przed wyjęciem etanolu i odłożeniem zestawu elektrod do wyschnięcia.

Możliwe jest ponowne wykorzystanie zakupionych wkładów poprzez usunięcie substratów, wysterylizowanie wkładu oraz wymianę podłoża na substrat pobrany z innego źródła. Wkładki 6-dołkowe o tej samej gęstości porów i średnicy są dostępne na rynku i mogą być używane do zbierania czterech 24-dołkowych substratów zastępczych o wielkości wkładki. Po wysterylizowaniu poprzednio używanych wkładek dodaj 10 μl żywicy epoksydowej utwardzanej światłem ultrafioletowym do świeżej szalki Petriego. Zanurz wkładkę od strony podłoża w kałuży żywicy epoksydowej, aby pokryć dolną powierzchnię, i ostrożnie umieść nowe podłoże nad otworem we wkładce. Sprawdź wzrokowo, czy żywica epoksydowa tworzy pełny pierścień, aby upewnić się, że nie ma żadnych przerw w połączeniu. Utwardzaj w świetle UV przez 30 sekund i przechowuj odnowione wkłady w czystej 24-dołkowej płytce, aby uniknąć uszkodzenia nowych podłoży przed ponownym użyciem.

Jak wspomniano wcześniej, chociaż przypuszcza się, że obserwowany wzrost TEEI wystąpi w wielu typach komórek, wykazano to tylko w przypadku linii komórkowych A431 i HEK293T13 (Figura 1C), z których obie są komórkami przylegającymi. Metodę można modyfikować poprzez selekcję różnych linii komórkowych, wybór błon o różnej charakterystyce porów, zastąpienie powłoki fibronektyny innym białkiem macierzy zewnątrzkomórkowej poprzez dostosowanie stężenia lub zmianę ładunku. Jeśli jednak zostaną wprowadzone jakiekolwiek zmiany w konfiguracji eksperymentu, może być konieczna ponowna optymalizacja przebiegu. Aby zoptymalizować przebieg, można przeprowadzić eksperyment pomiarowy TEEI, w którym tylko jeden parametr przebiegu, taki jak napięcie, jest zmieniany między każdą grupą trzech próbek. Wybierz optymalne napięcie, identyfikując największy wzrost TEEI w co najmniej dziewięciu zdrowych próbkach. Powtórz ten proces dla każdego parametru przebiegu, używając nowo zoptymalizowanych wartości podczas przechodzenia do następnego. Pamiętaj, że może istnieć wiele lokalnych optimów dla parametrów przebiegu (tj. optymalne napięcie dla jednego czasu trwania impulsu może nie być optymalnym napięciem dla czasu trwania innego impulsu i tak dalej).

Korzyści płynące z elektroporacji podłoża porowatego są szerokie. Podczas gdy inne metody dostarczania wewnątrzkomórkowego istnieją od dłuższego czasu, niewiele z nich łączy wysoką przepustowość z wysokim stopniem kontroli, który posiada PSEP 1,13. Ponadto wykorzystanie przez platformę pomiarów TEEI zapewnia wgląd w pośrednie etapy procesu elektroporacji. Odczyty TEEI informują o stanie ogniw, kierują doborem parametrów elektroporacji i umożliwiają dalszy wgląd w określone zachowania i mechanizmy ogniw13,17. Dzięki pomiarom TEEI platforma jest również zdolna do dostarczania bez etykiet13, co pozwala na szybką optymalizację przy zmniejszonym zapotrzebowaniu na drogie biomarkery i odczynniki za każdym razem, gdy przeprowadzany jest eksperyment. Ten wkład w obszar dostarczania wewnątrzkomórkowego sprawia, że jest to główny kandydat jako platforma dostarczania dla podstawowych badań biologicznych i zastosowań biomedycznych.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Podziękowania

Dziękujemy za wsparcie finansowe od NSF (Awards 1826135, 1936065, 2143997), NIH National Institutes of General Medical Sciences P20GM113126 (Nebraska Center for Integrated Biomolecular Communication) i P30GM127200 (Nebraska Center for Nanomedicine), Nebraska Collaborative Initiative oraz Voelte-Keegan Bioengineering Support. Urządzenie zostało wyprodukowane w NanoEngineering Research Core Facility (NERCF), który jest częściowo finansowany przez Nebraska Research Initiative.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
15 ml stożkowa probówka wirówkowaThermo Scientific339651
2-chipowy jednorazowy hemocytometrBulldog BioDHC-N01
75 cm2 Kolba do kultur tkankowychfisherbrandFB012937
A431 KomórkiATCCCRL-1555
Calcein AMInvitrogenC3099
Szafa bezpieczeństwa biologicznego klasy II typu A2LabgardNU-543-600
Komponenty niestandardoweJednorazowa
https://github.com/YangLabUNL/PSEP-TEEI (50 ml)fisherbrand05-539-6
DMEMGibco11965092
płodowej surowicy bydlęcejGibcoA5670401
vacuubrand20727403
HERACELL 240iThermo Scientific51026331
Hoechst 33342Thermo Scientific62249
Fibronektyna z ludzkiego osoczaSigma-AldrichFIBRP-RO
Odwrócony mikroskop fluorescencyjnyZeiss491916-0001-000
Mikroskop odwróconyLabomedTCM 400
PBScytivaSH30256,02
Probówka PCR 200 &mikro; LSarstedt72.737
Penicylina / StreptomycynaGibco15140148
Pipeta (0,2-2 &mikro; L)pipeta FBE00002
(100-1000 &mikro; L)Pipeta FBE01000
(20-200 &mikro; L)fisherbrand EliteFBE00200
Pipeta (2-20 &mikro; L)fisherbrand EliteFBE00020
Probidium JodekInvitrogenP1304MP
Probówka reakcyjna 1,5 mlSarstedt72.690.300
Wirówka Sorvall ST 16RThermo Scientific 75004240
Thincert (24-well)Greiner Bio-One662 6410,4 &mikro; m średnica porów, 2x106 cm-2 gęstość porów, przezroczysta
płytka do hodowli tkankowej PET (24-dołkowa)fisherbrandFB012929
Roztwór błękitu trypanowegoSigma-AldrichT8154-20mL
TrypsynaGibco15090046
probówka wirówkowa YangLab System aspiracji płynów fisherbrand Elitefisherbrand Elite

Bibliografia

  1. Brooks, J., et al. High throughput and highly controllable methods for in vitro intracellular delivery. Small. 16 (51), e2004917(2020).
  2. Stewart, M. P., Langer, R., Jensen, K. F. Intracellular delivery by membrane disruption: Mechanisms, strategies, and concepts. Chem Rev. 118 (16), 7409-7531 (2018).
  3. Canatella, P. J., Karr, J. F., Petros, J. A., Prausnitz, M. R. Quantitative study of electroporation-mediated molecular uptake and cell viability. Biophys J. 80 (2), 755-764 (2001).
  4. Pliquett, U., Gift, E. A., Weaver, J. C. Determination of the electric field and anomalous heating caused by exponential pulses with aluminum electrodes in electroporation experiments. Bioelectrochem Bioenerg. 39 (1), 39-53 (1996).
  5. Pan, J., et al. Cell membrane damage and cargo delivery in nano-electroporation. Nanoscale. 15 (8), 4080-4089 (2023).
  6. Boukany, P. E., et al. Nanochannel electroporation delivers precise amounts of biomolecules into living cells. Nat Nanotechnol. 6 (11), 747-754 (2011).
  7. Chang, L., et al. Micro-/nanoscale electroporation. Lab Chip. 16 (21), 4047-4062 (2016).
  8. Patino, C. A., et al. Multiplexed high-throughput localized electroporation workflow with deep learning-based analysis for cell engineering. Sci Adv. 8 (29), 7637(2022).
  9. Sagvolden, G., Giaever, I., Pettersen, E. O., Feder, J. Cell adhesion force microscopy. Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (2), 471-476 (1999).
  10. Ishibashi, T., Takoh, K., Kaji, H., Abe, T., Nishizawa, M. A porous membrane-based culture substrate for localized in situ electroporation of adherent mammalian cells. Sensors Actuators B: Chem. 128 (1), 5-11 (2007).
  11. Mukherjee, P., Nathamgari, S. S. P., Kessler, J. A., Espinosa, H. D. Combined numerical and experimental investigation of localized electroporation-based cell transfection and sampling. ACS Nano. 12 (12), 12118-12128 (2018).
  12. Brooks, J. R., et al. An equivalent circuit model for localized electroporation on porous substrates. Biosens Bioelectron. 199, 113862(2022).
  13. Brooks, J. R., et al. Transepithelial electrical impedance increase following porous substrate electroporation enables label-free delivery. Small. 20 (25), 2310221(2023).
  14. Vindiš, T., et al. Gene electrotransfer into mammalian cells using commercial cell culture inserts with porous substrate. Pharmaceutics. 14 (9), 1959(2022).
  15. Ye, Y., et al. Single-cell electroporation with real-time impedance assessment using a constriction microchannel. Micromachines. 11 (9), 856(2020).
  16. Bednarek, R. In vitro methods for measuring the permeability of cell monolayers. Methods Protoc. 5 (1), 17(2022).
  17. Harhaj, N. S., Antonetti, D. A. Regulation of tight junctions and loss of barrier function in pathophysiology. Int J Biochem Cell Biol. 36 (7), 1206-1237 (2004).
  18. Hunter, R. J. Zeta potential in colloid science: Principles and applications. 2, Academic Press. (2013).
  19. Wong, P. K., Wang, T. -H., Deval, J. H., Ho, C. -M. Electrokinetics in microdevices for biotechnology applications. IEEE/ASME Trans Mechatron. 9 (2), 366-376 (2004).
  20. Qian, K., Wang, Y., Lei, Y., Yang, Q., Yao, C. An experimental and theoretical study on cell swelling for osmotic imbalance induced by electroporation. Bioelectrochemistry. 157, 108637(2024).
  21. Fox, M. B., et al. Electroporation of cells in microfluidic devices: A review. Anal Bioanal Chem. 385 (3), 474-485 (2006).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Elektroporacja na podłożu porowatymmonitorowanie elektroporacjimikroskopia fluorescencyjnamonowarstwa komórkowawydajność dostarczaniażywotność komórekparametry kształtu impulsumacierz elektrodinserty do hodowli komórkowych
Elektroporacja na bazie porowatego podłoża z monitorowaniem transepitelalnej impedancji elektrycznej
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.