Artykuł metodologiczny

Elektroporacja na bazie porowatego podłoża z monitorowaniem transepitelalnej impedancji elektrycznej

DOI:

10.3791/66971

⸱

27 września 2024

 ,  ,  , 
1Department of Mechanical and Materials Engineering, University of Nebraska-Lincoln, 2Department of Biomedical Engineering, Michigan State University, 3Institute for Quantitative Health Science and Engineering (IQ), Michigan State University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Elektroporacja porowatego podłoża (PSEP) łączy spójne, wysokowydajne dostarczanie z wysoką żywotnością ogniw. Wprowadzenie pomiarów transnabłonkowej impedancji elektrycznej (TEEI) zapewnia wgląd w pośrednie procesy PSEP i pozwala na dostarczanie bez etykietowania. W tym artykule omówiono metodę jednoczesnego przeprowadzania eksperymentów z dostarczaniem PSEP i analizy pomiarów TEEI.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Elektroporacja porowatego podłoża (PSEP) to nowa metoda elektroporacji, która zapewnia wysoką przepustowość i stałe dostarczanie. Podobnie jak wiele innych rodzajów dostarczania wewnątrzkomórkowego, PSEP w dużej mierze opiera się na markerach fluorescencyjnych i mikroskopii fluorescencyjnej w celu określenia pomyślnego dostarczenia. Aby uzyskać wgląd w pośrednie etapy procesu elektroporacji, opracowano platformę PSEP ze zintegrowanym monitorowaniem transepitelialnej impedancji elektrycznej (TEEI). Komórki są hodowane w dostępnych na rynku wkładkach z porowatymi błonami. Po 12-godzinnym okresie inkubacji, aby umożliwić wytworzenie w pełni zlewającej się monowarstwy komórek, wkładki umieszcza się w pożywkach transfekcyjnych znajdujących się w dołkach urządzenia PSEP. Monowarstwy komórek są następnie poddawane zdefiniowanemu przez użytkownika kształtowi fali, a wydajność dostarczania jest potwierdzana za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Ten przepływ pracy można znacznie usprawnić dzięki pomiarom TEEI między mikroskopią pulsacyjną a fluorescencyjną w celu zebrania dodatkowych danych na temat procesu PSEP, a te dodatkowe dane TEEI są skorelowane ze wskaźnikami dostarczania, takimi jak wydajność dostarczania i opłacalność. W tym artykule opisano protokół wykonywania pomiarów PSEP z TEEI.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Elektroporacja to technika, w której komórki są wystawione na działanie pola elektrycznego, tworząc tymczasowe pory w błonie komórkowej, przez które mogą przechodzić ładunki, w tym białka, RNA i DNA1,2. Najczęściej stosowaną wersją jest elektroporacja masowa (BEP). BEP jest wykonywany poprzez napełnienie kuwety elektrolitem zawierającym miliony komórek, wystawienie elektrolitu na działanie wysokiego napięcia i umożliwienie przedostania się ładunku do komórek poprzez dyfuzję lub endocytozę1. BEP ma wiele zalet, w tym wysoką przepustowość i liczne dostępne na rynku systemy. Istnieją jednak ograniczenia w dostarczaniu BEP. Niespójne ustawienie ogniw względem elektrod i ekranowanie pola elektrycznego od sąsiednich ogniw powoduje znaczną zmienność ekspozycji na pole elektryczne podczas BEP3,4. Wysokie napięcie wymagane dla BEP ma również znaczący negatywny wpływ na żywotność ogniwa5. Od momentu powstania w 2011 roku6, rośnie zainteresowanie metodą elektroporacji zwanej elektroporacją podłoża porowatego (PSEP), choć czasami określa się ją innymi nazwami, w tym elektroporacją miejscową oraz nano- lub mikroelektroporacją1,7,8. W przeciwieństwie do zawiesiny komórkowej BEP, PSEP przeprowadza się na komórkach, które przylegają do porowatego podłoża. Nie tylko stan przylegania jest preferowany dla większości ludzkich linii komórkowych9, ale pory w podłożu koncentrują się również na prądzie elektrycznym, lokalizując transbłonowy potencjał elektryczny (TMP) w określonych regionach błony komórkowej10,11. Ta lokalizacja pozwala na znaczne zmniejszenie przyłożonego napięcia, zmniejszenie uszkodzeń i zwiększenie żywotności ogniwa. Ta kombinacja efektów pomaga kontrolować rozwój porów błony komórkowej, co skutkuje bardziej spójnym i wydajnym dostarczaniem1,5,12.

Niedawne badanie wprowadziło urządzenie PSEP z sześciodołkowym, pozłacanym układem elektrod do przechowywania dostępnych na rynku porowatych wkładek membranowych13 (Rysunek 1A,B), praktyka, która została po raz pierwszy wprowadzona przez Vindis et al.14. Urządzenie może aplikować impulsy i mierzyć impedancję elektryczną na monowarstwie ogniwa, znaną jako transepitelialna impedancja elektryczna (TEEI), w czasie rzeczywistym13. Interfejs użytkownika urządzenia pozwala na pełną kontrolę nad kształtem fali elektroporacji i polaryzacją. Co ważne, pomiary impedancji w czasie rzeczywistym mogą być wykorzystywane do przewidywania wyników dostarczania bez konieczności stosowania drogich odczynników lub markerów fluorescencyjnych, koncepcja znana jako dostarczanie bez etykiety15.

Platforma PSEP składa się z dwóch głównych niestandardowych komponentów elektrycznych: głównego korpusu urządzenia, w którym znajduje się generator impulsów i sprzęt pomiarowy TEEI, oraz układu elektrod, gdzie wprowadzane są porowate podłoża i następuje elektroporacja. Schematy dla wszystkich niestandardowych elementów elektronicznych i komponentów drukowanych w 3D można znaleźć na GitHub: https://github.com/YangLabUNL/PSEP-TEEI. Oprócz niestandardowej elektroniki, do prawidłowego działania platformy wymagany jest również komputer. Niestandardowe oprogramowanie wymaga do działania programu MATLAB (wersja 2021a lub nowsza) oraz programu Microsoft Excel do przechowywania i uzyskiwania dostępu do danych do analizy. Program steruje niestandardową elektroniką i zapewnia graficzny interfejs użytkownika (GUI) do regulacji ustawień. Programy te zostały również udostępnione na GitHub: https://github.com/YangLabUNL/PSEP-TEEI.

Wstępne dane sugerują, że ten proces jest możliwy dla różnych typów komórek przylegających (Rysunek 1C), ale ten artykuł będzie omawiał tylko przygotowanie komórek A431 przy użyciu parametrów, które zostały uznane za optymalne dla tej linii komórkowej przez Brooks et al.13. Dodatkowo, ponieważ ładunek jodku propidyny (PI) jest cytotoksyczny, przeprowadza się dwa eksperymenty, pierwszy z pożywką do transfekcji PI o wysokim stężeniu w celu ilościowego określenia wydajności dostarczania, a drugi z samą pożywką do hodowli komórkowych w celu pomiaru TEEI w dłuższych skalach czasowych. W eksperymentach tych wykorzystuje się identyczne przebiegi elektroporacji, co pozwala na skorelowanie wyników (Rysunek 1D).

figure-introduction-1
Rysunek 1: Schemat montażu matrycy elektrod i podstawowe dane. (A) Model CAD wkładki wewnątrz studzienki układu elektrod. (B) Model CAD układu elektrod. (C) Wzrost impedancji spowodowany PSEP dla wybranych linii komórkowych, n = 3 na linię komórkową. Pasek błędu: błąd standardowy średniej. (D) Efektywność dostaw vs. TEEI zwiększa dane dotyczące korelacji. Wydajność dostarczania obliczono, dzieląc liczbę komórek znakowanych zarówno na obrazach PI, jak i kalceiny z eksperymentów dostarczania przez całkowitą liczbę komórek zidentyfikowanych za pomocą Hoechst. Liczba ogniw została określona przy użyciu niestandardowego potoku CellProfiler, n = 6 na napięcie. Pasek błędu: (oś x i y) błąd standardowy średniej. Ten rysunek jest reprodukowany z Brooks et al.13 za zgodą. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Szczegóły dotyczące odczynników i sprzętu użytego w badaniu są wymienione w Tabeli Materiałów.

1. Przygotowanie odczynników i hodowla komórkowa

  1. Przygotować pożywkę do hodowli komórkowych, dodając 50 ml płodowej surowicy bydlęcej (FBS) i 5 ml penicyliny-streptomycyny do 500 ml pojemnika ze zmodyfikowanym podłożem Eagle (DMEM) firmy Dulbecco. Wyprodukować jedenaście podwielokrotności po 50 ml w celu zmniejszenia ryzyka zanieczyszczenia i przechowywać w lodówce w temperaturze 4 °C.
  2. Utworzyć 1 ml fibronektyny w ludzkim osoczu o stężeniu 25 μg/ml w roztworze podstawowym soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) zgodnie z instrukcjami producenta.
  3. Stworzyć 15 ml 0,1 mg/ml jodku propidyny w roztworze podstawowym DMEM, aby umożliwić eksperymenty z różnymi stężeniami ładunku.
  4. Hodować komórki A431 w kolbie T75 zawierającej 12 ml przygotowanej pożywki do hodowli komórkowych. Komórki pasażowano co 1-2 dni, aby utrzymać 50% konfluencję.

2. Przygotowanie próbki

  1. Powłoka fibronektyny
    1. Wybierz dwanaście wkładek i dwie płytki 24-dołkowe. Umieść wkładki w jednej płytce dołkowej, tworząc dwa rzędy po sześć. Odłóż drugą płytkę dołka na później.
    2. Stwórz 1,300 μl 1 μg/ml roztworu fibronektyny, mieszając 52 μl roztworu podstawowego fibronektyny i 1,248 μl PBS w probówce o pojemności 1,5 ml.
    3. Rozprowadzić 100 μl roztworu fibronektyny do każdej wkładki. Inkubować wkładki w płytce studzienkowej w temperaturze 37 °C przez 3 godziny.
  2. Regulacja stężenia komórek w celu uzyskania optymalnej gęstości komórek
    1. Około 1 godzinę przed zakończeniem inkubacji fibronektyny należy wyjąć kolbę T75 z komórkami A431 z inkubatora w celu ekstrakcji komórek.
    2. Wyjąć pożywkę z kolby za pomocą aspiratora i przemyć 5 ml PBS. Usuń PBS w ten sam sposób i dodaj 3 ml trypsyny. Inkubować przez 3-4 minuty przed stukaniem w bok kolby w celu całkowitego odłączenia komórek.
    3. Dodać 6 ml pożywki do hodowli komórkowych do kolby, energicznie mieszając pipetą w celu odłączenia pozostałych komórek, a następnie przenieść zawartość do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml. Wirować przy 100 x g i temperaturze 20 °C przez 5 min.
    4. Usuń pożywkę do hodowli komórkowych i trypsynę z probówki wirówkowej za pomocą aspiratora, uważając, aby nie naruszyć osadu komórkowego. Dodać 1 ml pożywki do probówki wirówkowej i pipetować tam iz powrotem (bez wytwarzania pęcherzyków), aby rozbić osad komórkowy i ponownie zawiesić komórki.
    5. Odpipetować 10 μl zawiesiny komórek, 40 μl pożywki do hodowli komórkowych i 50 μl barwnika błękitu trypanowego do probówki o pojemności 200 μl, używając pipety do dokładnego wymieszania.
    6. Usunąć 10 μl mieszaniny barwników i wstrzyknąć ją do hemocytometru. Policzyć komórki, stosując 10% rozcieńczenie mieszaniny barwników, aby oszacować całkowitą liczbę komórek w probówce wirówkowej o pojemności 15 ml.
      UWAGA: W przypadku tego protokołu przyjmij stężenie 5 000 000 komórek/ml.
    7. Pomnóż żądaną gęstość wysiewu przez powierzchnię membrany wkładki, podziel przez zliczone komórki/ml w zawiesinie i pomnóż przez 1,000, aby obliczyć wymagane mikrolitry zawiesiny komórek na wkładkę.
      1. Aby znaleźć całkowitą wymaganą ilość zawiesiny komórek, pomnóż tę liczbę przez 10 (aby zapewnić wystarczającą ilość komórek na 9 próbek, ponieważ 3 z 12 wstawek będą kontrolami bezkomórkowymi) i zaokrąglij w górę do najbliższej liczby całkowitej. W tym przypadku do tego eksperymentu wymagane jest łącznie 135 μl zawiesiny komórek.
    8. Stwórz 2 000 μl dostosowanego roztworu komórkowego, mieszając wcześniej obliczone 135 μl zawiesiny komórek z 1 865 μl pożywki do hodowli komórkowych w oddzielnej probówce wirówkowej o pojemności 15 ml.
  3. Komórki wysiewające
    1. Usuń nadmiar fibronektyny z każdej wkładki po zakończeniu inkubacji fibronektyny.
    2. Umyj wkładki dwukrotnie, dodając do każdej wkładki 100 μl sterylnej wody destylowanej. Usuń wodę zgodnie z tą samą kolejnością, w jakiej została dodana, aby zapewnić stały czas mycia między wkładkami.
    3. Ponownie umyć wkładkę, dodając 100 μl pożywki do hodowli komórkowych do każdej wkładki. Wyjmij nośnik zgodnie z tą samą kolejnością, w jakiej został dodany, aby zapewnić stały czas prania między wkładkami.
    4. Wkładki do próbek komórek
      1. Komórki nasienne przez pipetowanie 200 μl dostosowanego roztworu komórkowego do każdej wkładki. Aby zapewnić stałą konfluencję między wkładkami, wymieszaj roztwór komórkowy w probówce wirówkowej przed rozprowadzeniem i ponownie wymieszaj w każdej wkładce po rozprowadzeniu.
    5. Wkładki kontroli ujemnej
      1. Odpipetować 200 μl pożywki do hodowli komórkowych do każdej wkładki. Aby zachować spójność z wkładkami do próbek komórek, użyj pipety, aby wymieszać pożywkę do hodowli komórkowych w każdej wkładce.
  4. Etykietowanie i inkubacja
    1. Narysuj linię dzielącą drugą płytkę dołka na dwie kolumny o szerokości trzech dołków (w przypadku warunków prowadzonych w trzech dołkach) za pomocą trwałego markera. Podziel każdą kolumnę na wiersze. Oznacz każdy region w siatce odpowiednimi parametrami.
    2. Dodaj 1 ml pożywki do hodowli komórkowych do każdej studzienki, aby otrzymać wkładkę do eksperymentu. Przenieść wkładki z płytki studzienki przygotowawczej do odpowiedniego miejsca na oznakowanej płytce studzienki doświadczalnej i inkubować w temperaturze 37 °C przez co najmniej 12 godzin.

3. Procedura eksperymentalna

  1. Eksperyment z wyświetlaniem
    1. Odpipetować 1,5 ml roztworu PI o stężeniu 0,1 mg/ml do każdego dołka w układzie elektrod. Umieść wkładkę w każdym dołku w układzie elektrod, dopasowując nóżki wkładki do rowków wyrównujących tak, aby wkładka była równo z górną powierzchnią studni (Rysunek 1A,B).
    2. Przykręć górną elektrodę na płytce drukowanej (PCB) do górnej części dołków matrycy elektrod i podłącz matrycę elektrod do urządzenia PSEP.
    3. Umieścić zestaw elektrod w inkubatorze o temperaturze 37 °C na co najmniej 1 godzinę, aby umożliwić wyrównanie temperatury.
    4. Kliknij menu rozwijane obok "Membrana" w lewym górnym rogu graficznego interfejsu użytkownika i kliknij GBO 400 nm. Powtórz ten krok dla "Elektrolitu", "Komórek", "Gęstości wysiewu komórek" i "Czas trwania ogniwa", wybierając odpowiednio DMEM, A431, 200 i 12.
      UWAGA: Wartości te służą wyłącznie do celów archiwizacyjnych i nie mają wpływu na działanie urządzenia. Upewnij się, że dostosowałeś te wartości w razie potrzeby do prawidłowego śledzenia danych.
    5. Wpisz 1 w polu edycji Czas trwania impulsu (min) po prawej stronie GUI, aby zmienić domyślny czas pomiaru po impulsie na 1 min. Pozostaw wszystkie inne ustawienia w stanie domyślnym.
      UWAGA: Domyślne parametry impulsu tworzą przebieg prostokątny o napięciu 30 woltów, 20 Hz, czasie trwania 1 ms i 200 impulsach. Domyślne parametry pomiaru TEEI to 0,5 V i 100 Hz, 1 000 Hz, 10 000 Hz i 100 000 Hz.
    6. Kliknij przycisk Uruchom i wprowadź odpowiednie nazwy dla studni 1-3 i 4-6, gdy zostaniesz o to poproszony. Kliknij OK, aby rozpocząć eksperyment.
    7. Wyjmij matrycę elektrod z inkubatora i przenieś wkładki z powrotem do pierwotnych miejsc w płytce studzienki doświadczalnej po zakończeniu wykonywania programu.
    8. Zmieszać 2 μl Hoechst 33342 i 5 μl kalceiny AM ze 123 μl pożywki do hodowli komórkowych w probówce o pojemności 200 μl.
    9. Delikatnie odpipetować 10 μl roztworu barwienia do każdej wkładki po impulsie i umieścić wkładki z powrotem w inkubatorze na 5 minut.
    10. Przenieś płytkę studzienkową do uchwytu płytki mikroskopu fluorescencyjnego z obiektywem o 5-krotnym powiększeniu. Obraz z wykorzystaniem jasnego pola i fluorescencji każdej plamy. Wyśrodkuj wkładkę nad obiektywem przed wyzwoleniem aparatu.
      UWAGA: Długości fal wzbudzenia dla PI, kalceiny AM i Hoechst 33342 wynoszą odpowiednio 558 nm, 495 nm i 353 nm. Długości fal emisji wynoszą odpowiednio 575 nm, 519 nm i 465 nm.
  2. Eksperyment pomiarowy TEEI
    1. Odpipetować 1,5 ml pożywki do hodowli komórkowych do każdego dołka w układzie elektrod. Umieść wkładki próbki komórek w studzienkach 1-3, a wkładki kontrolne w studzienkach 4-6, dopasowując nóżki wkładki do rowków wyrównujących tak, aby wkładka była równo z górną powierzchnią studzienki.
    2. Przykręć płytkę PCB górnej elektrody do górnej części dołków matrycy elektrod i podłącz matrycę elektrod do urządzenia PSEP.
    3. Umieścić zestaw elektrod w inkubatorze o temperaturze 37 °C na co najmniej 1 godzinę, aby umożliwić wyrównanie temperatury.
    4. Kliknij menu rozwijane obok "Membrana" w lewym górnym rogu graficznego interfejsu użytkownika i kliknij GBO 400 nm. Powtórz ten krok dla "Elektrolitu", "Komórek", "Gęstości wysiewu komórek" i "Czas trwania ogniwa", wybierając odpowiednio DMEM, A431, 200 i 12.
      UWAGA: Wartości te służą wyłącznie do celów archiwizacyjnych i nie mają wpływu na działanie urządzenia. Upewnij się, że dostosowałeś te wartości w razie potrzeby do prawidłowego śledzenia danych.
    5. Pozostaw wszystkie pozostałe ustawienia w stanie domyślnym.
      UWAGA: Domyślne parametry impulsu tworzą przebieg prostokątny o napięciu 30 woltów, 20 Hz, czasie trwania 1 ms i 200 impulsach. Domyślne parametry pomiaru TEEI to 0,5 V i 100 Hz, 1 000 Hz, 10 000 Hz i 100 000 Hz.
    6. Kliknij przycisk Uruchom i wprowadź odpowiednie nazwy dla studni 1-3 i 4-6, gdy zostaniesz o to poproszony. Kliknij OK, aby rozpocząć eksperyment.
    7. Wyjmij matrycę elektrod z inkubatora i przenieś wkładki z powrotem do pierwotnych miejsc w płytce studzienki doświadczalnej po zakończeniu wykonywania programu.
    8. Wymieszać 2 μl Hoechst 33342, 5 μl kalceiny AM i 10 μl PI ze 113 μl pożywki do hodowli komórkowych w probówce reakcyjnej o pojemności 200 μl.
    9. Odpipetować 10 μl roztworu barwienia do każdej wkładki po impulsie i umieścić wkładki z powrotem w inkubatorze na 5 minut.
    10. Przenieś płytkę studzienkową do uchwytu płytki fluorescencyjnego mikroskopu obrazowego z soczewką obiektywową 5x. Obraz z wykorzystaniem jasnego pola i fluorescencji każdej plamy. Wyśrodkuj wkładkę nad obiektywem przed uruchomieniem aparatu.
      UWAGA: Długości fal wzbudzenia dla PI, kalceiny AM i Hoechst 33342 wynoszą odpowiednio 558 nm, 495 nm i 353 nm. Długości fal emisji wynoszą odpowiednio 575 nm, 519 nm i 465 nm.

4. Analiza danych

  1. Analizowanie danych obrazu za pomocą potoku CellProfiler
    1. Użyj niestandardowego przepływu pracy CellProfiler dostępnego w witrynie GitHub:https://github.com/YangLabUNL/PSEP-TEEI, aby przetworzyć obrazy eksperymentu dostarczania i pomiaru TEEI.
  2. Analiza TEEI
    1. Kliknij zakładkę Analiza w graficznym interfejsie użytkownika.
    2. Przełącz wskaźnik typu impedancji na TEEI u dołu graficznego interfejsu użytkownika.
    3. Kliknij strzałkę w lewym górnym polu, aby wyświetlić wszystkie nazwy eksperymentów w pliku danych. Wybierz wszystkie dane próbki komórki z eksperymentu pomiarowego TEEI.
    4. Kliknij strzałkę w następnym polu po prawej stronie, aby wyświetlić wszystkie nazwy eksperymentów w pliku danych. Wybierz wszystkie dane wkładki kontrolnej z pomiaru TEEI.
    5. Kliknij Uruchom. Pojawi się podstawowa figura zawierająca wybrane dane próbki komórki przy najniższej częstotliwości pomiaru.
    6. W polu opcji próbki po prawej stronie graficznego interfejsu użytkownika kliknij strzałkę, aby wyświetlić wszystkie wybrane dane wstawiania. Wartości odstające można usunąć, wybierając odpowiednie dane i klikając Usuń poniżej.
      UWAGA: Wszystkie dane, które zostały usunięte z analizy przez ostatnie kliknięcie przycisku Usuń, można odzyskać za pomocą przycisku Cofnij.
    7. Kliknij Gotowe, aby przejść do następnego rysunku, gdy żądane dane zostaną pokazane na rysunku.
    8. Powtórzyć kroki 4.2.6 i 4.2.7 dla pozostałych danych próbki komórki i danych kontrolnych. Gdy ostateczny zestaw danych zostanie potwierdzony przez kliknięcie przycisku "Gotowe", pojawi się pełna liczba analiz.
    9. Zapisz figurę analizy.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Podany protokół ustanawia metodę korzystania z pomiarów TEEI do badania pośrednich procesów elektroporacji i przewidywania dostaw, szczególnie dla linii komórek A431 i ładunku PI. Chociaż modyfikacja tego protokołu została omówiona w dalszej części artykułu, ważne jest, aby zauważyć, że chociaż konkretne wartości mogą ulec zmianie, ogólne trendy w odpowiedzi pozostają spójne. Na przykład dane TEEI, które spadają poniżej początkowej linii bazowej, odpowiadają śmierci komórki, podczas gdy maksymalny wzrost wartości TEEI powyżej minimum odpowiada wydajności dostarczania13. Te ogólne tendencje i ich implikacje omówiono poniżej.

Jak pokazano na Rysunek 2A, podczas korzystania z platformy PSEP może pojawić się szereg trendów w pomiarach TEEI i obrazowaniu komórek. Idealnym wynikiem tego protokołu jest uzyskanie krzywej podobnej do zoptymalizowanych danych w zakresie zdrowia pokazanych na rysunku Rysunek 2Ai. Jest to scharakteryzowane jako idealny wynik, ponieważ nie ma spadku poniżej linii wyjściowej, co wskazuje na bardzo niewielką, jeśli w ogóle, śmierć komórki. Ponadto zoptymalizowana krzywa kondycji ma największy wzrost TEEI od minimum, co wskazuje na wysoki stopień wydajności dostarczania13. Wnioski te są wspierane przez obrazowanie monowarstwy komórki po PSEP, które ujawnia znikomą śmierć komórki i zdrową, w pełni zlewającą się monowarstwę komórkową (Rysunek 2Aiii). Co więcej, udany eksperyment z dostarczaniem przy użyciu identycznych przebiegów PSEP można scharakteryzować za pomocą obrazów pokazanych na Rysunek 2B. Właściwe zastosowanie fali elektroporacyjnej i koncentracja ładunku skutkują wysokim stopniem spójności dostarczania i żywotnością ogniwa.

Zdrowie i konfluencja monowarstwy komórkowej są kluczowe dla pomyślnego zastosowania prognoz dostarczania opartych na TEEI16,17. Nawet przy zoptymalizowanym kształcie fali, niezdrowa lub niekompletna monowarstwa komórki powoduje zmniejszoną odpowiedź TEEI, jak ilustrują zoptymalizowane dane dotyczące złej kondycji w Rysunek 2Aii. Należy jednak zauważyć, że obrazy dla tego wyniku (Rysunek 2Avi) nadal odpowiadają interpretacji odpowiedzi TEEI podanej przez Brooksa i wsp.13. Nie ma spadku poniżej linii bazowej, co wskazuje na bliską zeru śmierć komórki (Rysunek 2C,D). Dodatkowo, zmniejszony wzrost od minimum odpowiada negatywnemu wpływowi na wydajność dostarczania, ponieważ mniej komórek w monowarstwie zmniejsza całkowite dostarczanie PI (Rysunek 2C,D).

Jeśli zastosuje się niezoptymalizowany przebieg, można zaobserwować jeszcze bardziej znaczące spadki odpowiedzi TEEI. W zależności od całkowitej energii i ram czasowych, w których jest stosowana, niezoptymalizowane przebiegi mogą dawać wyniki od zmniejszonej wydajności do prawie całkowitego anihilacji monowarstwy komórki (Rysunek 2Ai,iii,v). Zarówno niezoptymalizowane, jak i bardzo niezoptymalizowane krzywe wykazują znaczny spadek w stosunku do wartości wyjściowej, co wskazuje na znaczną śmierć komórki. Jednak coraz bardziej niezoptymalizowane kształty fal utrudniają regenerację komórek, co skutkuje zmniejszoną wydajnością dostarczania.

Efektywność dostarczania została obliczona, dzieląc liczbę komórek oznaczonych zarówno na obrazach PI, jak i kalceiny z eksperymentów z dostarczaniem, przez całkowitą liczbę komórek zidentyfikowanych za pomocą Hoechst. Śmierć obliczono, biorąc komórki oznaczone PI w eksperymentach pomiarowych TEEI i dzieląc przez całkowitą liczbę komórek zidentyfikowanych za pomocą Hoechst. Liczba komórek została określona przy użyciu niestandardowego potoku CellProfiler dla obu metryk.

figure-results-1
Rysunek 2: Krzywe odpowiedzi TEEI i obrazowanie dla typowych warunków. (A) (i) Dane odpowiedzi TEEI ilustrujące procentową zmianę TEEI dla optymalizowanych i niezoptymalizowanych warunków. (ii) Porównanie odpowiedzi TEEI między zdrowymi i niezdrowymi monowarstwami w zoptymalizowanych warunkach przebiegu. (iii-v) Reprezentatywne obrazowanie potencjalnych wyników dla zoptymalizowanych i niezoptymalizowanych warunków przebiegu pokazujących śmierć komórki (kolor czerwony) i żywe komórki (kolor zielony). (vi) Reprezentatywne obrazowanie niezdrowej monowarstwy po zastosowaniu zoptymalizowanych warunków przebiegu pokazujących śmierć komórki (czerwony) żywe komórki (zielony). (B) Obrazy przedstawiające pomyślne dostarczenie PI (czerwony), żywe komórki (zielony) i lokalizacje jąder (niebieski). Wszystkie obrazy zostały rozjaśnione dla zwiększenia wyrazistości. Podziałka liniowa: 1000 μm. (C) TEEI zmniejsza się od wartości podstawowej sprzed PSEP do minimalnej wartości po PSEP i wzrasta od minimum po PSEP do wartości szczytowej po PSEP dla danych napięć. (D) Wydajność dostarczania i procenty śmierci ogniw dla danych napięć. Słupki błędów reprezentują SEM (n = 6). (C,D) przedrukowane z Brooks et al.13 za zgodą. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rysunek 2C pokazuje, że TEEI wzrasta od minimum i maleje od linii bazowej dla każdego napięcia falowego PSEP. Wzrost TEEI tworzy łuk paraboliczny, osiągając szczyt około 20 woltów przed redukcją, podczas gdy spadek TEEI od wartości wyjściowej rośnie wykładniczo wraz ze wzrostem napięcia. Wydajność dostarczania i procenty śmierci na rysunku 2D odzwierciedlają te trendy, przy czym wydajność dostarczania rośnie parabolicznie, osiągając szczyt około 30 woltów, a śmierć rośnie wykładniczo wraz ze wzrostem napięcia falowego.

Jedną z hipotez dotyczących mechanizmu leżącego u podstaw wzrostu TEEI jest elektroosmoza za pośrednictwem ujemnie naładowanych mikrokanałów substratu, zjawisko spowodowane przyłożeniem pola elektrycznego18,19. Niezależnie od tego, czy odpowiedź TEEI jest spowodowana bodźcem mechanicznym wynikającym z pęcznienia komórki spowodowanego przepływem płynu elektroosmotycznego, czynnikiem, o którym wiadomo, że występuje w przypadku elektroporacji20, czy też bodźcem elektrycznym samego kształtu fali, jasne jest, że zdrowie i kompletność monowarstwy ma kluczowe znaczenie dla osiągnięcia odpowiedniego spadku napięcia na błonie komórkowej wymaganego do elektroporacji. Z tego powodu najbardziej krytycznymi krokami w tej metodzie są te dotyczące wysiewu komórek i zapewnienia prawidłowego tworzenia monowarstwy komórek. Można to potwierdzić poprzez obrazowanie monowarstwy komórki i wyjściową wartość TEEI. W przypadku komórek A431 średni TEEI wynosi około 7 Ω·cm², podczas gdy HEK293T komórek średnio 5 Ω·cm² (ryc. 2Aii), prawdopodobnie z powodu różnic morfologicznych powodujących różnice w obszarze połączenia komórka-komórka.

Ze względu na pole elektryczne wymagane do elektroporacji porowatego podłoża nastąpi elektroliza, powodująca korozję elektrod12,21. Było to szczególnie widoczne w przypadku dolnej elektrody, ponieważ w tym eksperymencie została ona naładowana dodatnio, aby dostarczyć dodatnio naładowane PI. Poprzez eksperymenty ustalono, że dolna płytka drukowana może być użyta około 20 razy, zanim znaczące negatywne skutki będą wymagały wymiany13. Aby oczyścić matrycę elektrod do ponownego użycia, usuń pozostałą hodowlę komórkową lub pożywkę transfekcyjną z komór za pomocą aspiratora. Napełnij każdą komorę w trzech czwartych 70% etanolem i umieść płytkę PCB górnej elektrody na tablicy elektrod, tak aby górne elektrody były zanurzone. Pozostaw etanol w układzie elektrod na co najmniej 10 minut przed wyjęciem etanolu i odłożeniem zestawu elektrod do wyschnięcia.

Możliwe jest ponowne wykorzystanie zakupionych wkładów poprzez usunięcie substratów, wysterylizowanie wkładu oraz wymianę podłoża na substrat pobrany z innego źródła. Wkładki 6-dołkowe o tej samej gęstości porów i średnicy są dostępne na rynku i mogą być używane do zbierania czterech 24-dołkowych substratów zastępczych o wielkości wkładki. Po wysterylizowaniu poprzednio używanych wkładek dodaj 10 μl żywicy epoksydowej utwardzanej światłem ultrafioletowym do świeżej szalki Petriego. Zanurz wkładkę od strony podłoża w kałuży żywicy epoksydowej, aby pokryć dolną powierzchnię, i ostrożnie umieść nowe podłoże nad otworem we wkładce. Sprawdź wzrokowo, czy żywica epoksydowa tworzy pełny pierścień, aby upewnić się, że nie ma żadnych przerw w połączeniu. Utwardzaj w świetle UV przez 30 sekund i przechowuj odnowione wkłady w czystej 24-dołkowej płytce, aby uniknąć uszkodzenia nowych podłoży przed ponownym użyciem.

Jak wspomniano wcześniej, chociaż przypuszcza się, że obserwowany wzrost TEEI wystąpi w wielu typach komórek, wykazano to tylko w przypadku linii komórkowych A431 i HEK293T13 (Figura 1C), z których obie są komórkami przylegającymi. Metodę można modyfikować poprzez selekcję różnych linii komórkowych, wybór błon o różnej charakterystyce porów, zastąpienie powłoki fibronektyny innym białkiem macierzy zewnątrzkomórkowej poprzez dostosowanie stężenia lub zmianę ładunku. Jeśli jednak zostaną wprowadzone jakiekolwiek zmiany w konfiguracji eksperymentu, może być konieczna ponowna optymalizacja przebiegu. Aby zoptymalizować przebieg, można przeprowadzić eksperyment pomiarowy TEEI, w którym tylko jeden parametr przebiegu, taki jak napięcie, jest zmieniany między każdą grupą trzech próbek. Wybierz optymalne napięcie, identyfikując największy wzrost TEEI w co najmniej dziewięciu zdrowych próbkach. Powtórz ten proces dla każdego parametru przebiegu, używając nowo zoptymalizowanych wartości podczas przechodzenia do następnego. Pamiętaj, że może istnieć wiele lokalnych optimów dla parametrów przebiegu (tj. optymalne napięcie dla jednego czasu trwania impulsu może nie być optymalnym napięciem dla czasu trwania innego impulsu i tak dalej).

Korzyści płynące z elektroporacji podłoża porowatego są szerokie. Podczas gdy inne metody dostarczania wewnątrzkomórkowego istnieją od dłuższego czasu, niewiele z nich łączy wysoką przepustowość z wysokim stopniem kontroli, który posiada PSEP 1,13. Ponadto wykorzystanie przez platformę pomiarów TEEI zapewnia wgląd w pośrednie etapy procesu elektroporacji. Odczyty TEEI informują o stanie ogniw, kierują doborem parametrów elektroporacji i umożliwiają dalszy wgląd w określone zachowania i mechanizmy ogniw13,17. Dzięki pomiarom TEEI platforma jest również zdolna do dostarczania bez etykiet13, co pozwala na szybką optymalizację przy zmniejszonym zapotrzebowaniu na drogie biomarkery i odczynniki za każdym razem, gdy przeprowadzany jest eksperyment. Ten wkład w obszar dostarczania wewnątrzkomórkowego sprawia, że jest to główny kandydat jako platforma dostarczania dla podstawowych badań biologicznych i zastosowań biomedycznych.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy za wsparcie finansowe od NSF (Awards 1826135, 1936065, 2143997), NIH National Institutes of General Medical Sciences P20GM113126 (Nebraska Center for Integrated Biomolecular Communication) i P30GM127200 (Nebraska Center for Nanomedicine), Nebraska Collaborative Initiative oraz Voelte-Keegan Bioengineering Support. Urządzenie zostało wyprodukowane w NanoEngineering Research Core Facility (NERCF), który jest częściowo finansowany przez Nebraska Research Initiative.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
15 ml stożkowa probówka wirówkowaThermo Scientific339651
2-chipowy jednorazowy hemocytometrBulldog BioDHC-N01
75 cm2 Kolba do kultur tkankowychfisherbrandFB012937
A431 KomórkiATCCCRL-1555
Calcein AMInvitrogenC3099
Szafa bezpieczeństwa biologicznego klasy II typu A2LabgardNU-543-600
Komponenty niestandardoweJednorazowa
https://github.com/YangLabUNL/PSEP-TEEI (50 ml)fisherbrand05-539-6
DMEMGibco11965092
płodowej surowicy bydlęcejGibcoA5670401
vacuubrand20727403
HERACELL 240iThermo Scientific51026331
Hoechst 33342Thermo Scientific62249
Fibronektyna z ludzkiego osoczaSigma-AldrichFIBRP-RO
Odwrócony mikroskop fluorescencyjnyZeiss491916-0001-000
Mikroskop odwróconyLabomedTCM 400
PBScytivaSH30256,02
Probówka PCR 200 &mikro; LSarstedt72.737
Penicylina / StreptomycynaGibco15140148
Pipeta (0,2-2 &mikro; L)pipeta FBE00002
(100-1000 &mikro; L)Pipeta FBE01000
(20-200 &mikro; L)fisherbrand EliteFBE00200
Pipeta (2-20 &mikro; L)fisherbrand EliteFBE00020
Probidium JodekInvitrogenP1304MP
Probówka reakcyjna 1,5 mlSarstedt72.690.300
Wirówka Sorvall ST 16RThermo Scientific 75004240
Thincert (24-well)Greiner Bio-One662 6410,4 &mikro; m średnica porów, 2x106 cm-2 gęstość porów, przezroczysta
płytka do hodowli tkankowej PET (24-dołkowa)fisherbrandFB012929
Roztwór błękitu trypanowegoSigma-AldrichT8154-20mL
TrypsynaGibco15090046
probówka wirówkowa YangLab System aspiracji płynów fisherbrand Elitefisherbrand Elite

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Brooks, J., et al. High throughput and highly controllable methods for in vitro intracellular delivery. Small. 16 (51), e2004917(2020).
  2. Stewart, M. P., Langer, R., Jensen, K. F. Intracellular delivery by membrane disruption: Mechanisms, strategies, and concepts. Chem Rev. 118 (16), 7409-7531 (2018).
  3. Canatella, P. J., Karr, J. F., Petros, J. A., Prausnitz, M. R. Quantitative study of electroporation-mediated molecular uptake and cell viability. Biophys J. 80 (2), 755-764 (2001).
  4. Pliquett, U., Gift, E. A., Weaver, J. C. Determination of the electric field and anomalous heating caused by exponential pulses with aluminum electrodes in electroporation experiments. Bioelectrochem Bioenerg. 39 (1), 39-53 (1996).
  5. Pan, J., et al. Cell membrane damage and cargo delivery in nano-electroporation. Nanoscale. 15 (8), 4080-4089 (2023).
  6. Boukany, P. E., et al. Nanochannel electroporation delivers precise amounts of biomolecules into living cells. Nat Nanotechnol. 6 (11), 747-754 (2011).
  7. Chang, L., et al. Micro-/nanoscale electroporation. Lab Chip. 16 (21), 4047-4062 (2016).
  8. Patino, C. A., et al. Multiplexed high-throughput localized electroporation workflow with deep learning-based analysis for cell engineering. Sci Adv. 8 (29), 7637(2022).
  9. Sagvolden, G., Giaever, I., Pettersen, E. O., Feder, J. Cell adhesion force microscopy. Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (2), 471-476 (1999).
  10. Ishibashi, T., Takoh, K., Kaji, H., Abe, T., Nishizawa, M. A porous membrane-based culture substrate for localized in situ electroporation of adherent mammalian cells. Sensors Actuators B: Chem. 128 (1), 5-11 (2007).
  11. Mukherjee, P., Nathamgari, S. S. P., Kessler, J. A., Espinosa, H. D. Combined numerical and experimental investigation of localized electroporation-based cell transfection and sampling. ACS Nano. 12 (12), 12118-12128 (2018).
  12. Brooks, J. R., et al. An equivalent circuit model for localized electroporation on porous substrates. Biosens Bioelectron. 199, 113862(2022).
  13. Brooks, J. R., et al. Transepithelial electrical impedance increase following porous substrate electroporation enables label-free delivery. Small. 20 (25), 2310221(2023).
  14. Vindiš, T., et al. Gene electrotransfer into mammalian cells using commercial cell culture inserts with porous substrate. Pharmaceutics. 14 (9), 1959(2022).
  15. Ye, Y., et al. Single-cell electroporation with real-time impedance assessment using a constriction microchannel. Micromachines. 11 (9), 856(2020).
  16. Bednarek, R. In vitro methods for measuring the permeability of cell monolayers. Methods Protoc. 5 (1), 17(2022).
  17. Harhaj, N. S., Antonetti, D. A. Regulation of tight junctions and loss of barrier function in pathophysiology. Int J Biochem Cell Biol. 36 (7), 1206-1237 (2004).
  18. Hunter, R. J. Zeta potential in colloid science: Principles and applications. 2, Academic Press. (2013).
  19. Wong, P. K., Wang, T. -H., Deval, J. H., Ho, C. -M. Electrokinetics in microdevices for biotechnology applications. IEEE/ASME Trans Mechatron. 9 (2), 366-376 (2004).
  20. Qian, K., Wang, Y., Lei, Y., Yang, Q., Yao, C. An experimental and theoretical study on cell swelling for osmotic imbalance induced by electroporation. Bioelectrochemistry. 157, 108637(2024).
  21. Fox, M. B., et al. Electroporation of cells in microfluidic devices: A review. Anal Bioanal Chem. 385 (3), 474-485 (2006).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Porous Substrate ElectroporationElectroporation MonitoringFluorescent MicroscopyCell MonolayerDelivery EfficiencyCell ViabilityWaveform ParametersElectrode ArrayCell Culture Inserts

Powiązane artykuły