Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Zoptymalizowany protokół dla jelitowych szwajcarskich bułeczek i barwienia immunofluorescencyjnego tkanek zatopionych w parafinie

8.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/66977

⸱

19 lipca 2024

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Regenerative Medicine and Cell Biology, Medical University of South Carolina

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Jelito jest niezbędne do trawienia i wchłaniania. Każdy region - dwunastnica, jelito czcze, jelito kręte, okrężnica - pełni różne funkcje dzięki unikalnym strukturom komórkowym. Studiowanie fizjologii jelit wymaga skrupulatnej analizy tkanek. Protokół ten określa utrwalanie i przetwarzanie tkanek przy użyciu szwajcarskiej techniki walcowania, zapewniając dokładne barwienie immunologiczne poprzez odpowiednie zachowanie i orientację tkanki.

Streszczenie

Jelito to złożony organ złożony z jelita cienkiego i grubego. Jelito cienkie można dalej podzielić na dwunastnicę, jelito czcze i jelito kręte. Każdy obszar anatomiczny jelita ma unikalną funkcję, która znajduje odzwierciedlenie w różnicach w strukturze komórkowej. Badanie zmian w jelicie wymaga dogłębnej analizy różnych regionów tkanek i zmian komórkowych. Aby zbadać jelito i uwidocznić duże kawałki tkanki, naukowcy powszechnie używają techniki znanej jako jelitowe szwajcarskie bułeczki. W tej technice jelito jest dzielone na każdy obszar anatomiczny i mocowane w płaskiej orientacji. Następnie tkanka jest starannie zwijana i przetwarzana w celu zatopienia w parafinie. Prawidłowe utrwalenie i orientacja tkanek jest często pomijaną techniką laboratoryjną, ale ma kluczowe znaczenie dla dalszej analizy. Ponadto niewłaściwe szwajcarskie zwijanie tkanki jelitowej może uszkodzić delikatny nabłonek jelitowy, prowadząc do złej jakości tkanek do barwienia immunologicznego. Zapewnienie dobrze utrwalonej i prawidłowo zorientowanej tkanki z nienaruszonymi strukturami komórkowymi jest kluczowym krokiem, który zapewnia optymalną wizualizację komórek jelitowych. Przedstawiamy opłacalną i prostą metodę wytwarzania szwajcarskich bułeczek, która obejmuje wszystkie odcinki jelita w jednym bloku zatopionym w parafinie. Opisujemy również zoptymalizowane barwienie immunofluorescencyjne tkanki jelitowej w celu zbadania różnych aspektów nabłonka jelitowego. Poniższy protokół zapewnia naukowcom kompleksowy przewodnik po uzyskiwaniu wysokiej jakości obrazów immunofluorescencyjnych poprzez utrwalanie tkanki jelitowej, technikę Swiss-roll i barwienie immunologiczne. Zastosowanie tych wyrafinowanych podejść pozwala zachować skomplikowaną morfologię nabłonka jelitowego i sprzyja głębszemu zrozumieniu fizjologii i patobiologii jelit.

Wprowadzenie

Architektura komórkowa jelita stanowi wyjątkowe wyzwanie w utrzymaniu jego integralności strukturalnej, gdy tkanka jelitowa jest zachowywana do barwienia immunologicznego. Jelito cienkie składa się z wydłużonych, przypominających palce struktur znanych jako kosmki1. Te kosmki często ulegają zniekształceniu podczas procesów osadzania. Zapewnienie, że badacze dysponują technikami prawidłowego osadzania jelit w celu uzyskania przekrojów poprzecznych, co pozwala na wizualizację wszystkich regionów jelita, a także warstw tworzących jelito (tj. muscularis propria, błona śluzowa i błona surowicza), ma kluczowe znaczenie dla solidnej analizy eksperymentalnej2. Nieodpowiednie utrwalenie, nadmierne utrwalenie i niewłaściwe obchodzenie się z tkankami naruszy integralność tkanki, powodując niezamierzone uszkodzenie nabłonka jelitowego3,4. Uszkodzenie nabłonka jelitowego podczas tych etapów może znacznie obniżyć jakość późniejszych analiz, takich jak immunofluorescencja, niezależnie od skuteczności protokołów immunohistochemicznych i zastosowanych przeciwciał.

Barwienie immunologiczne, podobnie jak prawidłowe utrwalanie tkanek, jest ważną częścią badań biomedycznych. Dobrze przeprowadzone barwienie immunologiczne może rzucić światło na nieznane wcześniej aspekty struktury i funkcji komórek. Barwienie immunofluorescencyjne skrawków parafiny może być trudne ze względu na modyfikacje fizykochemiczne wynikające z procesu utrwalania i zatapiania parafiny5. Utrwalanie i osadzanie parafiny powoduje maskowanie antygenu, które może zakłócać immunofluorescencyjne wykrywanie epitopów będących przedmiotem zainteresowania6. Opóźnione utrwalenie może wywołać degradację proteolityczną, co skutkuje osłabieniem lub brakiem barwienia krytycznych epitopów7. Ponadto przeciwciała są często niedokładne przy wysokim poziomie tła. Protokoły barwienia immunologicznego, które promują spójne i swoiste wiązanie przeciwciał oraz wysoki stosunek sygnału do szumu, mogą dostarczyć cennych informacji dla badaczy.

Tutaj oferujemy kompleksowy protokół przeznaczony do uzyskiwania wysokiej jakości obrazów immunofluorescencyjnych poprzez utrwalanie tkanki jelitowej, szwajcarskie przygotowanie rolki8, oraz barwienie immunologiczne. Kładąc nacisk na wytyczne dotyczące zachowania integralności jelita, protokół ma na celu zapewnienie naukowcom solidnej metodologii w celu poprawy jakości i wiarygodności badań obrazowania immunofluorescencyjnego. Staraliśmy się również wykorzystać opłacalne zasoby, w tym bibułę filtracyjną i domowe pobieranie antygenu, roztwory blokujące i rozcieńczalniki przeciwciał, aby protokół był bardziej dostępny dla laboratoriów, które mogą mieć ograniczone fundusze. Podobnie jak w przypadku wszystkich protokołów eksperymentalnych, badacze powinni zoptymalizować obecny protokół w oparciu o swoje podejście eksperymentalne i obszary zainteresowania.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Instytucjonalny Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania Uniwersytetu Medycznego Południowej Karoliny zatwierdził całą opiekę, utrzymanie i leczenie zwierząt. Tkankę jelitową pobrano od dorosłych myszy C57BL/6J (samce i samice w wieku 3-5 miesięcy, o masie około 30 g) do wykorzystania w niniejszym badaniu.

1. Utrwalenie tkanki jelitowej

  1. Ostrożnie wypreparuj całe jelito myszy poddanej eutanazji i umieść je w łodzi wagowej lub szalce Petriego zawierającej sól fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS).
  2. Usuń jelita z PBS i za pomocą nożyczek delikatnie usuń nadmiar tłuszczu i tkanki łącznej. Przecięcie tkanki łącznej pomaga tkance ułożyć się płasko podczas kolejnych etapów.
  3. Podziel jelito na poszczególne segmenty za pomocą nożyczek (tj. dwunastnica, jelito czcze, jelito kręte, jelito ślepe i okrężnica). Podziel segmenty na podstawie cech anatomicznych i/lub długości, przy czym około 13% długości jelita to dwunastnica, 58% to jelito czcze, 8% to jelito kręte, 6% to jelito ślepe, a okrężnica to 15%9. Dwunastnica podąża za żołądkiem, a jelito kręte jest końcowym odcinkiem jelita cienkiego bezpośrednio przed jelitem ślepym.
  4. Uwolnij okrężnicę, przecinając ją w miejscu, w którym łączy się z jelitem ślepym, za pomocą nożyczek. Umieść dwunastnicę, jelito czcze, jelito kręte i okrężnicę w łodzi do ważenia lub szalce Petriego PBS. Wyrzuć jelito ślepe lub napraw je zgodnie z innymi opublikowanymi metodami10.
  5. Przymocuj końcówkę pipety P200 do strzykawki o pojemności 10 ml, odcinając duży koniec końcówki żyletką. Napełnić strzykawkę PBS.
  6. Włożyć końcówkę strzykawki do otworu odcinka jelita za pomocą kleszczy. Użyj kleszczyków, aby przytrzymać odcinek jelitowy na strzykawce i delikatnie przepłukać z szybkością ~50 μL/s, aby usunąć zawartość jelitową. Zbierz zawartość jelit do pustej łódki wagowej lub szalki Petriego.
  7. Połóż mokry odcinek jelita w linii prostej na pasku suchej etylozowej bibuły filtracyjnej (patrz Tabela materiałów). Upewnij się, że segment jelitowy jest wystarczająco mokry, aby prawidłowo przylegał do suchej bibuły filtracyjnej. Oznacz bibułę filtracyjną informacjami o liczbie myszy, genotypie, grupie eksperymentalnej itp. za pomocą ołówka.
    UWAGA: Używanie długopisu do etykietowania bibuły filtracyjnej może spowodować utratę etykiet podczas utrwalania.
  8. Użyj nożyczek preparacyjnych, aby przeciąć jelito wzdłuż linii krezki. Ciąć ~ 5 mm na raz, używając dolnej krawędzi nożyczek lub kleszczy, aby położyć pociętą tkankę płasko na bibule filtracyjnej. Kontynuuj, aż cały odcinek jelita zostanie przecięty i ułożony płasko na bibule filtracyjnej. Uważaj, aby przeciąć jelito w jak najbardziej prostej linii, ponieważ ułatwi to zwijanie tkanki.
    UWAGA: Na tym etapie można użyć nożyczek z końcówką kulkową, aby uniknąć uszkodzenia tkanek.
  9. Umieść kolejny kawałek bibuły filtracyjnej na segmencie jelitowym. Upewnij się, że bibuła filtracyjna przylega do odcinka jelita, zapobiegając zwijaniu się jelita lub utracie spłaszczonego kształtu podczas utrwalania.
  10. Zszyj krawędzie bibuły filtracyjnej, aby zabezpieczyć tkankę na miejscu. Nie zszywać chusteczki. Umieść wystarczającą ilość zszywek wokół tkanki, aby zapobiec oderwaniu się tkanki od bibuły filtracyjnej podczas mocowania.
  11. Powtórz kroki 1,5-1,10 dla każdego z segmentów jelita (dwunastnica, jelito czcze, jelito kręte i okrężnica).
  12. Zanurz tkanki w 10% normalnej buforowanej formalinie (lub utrwalaczu z wyboru, takim jak 4% paraformaldehyd, utrwalacz Carnoya itp.) przez noc w temperaturze 4 °C.
    UWAGA: Upewnij się, że noszone są odpowiednie środki ochrony osobistej, ponieważ utrwalacze, takie jak formalina, są toksyczne.

2. Zwijanie i przetwarzanie tkanki jelitowej

UWAGA: Wykonaj kroki 2.1-2.6 w wentylowanym kapturze.

  1. Delikatnie usuń górny kawałek bibuły filtracyjnej (ten, który dotyka światła po stronie jelita). Użyj kleszczy, aby ostrożnie oderwać jelito od dolnego kawałka bibuły filtracyjnej. Wyrzuć bibułę filtracyjną.
  2. Napełnij trzy łodzie wagowe PBS. Umyj chusteczkę w PBS 3x, aby usunąć formalinę z tkanki.
  3. Używając kleszczy o odwróconym działaniu (patrz Tabela materiałów), podnieś kawałek jelita wzdłuż krótszej krawędzi stroną świetlną skierowaną do góry. Obróć kleszcze, aby zwinąć chusteczkę. Użyj pary zwykłych kleszczy, aby pomóc w prowadzeniu tkanki podczas jej zwijania. Jeśli chusteczka zostanie złożona, rozwiń ją i spróbuj ponownie.
  4. Umieść tkankę w suchej łodzi do ważenia lub na szalce Petriego. Przytrzymaj tkankę na miejscu za pomocą kleszczy w jednej ręce. Ostrożnie otwórz kleszcze o odwrotnym działaniu i uwolnij tkankę, używając innych kleszczy do usunięcia tkanki z kleszczy o odwrotnym działaniu.
  5. Włożyć szpilkę do preparowania w rozmiarze 00 lub szpilkę do drobnego rozmiaru do tkanki (patrz Tabela Materiałów). Użyj nożyc do drutu, aby usunąć ostrą końcówkę kołka. Umieść chusteczkę w dużej kasecie, a następnie umieść kasetę w pojemniku zawierającym 70% etanol, aż będzie gotowa do przetworzenia.
  6. Powtórz kroki 2.1-2.5 ze wszystkimi segmentami jelita (dwunastnica, jelito czcze, jelito kręte i okrężnica), umieszczając wszystkie cztery rolki tkanek w tej samej dużej kasecie (patrz Tabela materiałów). Upewnij się, że kaseta jest oznaczona ołówkiem, aby zapobiec zmywaniu się etykiety w roztworach etanolu i ksylenu (patrz Tabela materiałów).
  7. Po zrolowaniu wszystkich próbek umieść je w procesorze tkankowym. Użyj następujących ustawień dla tkanki jelitowej: 70% etanolu przez 35 minut; 90% etanolu przez 35 min; 95% etanolu przez 35 min; 100% etanol przez 35 min, 3x; ksylen przez 35 min, 3x; parafina przez 60 min, 3x. Kasety można pozostawiać w stopionym wosku parafinowym przez dłuższy czas.
    UWAGA: Upewnij się, że noszony jest odpowiedni sprzęt ochronny, ponieważ ksylen jest toksyczną substancją chemiczną.

3. Osadzanie tkanki jelitowej

  1. Rozgrzej duże formy do zatapiania, aby parafina się stopiła.
  2. Wyjmij kasety z procesora tkanek i umieść je w zlewce ze stopioną parafiną.
  3. Na stacji zatapiania umieść niewielką ilość parafiny w formie. Wyjmij cztery szwajcarskie rolki z kasety i umieść je wszystkie w jednej formie, układając je tak płasko, jak to możliwe. Dodaj więcej parafiny, aby wypełnić formę.
  4. Przenieś formę na zimną płytę i upewnij się, że wszystkie szwajcarskie bułki leżą płasko na dnie formy. Umieść oznaczoną małą kasetę (patrz Tabela materiałów) na formie i w razie potrzeby dodaj więcej parafiny.
  5. Gdy wosk zastygnie, wyjmij blok z formy. Tkanka jest teraz gotowa do pokrojenia na plastry o grubości 5 μm i unoszenia na naładowanych szkiełkach w celu barwienia immunologicznego11.

4. Przyleganie tkanek i przygotowanie preparatu

  1. Aby upewnić się, że przygotowany wycinek tkanki parafinowej o grubości 5 μm przylega do szkiełka, należy podgrzewać szkiełka podstawowe na podgrzewaczu do szkiełek lub bloku grzewczym ustawionym na 60 °C przez 15-30 minut. Szkiełka można również pozostawić w cieple na dłużej; ten krok nie jest wrażliwy na czas.
  2. Pozostaw szkiełka do ostygnięcia do temperatury pokojowej (~15 min).

5. Deparafinizacja

  1. Po rozpoczęciu odparafinowania szkiełek należy upewnić się, że tkanka pozostaje w roztworze i nie wysycha przez cały cykl barwienia immunologicznego.
  2. Użyj stojaka na szkiełka (patrz Tabela materiałów), aby przytrzymać szkiełka podstawowe i umieścić je w naczyniu odpornym na rozpuszczalniki (patrz Tabela materiałów), które jest wypełnione odczynnikiem do klarowania/odparafinowania (patrz Tabela materiałów). Upewnij się, że odczynnik całkowicie pokrywa tkankę na każdym szkiełku. Przed całkowitym zanurzeniem szkiełek w odczynniku czyszczącym, należy kilkakrotnie zanurzyć lub wstrząsnąć stojakiem na szkiełka w roztworze czyszczącym. Pozostaw slajdy zanurzone na 10 minut lub dłużej.
    UWAGA: Ten krok może być konieczny do wykonania w wentylowanym okapie ze względu na niebezpieczne opary, w zależności od wybranego środka czyszczącego. Deparafinizacja tkanki na tym etapie nie jest wrażliwa na czas, jeśli używa się nietoksycznego środka czyszczącego.
  3. Wyjmij i zamieszaj stojak na szkiełka, aby usunąć nadmiar odczynnika czyszczącego. W nowym naczyniu odpornym na rozpuszczalniki powtórzyć krok 5.2.
  4. W nowym naczyniu odpornym na rozpuszczalniki powtórzyć krok 5.3. Pozostaw szkiełka zanurzone na 15 minut lub dłużej. Ten krok nie jest wrażliwy na czas.

6. Nawodnienie

  1. Wyjmij i zamieszaj stojak na szkiełka, aby usunąć nadmiar odczynnika czyszczącego. W nowym, odpornym na rozpuszczalniki naczyniu wypełnionym 100% etanolem zanurz lub potrząśnij stojakiem na szkiełka kilka razy i pozostaw szkiełka zanurzone na 5 minut. Ten krok jest wrażliwy na czas. Powtórz 2 razy.
  2. Wyjmij i wymieszaj stojak na szkiełka, aby usunąć nadmiar 100% etanolu. W nowym, odpornym na rozpuszczalniki naczyniu wypełnionym 95% etanolem zanurz lub przetrząśnij stojakiem na szkiełka kilka razy i pozostaw szkiełka zanurzone na 5 minut. Ten krok jest wrażliwy na czas. Powtórz 1x.
  3. Wyjmij i zamieszaj stojak na szkiełka, aby usunąć nadmiar 95% etanolu. W nowym, odpornym na rozpuszczalniki naczyniu wypełnionym 70% etanolem zanurz lub przetrząśnij stojakiem na szkiełka kilka razy i pozostaw szkiełka zanurzone na 5 minut. Ten krok jest wrażliwy na czas.
  4. Wyjmij i zamieszaj stojak na szkiełka, aby usunąć nadmiar 70% etanolu. W nowym, odpornym na rozpuszczalniki naczyniu wypełnionym 50% etanolem zanurz lub przetrząśnij stojak na szkiełka kilka razy i pozostaw szkiełka zanurzone na 5 minut. Ten krok jest wrażliwy na czas.
  5. Wyjmij i wymieszaj stojak na szkiełka, aby usunąć nadmiar 50% etanolu. W nowym, odpornym na rozpuszczalniki naczyniu wypełnionym wodą dejonizowaną (DI) zanurz lub potrząśnij stojakiem na szkiełka kilka razy i pozostaw szkiełka zanurzone na 5 minut. Ten krok jest wrażliwy na czas.
    1. Aby zatrzymać się w tym miejscu, umieść szkiełka w pojemniku z PBS do czasu, aż barwienie immunologiczne będzie można wznowić po 5-minutowym etapie nawadniania wodą.

7. Pobieranie antygenu

  1. Napełnij nowe naczynie odporne na rozpuszczalniki odpowiednim buforem do odzyskiwania antygenu. Bezpośrednio przenieś stojak przesuwny do tego rozwiązania. Upewnij się, że szkiełka są całkowicie zanurzone w roztworze do pobierania antygenu, całkowicie pokrywając tkankę.
    UWAGA: Optymalne roztwory do pobierania antygenu mogą się różnić w zależności od konkretnego stosowanego przeciwciała. Pobieranie antygenu wymagane dla poszczególnych przeciwciał może wymagać określenia przez badacza.
    1. Aby przygotować 1x bufor do odzyskiwania antygenu cytrynianowego, dodaj 2,94 g dwuwodnego cytrynianu sodu (patrz tabela materiałów) na 1 l wody dejonizowanej. Po rozpuszczeniu dwuwodnego cytrynianu sodu dodawać chlorowodór (patrz tabela materiałów), aż roztwór osiągnie pH 6. Na koniec dodaj 500 μl Tween20 (patrz tabela materiałów) na 1 l wody dejonizowanej.
    2. Aby zrobić 1x bufor do odzyskiwania antygenu Tris-EDTA, dodaj 1,211 g zasady Tris i 0,292 g EDTA w 1 litrze wody dejonizowanej. Po rozpuszczeniu dostosuj do pH 9.
  2. Przykryj naczynie odporne na działanie rozpuszczalników zawierające roztwór do pobierania antygenu i szkiełka pokrywką i zabezpiecz pokrywkę gumowymi opaskami.
  3. Umieść bezpieczne, odporne na rozpuszczalniki naczynie w szybkowarze (patrz Tabela materiałów) na metalowym stojaku lub podstawce. Upewnij się, że w szybkowarze jest wystarczająca ilość wody, aby dotrzeć do metalowego stojaka lub podstawki, aby ciśnienie mogło wzrosnąć.
  4. Umieść pokrywkę na szybkowarze i przekręć zgodnie z ruchem wskazówek zegara, aby zablokować pokrywę na miejscu. Przekręć zawór ograniczający ciśnienie, który znajduje się na pokrywie, do ustawienia ciśnienia.
  5. W ustawieniach menu wybierz wysokie ciśnienie w szybkowarze, a następnie w ustawieniu czasu ustaw szybkowar na 30 minut. Wybierz Start.
  6. Po 30 minutach szybkowar wyda sygnał dźwiękowy i automatycznie ustawi się na ustawienie utrzymywania ciepła. Poczekaj, aż ciśnienie naturalnie spadnie, a pokrywka swobodnie się odkręci.
  7. Użyj rękawic żaroodpornych (patrz tabela materiałów), aby wyjąć naczynie odporne na rozpuszczalniki z szybkowaru i zdjąć gumkę i pokrywkę. Umieść naczynie w łaźni lodowej na ~30 minut, aby szkiełka ostygły do temperatury pokojowej. Ten krok nie jest wrażliwy na czas.
  8. Po schłodzeniu do temperatury pokojowej wyjmij ruszt szkiełkowy z naczynia odpornego na rozpuszczalniki i umieść go w nowym naczyniu odpornym na rozpuszczalniki wypełnionym wodą demineralizowaną, aby usunąć resztki roztworu do pobierania antygenu. Upewnij się, że prowadnice są całkowicie zanurzone.
  9. Wyjmij ruszt do szkiełek z wodą DI i umieść go w nowym, odpornym na rozpuszczalniki naczyniu wypełnionym PBS na 5 minut. Upewnij się, że szkiełka są całkowicie zanurzone. Ten krok nie jest wrażliwy na czas.

8. Blokowanie niespecyficznego barwienia tła

  1. Przygotuj nawilżoną komorę, biorąc duże pudełko szkiełkowe i zdejmując tekturową pokrywę przyklejoną do pokrywy. U podstawy pudełka na slajdy umieść wilgotne ręczniki papierowe pionowo w dół. Upewnij się, że wilgotne ręczniki papierowe leżą płasko.
  2. Wyjmuj slajd pojedynczo ze stojaka na slajdy zanurzonego w PBS. Ostrożnie zetrzyj nadmiar PBS ze szkiełka, omijając chusteczkę.
  3. Za pomocą pisaka hydrofobowego (patrz Tabela materiałów) utwórz barierę otaczającą tkankę, rysując pudełko wokół tkanki za pomocą hydrofobowego pisaka. Należy uważać, aby unikać chusteczki i nie używać pisaka hydrofobowego zbyt blisko tkanki.
  4. Umieść zarysowaną prowadnicę poziomo na wilgotnych ręcznikach papierowych. Dodać bufor blokujący, aby pokryć tkankę (~100 μL).
    1. Aby utworzyć bufor blokujący, dodaj 100 μl żelatyny ze skóry ryb zimnowodnych (żelatyna Teleostein; patrz tabela materiałów) do 9,85 ml PBS. Na koniec dodać 50 μl 20% Triton X-100 (patrz tabela materiałów) i mieszać aż do rozpuszczenia.
  5. Powtórz kroki 8.2-8.4 dla każdego slajdu. Zamknąć nawilżoną komorę i inkubować szkiełka w temperaturze pokojowej przez 90 min.

9. Blokowanie myszy na myszy

  1. W przypadku stosowania pierwszorzędowego przeciwciała mysiego do barwienia immunologicznego tkanki myszy należy wykonać dodatkowy etap blokowania. Odczynniki blokujące "mysz na myszy" (blok "mysz na myszy"; patrz Tabela materiałów) są dostępne w handlu; Postępuj zgodnie z instrukcjami handlowymi podczas przygotowywania bloku mysz na myszy.
  2. Delikatnie strzepnąć roztwór blokujący i natychmiast dodać przygotowany blok mysz na myszy, aby pokryć tkankę (~100 μL). Powtórz te czynności dla każdego szkiełka zawierającego tkankę myszy, która zostanie wybarwiona przy użyciu pierwszorzędowego przeciwciała wyhodowanego u myszy.
  3. Skrawki tkanek inkubować w wilgotnej komorze w temperaturze pokojowej przez 15 minut.
  4. Wyjmij szkiełka z nawilżonej komory i umieść je bezpośrednio w stojaku na slajdy zanurzonym w PBS. Pozostaw szkiełka w PBS na 5 minut, aby zmyć blok myszy na myszy.

10. Przeciwciała pierwszorzędowe

  1. Dla każdego slajdu wybierz interesujące nas pierwszorzędowe przeciwciała, które są hodowane u różnych gatunków. Rozcieńczyć przeciwciała pierwszorzędowe w rozcieńczalniku przeciwciał zgodnie z instrukcją producenta. Zastosowano następujące przeciwciała pierwszorzędowe: E-CADHERIN (1:100), MUC2 (1:200), PCNA (1:500), LAMININ (1:200), β-KATENINA (1:200) i LAMP1 (1:50).
    UWAGA: Jeśli producent nie podaje zalecanych rozcieńczeń, dobrym punktem wyjścia jest rozcieńczenie 1:100. Jeśli pierwszorzędowe przeciwciało będące przedmiotem zainteresowania jest sprzężone z fluoroforem, patrz krok 12.2.
    1. Aby przygotować rozcieńczalnik przeciwciał, dodaj bufor blokujący 1:20 do PBS, jeśli używasz buforu blokującego żelatynę rybną opisanego powyżej.
  2. Wyjmij szkiełka z PBS lub z nawilżonej komory, delikatnie strzepnij nadmiar roztworu blokującego lub PBS i umieść je poziomo z powrotem w nawilżonej komorze. Upewnij się, że bariera utworzona za pomocą pióra hydrofobowego w kroku 8.3 pozostaje; W razie potrzeby ponownie obrysuj tkankę.
  3. Dodać odpowiednio rozcieńczone przeciwciała pierwszorzędowe, które mają być przedmiotem zainteresowania, aby pokryć tkankę (~100 μL).
  4. Zamknąć wilgotną komorę i inkubować szkiełka podstawowe na płaskiej powierzchni w temperaturze 4 °C w ciemności przez noc.

11. Mycie szkiełek

  1. Wyjąć szkiełka z nawilżonej komory, delikatnie stuknąć w przeciwciała pierwotne i umieścić szkiełka w stojaku na szkiełka zanurzonym w PBS na 5 minut.
  2. Wyjmij ruszt do szkiełków i umieść go w nowym, odpornym na rozpuszczalniki naczyniu wypełnionym PBS na 5 minut. Powtórz krok 1x.

12. Wtórne przeciwciała i przeciwbarwienie jąder

  1. Dla każdego szkiełka wybierz drugorzędowe fluorofory przeciwciał zaprojektowane do wiązania się z pierwszorzędowymi gatunkami przeciwciał. Rozcieńczyć fluorofory przeciwciał drugorzędowych lub sprzężone przeciwciała pierwszorzędowe w rozcieńczalniku przeciwciał drugorzędowych. Użytymi drugorzędowymi przeciwciałami były: anty-koza osła 488 (1:200), anty-królik cy3 osła (1:200), osła anty-mysz 647 (1:200), osła anty-królik 647 (1:200) i osła anty-szczur cy3 (1:200). Pierwszorzędowe przeciwciało γ-AKTYNA sprzężona z fluoroforem 647 zastosowano w rozcieńczeniu 1:100.
    1. Aby uzyskać drugorzędowy rozcieńczalnik przeciwciał, dodaj bufor blokujący 1:100 do PBS, jeśli używasz buforu blokującego żelatynę rybną, jak opisano powyżej.
  2. Wyjmij szkiełka z PBS, delikatnie strzepnij nadmiar PBS i umieść je poziomo z powrotem w wilgotnej komorze. Upewnij się, że bariera utworzona za pomocą pióra hydrofobowego w kroku 8.3 pozostaje; W razie potrzeby ponownie obrysuj tkankę.
  3. Dodaj odpowiednio rozcieńczone fluorofory przeciwciał drugorzędowych lub sprzężone przeciwciała pierwszorzędowe będące przedmiotem zainteresowania, aby pokryć tkankę (~100 μL).
  4. Zamknij nawilżoną komorę i inkubuj szkiełka w temperaturze pokojowej w ciemności przez 1 godzinę.
  5. Rozcieńczyć 10 mg/ml Hoechst (patrz tabela materiałów) lub DAPI za pomocą PBS dla końcowego stężenia 1 μg/ml Hoechst lub DAPI za pomocą PBS i dodać bezpośrednio do tkanki (~100 μL). Inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej w ciemności.
  6. Wyjmij szkiełka z nawilżonej komory i umieść je w stojaku na slajdy, który jest zanurzony w PBS na 5 minut w ciemności.
  7. Wyjmij ruszt do szkiełka i umieść w nowym naczyniu odpornym na rozpuszczalniki wypełnionym PBS na 5 minut w ciemności. Powtórz krok 1x.

13. Montaż i przygotowanie do mikroskopii

  1. Wyjmuj po jednym slajdzie ze stojaka na slajdy zanurzonego w PBS, pozostawiając pozostałe slajdy zanurzone w PBS w ciemności. Delikatnie strzepnij nadmiar PBS i, jeśli to konieczne, użyj niestrzępiącej się chusteczki, aby ostrożnie zetrzeć nadmiar PBS ze szkiełka, omijając chusteczkę.
  2. Dodaj jedną lub dwie krople podłoża mocującego zapobiegającego blaknięciu (patrz Tabela materiałów) na środek tkanki.
  3. Chwyć czyste szkiełko nakrywkowe (patrz Tabela materiałów) za krawędzie i powoli opuść je na szkiełko pod kątem 45°. Upewnij się, że podłoże montażowe równomiernie rozprowadza się po tkance.
  4. Zaczynając od środka tkanki, delikatnie dociśnij szkiełko nakrywkowe dwoma palcami, aby usunąć pęcherzyki powietrza i nadmiar podłoża mocującego. W razie potrzeby kontynuuj naciskanie w kierunku krawędzi i utrzymuj delikatny nacisk przez cały czas.
  5. Odetnij małą końcówkę niefiltrowanej pipety P200 i przymocuj ją do końcówki pipety serologicznej podłączonej do próżni.
  6. Podążając za krawędziami szkiełka nakrywkowego, użyj odkurzacza, aby usunąć nadmiar medium montażowego.
  7. W nowym pudełku na szkiełka połóż szkiełko poziomo płasko i pozwól szkiełku wyschnąć w ciemności w temperaturze pokojowej.
  8. Powtórz ten proces dla każdego slajdu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Przeprowadzono barwienie hematoksyliną i eozyną (H&E), zgodnie z wcześniejszym opisem12. Dzięki zastosowaniu zoptymalizowanej metody, preparaty typu „Swiss roll” jelita obejmowały wszystkie trzy segmenty jelita cienkiego oraz jelito grube na jednym szkiełku. Umieszczenie całego jelita na jednym szkiełku pozwala badaczom na analizę zmian we wszystkich częściach jelita i redukuje koszty sekcjonowania oraz odczynników do barwienia (Rycina 1). Ponadto jednoczesne nara...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W tym miejscu przedstawiamy zoptymalizowaną metodę utrwalania tkanek przy użyciu szwajcarskiej techniki rolkowej w celu zachowania architektury jelit i promowania dokładnego barwienia immunologicznego. Po opanowaniu technika ta może być wykorzystana do zbadania szerokiej gamy pytań badawczych związanych z fizjologią jelit i biologią komórki19. Opublikowano kilka zoptymalizowanych szwajcarskich metod walcowania, które są bardzo przydatne20,21

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

To badanie było wspierane przez National Institutes of Health (NIH) przyznające DK121869 K01 ACE, a ta publikacja była częściowo wspierana przez T32 GM132055 (RME), F31 DK139736 (SAD), T32 DK124191 (SAD), TL1 TR001451 (RS), UL1 TR001450 (RS) oraz granty HCS dla SAD & RS. Praca ta była wspierana przez fundusze startowe z Uniwersytetu Medycznego Karoliny Południowej (MUSC) dla ACE i była wspierana przez MUSC Digestive Disease Research Core Center (P30 DK123704) oraz COBRE in Digestive and Liver Disease (P20 GM120475). Obrazowanie przeprowadzono przy użyciu rdzenia obrazowania komórkowego i molekularnego w MUSC.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
β-CATENINGeneTexGTX101435
Celulozowa bibuła filtracyjnaCytiva10427804Gruby papier Whatman
Szkiełka szklane z ładunkiemThermo Fisher Scientific23888114
Szkiełko nakrywkoweEpredia152440
Szpilki preparacyjne rozmiar 00PhusisB082DH4TZF
E-CADHERINR& D SystemsAF748
Rękawice do zamrażaniaTempshieldUX-09113-02
Blok grzewczyPremiereXH-2001Podgrzewacz do slajdów
Histo-Clear IIMikroskopia elektronowa Sciences64111-04Odczynnik czyszczący
HoeschtThermo Fisher Scientific62249
Kwas solnySigma Aldrich320331
Długopis hydrofobowyMillipore402176
LAMININGeneTexGTX27463
LAMP1Santa CruzSC-19992
Duże kasetyTissue-Tek4173
Szpilki MinutienNarzędzia do naukiprecyzyjnej NC9679721
Odczynnik blokujący Mysz na myszyVector LaboratoriesMKB-2213Blok myszy na myszy
MUC2GeneTexGTX100664
Technologia sygnalizacji komórkowejPCNA2586S
SzybkowarCuisinartB000MPA044
ProLong złoty antifadeThermo Fisher ScientificP36934Medium
montażowe Kleszcze odwrotnego działaniaDumont5748
Stojak na slajdyTissue-Tek62543-06
Zestaw do barwienia szkiełekTissue-Tek62540-01Naczynia odporne na rozpuszczalniki i metalowa rama
Małe kasetyFisherbrand15-200-403B
Cytrynian sodu dwuwodnyFisher BioreagentsBP327-1
Teleostein GelatinSigmaG7765Bufor blokujący
Triton X-100Thermo Fisher ScientificA16046
Tween 20Thermo Fisher ScientificJ20605-AP
ChusteczkiKimTech34155
KsylenyFisher Chemical1330-20-7
γ-ACTINSanta CruzSC-65638

Bibliografia

  1. Louvard, D., Kedinger, M., Hauri, H. P. The differentiating intestinal epithelial cell: Establishment and maintenance of functions through interactions between cellular structures. Annu Rev Cell Biol. 8, 157-195 (1992).
  2. Rieger, J., Pelckmann, L. M., Drewes, B. Animal models of allergic disease: Methods and protocols. , Springer US. New York, NY. (2021).
  3. Webster, J. D., Miller, M. A., Dusold, D., Ramos-Vara, J. Effects of prolonged formalin fixation on the immunohistochemical detection of infectious agents in formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. Vet Pathol. 47 (3), 529-535 (2010).
  4. Hayashi, Y., Koike, M., Matsutani, M., Hoshino, T. Effects of fixation time and enzymatic digestion on immunohistochemical demonstration of bromodeoxyuridine in formalin-fixed, paraffin-embedded tissue. J Histochem Cytochemis. 36 (5), 511-514 (1988).
  5. Werner, M., Chott, A., Fabiano, A., Battifora, H. Effect of formalin tissue fixation and processing on immunohistochemistry. Am J Surg Pathol. 24 (7), 1016-1019 (2000).
  6. Scalia, C. R., et al. Antigen masking during fixation and embedding, dissected. J Histochem Cytochem. 65 (1), 5-20 (2017).
  7. Masood, S., Von Wasielewski, R., Mengel, M., Nolte, M., Werner, M. Influence of fixation, antibody clones, and signal amplification on steroid receptor analysis. Breast J. 4 (1), 33-40 (1998).
  8. Moolenbeek, C., Ruitenberg, E. J. The "swiss roll": A simple technique for histological studies of the rodent intestine. Lab Anim. 15 (1), 57-59 (1981).
  9. Casteleyn, C., Rekecki, A., Van Der Aa, A., Simoens, P., Van Den Broeck, W. Surface area assessment of the murine intestinal tract as a prerequisite for oral dose translation from mouse to man. Lab Animals. 44 (3), 176-183 (2010).
  10. Lunnemann, H. M., et al. Cecum axis (cecax) preservation reveals physiological and pathological gradients in mouse gastrointestinal epithelium. Gut Microbes. 15 (1), 2185029(2023).
  11. Qin, C., et al. The cutting and floating method for paraffin-embedded tissue for sectioning. J Vis Exp. (139), e58288(2018).
  12. Feldman, A. T., Wolfe, D. Histopathology: Methods and protocols. , Springer New York. New York, NY. (2014).
  13. Yang, W. H., et al. Innate mechanism of mucosal barrier erosion in the pathogenesis of acquired colitis. iScience. 26 (10), 107883(2023).
  14. Dooley, S. A., et al. Myosin 5b is required for proper localization of the intermicrovillar adhesion complex in the intestinal brush border. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 323 (5), G501-G510 (2022).
  15. Danan, C. H., et al. Intestinal transit amplifying cells require mettl3 for growth factor signaling, kras expression, and cell survival. bioRxiv. , 10.1101/2023.04.06.535853 (2023).
  16. Han, B., Qi, S., Hu, B., Luo, H., Wu, J. Tgf-beta i promotes islet beta-cell function and regeneration. J Immunol. 186 (10), 5833-5844 (2011).
  17. Chen, L. C., Wang, H. W., Huang, C. C. Modulation of inherent niches in 3d multicellular msc spheroids reconfigures metabolism and enhances therapeutic potential. Cells. 10 (10), 2747(2021).
  18. Fang, Y., et al. Cd36 inhibits beta-catenin/c-myc-mediated glycolysis through ubiquitination of gpc4 to repress colorectal tumorigenesis. Nat Commun. 10 (1), 3981(2019).
  19. Whittem, C. G., Williams, A. D., Williams, C. S. Murine colitis modeling using dextran sulfate sodium (dss). J Vis Exp. (35), e1652(2010).
  20. Bialkowska, A. B., Ghaleb, A. M., Nandan, M. O., Yang, V. W. Improved swiss-rolling technique for intestinal tissue preparation for immunohistochemical and immunofluorescent analyses. J Vis Exp. (113), e54161(2016).
  21. Le Naour, J., et al. Improved swiss-rolling method for histological analyses of colon tissue. MethodsX. 9, 101630(2022).
  22. Cardiff, R. D., Miller, C. H., Munn, R. J. Mouse tissue fixation. Cold Spring Harb Protoc. 2014 (5), 073403(2014).
  23. Pereira E Silva, A., Lourenço, A. L., Marmello, B. O., Bitteti, M., Teixeira, G. aP. B. Comparison of two techniques for a comprehensive gut histopathological analysis: Swiss roll versus intestine strips. Exp Mol Pathol. 111, 104302(2019).
  24. Williams, J. M., Duckworth, C. A., Vowell, K., Burkitt, M. D., Pritchard, D. M. Intestinal preparation techniques for histological analysis in the mouse. Curr Prot Mouse Biol. 6 (2), 148-168 (2016).
  25. Boenisch, T. Effect of heat-induced antigen retrieval following inconsistent formalin fixation. Appl Immunohistochem Mol Morphol. 13 (3), 283-286 (2005).
  26. Hasegawa, Y., Mark Welch, J. L., Rossetti, B. J., Borisy, G. G. Preservation of three-dimensional spatial structure in the gut microbiome. PLoS One. 12 (11), e0188257(2017).
  27. Garabedian, E. M., Roberts, L. J., Mcnevin, M. S., Gordon, J. I. Examining the role of paneth cells in the small intestine by lineage ablation in transgenic mice. J Biol Chem. 272 (38), 23729-23740 (1997).
  28. Moshi, J. M., Ummelen, M., Broers, J. L. V., Ramaekers, F. C. S., Hopman, A. H. N. Impact of antigen retrieval protocols on the immunohistochemical detection of epigenetic DNA modifications. Histochem Cell Biol. 159 (6), 513-526 (2023).
  29. Krenacs, L., Krenacs, T., Stelkovics, E., Raffeld, M. Heat-induced antigen retrieval for immunohistochemical reactions in routinely processed paraffin sections. Methods Mol Biol. 588, 103-119 (2010).
  30. Pereira, E. S. A., Lourenco, A. L., Marmello, B. O., Bitteti, M., Teixeira, G. Comparison of two techniques for a comprehensive gut histopathological analysis: Swiss roll versus intestine strips. Exp Mol Pathol. 111, 104302(2019).
  31. Bolognesi, M. aO., et al. Antibodies validated for routinely processed tissues stain frozen sections unpredictably. Bio Techniques. 3 (3), 137-148 (2021).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

utrwalanie tkaneknabłonek jelitowykonserwacja tkanekswoistość przeciwciałjelito myszytechnika rolowania tkanekmorfologia komórkowa
Zoptymalizowany protokół dla jelitowych szwajcarskich bułeczek i barwienia immunofluorescencyjnego tkanek zatopionych w parafinie
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.