Zoptymalizowany protokół dla jelitowych szwajcarskich bułeczek i barwienia immunofluorescencyjnego tkanek zatopionych w parafinie

Podsumowanie

Jelito jest niezbędne do trawienia i wchłaniania. Każdy region - dwunastnica, jelito czcze, jelito kręte, okrężnica - pełni różne funkcje dzięki unikalnym strukturom komórkowym. Studiowanie fizjologii jelit wymaga skrupulatnej analizy tkanek. Protokół ten określa utrwalanie i przetwarzanie tkanek przy użyciu szwajcarskiej techniki walcowania, zapewniając dokładne barwienie immunologiczne poprzez odpowiednie zachowanie i orientację tkanki.

Streszczenie

Jelito to złożony organ złożony z jelita cienkiego i grubego. Jelito cienkie można dalej podzielić na dwunastnicę, jelito czcze i jelito kręte. Każdy obszar anatomiczny jelita ma unikalną funkcję, która znajduje odzwierciedlenie w różnicach w strukturze komórkowej. Badanie zmian w jelicie wymaga dogłębnej analizy różnych regionów tkanek i zmian komórkowych. Aby zbadać jelito i uwidocznić duże kawałki tkanki, naukowcy powszechnie używają techniki znanej jako jelitowe szwajcarskie bułeczki. W tej technice jelito jest dzielone na każdy obszar anatomiczny i mocowane w płaskiej orientacji. Następnie tkanka jest starannie zwijana i przetwarzana w celu zatopienia w parafinie. Prawidłowe utrwalenie i orientacja tkanek jest często pomijaną techniką laboratoryjną, ale ma kluczowe znaczenie dla dalszej analizy. Ponadto niewłaściwe szwajcarskie zwijanie tkanki jelitowej może uszkodzić delikatny nabłonek jelitowy, prowadząc do złej jakości tkanek do barwienia immunologicznego. Zapewnienie dobrze utrwalonej i prawidłowo zorientowanej tkanki z nienaruszonymi strukturami komórkowymi jest kluczowym krokiem, który zapewnia optymalną wizualizację komórek jelitowych. Przedstawiamy opłacalną i prostą metodę wytwarzania szwajcarskich bułeczek, która obejmuje wszystkie odcinki jelita w jednym bloku zatopionym w parafinie. Opisujemy również zoptymalizowane barwienie immunofluorescencyjne tkanki jelitowej w celu zbadania różnych aspektów nabłonka jelitowego. Poniższy protokół zapewnia naukowcom kompleksowy przewodnik po uzyskiwaniu wysokiej jakości obrazów immunofluorescencyjnych poprzez utrwalanie tkanki jelitowej, technikę Swiss-roll i barwienie immunologiczne. Zastosowanie tych wyrafinowanych podejść pozwala zachować skomplikowaną morfologię nabłonka jelitowego i sprzyja głębszemu zrozumieniu fizjologii i patobiologii jelit.

Wprowadzenie

Architektura komórkowa jelita stanowi wyjątkowe wyzwanie w utrzymaniu jego integralności strukturalnej, gdy tkanka jelitowa jest zachowywana do barwienia immunologicznego. Jelito cienkie składa się z wydłużonych, przypominających palce struktur znanych jako kosmki¹. Te kosmki często ulegają zniekształceniu podczas procesów osadzania. Zapewnienie, że badacze dysponują technikami prawidłowego osadzania jelit w celu uzyskania przekrojów poprzecznych, co pozwala na wizualizację wszystkich regionów jelita, a także warstw tworzących jelito (tj. muscularis propria, błona śluzowa i błona surowicza), ma kluczowe znaczenie dla solidnej analizy eksperymentalnej². Nieodpowiednie utrwalenie, nadmierne utrwalenie i niewłaściwe obchodzenie się z tkankami naruszy integralność tkanki, powodując niezamierzone uszkodzenie nabłonka jelitowego^3,4. Uszkodzenie nabłonka jelitowego podczas tych etapów może znacznie obniżyć jakość późniejszych analiz, takich jak immunofluorescencja, niezależnie od skuteczności protokołów immunohistochemicznych i zastosowanych przeciwciał.

Barwienie immunologiczne, podobnie jak prawidłowe utrwalanie tkanek, jest ważną częścią badań biomedycznych. Dobrze przeprowadzone barwienie immunologiczne może rzucić światło na nieznane wcześniej aspekty struktury i funkcji komórek. Barwienie immunofluorescencyjne skrawków parafiny może być trudne ze względu na modyfikacje fizykochemiczne wynikające z procesu utrwalania i zatapiania parafiny⁵. Utrwalanie i osadzanie parafiny powoduje maskowanie antygenu, które może zakłócać immunofluorescencyjne wykrywanie epitopów będących przedmiotem zainteresowania⁶. Opóźnione utrwalenie może wywołać degradację proteolityczną, co skutkuje osłabieniem lub brakiem barwienia krytycznych epitopów⁷. Ponadto przeciwciała są często niedokładne przy wysokim poziomie tła. Protokoły barwienia immunologicznego, które promują spójne i swoiste wiązanie przeciwciał oraz wysoki stosunek sygnału do szumu, mogą dostarczyć cennych informacji dla badaczy.

Tutaj oferujemy kompleksowy protokół przeznaczony do uzyskiwania wysokiej jakości obrazów immunofluorescencyjnych poprzez utrwalanie tkanki jelitowej, szwajcarskie przygotowanie rolki⁸, oraz barwienie immunologiczne. Kładąc nacisk na wytyczne dotyczące zachowania integralności jelita, protokół ma na celu zapewnienie naukowcom solidnej metodologii w celu poprawy jakości i wiarygodności badań obrazowania immunofluorescencyjnego. Staraliśmy się również wykorzystać opłacalne zasoby, w tym bibułę filtracyjną i domowe pobieranie antygenu, roztwory blokujące i rozcieńczalniki przeciwciał, aby protokół był bardziej dostępny dla laboratoriów, które mogą mieć ograniczone fundusze. Podobnie jak w przypadku wszystkich protokołów eksperymentalnych, badacze powinni zoptymalizować obecny protokół w oparciu o swoje podejście eksperymentalne i obszary zainteresowania.

Protokół

Instytucjonalny Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania Uniwersytetu Medycznego Południowej Karoliny zatwierdził całą opiekę, utrzymanie i leczenie zwierząt. Tkankę jelitową pobrano od dorosłych myszy C57BL/6J (samce i samice w wieku 3-5 miesięcy, o masie około 30 g) do wykorzystania w niniejszym badaniu.

1. Utrwalenie tkanki jelitowej

1. Ostrożnie wypreparuj całe jelito myszy poddanej eutanazji i umieść je w łodzi wagowej lub szalce Petriego zawierającej sól fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS).
2. Usuń jelita z PBS i za pomocą nożyczek delikatnie usuń nadmiar tłuszczu i tkanki łącznej. Przecięcie tkanki łącznej pomaga tkance ułożyć się płasko podczas kolejnych etapów.
3. Podziel jelito na poszczególne segmenty za pomocą nożyczek (tj. dwunastnica, jelito czcze, jelito kręte, jelito ślepe i okrężnica). Podziel segmenty na podstawie cech anatomicznych i/lub długości, przy czym około 13% długości jelita to dwunastnica, 58% to jelito czcze, 8% to jelito kręte, 6% to jelito ślepe, a okrężnica to 15%⁹. Dwunastnica podąża za żołądkiem, a jelito kręte jest końcowym odcinkiem jelita cienkiego bezpośrednio przed jelitem ślepym.
4. Uwolnij okrężnicę, przecinając ją w miejscu, w którym łączy się z jelitem ślepym, za pomocą nożyczek. Umieść dwunastnicę, jelito czcze, jelito kręte i okrężnicę w łodzi do ważenia lub szalce Petriego PBS. Wyrzuć jelito ślepe lub napraw je zgodnie z innymi opublikowanymi metodami¹⁰.
5. Przymocuj końcówkę pipety P200 do strzykawki o pojemności 10 ml, odcinając duży koniec końcówki żyletką. Napełnić strzykawkę PBS.
6. Włożyć końcówkę strzykawki do otworu odcinka jelita za pomocą kleszczy. Użyj kleszczyków, aby przytrzymać odcinek jelitowy na strzykawce i delikatnie przepłukać z szybkością ~50 μL/s, aby usunąć zawartość jelitową. Zbierz zawartość jelit do pustej łódki wagowej lub szalki Petriego.
7. Połóż mokry odcinek jelita w linii prostej na pasku suchej etylozowej bibuły filtracyjnej (patrz Tabela materiałów). Upewnij się, że segment jelitowy jest wystarczająco mokry, aby prawidłowo przylegał do suchej bibuły filtracyjnej. Oznacz bibułę filtracyjną informacjami o liczbie myszy, genotypie, grupie eksperymentalnej itp. za pomocą ołówka.
   UWAGA: Używanie długopisu do etykietowania bibuły filtracyjnej może spowodować utratę etykiet podczas utrwalania.
8. Użyj nożyczek preparacyjnych, aby przeciąć jelito wzdłuż linii krezki. Ciąć ~ 5 mm na raz, używając dolnej krawędzi nożyczek lub kleszczy, aby położyć pociętą tkankę płasko na bibule filtracyjnej. Kontynuuj, aż cały odcinek jelita zostanie przecięty i ułożony płasko na bibule filtracyjnej. Uważaj, aby przeciąć jelito w jak najbardziej prostej linii, ponieważ ułatwi to zwijanie tkanki.
   UWAGA: Na tym etapie można użyć nożyczek z końcówką kulkową, aby uniknąć uszkodzenia tkanek.
9. Umieść kolejny kawałek bibuły filtracyjnej na segmencie jelitowym. Upewnij się, że bibuła filtracyjna przylega do odcinka jelita, zapobiegając zwijaniu się jelita lub utracie spłaszczonego kształtu podczas utrwalania.
10. Zszyj krawędzie bibuły filtracyjnej, aby zabezpieczyć tkankę na miejscu. Nie zszywać chusteczki. Umieść wystarczającą ilość zszywek wokół tkanki, aby zapobiec oderwaniu się tkanki od bibuły filtracyjnej podczas mocowania.
11. Powtórz kroki 1,5-1,10 dla każdego z segmentów jelita (dwunastnica, jelito czcze, jelito kręte i okrężnica).
12. Zanurz tkanki w 10% normalnej buforowanej formalinie (lub utrwalaczu z wyboru, takim jak 4% paraformaldehyd, utrwalacz Carnoya itp.) przez noc w temperaturze 4 °C.
    UWAGA: Upewnij się, że noszone są odpowiednie środki ochrony osobistej, ponieważ utrwalacze, takie jak formalina, są toksyczne.

2. Zwijanie i przetwarzanie tkanki jelitowej

UWAGA: Wykonaj kroki 2.1-2.6 w wentylowanym kapturze.

1. Delikatnie usuń górny kawałek bibuły filtracyjnej (ten, który dotyka światła po stronie jelita). Użyj kleszczy, aby ostrożnie oderwać jelito od dolnego kawałka bibuły filtracyjnej. Wyrzuć bibułę filtracyjną.
2. Napełnij trzy łodzie wagowe PBS. Umyj chusteczkę w PBS 3x, aby usunąć formalinę z tkanki.
3. Używając kleszczy o odwróconym działaniu (patrz Tabela materiałów), podnieś kawałek jelita wzdłuż krótszej krawędzi stroną świetlną skierowaną do góry. Obróć kleszcze, aby zwinąć chusteczkę. Użyj pary zwykłych kleszczy, aby pomóc w prowadzeniu tkanki podczas jej zwijania. Jeśli chusteczka zostanie złożona, rozwiń ją i spróbuj ponownie.
4. Umieść tkankę w suchej łodzi do ważenia lub na szalce Petriego. Przytrzymaj tkankę na miejscu za pomocą kleszczy w jednej ręce. Ostrożnie otwórz kleszcze o odwrotnym działaniu i uwolnij tkankę, używając innych kleszczy do usunięcia tkanki z kleszczy o odwrotnym działaniu.
5. Włożyć szpilkę do preparowania w rozmiarze 00 lub szpilkę do drobnego rozmiaru do tkanki (patrz Tabela Materiałów). Użyj nożyc do drutu, aby usunąć ostrą końcówkę kołka. Umieść chusteczkę w dużej kasecie, a następnie umieść kasetę w pojemniku zawierającym 70% etanol, aż będzie gotowa do przetworzenia.
6. Powtórz kroki 2.1-2.5 ze wszystkimi segmentami jelita (dwunastnica, jelito czcze, jelito kręte i okrężnica), umieszczając wszystkie cztery rolki tkanek w tej samej dużej kasecie (patrz Tabela materiałów). Upewnij się, że kaseta jest oznaczona ołówkiem, aby zapobiec zmywaniu się etykiety w roztworach etanolu i ksylenu (patrz Tabela materiałów).
7. Po zrolowaniu wszystkich próbek umieść je w procesorze tkankowym. Użyj następujących ustawień dla tkanki jelitowej: 70% etanolu przez 35 minut; 90% etanolu przez 35 min; 95% etanolu przez 35 min; 100% etanol przez 35 min, 3x; ksylen przez 35 min, 3x; parafina przez 60 min, 3x. Kasety można pozostawiać w stopionym wosku parafinowym przez dłuższy czas.
   UWAGA: Upewnij się, że noszony jest odpowiedni sprzęt ochronny, ponieważ ksylen jest toksyczną substancją chemiczną.

3. Osadzanie tkanki jelitowej

1. Rozgrzej duże formy do zatapiania, aby parafina się stopiła.
2. Wyjmij kasety z procesora tkanek i umieść je w zlewce ze stopioną parafiną.
3. Na stacji zatapiania umieść niewielką ilość parafiny w formie. Wyjmij cztery szwajcarskie rolki z kasety i umieść je wszystkie w jednej formie, układając je tak płasko, jak to możliwe. Dodaj więcej parafiny, aby wypełnić formę.
4. Przenieś formę na zimną płytę i upewnij się, że wszystkie szwajcarskie bułki leżą płasko na dnie formy. Umieść oznaczoną małą kasetę (patrz Tabela materiałów) na formie i w razie potrzeby dodaj więcej parafiny.
5. Gdy wosk zastygnie, wyjmij blok z formy. Tkanka jest teraz gotowa do pokrojenia na plastry o grubości 5 μm i unoszenia na naładowanych szkiełkach w celu barwienia immunologicznego¹¹.

4. Przyleganie tkanek i przygotowanie preparatu

1. Aby upewnić się, że przygotowany wycinek tkanki parafinowej o grubości 5 μm przylega do szkiełka, należy podgrzewać szkiełka podstawowe na podgrzewaczu do szkiełek lub bloku grzewczym ustawionym na 60 °C przez 15-30 minut. Szkiełka można również pozostawić w cieple na dłużej; ten krok nie jest wrażliwy na czas.
2. Pozostaw szkiełka do ostygnięcia do temperatury pokojowej (~15 min).

5. Deparafinizacja

1. Po rozpoczęciu odparafinowania szkiełek należy upewnić się, że tkanka pozostaje w roztworze i nie wysycha przez cały cykl barwienia immunologicznego.
2. Użyj stojaka na szkiełka (patrz Tabela materiałów), aby przytrzymać szkiełka podstawowe i umieścić je w naczyniu odpornym na rozpuszczalniki (patrz Tabela materiałów), które jest wypełnione odczynnikiem do klarowania/odparafinowania (patrz Tabela materiałów). Upewnij się, że odczynnik całkowicie pokrywa tkankę na każdym szkiełku. Przed całkowitym zanurzeniem szkiełek w odczynniku czyszczącym, należy kilkakrotnie zanurzyć lub wstrząsnąć stojakiem na szkiełka w roztworze czyszczącym. Pozostaw slajdy zanurzone na 10 minut lub dłużej.
   UWAGA: Ten krok może być konieczny do wykonania w wentylowanym okapie ze względu na niebezpieczne opary, w zależności od wybranego środka czyszczącego. Deparafinizacja tkanki na tym etapie nie jest wrażliwa na czas, jeśli używa się nietoksycznego środka czyszczącego.
3. Wyjmij i zamieszaj stojak na szkiełka, aby usunąć nadmiar odczynnika czyszczącego. W nowym naczyniu odpornym na rozpuszczalniki powtórzyć krok 5.2.
4. W nowym naczyniu odpornym na rozpuszczalniki powtórzyć krok 5.3. Pozostaw szkiełka zanurzone na 15 minut lub dłużej. Ten krok nie jest wrażliwy na czas.

6. Nawodnienie

1. Wyjmij i zamieszaj stojak na szkiełka, aby usunąć nadmiar odczynnika czyszczącego. W nowym, odpornym na rozpuszczalniki naczyniu wypełnionym 100% etanolem zanurz lub potrząśnij stojakiem na szkiełka kilka razy i pozostaw szkiełka zanurzone na 5 minut. Ten krok jest wrażliwy na czas. Powtórz 2 razy.
2. Wyjmij i wymieszaj stojak na szkiełka, aby usunąć nadmiar 100% etanolu. W nowym, odpornym na rozpuszczalniki naczyniu wypełnionym 95% etanolem zanurz lub przetrząśnij stojakiem na szkiełka kilka razy i pozostaw szkiełka zanurzone na 5 minut. Ten krok jest wrażliwy na czas. Powtórz 1x.
3. Wyjmij i zamieszaj stojak na szkiełka, aby usunąć nadmiar 95% etanolu. W nowym, odpornym na rozpuszczalniki naczyniu wypełnionym 70% etanolem zanurz lub przetrząśnij stojakiem na szkiełka kilka razy i pozostaw szkiełka zanurzone na 5 minut. Ten krok jest wrażliwy na czas.
4. Wyjmij i zamieszaj stojak na szkiełka, aby usunąć nadmiar 70% etanolu. W nowym, odpornym na rozpuszczalniki naczyniu wypełnionym 50% etanolem zanurz lub przetrząśnij stojak na szkiełka kilka razy i pozostaw szkiełka zanurzone na 5 minut. Ten krok jest wrażliwy na czas.
5. Wyjmij i wymieszaj stojak na szkiełka, aby usunąć nadmiar 50% etanolu. W nowym, odpornym na rozpuszczalniki naczyniu wypełnionym wodą dejonizowaną (DI) zanurz lub potrząśnij stojakiem na szkiełka kilka razy i pozostaw szkiełka zanurzone na 5 minut. Ten krok jest wrażliwy na czas.
   1. Aby zatrzymać się w tym miejscu, umieść szkiełka w pojemniku z PBS do czasu, aż barwienie immunologiczne będzie można wznowić po 5-minutowym etapie nawadniania wodą.

7. Pobieranie antygenu

1. Napełnij nowe naczynie odporne na rozpuszczalniki odpowiednim buforem do odzyskiwania antygenu. Bezpośrednio przenieś stojak przesuwny do tego rozwiązania. Upewnij się, że szkiełka są całkowicie zanurzone w roztworze do pobierania antygenu, całkowicie pokrywając tkankę.
   UWAGA: Optymalne roztwory do pobierania antygenu mogą się różnić w zależności od konkretnego stosowanego przeciwciała. Pobieranie antygenu wymagane dla poszczególnych przeciwciał może wymagać określenia przez badacza.
   1. Aby przygotować 1x bufor do odzyskiwania antygenu cytrynianowego, dodaj 2,94 g dwuwodnego cytrynianu sodu (patrz tabela materiałów) na 1 l wody dejonizowanej. Po rozpuszczeniu dwuwodnego cytrynianu sodu dodawać chlorowodór (patrz tabela materiałów), aż roztwór osiągnie pH 6. Na koniec dodaj 500 μl Tween20 (patrz tabela materiałów) na 1 l wody dejonizowanej.
   2. Aby zrobić 1x bufor do odzyskiwania antygenu Tris-EDTA, dodaj 1,211 g zasady Tris i 0,292 g EDTA w 1 litrze wody dejonizowanej. Po rozpuszczeniu dostosuj do pH 9.
2. Przykryj naczynie odporne na działanie rozpuszczalników zawierające roztwór do pobierania antygenu i szkiełka pokrywką i zabezpiecz pokrywkę gumowymi opaskami.
3. Umieść bezpieczne, odporne na rozpuszczalniki naczynie w szybkowarze (patrz Tabela materiałów) na metalowym stojaku lub podstawce. Upewnij się, że w szybkowarze jest wystarczająca ilość wody, aby dotrzeć do metalowego stojaka lub podstawki, aby ciśnienie mogło wzrosnąć.
4. Umieść pokrywkę na szybkowarze i przekręć zgodnie z ruchem wskazówek zegara, aby zablokować pokrywę na miejscu. Przekręć zawór ograniczający ciśnienie, który znajduje się na pokrywie, do ustawienia ciśnienia.
5. W ustawieniach menu wybierz wysokie ciśnienie w szybkowarze, a następnie w ustawieniu czasu ustaw szybkowar na 30 minut. Wybierz Start.
6. Po 30 minutach szybkowar wyda sygnał dźwiękowy i automatycznie ustawi się na ustawienie utrzymywania ciepła. Poczekaj, aż ciśnienie naturalnie spadnie, a pokrywka swobodnie się odkręci.
7. Użyj rękawic żaroodpornych (patrz tabela materiałów), aby wyjąć naczynie odporne na rozpuszczalniki z szybkowaru i zdjąć gumkę i pokrywkę. Umieść naczynie w łaźni lodowej na ~30 minut, aby szkiełka ostygły do temperatury pokojowej. Ten krok nie jest wrażliwy na czas.
8. Po schłodzeniu do temperatury pokojowej wyjmij ruszt szkiełkowy z naczynia odpornego na rozpuszczalniki i umieść go w nowym naczyniu odpornym na rozpuszczalniki wypełnionym wodą demineralizowaną, aby usunąć resztki roztworu do pobierania antygenu. Upewnij się, że prowadnice są całkowicie zanurzone.
9. Wyjmij ruszt do szkiełek z wodą DI i umieść go w nowym, odpornym na rozpuszczalniki naczyniu wypełnionym PBS na 5 minut. Upewnij się, że szkiełka są całkowicie zanurzone. Ten krok nie jest wrażliwy na czas.

8. Blokowanie niespecyficznego barwienia tła

1. Przygotuj nawilżoną komorę, biorąc duże pudełko szkiełkowe i zdejmując tekturową pokrywę przyklejoną do pokrywy. U podstawy pudełka na slajdy umieść wilgotne ręczniki papierowe pionowo w dół. Upewnij się, że wilgotne ręczniki papierowe leżą płasko.
2. Wyjmuj slajd pojedynczo ze stojaka na slajdy zanurzonego w PBS. Ostrożnie zetrzyj nadmiar PBS ze szkiełka, omijając chusteczkę.
3. Za pomocą pisaka hydrofobowego (patrz Tabela materiałów) utwórz barierę otaczającą tkankę, rysując pudełko wokół tkanki za pomocą hydrofobowego pisaka. Należy uważać, aby unikać chusteczki i nie używać pisaka hydrofobowego zbyt blisko tkanki.
4. Umieść zarysowaną prowadnicę poziomo na wilgotnych ręcznikach papierowych. Dodać bufor blokujący, aby pokryć tkankę (~100 μL).
   1. Aby utworzyć bufor blokujący, dodaj 100 μl żelatyny ze skóry ryb zimnowodnych (żelatyna Teleostein; patrz tabela materiałów) do 9,85 ml PBS. Na koniec dodać 50 μl 20% Triton X-100 (patrz tabela materiałów) i mieszać aż do rozpuszczenia.
5. Powtórz kroki 8.2-8.4 dla każdego slajdu. Zamknąć nawilżoną komorę i inkubować szkiełka w temperaturze pokojowej przez 90 min.

9. Blokowanie myszy na myszy

1. W przypadku stosowania pierwszorzędowego przeciwciała mysiego do barwienia immunologicznego tkanki myszy należy wykonać dodatkowy etap blokowania. Odczynniki blokujące "mysz na myszy" (blok "mysz na myszy"; patrz Tabela materiałów) są dostępne w handlu; Postępuj zgodnie z instrukcjami handlowymi podczas przygotowywania bloku mysz na myszy.
2. Delikatnie strzepnąć roztwór blokujący i natychmiast dodać przygotowany blok mysz na myszy, aby pokryć tkankę (~100 μL). Powtórz te czynności dla każdego szkiełka zawierającego tkankę myszy, która zostanie wybarwiona przy użyciu pierwszorzędowego przeciwciała wyhodowanego u myszy.
3. Skrawki tkanek inkubować w wilgotnej komorze w temperaturze pokojowej przez 15 minut.
4. Wyjmij szkiełka z nawilżonej komory i umieść je bezpośrednio w stojaku na slajdy zanurzonym w PBS. Pozostaw szkiełka w PBS na 5 minut, aby zmyć blok myszy na myszy.

10. Przeciwciała pierwszorzędowe

1. Dla każdego slajdu wybierz interesujące nas pierwszorzędowe przeciwciała, które są hodowane u różnych gatunków. Rozcieńczyć przeciwciała pierwszorzędowe w rozcieńczalniku przeciwciał zgodnie z instrukcją producenta. Zastosowano następujące przeciwciała pierwszorzędowe: E-CADHERIN (1:100), MUC2 (1:200), PCNA (1:500), LAMININ (1:200), β-KATENINA (1:200) i LAMP1 (1:50).
   UWAGA: Jeśli producent nie podaje zalecanych rozcieńczeń, dobrym punktem wyjścia jest rozcieńczenie 1:100. Jeśli pierwszorzędowe przeciwciało będące przedmiotem zainteresowania jest sprzężone z fluoroforem, patrz krok 12.2.
   1. Aby przygotować rozcieńczalnik przeciwciał, dodaj bufor blokujący 1:20 do PBS, jeśli używasz buforu blokującego żelatynę rybną opisanego powyżej.
2. Wyjmij szkiełka z PBS lub z nawilżonej komory, delikatnie strzepnij nadmiar roztworu blokującego lub PBS i umieść je poziomo z powrotem w nawilżonej komorze. Upewnij się, że bariera utworzona za pomocą pióra hydrofobowego w kroku 8.3 pozostaje; W razie potrzeby ponownie obrysuj tkankę.
3. Dodać odpowiednio rozcieńczone przeciwciała pierwszorzędowe, które mają być przedmiotem zainteresowania, aby pokryć tkankę (~100 μL).
4. Zamknąć wilgotną komorę i inkubować szkiełka podstawowe na płaskiej powierzchni w temperaturze 4 °C w ciemności przez noc.

11. Mycie szkiełek

1. Wyjąć szkiełka z nawilżonej komory, delikatnie stuknąć w przeciwciała pierwotne i umieścić szkiełka w stojaku na szkiełka zanurzonym w PBS na 5 minut.
2. Wyjmij ruszt do szkiełków i umieść go w nowym, odpornym na rozpuszczalniki naczyniu wypełnionym PBS na 5 minut. Powtórz krok 1x.

12. Wtórne przeciwciała i przeciwbarwienie jąder

1. Dla każdego szkiełka wybierz drugorzędowe fluorofory przeciwciał zaprojektowane do wiązania się z pierwszorzędowymi gatunkami przeciwciał. Rozcieńczyć fluorofory przeciwciał drugorzędowych lub sprzężone przeciwciała pierwszorzędowe w rozcieńczalniku przeciwciał drugorzędowych. Użytymi drugorzędowymi przeciwciałami były: anty-koza osła 488 (1:200), anty-królik cy3 osła (1:200), osła anty-mysz 647 (1:200), osła anty-królik 647 (1:200) i osła anty-szczur cy3 (1:200). Pierwszorzędowe przeciwciało γ-AKTYNA sprzężona z fluoroforem 647 zastosowano w rozcieńczeniu 1:100.
   1. Aby uzyskać drugorzędowy rozcieńczalnik przeciwciał, dodaj bufor blokujący 1:100 do PBS, jeśli używasz buforu blokującego żelatynę rybną, jak opisano powyżej.
2. Wyjmij szkiełka z PBS, delikatnie strzepnij nadmiar PBS i umieść je poziomo z powrotem w wilgotnej komorze. Upewnij się, że bariera utworzona za pomocą pióra hydrofobowego w kroku 8.3 pozostaje; W razie potrzeby ponownie obrysuj tkankę.
3. Dodaj odpowiednio rozcieńczone fluorofory przeciwciał drugorzędowych lub sprzężone przeciwciała pierwszorzędowe będące przedmiotem zainteresowania, aby pokryć tkankę (~100 μL).
4. Zamknij nawilżoną komorę i inkubuj szkiełka w temperaturze pokojowej w ciemności przez 1 godzinę.
5. Rozcieńczyć 10 mg/ml Hoechst (patrz tabela materiałów) lub DAPI za pomocą PBS dla końcowego stężenia 1 μg/ml Hoechst lub DAPI za pomocą PBS i dodać bezpośrednio do tkanki (~100 μL). Inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej w ciemności.
6. Wyjmij szkiełka z nawilżonej komory i umieść je w stojaku na slajdy, który jest zanurzony w PBS na 5 minut w ciemności.
7. Wyjmij ruszt do szkiełka i umieść w nowym naczyniu odpornym na rozpuszczalniki wypełnionym PBS na 5 minut w ciemności. Powtórz krok 1x.

13. Montaż i przygotowanie do mikroskopii

1. Wyjmuj po jednym slajdzie ze stojaka na slajdy zanurzonego w PBS, pozostawiając pozostałe slajdy zanurzone w PBS w ciemności. Delikatnie strzepnij nadmiar PBS i, jeśli to konieczne, użyj niestrzępiącej się chusteczki, aby ostrożnie zetrzeć nadmiar PBS ze szkiełka, omijając chusteczkę.
2. Dodaj jedną lub dwie krople podłoża mocującego zapobiegającego blaknięciu (patrz Tabela materiałów) na środek tkanki.
3. Chwyć czyste szkiełko nakrywkowe (patrz Tabela materiałów) za krawędzie i powoli opuść je na szkiełko pod kątem 45°. Upewnij się, że podłoże montażowe równomiernie rozprowadza się po tkance.
4. Zaczynając od środka tkanki, delikatnie dociśnij szkiełko nakrywkowe dwoma palcami, aby usunąć pęcherzyki powietrza i nadmiar podłoża mocującego. W razie potrzeby kontynuuj naciskanie w kierunku krawędzi i utrzymuj delikatny nacisk przez cały czas.
5. Odetnij małą końcówkę niefiltrowanej pipety P200 i przymocuj ją do końcówki pipety serologicznej podłączonej do próżni.
6. Podążając za krawędziami szkiełka nakrywkowego, użyj odkurzacza, aby usunąć nadmiar medium montażowego.
7. W nowym pudełku na szkiełka połóż szkiełko poziomo płasko i pozwól szkiełku wyschnąć w ciemności w temperaturze pokojowej.
8. Powtórz ten proces dla każdego slajdu.

Wyniki

Barwienie hematoksyliną i eozyną (H&E) zostało wykonane, jak opisano wcześniej¹². Stosując zoptymalizowaną metodę, szwajcarskie bułeczki jelitowe zawierały wszystkie trzy segmenty jelita cienkiego i jelita grubego na jednym szkiełku. Umieszczenie całego jelita na szkiełku pozwala naukowcom analizować zmiany we wszystkich częściach jelita i oszczędza koszty odczynników do cięcia i barwienia (Rysunek 1). Ponadto jednoczesne wystawienie wszystkich segmentów jelita na działanie tych samych roztworów podczas barwienia immunologicznego pomaga zapewnić dokładne wyniki. Mikrografia H&E pokazuje zachowaną architekturę jelitową wszystkich części jelita cienkiego i jelita grubego (Ryc. 2). Pomiar kosmków dwunastnicy nie wykazał znaczącej różnicy w wysokości kosmków w nieotwartej tkance jelitowej w porównaniu z tą szwajcarską metodą rolowania, co sugeruje, że otwarcie jelita nie zaburza architektury tkanki (Ryc. 2D). Barwienie immunologiczne jelitowych bułeczek szwajcarskich uwidacznia różne warstwy jelita, a także całą oś krypty kosmków. Obrazy fluorescencyjne pokazują niskie poziomy tła z pierwotnego i wtórnego barwienia przeciwciałami i wyraźnie przedstawiają poszczególne komórki obecne w nabłonku. Rysunek 3 pokazuje morfologię różnych segmentów jelita i barwienie komórek kubkowych (komórki dodatnie MUC2)¹³, błona wierzchołkowa (γ-ACTIN)¹⁴, błona boczna komórek nabłonkowych (E-CADHERIN)¹⁵, oraz jądra. Protokół ten jest odpowiedni do identyfikacji wielu różnych przedziałów komórkowych, w tym komórek proliferacyjnych (PCNA)¹⁶, śródmiąższu (LAMININ; Rysunek 4A)¹⁷, domena lizosomalna (LAMP1)¹⁴, oraz nabłonek (β-katenina; Rysunek 4B)¹⁸.

Rysunek 1: Przebieg pracy w celu przygotowania i przetwarzania jelitowych bułeczek szwajcarskich. (A) Segmenty jelita są przepłukiwane strzykawką zawierającą PBS, a następnie myte w PBS. (B) Mokrą tkankę jelitową umieszcza się następnie na suchej bibule filtracyjnej. (C) Jelito jest rozcinane wzdłużnie na bibule filtracyjnej i (D) delikatnie rozchylane. (E) Kawałek bibuły filtracyjnej kładzie się na otwartym jelicie, a jelito delikatnie umieszcza się między bibułą filtracyjną i zszywa. Segmenty jelita są mocowane przez noc, a (F) zwija się za pomocą kleszczy. (G) Jelito jest delikatnie wyrywane z kleszczy o odwrotnym działaniu, oraz (H) ma wygląd rozety. (I, J) Tkanka jelitowa jest przypinana i umieszczana w dużej kasecie. (K) Wszystkie cztery segmenty jelita umieszcza się w tej samej kasecie w celu przetwarzania i osadzania tkanek. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Barwienie hematoksyliną i eozyną wszystkich czterech segmentów jelita. (A) Skanowanie kafelków demonstruje zdolność do wizualizacji całego jelita na jednym szkiełku z pojedynczymi szwajcarskimi rolkami dwunastnicy, jelita czczego, jelita krętego i okrężnicy. (B) Mikrofotografia szwajcarskiej rolki jelitowej i (C) wstawka w większym powiększeniu, aby pokazać architekturę kosmków i krypty. (D) Kwantyfikacja długości kosmków jelita cienkiego w jelicie cienkim nie wykazuje znaczącej różnicy między tkanką szwajcarską a tkanką nieotwartą. Podziałka = 1000 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Barwienie immunofluorescencyjne wszystkich czterech segmentów jelita. Dorosłe myszy kontrolne C57BL / 6J zostały wybarwione immunologicznie pod kątem jąder (cyjan), markera błony bocznej, E-CADHERIN (zielony), komórek kubkowych zidentyfikowanych przez MUC2 (żółty) i znacznika granicy wierzchołkowej szczotki, γ-ACTIN, (magenta). Podziałka = 50 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4. Barwienie immunofluorescencyjne jelita. (A) Reprezentatywna mikrofotografia barwienia immunofluorescencyjnego jelita myszy uwydatnia jądra (cyjan), komórki proliferacyjne, PCNA (zielony) i blaszkę właściwą, LAMININĘ (magenta). (B) Obraz immunofluorescencyjny identyfikujący jądra (cyjan), marker błony komórkowej β-katenina (zielony) i marker lizosomów LAMP1 (magenta) w jelicie. Podziałka liniowa = 50 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

W tym miejscu przedstawiamy zoptymalizowaną metodę utrwalania tkanek przy użyciu szwajcarskiej techniki rolkowej w celu zachowania architektury jelit i promowania dokładnego barwienia immunologicznego. Po opanowaniu technika ta może być wykorzystana do zbadania szerokiej gamy pytań badawczych związanych z fizjologią jelit i biologią komórki¹⁹. Opublikowano kilka zoptymalizowanych szwajcarskich metod walcowania, które są bardzo przydatne^20,21. Zaletą tej techniki jest łatwość dokładnego otwarcia jelita na bibule filtracyjnej. Pozwala to na płaskie unieruchomienie tkanki, zapobiegając zwijaniu się tkanki do wewnątrz podczas toczenia, co jest szczególnie pomocne podczas analizy tkanki objętej stanem zapalnym z pogrubionymi mięśniami. Ponadto należy podkreślić kluczową rolę sekcji tkanek w osiąganiu wiarygodnych wyników. Prawidłowe sekcjonowanie zapewnia zachowanie architektury tkanki i ułatwia dokładne barwienie immunologiczne, co ostatecznie przyczynia się do sukcesu dalszych analiz¹¹. Zoptymalizowane podejście jest mniej trudne w porównaniu z innymi protokołami, dając spójne wyniki u różnych osób. Technika przedstawiona w tym artykule zapewnia również dobrze zachowaną architekturę tkankową, wszechstronność i wysoce powtarzalne barwienie immunologiczne przy użyciu różnych przeciwciał.

Krytycznym aspektem tego protokołu jest czas utrwalania i przetwarzania. Niewłaściwe utrwalenie i przetwarzanie tkanek może zakłócić analizę histochemiczną. Tkanka, która jest nadmiernie utrwalona, staje się krucha, podczas gdy tkanka niedostatecznie utrwalona pozostaje zbyt miękka. Zarówno nadmiernie utrwalone, jak i niedostatecznie utrwalone tkanki są trudne do przekroju i pogarszają barwienie immunologiczne. Po wypreparowaniu na bibułę filtracyjną tkankę należy natychmiast umieścić w formalinie, aby zmniejszyć zmiany pośmiertne²². W tym protokole tkanka mysia jest utrwalana w formalinie przez noc. W kilku badaniach wykorzystano ten czas fiksacji 20,23,24. Jednak Boenisch i wsp. wykazali, że barwienie immunologiczne jest spójne w tkance utrwalonej w formalinie przez okres do 4 dni²⁵. W zależności od pożądanych analiz wymagana jest optymalizacja czasu mocowania i utrwalacza. Na przykład utrwalacz Carnoya jest często preferowany do barwienia śluzu²⁶. Wybór utrwalaczy i czas trwania utrwalania powinien być optymalizowany przez każdego badacza w zależności od jego podejścia eksperymentalnego. Zaleca się stosowanie automatycznego procesora tkanek w celu zapewnienia dokładnych i spójnych czasów przetwarzania. Nasze laboratorium używa małych szpilek do utrzymywania tkanki jelitowej na miejscu w postaci rolek. Bez szpilek tkanka może się rozwinąć podczas przetwarzania. Ponieważ te szpilki są dość małe i ostre, należy podjąć środki ostrożności. Zalecamy użycie nożyc do drutu w celu usunięcia ostrego końca szpilki przed obróbką tkanki. Niektóre rdzenie histologiczne nie akceptują tkanek z szpilkami; Dlatego najlepiej sprawdzić przed użyciem. Alternatywnym podejściem jest użycie agaru do zakotwiczenia tkanki przed przetworzeniem²⁷ lub gąbki kasetowe mogą być używane w kasetach, aby pomóc w utrzymaniu rolek.

Barwienie immunologiczne to protokół, który wymaga optymalizacji dla każdego przeciwciała. W miarę możliwości zaleca się stosowanie przeciwciał zwalidowanych przez nokaut. Ta metoda utrwalania i przetwarzania tkanek powoduje wyraźne barwienie, co pozwala na łatwą identyfikację wiązania przeciwciał w porównaniu z sygnałem tła, gdy stosowane są niezwalidowane przeciwciała. Wybór utrwalacza, pobieranie antygenu i rozcieńczanie przeciwciał mogą mieć wpływ na swoistość przeciwciała. Zalecamy, aby badacze dokładnie ocenili i zoptymalizowali protokół, dostosowując fiksację, pobieranie antygenu i czas inkubacji dla każdego przeciwciała. Aby uzyskać najlepsze wyniki, przeciwciała należy testować w różnych rozcieńczeniach w celu określenia optymalnego stężenia i w różnych do pobierania antygenu. Pobieranie epitopów poprawia barwienie immunologiczne poprzez rozbijanie mostków metylenowych powstałych podczas utrwalania. W tym protokole stosuje się odzyskiwanie epitopów indukowane ciepłem, a nie odzyskiwanie epitopów indukowane proteolityzmem, ponieważ trawienie enzymatyczne jest bardziej prawdopodobne, że zakłóci morfologię tkanek²⁸. Najczęstszymi do odzyskiwania epitopów indukowanymi ciepłem są bufor cytrynianowy, tris-HCl i tris-EDTA, przy czym bufor cytrynianowy jest najłagodniejszy pod względem morfologii tkanek²⁹. Wybór buforu jest różny i powinien być określony dla każdego przeciwciała. W handlu dostępnych jest wiele do odzyskiwania antygenów, roztworów blokujących i rozcieńczalników przeciwciał. Jednak rozwiązania te mogą być niezwykle drogie i zbyt kosztowne. Dostarczyliśmy receptury popularnych roztworów do odzyskiwania antygenów oraz roztworów blokujących i rozcieńczalników przeciwciał, aby zapewnić opłacalność.

Ograniczeniem tej metody jest to, że utrwalanie i przetwarzanie może zmieniać tkanki i maskować epitopy. Alternatywnym podejściem jest barwienie immunologiczne świeżo zamrożonej tkanki. Świeżo zamrożona tkanka jest zamrażana błyskawicznie, co pozwala uniknąć narażenia na toksyczne utrwalacze, zachować strukturę białka i poprawić dostępność niektórych epitopów. Jednak architektura i morfologia tkanek są gorsze niż w przypadku tkanek utrwalonych i zanurzonych w parafinie. Kolejne wyzwania związane ze świeżo mrożoną tkanką obejmują materiały i logistykę wymaganą do cięcia i przechowywania zamrożonych bloków i szkiełek. Analiza szwajcarskich bułek w porównaniu z paskami tkanki jelitowej pokazuje różnice w wysokości i szerokości kosmków oraz różnice w komórkach odpornościowych w blaszce właściwej, jak opisano we wcześniejszym raporcie³⁰. Wyniki te sugerują, że jelitowe bułeczki szwajcarskie zmieniają niektóre cechy jelit, które należy wziąć pod uwagę przy planowaniu eksperymentów. Ponadto wymagana jest ponowna walidacja przeciwciał, ponieważ wiele przeciwciał, które wiążą się specyficznie z tkanką zatopioną w parafinie utrwalonej w formalinie, nie barwi się dobrze w świeżo zamrożonej tkance³¹.

Barwienie immunologiczne tkanki jelitowej może być wykorzystane do udzielenia odpowiedzi na wiele różnych pytań dotyczących biologii i fizjologii komórek przewodu pokarmowego. Technika ta jest szeroko stosowana do identyfikacji zmian nabłonkowych w przebiegu zapalenia jelit, po infekcji bakteryjnej oraz podczas progresji raka. Przedstawiona tutaj metoda jest idealna do konserwacji tkanki jelitowej, ponieważ jest opłacalna, nie stanowi wyzwania technicznego i jest wysoce powtarzalna. Aby zapewnić najlepsze wyniki, zachęcamy do optymalizacji kroków opisanych w niniejszym protokole w oparciu o projekt eksperymentalny i testowaną hipotezę.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
β-CATENIN	GeneTex	GTX101435
Celulozowa bibuła filtracyjna	Cytiva	10427804	Gruby papier Whatman
Szkiełka szklane z ładunkiem	Thermo Fisher Scientific	23888114
Szkiełko nakrywkowe	Epredia	152440
Szpilki preparacyjne rozmiar 00	Phusis	B082DH4TZF
E-CADHERIN	R& D Systems	AF748
Rękawice do zamrażania	Tempshield	UX-09113-02
Blok grzewczy	Premiere	XH-2001	Podgrzewacz do slajdów
Histo-Clear II	Mikroskopia elektronowa Sciences	64111-04	Odczynnik czyszczący
Hoescht	Thermo Fisher Scientific	62249
Kwas solny	Sigma Aldrich	320331
Długopis hydrofobowy	Millipore	402176
LAMININ	GeneTex	GTX27463
LAMP1	Santa Cruz	SC-19992
Duże kasety	Tissue-Tek	4173
Szpilki Minutien	Narzędzia do nauki	precyzyjnej NC9679721
Odczynnik blokujący Mysz na myszy	Vector Laboratories	MKB-2213	Blok myszy na myszy
MUC2	GeneTex	GTX100664
Technologia sygnalizacji komórkowej	PCNA	2586S
Szybkowar	Cuisinart	B000MPA044
ProLong złoty antifade	Thermo Fisher Scientific	P36934	Medium
montażowe Kleszcze odwrotnego działania	Dumont	5748
Stojak na slajdy	Tissue-Tek	62543-06
Zestaw do barwienia szkiełek	Tissue-Tek	62540-01	Naczynia odporne na rozpuszczalniki i metalowa rama
Małe kasety	Fisherbrand	15-200-403B
Cytrynian sodu dwuwodny	Fisher Bioreagents	BP327-1
Teleostein Gelatin	Sigma	G7765	Bufor blokujący
Triton X-100	Thermo Fisher Scientific	A16046
Tween 20	Thermo Fisher Scientific	J20605-AP
Chusteczki	KimTech	34155
Ksyleny	Fisher Chemical	1330-20-7
γ-ACTIN	Santa Cruz	SC-65638