Artykuł metodologiczny

Niezawodna detekcja amplifikacji genów w próbkach zatopionych w parafinie utrwalonych w formalinie poprzez fluorescencyjną hybrydyzację in situ

DOI:

10.3791/66978

⸱

12 lipca 2024

 ,  , 
1Children's Medical Center Research Institute, University of Texas Southwestern Medical Center, 2Department of Pathology, University of Texas Southwestern Medical Center

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół zapewnia powtarzalną metodę wizualizacji amplifikacji genów w próbkach tkanek z parafiną (FFPE) utrwaloną w formalinie.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ogniskowa amplifikacja genów, taka jak pozachromosomalne DNA (ecDNA), odgrywa ważną rolę w rozwoju raka i oporności na terapię. Podczas gdy metodologie oparte na sekwencjonowaniu umożliwiają bezstronną identyfikację ecDNA, techniki oparte na cytogenetyce, takie jak fluorescencyjna hybrydyzacja in situ (FISH), pozostają efektywne czasowo i kosztowo w identyfikacji ecDNA w próbkach klinicznych. Zastosowanie FISH w próbkach tkanek zatopionych w parafinie (FFPE) utrwalonych w formalinie oferuje unikalną drogę do wykrywania amplifikowanych genów, szczególnie gdy żywe próbki nie są dostępne do badania kariotypu. Brakuje jednak procedur konsensusu w odniesieniu do tej techniki. Protokół ten zawiera kompleksowe, w pełni zoptymalizowane instrukcje krok po kroku dotyczące przeprowadzania FISH w celu wykrycia amplifikacji genów, w tym ecDNA, w próbkach tkanek FFPE, które stanowią wyjątkowe wyzwania, które ten protokół ma na celu przezwyciężyć i ustandaryzować. Postępując zgodnie z tym protokołem, naukowcy mogą w powtarzalny sposób pozyskiwać wysokiej jakości dane obrazowe w celu oceny amplifikacji genów.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Badanie ogniskowej amplifikacji onkogenu jest kluczowe, ponieważ napędza powstawanie, progresję i oporność na terapię raka1. Co ważne, onkogeny i geny immunoregulacyjne mogą amplifikować się jako pozachromosomalne DNA (ecDNA), których asymetryczne dziedziczenie sprzyja heterogeniczności genetycznej w raku2,3. ecDNA zostało powiązane z opornością na terapię i niekorzystnymi wynikami klinicznymi4,5,6.

Próbki tkanek zatopionych w parafinie (FFPE) utrwalone w formalinie stanowią ogromny zasób archiwalny w laboratoriach patologicznych, oferując obfite informacje do badań retrospektywnych. Jednak ekstrakcja danych molekularnych z próbek FFPE za pomocą PCR lub sekwencjonowania jest trudna ze względu na fragmentację, degradację i sieciowanie kwasów nukleinowych podczas utrwalania7. Spośród szeregu technik dostępnych do analizy molekularnej tkanek FFPE, fluorescencyjna hybrydyzacja in situ (FISH) okazała się skuteczna w wizualizacji określonych sekwencji DNA8.

Pomimo postępu nowoczesnych technik diagnostyki molekularnej, zdolność FISH do wizualizacji i ilościowego określania amplifikacji genów na poziomie pojedynczej komórki dostarcza cennych informacji na temat mechanizmów molekularnych leżących u podstaw nowotworzenia i wyników klinicznych. Korzystając ze znakowanych fluorescencyjnie sond komplementarnych do docelowego genu będącego przedmiotem zainteresowania, FISH może wygodnie określić lokalizację onkogenu i wywnioskować formę amplifikacji onkogenu (taką jak ecDNA) w poszczególnych komórkach, co w innym przypadku jest niemożliwe lub kosztowne przy użyciu innych technologii. Dlatego FISH oferuje ekonomiczny sposób oceny heterogeniczności guza i ewolucji klonalnej9. Co więcej, postępy w automatyzacji, obrazowaniu i analizie obliczeniowej ułatwiły wysokoprzepustową analizę danych FISH, umożliwiając solidną kwantyfikację amplifikacji genów w dużych kohortach tkankowych10.

Jednak zastosowanie FISH do tkanki FFPE wiąże się z nieodłącznymi wyzwaniami, w tym z artefaktami sieciowania i autofluorescencji tła. Pokonanie tych przeszkód wymaga starannej optymalizacji każdej procedury, aby zapewnić dokładne i powtarzalne wyniki. W tym artykule przedstawiono krok po kroku, w pełni zoptymalizowany protokół stosowania FISH do badania amplifikacji genów w próbkach tkanek FFPE. Za pomocą sondy ukierunkowanej na locus genu ERBB2 (HER2) wykazaliśmy, że FISH może solidnie wykryć status amplifikacji ERBB2 w próbkach FFPE od pacjentek z rakiem piersi. Możliwe jest nawet oszacowanie, czy ERBB2 jest amplifikowany jako ecDNA. Syntetyzując istniejącą literaturę i wyniki naszych eksperymentów, wyjaśniamy względy metodologiczne, wyzwania techniczne i potencjalne pułapki analizy opartej na FISH. Omawiamy również kliniczne znaczenie profilowania amplifikacji genów w różnych typach nowotworów, podkreślając jego znaczenie prognostyczne i potencjał dla spersonalizowanych strategii terapeutycznych.

Podsumowując, ten artykuł podkreśla znaczenie FISH jako cennego narzędzia do badania amplifikacji genów w próbkach tkanek FFPE, oferując niezrównany wgląd w biologię nowotworów i pomagając w podejmowaniu decyzji klinicznych w onkologii. Dzięki ciągłemu udoskonalaniu i integracji z komplementarnymi testami molekularnymi, analiza oparta na projekcie FISH może jeszcze bardziej poszerzyć naszą wiedzę na temat patogenezy nowotworów i poprawić wyniki leczenia pacjentów w erze medycyny precyzyjnej.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół badawczy został zatwierdzony przez Institutional Review Board (IRB) University of Texas Southwestern Medical Center. Przed zabiegiem uzyskano świadomą zgodę od wszystkich pacjentów.

1. Przygotowanie odczynników i materiałów

  1. Przygotować 0,2 N roztwór chlorku sodu (HCl) w dygestorium, powoli dodając 8,212 ml HCl (37% m/w lub 12,1 N) do 491,788 ml ddH2O. Przechowywać w temperaturze pokojowej (RT).
    UWAGA: Powoli dodawaj kwas do wody. Nie dodawaj wody do kwasu.
  2. Przygotować 10 mM roztwór kwasu cytrynowego (pH 6,0), rozpuszczając 1,47 g cytrynianu trisodowego (dwuwodnego) w 400 ml ddH2O. Użyj HCl, aby dostosować do pH 6,0, a następnie doprowadzić końcową objętość do 500 ml za pomocą ddH2O. Przechowywać bufor w temperaturze pokojowej.
  3. Przygotować 10% roztwór Tween-20, dodając 100 μL Tween-20 do 900 μL ddH2O. Przechowywać go w temperaturze pokojowej.
  4. Przygotować 10% roztwór IGEPAL, dodając 5 ml IGEPAL CA-630 do 45 ml ddH2O. Przechowywać w temperaturze pokojowej.
  5. Przygotować 20 x roztwór SSC (pH 7,0, 3 M NaCl, 0,3 M cytrynian sodu), rozpuszczając 44,1 g cytrynianu trisodu (dwuwodnego) i 87,65 g chlorku sodu (NaCl) w 900 ml ddH2O. Użyj HCl, aby dostosować do pH 7,0, a następnie doprowadzić końcową objętość do 1000 ml za pomocą ddH2O. Przechowywać bufor w temperaturze pokojowej
  6. Przygotować roztwór 2x SSC, dodając 100 ml 20x SSC do 900 ml ddH2O. W razie potrzeby dodać 0,5 ml środka konserwującego (tabela materiałów). Przechowuj go w RT.
  7. Przygotować bufor hybrydyzacyjny sondy, mieszając 910 μl ddH2O, 500 μl 20x SSC, 50 μl 10% Tween-20, 40 μl RNazy A, 1 ml 50% siarczanu dekstranu i 2,5 ml formamidu. Porcjować w 1 ml i przechowywać w temperaturze -20 °C.
  8. Przygotować 0,4x SSC z 0,3% roztworem IGEPAL, mieszając 100 ml 2x SSC, 15 ml 10% IGEPAL i 385 ml ddH2O. Przechowywać w temperaturze pokojowej.
  9. Przygotować 2x SSC z 0,1% roztworem IGEPAL, dodając 5 ml 10% IGEPAL do 495 ml 2x roztworu SSC. Przechowuj go w RT.
  10. Świeżo przygotuj bufor do trawienia proteinazy K przed użyciem, dodając 1 μl proteinazy K do 99 μl buforu Tris-EDTA.
  11. Przygotować 1 mg/ml DAPI poprzez rozpuszczenie 1 mg DAPI w 1 ml ddH2O. Przechowywać w temperaturze -20 °C, z dala od światła. Przygotować roztwór roboczy DAPI, dodając 1 μl zapasu do przechowywania DAPI do 999 μl 2x roztworu SSC. Przechowywać z dala od światła do czasu użycia.

2. Wstępna obróbka próbki

UWAGA: Slajd używany tutaj zawiera próbkę.

  1. Postarzaj szkiełko w temperaturze 60-90°C przez 20 minut lub przez noc (Rysunek 1).
    UWAGA: Ten krok ułatwia topienie parafiny. Zwykle wystarcza 20 minut ogrzewania. Można go przedłużyć do nocy, aby dostosować się do harmonogramu.
  2. Odparafinować szkiełko, zanurzając je w ksylenie lub jego substytutach w słoiku z kopliny na 10 minut. Powtórz ten krok ze świeżym ksylenem lub jego substytutami. Wykonaj wszystkie poniższe czynności związane z obróbką wstępną i myciem w słoiku Coplin.
    UWAGA: Substytuty ksylenu są bezpieczną i przyjazną dla środowiska alternatywą dla ksylenu. Jeden z substytutów (patrz Tabela materiałów) działa równie dobrze jak ksylen, jeśli nie lepiej. Chociaż substytuty ksylenu wytwarzają mniej zapachu niż ksylen, zaleca się stosowanie go wewnątrz dygestoria. Jeśli substytuty ksylenu nie są dostępne, wszystkie procedury są zgodne z deparafinowaniem na bazie ksylenu bez żadnych zmian.
  3. Zmywaj substytut ksylenu 100% etanolem przez 5 minut.
  4. Nawodnij zjeżdżalnię za pomocą 70% zanurzenia w etanolu przez 5 minut.
  5. Zanurzyć szkiełko w 0,2 N kwasie solnym (HCl) w temperaturze pokojowej na 20 minut
    UWAGA: HCl skutecznie ekstrahuje białka rozpuszczalne w kwasach, takie jak podstawowe białka jądrowe, w celu poprawy dostępności DNA dla sond FISH11.
  6. Zanurzyć szkiełko w 10 mM gorącego roztworu kwasu cytrynowego i inkubować w temperaturze 90-95 °C przez 20 min.
    UWAGA: Obróbka kwasem cytrynowym w wysokich temperaturach podobnie ekstrahuje białka rozpuszczalne w kwasach. Uważa się, że obie metody leczenia kwasami ekstrahują białka macierzy zewnątrzkomórkowej w celu zmniejszenia autofluorescencji12. Zaleca się, aby roztwór cytrynowy został wstępnie podgrzany do żądanego zakresu temperatur przed nałożeniem na szkiełko. Kuchenka mikrofalowa może być na to wygodnym sposobem. Kąpiel wodna, taka jak kuchenka do sous vide, jest najskuteczniejszym i najbardziej ekonomicznym rozwiązaniem do inkubacji w wysokiej temperaturze.
  7. Przepłucz krótko szkiełko w 2x SSC, aby zneutralizować pH.
  8. Trawić tkankę, dodając 100-200 μl (wystarczająco, aby całkowicie pokryć tkankę, w zależności od wielkości sekcji) buforu do trawienia proteinazy K i inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 min.
    UWAGA: Trawienie proteinazy K dodatkowo zwiększa dostępność sond FISH i zmniejsza autofluorescencję. Czas trawienia powinien być zoptymalizowany w zależności od typu tkanki. W większości przypadków wystarczy 1 minuta trawienia. Nadmierne trawienie prowadzi do morfologii jąder w kształcie aureoli, a czas trawienia powinien zostać skrócony.
  9. Natychmiast przerwij trawienie proteinazy K i odwodnij szkiełko, zanurzając je w 70% etanolu na 2 minuty, a następnie poddaj je działaniu 85% i 100% etanolu na 2 minuty każde.

3. RYBY i obrazowanie

  1. Przygotuj mieszankę do hybrydyzacji FISH, rozcieńczając 2 μl bulionu z sondy FISH z 8 μl buforu hybrydyzacyjnego, a następnie nałóż ją na szkiełko. Przykryj próbkę szkiełkiem nakrywkowym.
    UWAGA: Całkowita ilość użytej sondy FISH waha się od 0,5 do 4 μl, w zależności od jakości obrazu. Jeśli sygnał jest zbyt niski, zwiększ wejście sondy. Zmniejsz wejście sondy FISH, jeśli tło jest zbyt wysokie, zwłaszcza gdy obserwuje się fluorescencyjne szczątki na zewnątrz jąder. Bufor hybrydyzacyjny może być dostarczony z sondami zakupionymi w handlu lub przygotowany zgodnie z sekcją 1.
  2. Umieść szkiełka na gorącej płycie, takiej jak system hybrydyzacji fosy szkiełkowej, aby denaturować DNA w temperaturze 75 °C przez 2-5 minut. Następnie przenieś szkiełko na inną płytę grzejną ustawioną w temperaturze 37 °C w celu hybrydyzacji przez noc.
    UWAGA: Jeśli płyta grzejna ma tacę na wodę lub zbiornik w celu utrzymania wilgotności podczas hybrydyzacji, uszczelnianie szkiełka nakrywkowego cementem gumowym nie jest konieczne.
  3. Po hybrydyzacji zanurzyć szkiełko w temperaturze 40-60 °C ogrzanym 0,4x SSC z 0,3% buforem myjącym IGEPAL CA-630, a następnie ostrożnie usunąć szkiełko nakrywkowe. Kontynuuj pranie dwa razy przez 5 minut w ciemności, mieszając przez pierwsze 10-15 s.
    UWAGA: Zanurzenie szkiełka w buforze do mycia pomaga delikatnie zwolnić szkiełko nakrywkowe.
  4. Myć szkiełko w SSC 0,1% IGEPAL CA-630 przez 5 min w temperaturze RT w ciemności, z mieszaniem przez pierwsze 10-15 s.
  5. Aby wygasić autofluorescencję, należy potraktować szkiełko zestawem do hartowania autofluorescencji (patrz Tabela materiałów), nakładając 150 μL odczynnika (50 μL + 50 μL + 50 μL odczynników A, B, C) przez 2-5 min, a następnie przemyć je 2x SSC przez 5 min.
    UWAGA: Jest to krok opcjonalny. Autofluorescencja tkankowa wywodzi się przede wszystkim ze składników macierzy zewnątrzkomórkowej, takich jak kolagen i elastyna. Znaczący wpływ mają również lizosomy i mitochondria ze względu na zawartość lipofuscyny, NADPH i koenzymu flawiny. Wiązanie aldehydu i obecność komórek krwi mogą również dobrze zwiększać autofluorescencję13,14.
  6. Szkiełko należy zabarwić DAPI przez 10 min. Przepłukać szkiełko 2x buforem SSC przez 5 min.
    UWAGA: Jeśli szkiełko nie zostanie poddane obróbce za pomocą zestawu do hartowania autofluorescencji, barwienie DAPI można skrócić do 2 minut.
  7. Szybko zanurz szkiełko w wodzie dejonizowanej na nie dłużej niż 1 s, a następnie szybko wysusz, wchłaniając dodatkową wilgoć ręcznikiem papierowym.
    UWAGA: Jest to krok opcjonalny. Uzdatnianie wody dejonizowanej skutecznie zapobiega osadzaniu się kryształów soli w buforze SSC na szkiełku i poprawia jakość obrazowania. Jednak w tak niskich warunkach jonowych wiązania wodorowe między sondą FISH a docelowym DNA są osłabione, co prowadzi do dysocjacji sondy i utraty sygnału. Dlatego kluczowe znaczenie ma utrzymanie etapu uzdatniania wody przez bardzo krótki czas.
  8. Osusz szkiełko, a następnie zamontuj je za pomocą nośnika montażowego zapobiegającego blaknięciu. Uszczelnij szkiełko nakrywkowe lakierem do paznokci przed obrazowaniem.
    UWAGA: Jeśli szkiełko jest poddawane działaniu odczynnika do gaszenia autofluorescencji, należy zamontować szkiełko za pomocą środka montażowego zapobiegającego blaknięciu zgodnie z instrukcją producenta. Ponadto, w zależności od rodzaju materiału montażowego, utwardzającego lub nieutwardzającego, próbka musi być utwardzona przez 1-24 godziny przed uszczelnieniem i obrazowaniem. Zaleca się, aby próbka była utwardzana co najmniej przez noc, aby uzyskać najlepszy współczynnik załamania światła do obrazowania.
  9. Użyj soczewki olejowej 60×, aby uchwycić sygnał fluorescencji. Użyj kanału DAPI, aby dostosować ostrość. Upewnij się, że uzyskałeś wiele stosów Z. Zazwyczaj wystarczy 5-10 stosów z odstępem 1 μm. Wykonaj maksymalną projekcję 3D, aby uzyskać najlepszą rozdzielczość. Zastosuj dekonwolucję lub inne algorytmy czyszczenia tła, aby jeszcze bardziej poprawić jakość obrazu.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Użyliśmy próbek FFPE zarówno z HER2-dodatniego, jak i ujemnego raka piersi, aby zademonstrować wynik obrazowania FISH. Amplifikacja HER2 (kodowana przez gen ERBB2) jest korzystnym markerem ze względu na dostępność i skuteczność terapii ukierunkowanych molekularnie na HER2. Wręcz przeciwnie, pacjenci z potrójnie ujemnym rakiem piersi, w którym brakuje ekspresji HER2, receptora estrogenowego (ER) i receptora progesteronowego (PR), borykają się ze złymi wynikami z powodu ograniczonych opcji terapeutycznych. Dlatego określenie statusu HER2 ma kluczowe znaczenie w badaniach i leczeniu raka piersi15.

W potrójnie ujemnej próbce raka piersi, większość jąder wykazuje dwie wyraźne kropki reprezentujące sygnały HER2/ERBB2 FISH. Niektóre jądra mogą mieć tylko jedną kropkę ze względu na odchylenie sekcji (Rysunek 2, po lewej). W przeciwieństwie do tego, próbki HER2-dodatnie prezentują obfite sygnały FISH o dwóch różnych wzorcach. Jeden ze wzorów pokazuje rozrzucone kropki w całym jądrze (Rysunek 2, środek). Ten wzorzec jest charakterystyczny dla morfologii ecDNA, ponieważ ecDNA mogą nie zajmować unikalnego i zorganizowanego terytorium jądrowego16. Co więcej, asymetryczna segregacja ecDNA podczas mitozy napędza zmienność liczby kopii, prowadząc do niejednorodności sygnału między jądrami17. Niektóre jądra mogą wykazywać sporadyczne skupiska, co wskazuje na węzły ecDNA18 (Rysunek 2, po prawej). Drugi rodzaj wzmocnienia HER2 wyświetla przede wszystkim skondensowane agregaty w kształcie prętów. Ta morfologia prawdopodobnie wskazuje na amplifikację opartą na chromosomach, taką jak jednorodnie barwiące regiony (HSR)19 lub poprzez cykl pękania-fuzji-mostu (BFB)20. Warto zauważyć, że amplifikacja ecDNA, HSR i BFB może współistnieć w tym samym jądrze. Dlatego zaleca się badanie jąder wielorakich w celu wywnioskowania formy amplifikacji ogniskowej.

figure-results-1
Rysunek 1: Schemat dla FISH w próbkach FFPE. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Reprezentatywny obraz FISH w próbkach FFPE raka piersi. Powiększenie: 600x; Podziałka skali: 10 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

FISH to szybka i niedroga opcja do diagnostyki cytogenetycznej. Szczególnie w określaniu, czy ecDNA jest obecne w raku, dowody FISH pozostają złotymstandardem1. FISH w tkance FFPE umożliwia szybkie określenie statusu genów w próbkach biopsyjnych pacjenta, co pozwala na szybszą diagnozę i śledzenie zmian w trakcie postępu choroby. Technika ta jest szczególnie cenna w przypadku badania próbek klinicznych, które zostały już pobrane do celów patologicznych.

Protokół ten obejmuje kilka krytycznych kroków. Pierwszym krokiem jest dokładna deparafinizacja. Resztkowa parafina może zakłócić hybrydyzację FISH. Jeśli po etapie 2 próbka nadal wydaje się woskowata, należy ją ponownie poddać działaniu świeżego ksylenu lub jego substytutów.

Po drugie, ekstrakcja i trawienie białka mają kluczowe znaczenie. Procesy te nie tylko zwiększają dostęp DNA do sondy FISH, ale także znacznie zmniejszają autofluorescencję. Protokół ten obejmuje trzy etapy deproteinizacji. Podczas gdy leczenie 0,2 N HCl i 10 mM kwasem cytrynowym jest proste, trawienie proteinazy K może wymagać optymalizacji. Nadmierne trawienie jest najczęstszym błędem podczas stosowania proteinazy K, co skutkuje jądrami w kształcie halo. Skrócenie czasu trawienia poprawi morfologię jąder. Dodatkowo zaleca się, aby nie trawić więcej niż czterech próbek jednocześnie, aby zminimalizować różnicę czasu między pierwszą a ostatnią próbką. Ważne jest, aby pamiętać, że nawet nienaruszone jądro może wyglądać jak halo pod mikroskopem w dużym powiększeniu i wysokiej rozdzielczości. Dzieje się tak, ponieważ jądro nie znajduje się na tej samej płaszczyźnie ogniskowej. Dlatego sugeruje się, aby wziąć wiele stosów Z i wykonać maksymalną projekcję w celu sprawdzenia morfologii jądrowej.

Na koniec zalecana jest autofluorescencja gaszenia. Chociaż ekstrakcja kwasem i trawienie proteinazy K mogą znacznie zmniejszyć tło pochodzące z białek, metabolity fluorescencyjne mogą nadal wpływać na jakość obrazowania.

Chociaż FISH oferuje niezrównaną rozdzielczość przestrzenną w identyfikacji ogniskowej amplifikacji genów, ma ograniczenia. Po pierwsze, zawartość i przepustowość są niskie w porównaniu z podejściami opartymi na PCR lub sekwencjonowaniu nowej generacji (NGS). Zazwyczaj na jedno szkiełko można nałożyć od jednej do trzech sond FISH o różnych kolorach bez specjalistycznego sprzętu. Niemniej jednak postęp w technologiach automatyzacji umożliwił stosowanie FISH o wysokiej zawartości i przepustowości, takich jak sekwencjonowanie in situ 21. Po drugie, konstrukcja sondy FISH wymaga wcześniejszych informacji. Nieustanne wysiłki mające na celu zidentyfikowanie nawracających ogniskowych zdarzeń amplifikacji w nowotworach umożliwiły stworzenie wstępnie zaprojektowanych paneli FISH do zastosowań laboratoryjnych i klinicznych. Na przykład onkogeny z rodziny MYC są często amplifikowane jako ecDNA w drobnokomórkowym raku płuca w celu pośredniczenia w oporności na chemioterapię. W związku z tym panel FISH ukierunkowany na geny MYC, MYCL i MYCN może przyspieszyć określenie odpowiedzi na leczenie w biopsjach. Dla porównania, NGS pozwala na bardziej bezstronne badania przesiewowe genów, które są przedmiotem zainteresowania. Jednak wśród technologii opartych na NGS tylko sekwencjonowanie całego genomu z kosztowną analiząobliczeniową 22 może scharakteryzować ecDNA.

Podsumowując, przedstawiamy solidne i kompleksowe instrukcje dotyczące badania ogniskowej amplifikacji genów w próbkach FFPE. Badając wzorzec sygnału FISH, staje się jednoznacznie jasne, czy i w jaki sposób locus genu jest amplifikowany. Przewidujemy integrację uczenia maszynowego z analizą obrazu23 jąder międzyfazowych w celu wyodrębnienia informacji cytogenetycznych dotyczących liczby kopii i formy amplifikacji (chromosomu lub ecDNA), usprawniając w ten sposób proces diagnostyki molekularnej i zwiększając nasze zrozumienie mechanizmów patogenetycznych w raku.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

S.W. jest członkiem naukowej rady doradczej Dimension Genomics Inc.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

S.W. jest stypendystą i jest wspierany przez Cancer Prevention and Research Institute of Texas (RR210034)

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
DAPITocris Bioscience5748Barwienie jądra
Siarczan dekstranu 50% roztwórEMD Millipore SigmaS4030Sonda buforowa do hybrydyzacji
ERBB2 (HER2) FISH SondaEmpire GenomicsERBB2-20-RESonda FISH
EtanolDecon Labs2716Odwadnianie i nawilżanie tkanki
FormamidThermo Scientific Chemikalia205821000Bufor hybrydyzacyjny sondy
Formuła 83 (substytut ksylenu)CBG BiotechCH0104AUsuwanie parafiny
Kwas solnyFisher ChemicalA144-500Obróbka wstępna próbki
IGEPAL CA-630 Thermo Scientific ChemicalsJ19628K2Mycie szkiełek
Proclin 300Sigma-Aldrich48914-UKonserwant do buforu SSC (opcjonalnie
)Proteinaza K (800 jednostek/ml)New England BiolabsP8107STrawienie białek
RNaza A (20 mg / ml)New England BiolabsT3018LBufor hybrydyzacyjny sondy
System hybrydyzacjifosy ślizgowejBoekel Scientific280001Denaturyzacja i hybrydyzacja próbek. Dopuszczalne są alternatywne płyty grzejne.
Chlorek soduBufor SSCFisher ChemicalS2713
Dwuwodny cytrynian soduOdczynniki Fisher BioReagentsFLBP3271bufor SSC i wstępna obróbka próbki
Bufor Tris-EDTA (TE)Odczynniki Fisher BP2473500Bufor do trawienia proteinazy K
Tween-20Fisher BioReagentsBP337-500Bufor hybrydyzacyjny sondy
Vectashield Nośniki montażowe zapobiegające blaknięciuVector Laboratories H190010Montaż ślizgowy
Vector TrueVIEWVector Laboratories SP8400Zestaw do hartowania autofluorescencji

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. ICGC/TCGA Pan-Cancer Analysis of Whole Genomes Consortium. Pan-cancer analysis of whole genomes. Nature. 578 (7793), 82-93 (2020).
  2. Wu, S., Bafna, V., Chang, H. Y., Mischel, P. S. Extrachromosomal DNA: An emerging hallmark in human cancer. Annu Rev Pathol. 17, 367-386 (2022).
  3. Luebeck, J., et al. Extrachromosomal DNA in the cancerous transformation of Barrett's oesophagus. Nature. 616 (7958), 798-805 (2023).
  4. Nathanson, D. A., et al. Targeted therapy resistance mediated by dynamic regulation of extrachromosomal mutant EGFR DNA. Science. 343 (6166), 72-76 (2014).
  5. Kim, H., et al. Extrachromosomal DNA is associated with oncogene amplification and poor outcome across multiple cancers. Nat Genet. 52 (9), 891-897 (2020).
  6. Pal Choudhuri, S., et al. Acquired cross-resistance in small cell lung cancer due to extrachromosomal DNA amplification of MYC paralogs. Cancer Discov. 14 (5), 804-827 (2024).
  7. Greytak, S. R., Engel, K. B., Bass, B. P., Moore, H. M. Accuracy of molecular data generated with FFPE biospecimens: Lessons from the literature. Cancer Res. 75 (8), 1541-1547 (2015).
  8. Chrzanowska, N. M., Kowalewski, J., Lewandowska, M. A. Use of fluorescence in situ hybridization (FISH) in diagnosis and tailored therapies in solid tumors. Molecules. 25 (8), 1864(2020).
  9. Cui, C., Shu, W., Li, P. Fluorescence in situ hybridization: Cell-based genetic diagnostic and research applications. Front Cell Dev Biol. 4, 89(2016).
  10. Finn, E. H., Misteli, T. A high-throughput DNA FISH protocol to visualize genome regions in human cells. STAR Protoc. 2 (3), 100741(2021).
  11. Watters, A. D., Bartlett, J. M. S. Fluorescence in situ hybridization in paraffin tissue sections. Mol Biotechnol. 21 (3), 217-220 (2002).
  12. Richardson, S. O., et al. One-fits-all pretreatment protocol facilitating fluorescence in situ hybridization on formalin-fixed paraffin-embedded, fresh frozen and cytological slides. Mol Cytogenet. 12, 27(2019).
  13. Monici, M. Cell and tissue autofluorescence research and diagnostic applications. Biotechnol Annu Rev. 11, 227-256 (2005).
  14. Davis, A. S., et al. Characterizing and diminishing autofluorescence in formalin-fixed paraffin-embedded human respiratory tissue. J Histochem Cytochem. 62 (6), 405-423 (2014).
  15. Cancer Genome Atlas Network. Comprehensive molecular portraits of human breast tumours. Nature. 490 (7418), 61-70 (2012).
  16. Liang, Z., et al. Chromatin-associated RNA dictates the ecDNA interactome in the nucleus. bioRxiv. , (2023).
  17. Lange, J. T., et al. The evolutionary dynamics of extrachromosomal DNA in human cancers. Nat Genet. 54 (10), 1527-1533 (2022).
  18. Hung, K. L., et al. ecDNA hubs drive cooperative intermolecular oncogene expression. Nature. 600 (7890), 731-736 (2021).
  19. Storlazzi, C. T., et al. Gene amplification as double minutes or homogeneously staining regions in solid tumors: origin and structure. Genome Res. 20 (9), 1198-1206 (2010).
  20. Guerin, T. M., Marcand, S. Breakage in breakage-fusion-bridge cycle: an 80-year-old mystery. Trends Genet. 38 (7), 641-645 (2022).
  21. Nguyen, H. Q., et al. 3D mapping and accelerated super-resolution imaging of the human genome using in situ sequencing. Nat Methods. 17 (8), 822-832 (2020).
  22. Deshpande, V., et al. Exploring the landscape of focal amplifications in cancer using AmpliconArchitect. Nat Commun. 10 (1), 392(2019).
  23. Rajkumar, U., et al. EcSeg: Semantic segmentation of metaphase images containing extrachromosomal DNA. iScience. 21, 428-435 (2019).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Gene AmplificationFluorescence In Situ HybridizationFFPE SamplesExtrachromosomal DNACytogenetic TechniquesProteinase K DigestionAutofluorescence QuenchingCancer ProgressionHER2 Amplification3D Projection Imaging

Powiązane artykuły