Artykuł metodologiczny

Operacja transferu zarodków przez laparotomię u loszek

1.9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/66984

⸱

18 października 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Centro de Estudos sobre o Genoma Humano e Células-Tronco, Instituto de Biociências, Universidade de São Paulo, 2Instituto do Coração (Incor), Hospital das Clínicas HCFMUSP, Faculdade de Medicina, Universidade de São Paulo, 3Faculdade de Medicina, Universidade de São Paulo

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół opisuje zastosowanie techniki chirurgicznej używanej do transferu sklonowanych zarodków świń poprzez laparotomię u loszek.

Streszczenie

Ten protokół ma na celu zademonstrowanie techniki chirurgicznej transferu sklonowanych zarodków świń do jajowodu, metody szeroko stosowanej w produkcji genetycznie modyfikowanych świń do badań biomedycznych. Dziewięć loszek poddano synchronizacji hormonalnej i laparotomii w celu transferu sklonowanych zarodków wytworzonych w wyniku transferu jądra komórki somatycznej (SCNT) w stadium do 4 komórek w 2 dniu do jajowodu. Diagnostykę ciążową przeprowadzono za pomocą badania ultrasonograficznego 30 dni po operacji transferu. Sześć z dziewięciu operowanych loszek wykazywało oznaki ciąży w badaniu ultrasonograficznym. Ponieważ jednak nie stwierdzono postępu w rozwoju płodu ocenianego za pomocą echografii, loszki poddano sekcji zwłok po 60 dniach w celu pobrania materiału biologicznego i oceny układu rozrodczego. Zrosty zaobserwowano w rogach macicy, jajnikach i jajowodach. Ze światła macicy dwóch loszek poddanych eutanazji uzyskano jedną i cztery struktury embrionalne o wieku ciążowym od 12 do 20 dni. Pomimo braku żywych prosiąt, co prawdopodobnie przypisuje się niskiej efektywności transferu sklonowanych zarodków świń, na którą wpływają różne czynniki, w tym liczba i jakość przenoszonych zarodków, przedstawiona technika chirurgiczna okazała się szybka i bezpieczna.

Wprowadzenie

Świnie są doskonałym modelem eksperymentalnym do badań biomedycznych ze względu na ich anatomiczne, fizjologiczne i genetyczne podobieństwa do ludzi1. Zwierzęta te były często wykorzystywane w badaniach związanych z ksenotransplantacją, z zamiarem wytworzenia narządów, komórek lub tkanek, które sprzyjają niskiemu ryzyku odrzucenia po przeszczepieniu ludziom. Badania nad ksenotransplantacją mają na celu zwiększenie podaży narządów do przeszczepów u ludzi, a tym samym skrócenie listy oczekujących pacjentów2.

Produkcja świń do ksenotransplantacji obejmuje kilka etapów, w tym produkcję klonów z genetycznie edytowanych komórek świń. Po wyprodukowaniu in vitro genetycznie zmodyfikowanych sklonowanych zarodków, zarodki są przenoszone do układu rozrodczego lochy z zsynchronizowanym cyklem rujowym, aby przygotować fizjologię macicy do przyjęcia i ciąży nowego conceptus3.

Transfer zarodków u świń może być przeprowadzony metodami nieinwazyjnymi lub inwazyjnymi4. Wśród metod nieinwazyjnych znajduje się transfer przezszyjkowy, który nie wymaga żadnej interwencji chirurgicznej. Metoda ta jest jednak ograniczona do transferu zarodków w późniejszych stadiach rozwoju (tj. w stadium moruli lub blastocysty) i nie pozwala na dokładne określenie miejsca wprowadzenia cewnika lub osadzenia zarodka5. Laparoskopia i laparotomia są uważane za inwazyjne metody transferu zarodków. Laparoskopia jest mniej inwazyjna, ale wymaga specjalistycznego i kosztownego sprzętu, a jej skuteczność jest bardzo zróżnicowana (od mniej niż 20% do ponad 80%) ze względu na różne czynniki, takie jak trudności w manipulowaniu strukturami rozrodczymi i rodzaj zastosowanego cewnika4,6. W związku z tym transfer za pomocą laparoskopii jest nadal mniej wydajny w porównaniu z metodami transferu chirurgicznego za pomocą laparotomii4.

Operacja transferu zarodków u loch za pomocą laparotomii jest stosunkowo prostą i szybką procedurą, zwykle trwającą około 30 minut. Powinien być jednak wykonywany w centrum chirurgicznym wyposażonym w aparat do znieczulenia wziewnego oraz specjalistyczny zespół. W przypadku komercyjnych odmian świń (takich jak Landrace, Large White lub ich krzyżówki) ze względu na znaczną wagę zwierząt (około 130-150 kg) konieczne jest specjalne wyposażenie, takie jak podnośniki do podnoszenia loszek i szeroki, solidny stół chirurgiczny.

Aby operacja zakończyła się sukcesem, zarodki muszą być wcześniej ocenione pod kątem ich etapu rozwoju. Zaleca się przeniesienie zarodków do 4 komórek do jajowodu. Zarodki w stadiach powyżej 4 komórek, takie jak morula i blastocysty, powinny być przenoszone do rogu macicy7,8.

Chociaż grupy badawcze na całym świecie zajmują się produkcją i chirurgicznym transferem genetycznie zmodyfikowanych sklonowanych zarodków świń, nadal nie ma dobrze zdefiniowanych protokołów demonstrujących tę procedurę za pomocą filmów. Takie podejście ma kluczowe znaczenie dla powodzenia ciąży, ponieważ technika ta wymaga precyzyjnego osadzania zarodków w dokładnym miejscu jajowodu, co wiąże się z lokalizacją ujścia jajowodów i wprowadzeniem pipety zawierającej zarodki. Technikę tę można lepiej zrozumieć dzięki filmom instruktażowym przedstawiającym całą procedurę. Dlatego artykuł ten ma na celu zademonstrowanie operacji laparotomii polegającej na transferze sklonowanych zarodków do jajowodu loszek, co jest niezbędnym warunkiem wstępnym dla przyszłej produkcji genetycznie zmodyfikowanych świń, które mają być wykorzystywane do ksenotransplantacji lub innych powiązanych celów.

Protokół

To badanie zostało zatwierdzone przez Komitet Etyki ds. Wykorzystania Zwierząt w Badaniach Kolegium Medycyny Weterynaryjnej i Nauk o Zwierzętach Uniwersytetu w São Paulo, numer protokołu 6088030523. Dziewięć siedmiomiesięcznych loszek z hodowli trzody chlewnej Água Branca, znajdującej się w mieście Itu w stanie São Paulo w Brazylii, zostało użytych zaraz po drugim wykryciu rui9. Szczegółowe informacje na temat odczynników i sprzętu użytego w badaniu są wymienione w Tabeli Materiałów.

1. Przygotowanie zwierząt

  1. Pościć zwierzęta przez 12 godzin i ograniczyć dostęp do wody na 4 godziny przed zabiegiem chirurgicznym.
  2. Za pomocą igły o wymiarach 40 mm x 12 mm pobrać 10 mg/kg ketaminy i 0,2 mg/kg midazolamu do tej samej strzykawki o pojemności 50 ml. Podłączyć strzykawkę do zestawu do podawania dożylnego, aby ułatwić podawanie leków, zachowując bezpieczną odległość od zwierzęcia i umożliwiając mu swobodne poruszanie się.
  3. Lek wstępny należy podać we wstrzyknięciu domięśniowym do mięśnia czworobocznego, doogonowego do zewnętrznego przewodu słuchowego.
  4. Kankaniulować żyłę uszną za pomocą cewnika 20 G i podłączyć go do zestawu do podawania makrokroplówek do śródoperacyjnej płynowej terapii 0,9% roztworem NaCl w ilości 10 ml/kg/h.
  5. Wywołać znieczulenie 4 mg/kg propofolu dożylnie (zgodnie z instytucjonalnie zatwierdzonymi protokołami).
  6. Wykonaj intubację ustno-tchawiczą zwierzęcia za pomocą laryngoskopu i rurki ustno-tchawiczej w rozmiarze 9 z mankietem10.
  7. Utrzymuj znieczulenie za pomocą 1,5% do 2% inhalacji izofluranu. Dodatkowo monitoruj znieczulenie, oceniając parametry fizjologiczne, takie jak tętno, które powinno być utrzymywane w zakresie od 100 do 120 uderzeń na minutę, nasycenie tlenem, które powinno być utrzymywane między 99% a 100%, rozluźnienie mięśni, brak ruchu i ocena odruchów.
    UWAGA: Temperatura ciała powinna być również monitorowana i kontrolowana, utrzymując się w zakresie 37,5-38,5 °C. W razie potrzeby, oprócz izofluranu, można zastosować propofol w celu utrzymania kontroli parametrów. Chlorowodorek fentanylu należy podawać jako środek przeciwbólowy w dawce 0,02 mg/kg mc. co 20 minut. Wszystkie parametry powinny być rejestrowane co 5 minut.
  8. Znieczulenie okołooperacyjne należy podawać dożylnie pojedynczej dawce 0,002 mg/kg fentanylu i 4 mg/kg chlorowodorku tramadolu domięśniowo do mięśnia pośladkowego lub czworobocznego.
  9. Umieść elektrody sercowe w okolicy klatki piersiowej w celu śródoperacyjnego monitorowania częstości akcji serca. Rejestruj tętno, temperaturę w odbycie i nasycenie tlenem co 5 minut.

2. Zabieg chirurgiczny

  1. Umieść lodzkę na stole operacyjnym w pozycji grzbietowej.
  2. Przykryj nogi zwierzęcia rękawicami zabiegowymi, aby zminimalizować zanieczyszczenie pola operacyjnego.
  3. Wykonaj depilację brzusznej części ogona brzusznego między przedostatnią parą gruczołów sutkowych za pomocą maszynki do strzyżenia chirurgicznego.
  4. Wykonaj przedoperacyjną antyseptykę skóry za pomocą szczoteczki antyseptycznej nasączonej chlorheksydyną, wykonując okrężne ruchy od okolicy blizny pępkowej do ostatniej pary gruczołów sutkowych. Usuń chlorheksydynę czystym, zwilżonym kompresem.
  5. Upewnij się, że chirurg i asystent wykonują chirurgiczne leczenie antyseptyczne i noszą sterylne fartuchy chirurgiczne i rękawice chirurgiczne do operacji.
    UWAGA: Zwierzę powinno być przygotowane do zabiegu w obszarze przygotowawczym oddzielonym od pola operacyjnego.
  6. Przygotuj stół operacyjny z odpowiednimi i wcześniej wysterylizowanymi narzędziami wymienionymi w Tabeli Materiałów.
  7. Wykonaj końcową antyseptykę pola operacyjnego za pomocą sterylnej gazy i środka antyseptycznego z chlorheksydyną, oczyszczając obszar w kształcie rybiej ości, zaczynając od miejsca nacięcia i rozszerzając się na boki.
  8. Powtórz tę procedurę trzy razy z antyseptyną chlorheksydyny, a następnie powtórz procedurę z alkoholową chlorheksydyną.
  9. Całkowicie przykryj zwierzę sterylną obłożeniem chirurgicznym i za pomocą nożyczek utwórz prostokątny otwór w serwety chirurgicznej, około 10 x 20 cm², jeśli serweta nie jest zasłonięta.
  10. Umieść serwetę chirurgiczną na przedostatniej parze pachwinowych gruczołów sutkowych. Umieść 4 zaciski Backhaus, aby zabezpieczyć serwetę chirurgiczną na skórze zwierzęcia.
  11. Naciąć skórę skalpelem, tworząc nacięcie o długości około 10 cm.
  12. Osiągnąć hemostazę naczyń podskórnych za pomocą kleszczy hemostatycznych i/lub szwów wchłanialnych w rozmiarze 2.
  13. Wypreparować tkankę podskórną palcami lub za pomocą drobno zakończonych nożyczek, pogłębiając nacięcie, aby dotrzeć do kredy białej w mięśniach brzucha.
    UWAGA: Zbadaj palpacyjnie linię środkową brzucha, aby wyczuć linię białą jako bardziej sztywny i włóknisty obszar; Obserwuj separację mięśni prostych brzucha i zwróć uwagę na zmianę konsystencji tkanki podczas sekcji, aby dokładnie zidentyfikować Linea alba11.
  14. Za pomocą kleszczy Allis chwyć mięśnie i podnieś je, aby wykonać nacięcie w linea alba skalpelem.
  15. Włóż palec wskazujący do nacięcia, aby ocenić obecność zrostów. Ostrożnie rozciągnij nacięcie nad linią białą doogonowo i czaszkowo/lub cienkimi/nożyczkami, aby uniknąć uszkodzenia innych narządów i leżących poniżej struktur.
  16. Wykonaj nacięcie o wystarczającej długości, aby jedna ręka chirurga mogła zostać wprowadzona do jamy brzusznej w celu zlokalizowania i uzewnętrznienia rogów macicy i/lub jajników. Retraktor Gosset może być użyty w celu ułatwienia wejścia do jamy brzusznej i zszycia mięśni w jednej warstwie na końcu zabiegu.
  17. Jeśli jeden z rogów macicy znajduje się przed jajnikami, delikatnie podążaj za nim, aż dotrze do końca rogu macicy i jajnika ipsilateralnego. Podczas tej procedury oceń obecność płynu w macicy, który może zagrozić ciąży
    18. .
  18. Po zlokalizowaniu jajnika delikatnie go pociągnij i ostrożnie odsłoń. Oceń obecność pęcherzyków przedowulacyjnych, krwotocznych ciałek żółtych, cyklicznych ciałek żółtych i ciałek białych, aby ocenić, czy synchronizacja loszek jest zgodna z oczekiwaniami.
  19. Delikatnie usuń fimbrie jajowodu pokrywającego jajnik, zlikwiduj jego błonę śluzową i zlokalizuj ujście jajowodu.
    UWAGA: Jeśli chirurg ma trudności z identyfikacją ujścia fimbrii, kieszeń na bańce jajowodu można wykonać za pomocą okrągłej igły do szwów, unikając nakłuwania naczyń krwionośnych, w celu wprowadzenia cewnika Tomcat zawierającego zarodki.
  20. Ostrożnie włóż cewnik Tomcat zawierający zarodki do ujścia fimbrii, aż dotrze do obszaru bańki jajowodu.
  21. Podłącz strzykawkę o pojemności 1 ml do cewnika Tomcat, aby wepchnąć płyn zawierający zarodek do rurki macicy. Przykryj jajnik fimbriami i przywróć go do jamy brzusznej.
  22. Zlokalizuj przeciwległy róg macicy i jajnik i powtórz kroki 2.17-2.21.
  23. Zmienić położenie struktur wewnątrz jamy brzusznej i dodać 1 l roztworu soli fizjologicznej lub roztworu mleczanu Ringera ogrzanego (39 °C), aby zapobiec zrostom przed rozpoczęciem abdominorrafii.
  24. Zszyj mięśnie brzucha szwem wchłanialnym w rozmiarze 2 w szwach "X" (sułtan) przerwany.
  25. Przybliżyć tkankę podskórną za pomocą ciągłego szwu materacowego za pomocą wchłanialnego szwu w rozmiarze 2.
  26. Zamknij skórę nylonowym szwem w rozmiarze 2 w przerywanych prostych szwach, zszywkami chirurgicznymi lub klejem z cyjanoakrylanu etylu. W tej procedurze zdecydowaliśmy się na użycie kleju.
  27. Oczyść ranę pooperacyjną gazą nasączoną nadtlenkiem wodoru i osusz kompresem, aby zwiększyć mocowanie kleju chirurgicznego na ranie operacyjnej. Nałóż ryfamycynę lub maść Pearsona, przykryj gazą, a na koniec nałóż klej chirurgiczny.
    UWAGA: Rana powinna pozostać zamknięta opatrunkiem przez 5 dni.

3. Opieka pooperacyjna

  1. Oceń zwierzęta pod kątem oznak charakterystycznego bólu klinicznego przez co najmniej 3 następne kolejne dni, zgodnie ze skalą zaproponowaną przez Luna et al.12.
    UWAGA: Skala ta opiera się na różnych zachowaniach wykazywanych przez świnie podczas doświadczania różnych poziomów bólu, takich jak postawa, interakcja i zainteresowanie środowiskiem, aktywność, apetyt i uwaga na dotknięty obszar. Wynik waha się od 0 do 3, w zależności od rodzaju wykazywanego zachowania, dla każdego ocenianego parametru. Na końcu oceny suma wszystkich punktów odzwierciedla intensywność bólu odczuwanego przez zwierzę, gdzie 0 oznacza brak bólu, a 18 oznacza bardzo intensywny ból12.
  2. Podawać pojedynczą dawkę 15 mg/kg amoksycyliny i 0,4 mg/kg 2% meloksykamu domięśniowo (w mięsień pośladkowy lub szyjny) raz dziennie przez 3 dni jako opiekę pooperacyjną w celu zapobiegania bólowi, procesom zapalnym i infekcjom.
    UWAGA: Jeśli ocena bólu jest równa lub większa niż 6 w zastosowanej skali bólu (wynik od 0 do 18), podawaj 5 000 mg / zwierzę dipironu sodu domięśniowo (w mięsień pośladkowy lub szyjny) raz dziennie oprócz środka przeciwzapalnego i antybiotyku. Alternatywnie należy przeprowadzić analgezję zgodnie z lokalnymi wytycznymi IACUC.
  3. W 6 dobie po zabiegu należy usunąć klej chirurgiczny do oczyszczania ran za pomocą gazy nasączonej 2% alkoholowym roztworem chlorheksydyny i stosować miejscowo maść Pearsona do 10 dnia, kiedy to zaleca się usunięcie szwów lub usunięcie zszywek chirurgicznych, jeśli są stosowane.

4. Ultrasonograficzne rozpoznanie ciąży

  1. Przeprowadzić ocenę ultrasonograficzną ciąży przezbrzusznej za pomocą urządzenia ultrasonograficznego (zakres częstotliwości od 4,5 do 8,5 MHz) 30 dni po operacji transferu zarodków.
  2. Nałóż żel ultradźwiękowy na sondę i umieść go w pobliżu pachwinowej okolicy brzucha, skierowaną przyśrodkowo.
    UWAGA: Wizualizacja zaokrąglonych bezechowych pęcherzyków embrionalnych, spowodowanych płynem w świetle macicy, wskazuje na ciążę. Brak wizualizacji płynu wewnątrzmacicznego lub obecność płynu wewnątrzmacicznego bez zarysowania pęcherzyków zarodkowych sugeruje brak ciąży.

5. Eutanazja zwierząt

UWAGA: Poddaj eutanazji loszki, które w badaniu ultrasonograficznym nie miały płodu o wielkości i wyglądzie odpowiadającym wiekowi ciążowemu.

  1. Za pomocą igły o wymiarach 40 mm x 12 mm pobrać 15 mg/kg ketaminy i 2 mg/kg midazolamu do tej samej strzykawki o pojemności 50 ml dołączonej do zestawu do podawania dożylnego i podać domięśniowo do mięśnia czworobocznego w odcinku szyjnym od ogona do zewnętrznego przewodu słuchowego, jako lek przedznieczulający.
  2. Kanulować żyłę uszną za pomocą cewnika 20 G i indukować znieczulenie 4 mg/kg propofolu dożylnie w bolusie, aż do wystąpienia bradykardii (zgodnie z instytucjonalnie zatwierdzonymi protokołami).
  3. Następnie należy podać dożylnie od 10 do 20 ml 19,1% chlorku potasu. Potwierdź zatrzymanie krążenia i oddychania, obserwując brak ruchów oddechowych, blade błony śluzowe, utratę odruchu rogówkowego i brak bicia serca, umieszczając stetoskop nad obszarem serca.
  4. Zbierz dowolny rodzaj zawartości wewnątrzmacicznej (tkanka embrionalna, płyn lub wydzielina śluzowa) od samic poddanych sekcji zwłok13 i prześlij je do analizy mikrobiologicznej w celu wykrycia możliwych patogenów, a także do charakterystyki genotypowej klonów (jeśli jest to konieczne). Sprawdź wzrokowo obecność lub brak ciałek żółtych, torbieli jajników, nieprawidłowych wydzielin oraz występowania zrostów w macicy, jajnikach i jajowodach14.

Wyniki

Celem niniejszego artykułu jest zaprezentowanie zabiegu laparotomii w celu przeniesienia sklonowanych embrionów do jajowodu loch. Wszystkie zwierzęta pozostały w odpowiedniej płaszczyźnie znieczulenia, bez żadnych incydentów śródoperacyjnych lub powikłań podczas wybudzania z narkozy. Lochy potrzebowały średnio 2-3 h, aby wstać po zakończeniu operacji.

Wszystkie procedury chirurgiczne trwały średnio 44 min. Operację poddano dziewięciu lochom, przy średniej liczbie 185 przeniesionych embrionów klonowanych na jedną lochę, co łącznie dało 1 664 embrionów przeniesionych obustronnie (Tabela 1). Lokalizacja jajników, ich eksternalizacja oraz wprowadzenie cewnika Tomcat zawierającego embriony do ujścia jajowodu stanowiły najbardziej delikatne momenty operacji. Podczas zabiegu sprawdzono jajniki wszystkich loch i u wszystkich stwierdzono obecność niedawno owulowanych mieszków krwotocznych, co było zgodne z oczekiwaniami po zastosowanym protokole synchronizacji rui, którego celem było przeprowadzenie transferu embrionów wkrótce po wystąpieniu owulacji. Wszystkie procedury przebiegły bez incydentów śródoperacyjnych.

Żadne z zwierząt nie wykazywało oznak silnego bólu po operacji, przy średnich wynikach w skali bólu (zakres od 0 do 18) wynoszących odpowiednio 0,33, 0,33, 3,67, 1,33, 0,33, 1,33, 4,67, 2,00 i 0,33, ocenianych przez 3 dni pooperacyjne dla każdej z operowanych lochach (Tabela 2). Tylko u 1 z operowanych loch wystąpiło podskórne gromadzenie się płynu (seroma) w 12tym dniu po operacji, z oznakami infekcji i stanu zapalnego zlokalizowanymi w okolicy rany chirurgicznej. Po odessaniu płynu igłą 40 mm x 1,6 mm pod kontrolą USG, stosowaniu zimnych okładów na zapalony obszar przez 30 minut dziennie przez 7 dni, podaniu ceftiofuru (3 iniekcje domięśniowe w odstępach 72 h) oraz 2% meloksykamu (0,4 mg/kg SID, domięśniowo, przez 3 dni), rana uległa przetokowaniu i odprowadziła pozostałą treść śluzowo-ropną, co doprowadziło do całkowitej poprawy stanu zwierzęcia. Pozostałe operowane lochy pozostawały z opatrunkiem chirurgicznym przez 5 dni bez konieczności jego zmiany lub usunięcia w celu oczyszczenia rany, co wykonywano dopiero od 6tego do 10tego dnia po operacji.

U loch 2, 8 i 9 w świetle macicy nie zaobserwowano gromadzenia się płynu ani tworzenia pęcherzyków zarodkowych (Rysunek 1A). W związku z tym diagnoza ciążową tych zwierząt uznano za negatywną. U pozostałych loch stwierdzono wewnątrzmaciczne gromadzenie się płynu oraz tworzenie pęcherzyków zarodkowych, widocznych jako wyraźnie zdefiniowane anechogeniczne struktury zaokrąglone (Rysunek 1B-D). U dwóch loch biorców możliwe było zidentyfikowanie, w 32nd dniu ciąży, obszaru hiperechogenicznego względem struktury zarodkowej w fazie wczesnego rozwoju wewnątrz pęcherzyków zarodkowych (Rysunek 1E,F).

Po negatywnej diagnozie ciążowej lub braku rozwoju ciąży, lochy zostały poddane eutanazji, a następnie przeanalizowano ich układ rozrodczy. W przypadku loch 1, 2, 3 i 4 zaobserwowano zrośnięcia w obrębie jajników, jajowodów i rogów macicy w różnym stopniu, natomiast u lochy 8 stwierdzono obecność torbieli jajnika (Rysunek 2). Z macicy lochy 3 uzyskano cztery struktury embrionalne o wieku ciążowym odpowiadającym w przybliżeniu 12 do 20 dniom gestacji, a z lochy 7 uzyskano jedną strukturę (Rysunek 3). Analiza fragmentów tkanek embrionalnych dała wynik negatywny w kierunku wykrycia Parvovirus, Leptospira sp., Erysipelothrix rhusiopathiae oraz cyrkowirusów świń typu 2 i 3 (PCV2/PCV3), które mogą powodować śmierć zarodkową lub aborcję.

Sekwencja obrazów ultrasonograficznych, struktury brzuszne, obrazowanie diagnostyczne, analiza badań klinicznych.
Rysunek 1: Obrazy ultrasonograficzne macic loch w odbiorcach embrionów 30 dni po zabiegu chirurgicznym. (A) Macica lochy 2 bez obecności płynu wewnątrz, co charakteryzuje negatywną diagnozę ciążową. Ciężarna macica lochy 1 (B), lochy 3 (C) i lochy 4 (D) zawierająca pęcherzyki zarodkowe z płynem wewnątrz (gwiazdki). Ciężarna macica lochy 3 (E) i lochy 7 (F) wykazująca strukturę hiperechogeniczną (strzałka) wewnątrz pęcherzyka zarodkowego, co wskazuje na formowanie się płodu we wczesnej fazie w 32. dniu ciąży. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Dziewięć rozsektowanych układów pokarmowych oznaczonych od A do I, ilustrujących zmienność anatomiczną wraz ze skalą pomiarową.
Rycina 2: Analiza układu rozrodczego. Zdjęcia macic, jajników i jajowodów po sekcji zwłok lochy 1 (A), lochy 2 (B), lochy 3 (C), lochy 4 (D), lochy 5 (E), lochy 6 (F), lochy 7 (G), lochy 8 (H) i lochy 9 (I). Strzałki wskazują zrosty w rogach macicy, jajnikach i jajowodach, a groty strzałek wskazują torbiele jajnika. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Eksperyment z sekcji tkanek; próbki biologiczne w szalce Petriego; skupienie na procesie izolacji organów.
Rycina 3: Diagnoza ciążowa. Zarodki we wczesnym stadium pobrane od lochy 3 (A-D) i lochy 7 (E) wykazują pozytywną diagnozę ciążową oraz struktury hiperechogeniczne wewnątrz pęcherzyków zarodkowych w badaniu ultrasonograficznym. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Tabela 1: Liczba i rodzaj zarodków przeniesionych na lochę, zdiagnozowane ciąże oraz liczba zarodków uzyskanych po sekcji zwłok zoperowanych loch. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Tabela 2: Wartości przypisane każdej z operowanych loch w odniesieniu do objawów bólu. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Dyskusja

Opisana metoda chirurgiczna była wcześniej wykonywana przez inne grupy badawcze zajmujące się produkcją klonowanych świń lub genetycznie modyfikowanych klonowanych świń, z doniesieniami o narodzinach po wdrożeniu tej techniki 15,16,17,18,19,20. Wskaźniki ciąż i urodzeń zarodków SCNT wytworzonych z różnych linii komórkowych wahają się około 20%-30% (z 264 transferów od 2017 r.), przy średniej 3,2 ± 0,4 prosiąt urodzonych w miocie 3,21. Z niską skutecznością tej techniki związanych jest kilka czynników, w tym protokół synchronizacji stosowany w przypadku loch biorczy, synchronizacja między lochą biorcą a stadium przenoszonych zarodków, miejsce depozycji zarodka, jakość oocytów wykorzystywanych do SCNT i produkowanych zarodków, jakość i stadium komórkowe komórek somatycznych dawcy jądra oraz liczba przenoszonych zarodków21.

Zgodnie z niniejszym badaniem, opisana operacja okazała się skuteczna, szybka i bezpieczna w przeprowadzaniu chirurgicznego transferu sklonowanych zarodków (do stadium 4-komórkowego) u loszek, co dało dodatnie rozpoznanie ultrasonograficzne ciąży i wizualizację struktur embrionalnych wewnątrz światła macicy po sekcji zwłok, w wieku ciążowym około 12-20 dni ciąży22. Inną, mniej inwazyjną metodą transferu zarodków SCNT do jajowodu loch jest laparoskopia. Jednak skuteczność tej techniki różni się znacznie od mniej niż 20% do ponad 80% ze względu na różne czynniki, takie jak anatomia struktur, rodzaj zastosowanego cewnika i miejsce osadzania zarodków 4,6,23,24,25,26,27. Podczas transferu 2-4 zarodków blastomerów świń metodą laparoskopii przez lejek do 6 loch, Wieczorek i wsp.4 nie uzyskali dodatniej ciąży po 28-31 dniach od zabiegu, a wynik ten był związany z trudnościami we wprowadzaniu cewnika do jajowodu, płytkim wprowadzaniem cewnika do jajowodu oraz występowaniem perforacji lejka z cewnikiem. Dlatego metoda transferu zarodków za pomocą laparotomii do jajowodu loch nadal wydaje się najbardziej efektywna.

Ryzyko chirurgiczne związane z zabiegiem laparotomii w celu transferu zarodków u loch jest niewielkie; jednak ważne jest, aby zwrócić uwagę na możliwość złośliwej hipertermii podczas znieczulenia, która jest powszechnie obserwowana u komercyjnych świń ras Landrace i Large White28. W tym przypadku żadna z operowanych loszek nie wykazywała klinicznych objawów złośliwej hipertermii podczas znieczulenia. Istnieje również ryzyko niewielkiego miejscowego krwawienia z większych naczyń w okolicy podskórnej, które można łatwo zatamować za pomocą kleszczy hemostatycznych lub szycia szwem wchłanialnym. Może również wystąpić możliwość przypadkowego nacięcia dowolnego narządu jamy brzusznej, takiego jak pęcherz moczowy lub pętle jelitowe, podczas nacięcia skalpelem w przypadku ukłucia i wyprostu w kresie białym nożyczkami. W takim przypadku chirurg musi zwrócić szczególną uwagę podczas nacinania kresy białej i zszywania mięśni brzucha, aby uniknąć przecięcia lub uszkodzenia leżących poniżej struktur.

Sprawność manualna chirurga jest niezbędna do prawidłowej manipulacji jajnikami i starannej eksterioryzacji, unikając pęknięcia naczyń szypułki jajnika. W przypadku trudności z lokalizacją jajnika (jajników) możliwe jest rozpoczęcie zabiegu od zlokalizowania jednego z rogów macicy i podążania za jego przedłużeniem aż do osiągnięcia końca rogu macicy na połączeniu macicowo-jajowodowym w pobliżu jajnika. Należy zachować ostrożność, aby uniknąć zrostów jajników i macicy spowodowanych nadmierną manipulacją tymi narządami. Nawilżenie tych struktur roztworem Ringera z mleczanami lub roztworem soli fizjologicznej w temperaturze 39 °C podczas operacji może pomóc w zapobieganiu tworzeniu się zrostów29. Manipulacja jajowodem, zwłaszcza w okolicy fimbrii, powinna być wykonywana bardzo delikatnie, aby uniknąć rozciągnięcia i pęknięcia. Chociaż jednostronny transfer zarodków, tylko do jednego z jajowodów, może być wykonany w celu uniknięcia nadmiernej manipulacji macicy i skrócenia czasu operacji, transfer obustronny może być bezpieczniejszy i korzystniejszy, zwłaszcza w przypadkach, gdy dochodzi do przypadkowego pęknięcia jednej z jajowodów lub wątpliwości co do osadzenia się zarodka we właściwym miejscu. Ponadto bardziej zalecany jest transfer dwustronny, ponieważ sprzyja on wyższemu wskaźnikowi ciąż i liczbie urodzonych prosiąt w porównaniu z transferem jednostronnym16,30. Obecność torbieli wiąże się z regularnym lub nieregularnym powrotem rui, przy czym do 10% samic z torbielami jajników pozostaje w anestrus. Jest to związane z różnymi przyczynami, takimi jak stres, stosowanie protokołów hormonalnych lub dziedziczenie genetyczne31,32. W naszym przypadku torbiele pęcherzykowe wystąpiły pomimo przestrzegania dawki i czasu podania zalecanego przez producenta hormonu do synchronizacji ciepła.

Wiedza o tym, jak zlokalizować ujście jajowodu przez otwarcie fimbrii, ma fundamentalne znaczenie dla prawidłowego rozmieszczenia zarodków w odpowiednim miejscu. Aby uniknąć pomyłek co do miejsca odkładania się zarodków, zaleca się wcześniejsze przeszkolenie w zakresie przechodzenia cewnika Tomcat wypełnionego roztworem (np. wodą) przez ujście jajowodu w próbkach pochodzących z rzeźni. Po wprowadzeniu pipety we właściwe miejsce można zaobserwować wzrost objętości jajowodu po wstrzyknięciu roztworu. Warto zauważyć, że im mniejsza ilość płynu przenoszonego wraz z zarodkami, tym większe szanse na ciążę33. Jeśli chirurg ma duże trudności ze znalezieniem ujścia jajowodu, możliwe jest wykonanie kieszonki na jajowodzie i wprowadzenie przez nią cewnika. Chociaż ta ostatnia metoda jest szybsza i wiąże się z mniejszą manipulacją jajowodu, chirurg musi unikać naczyń krwionośnych i upewnić się, że cewnik został prawidłowo wprowadzony do światła jajowodu.

Chociaż ryzyko infekcji pooperacyjnych związanych z tym zabiegiem chirurgicznym jest niskie, może wystąpić z powodu takich czynników, jak poziom czystości obszaru, w którym trzymane są zwierzęta, czas trwania zabiegu chirurgicznego, utrzymanie opatrunku przez odpowiedni czas oraz prawidłowe przepisywanie leków, takich jak profilaktyka antybiotykowa i leki przeciwzapalne. Najbardziej prawdopodobna hipoteza dotycząca wystąpienia infekcji zaobserwowanej u jednej z operowanych loszek związana jest z odpadnięciem opatrunku wkrótce po wstaniu zwierzęcia ze znieczulenia. Chociaż codzienne oczyszczanie rany operacyjnej tej loszek odbywało się za pomocą gazy nasączonej roztworem soli fizjologicznej i miejscowego stosowania maści Pearsona, taka procedura nie wystarczyła, aby zapobiec wstępującemu zanieczyszczeniu, wymagając aplikacji zimnej wody w miejscu, drenażu, antybiotykoterapii ogólnoustrojowej i dodatkowych 3 dni leczenia przeciwzapalnego. Nawet przy wystąpieniu infekcji podskórnej loszka ta wykazywała oznaki ciąży w badaniu ultrasonograficznym.

Po użyciu nici nylonowych i zszywek chirurgicznych do zamknięcia skóry w poprzednich operacjach, zdecydowaliśmy się użyć kleju z cyjanoakrylanu etylu, aby zmniejszyć naprężenia podczas zdejmowania szwów i zapobiec pozostałościom nici lub zszywek. Obecność nici lub zszywek sprzyja niewielkiemu miejscowemu zapaleniu z tworzeniem krost. Klej cyjanoakrylowy etylu jest już bezpiecznie stosowany w zabiegach chirurgicznych, okazując się skuteczny, nietoksyczny i bakteriobójczy34,35. Wszystkie zwierzęta wykazywały doskonałe gojenie się ran, bez powikłań, z wyjątkiem loszki, której opatrunek odpadł wkrótce po zabiegu chirurgicznym.

Oświadczenia

Żaden z autorów nie ujawnia konfliktu interesów

Podziękowania

Chcielibyśmy podziękować Szpitalowi Weterynaryjnemu Koni i Szpitalowi Weterynaryjnemu Przeżuwaczy College of Veterinary Medicine, University of Sao Paulo (FMVZ/USP), Sao Paulo, Brazylia, FAPESP (grant 2022/11459-3, Sao Paulo Research Foundation), EMS Pharma, CNPq (grant 405254/2022-9) oraz hodowli trzody chlewnej Água Branca, Itu, Sao Paulo, Brazylia.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,25 ml słomkaogólnymateriał chirurgiczny
1 ml strzykawkaDescarpack341001Materiał chirurgiczny
Strzykawka 10 mlDescarpack324601Materiał chirurgiczny
Strzykawka 20 mlDescarpack324801Materiał chirurgiczny
Strzykawka 3 mlDescarpack324201Materiał
Strzykawka 5 mlDescarpack324401Materiał chirurgiczny
Strzykawka 60 mlDescarpack323201Materiał chirurgiczny
Rurka dotchawicza 9 mmRusch112482-000090Materiał chirurgiczny
Allis kleszczeogólneNarzędzie chirurgiczne
Amox LAJA Saú de ZwierzęRejestracja MAPA: 8.781/2004Lek farmaceutyczny
Kleszcze Bakhausgeneryczno-Narzędziechirurgiczne
Cewnik 20GDescarpack362401Cewnik do dostępu dożylnego
CetaminAgener Uniã oRejestracja MAPA: SP-000292-5.000011 Znieczulenia
Przewodzący żel klinicznyRMCANVISA rejestracja: 80122200013Materiał chirurgiczny
Dipyrone D-500ZoetisRejestracja MAPA: SP0000728-46Lek farmaceutyczny
Skalpel jednorazowy nr 22WiltexRejestracja ANVISA: 10150470565Narzędzie chirurgiczne
Jednorazowa sterylna szczotka gąbkowaRioquimica7.89778E+12Asepsja chirurgiczna
Easy-Scan:GoIMVESCG01Endozime ultrasonograficzne
AW PlusRuhof34514Detergent do narzędzi chirurgicznych
Fentanyl (Fentanest)Cristá liaRejestracja ANVISA: 1029800810159Znieczulenie
Zwijacz Gossetogólny-Instrumentchirurgiczny
Kleszcze hemostatyczne Halstead-mosquitoogólne-Instrumentchirurgiczny
Maść lecznicza - Unguento PearsonPearson SARejestracja MAPA: SP0000094-16Lek farmaceutyczny
roztwór nadtlenku wodoruRioquimicaRejestracja ANVISA: 218690015Materiał chirurgiczny
IzofluoranBiochimicoRejestracja ANVISA: 100630222Znieczulenie
Zestaw kroplówek Prostownik
IV Zestaw do kroplówek makroDescarpack410301Płynoterapia
Lactofur (ceftiofur)Ourofino SAMAPA rejestracja: SP0000051-50Lek farmaceutyczny
Laringoskop--Instrument chirurgiczny
Maxicam 2%Ourofino SAMAPA rejestracja: SP0000051-69Lek farmaceutyczny
Klej mikroporowy 5 cm x 10 cm ogólny1530Materiał chirurgiczny
MidazolamHipolaborANVISA rejestracja: 1134301430035Znieczulający
wielokierunkowy zestaw infuzyjny dożylnyDescarpack413201Igła do płynoterapii
40 mm x 1,2 mmDescarpack353601Sterylna igła do nakładania leków i środków znieczulających.
Igła 40 mm x 1,6 mmWiltexANVISA rejestracja: 10150470664Sterylna igła do aplikacji leków i środków znieczulających.
Uchwyt igłyogólny-Instrumentchirurgiczny
Nylon 2 szwyShalon MedicalN502CTI40Materiał chirurgiczny
Zwykły długopisogólny-Zwykłydługopis do robienia notatek
Roztwór fizjologiczny 0,9% 500 ml worekJP FarmaMS:1.0491.0070Płynoterapia
Kwas poliglikolowy 2 nić do szwówAtramatG4099-75HMateriał chirurgiczny
Chlorek potasuRejestracja SamtecANVISA: 1559200010139Lek pozajelitowy
Rękawice zabiegoweDescarpack122401Środki ochrony indywidualnej (PPE)
Propofol (Provive)Uniã o Quí micaRejestracja ANVISA: 1049714490057Znieczulający
roztwór mleczanu Ringer 500 ml worekJP FarmaMS:1.0491.0061Terapia płynami
Riohex 0,5% roztwór alkoholu kloreksylowegoRioquimica218690356Asepsja chirurgiczna
Riohex 2% roztwór kloreksydyny ze środkiem powierzchniowo czynnymRioquimica218690356Asepsja chirurgiczna
Skóra głowy 21 GDescarpack421201Materiał chirurgiczny
Ochraniacze na butyOgólneśrodki ochrony indywidualnej (PPE)
Sterylne kompresyCremerANVISA rejestracja: 10071150065Materiał chirurgiczny
Sterylna gazkaProcitexANVISA rejestracja: 80245210083Materiał chirurgiczny
Sterylne obłożenia chirurgiczne 140 cm x 90 cm Venkuri7010003Materiał chirurgiczny
Sterylne obłożenia chirurgiczne 150 cm x 190 cm PolarFixF00208Materiał chirurgiczny
Sterylne rękawice chirurgiczneMucamboCA: 39.317Środki ochrony osobistej (PPE)
StetoskopogólnySprzęt chirurgiczny
Czepek chirurgicznyDescarpack93201Środki ochrony osobistej (PPE)
Fartuch chirurgicznyDescarpack231101Środki ochrony osobistej (ŚOI)
Maska chirurgicznaDescarpack110701Środki ochrony osobistej (PPE)
Nożyczki chirurgiczne-ogólnenarzędzie chirurgiczne
Nożyczki chirurgiczne ostre-ostreogólnenarzędzie chirurgiczne
Zszywacz chirurgicznyTradevet-Materiałchirurgiczny
Tekbond super glueTek Bond78072720030Materiał chirurgiczny
Termometrogólny-Sprzętchirurgiczny
Trójdrożny kranSolidor374Materiał chirurgiczny
Tramadol hydroklorydAgener Uniã oRejestracja MAPA: SP-000292-5.000002Znieczulenie
Przezroczysty opatrunek foliowySkinupperANVISA rejestracja: 82307460014Materiał chirurgiczny
Wodoodporny klej 10 cm x 4,5 cm ogólny364828Materiał chirurgiczny
chirurgiczny generyczny-Płynoterapia głowica

Bibliografia

  1. Lunney, J. K., et al. Importance of the pig as a human biomedical model. Sci Transl Med. 13 (621), 5758(2021).
  2. Xi, J., et al. Genetically engineered pigs for xenotransplantation: Hopes and challenges. Front Cell Dev Biol. 10, 1093534(2023).
  3. Chen, P. R., et al. Production of pigs from porcine embryos generated in vitro. Front Anim Sci. 3, 826324(2022).
  4. Wieczorek, J., et al. Laparoscopic embryo transfer in pigs - comparison of different variants and efficiencies of the method. Pol J Vet Sci. 26 (2), 295-306 (2023).
  5. Martinez, E. A., et al. Design, development, and application of a non-surgical deep uterine embryo transfer technique in pigs. Anim Front. 3 (4), 40-47 (2013).
  6. Wieczorek, J., et al. A new concept in minimally invasive embryo transfer. Ann Anim Sci. 20 (4), 1289-1308 (2020).
  7. Brussow, K. P., Torner, H., Kanitz, W., Ratky, J. In vitro technologies related to pig embryo transfer. Reprod Nutr Dev. 40 (5), 469-480 (2000).
  8. Chen, P. R., et al. Production of pigs from porcine embryos generated in vitro. Front Anim. Sci. 3, 826324(2022).
  9. Langendijk, P., vanden Brand, H., Soede, N. M., Kemp, B. Effect of boar contact on follicular development and on estrus expression after weaning in primiparous sows. Theriogenology. 54 (8), 1295-1303 (2000).
  10. Costea, R., Ene, I., Pavel, R. Pig sedation and anesthesia for medical research. Animals. 13, 3807(2023).
  11. Vierstraete, M., Der Vekens, N. V. an, Beckers, R., Renard, Y., Muysoms, F. Descriptive anatomy of the porcine ventral abdominal wall as a basis for training ventral hernia repair techniques. J Abdom Wall Surg. 3, (2024).
  12. Luna, S. P. L., et al. Validation of the UNESP-Botucatu pig composite acute pain scale (UPAPS). PLoS One. 15 (6), e0233552(2020).
  13. Arruda, P. H. E., Gauger, P. Optimizing sample selection, collection, and submission to optimize diagnostic value. Diseases of swine. 11th ed. Zimmerman, J. J., Karriker, L. A., Ramirez, A., Schwartz, K. J., Stevenson, G. W., Zhang, J. , Wiley-Blackwell. Hoboken, NJ. 98-111 (2019).
  14. Althouse, G. C., Kauffold, J., Rossow, S. Diseases of the reproductive system. Diseases of swine. 11th ed. Zimmerman, J. J., Karriker, L. A., Ramirez, A., Schwartz, K. J., Stevenson, G. W., Zhang, J. , Wiley-Blackwell. Hoboken, NJ. 373-392 (2019).
  15. Hao, Y., et al. Porcine skin-derived stem cells can serve as donor cells for nuclear transfer. Cloning Stem Cells. 11 (1), 101-109 (2010).
  16. Rim, C. H., et al. The effect of the number of transferred embryos, the interval between nuclear transfer and embryo transfer, and the transfer pattern on pig cloning efficiency. Anim Reprod Sci. 143 (1-4), 91-96 (2013).
  17. Choi, K., et al. Production of heterozygous alpha 1,3-galactosyltransferase (GGTA1) knock-out transgenic miniature pigs expressing human CD39. Transgenic Res. 26 (2), 209-224 (2017).
  18. Shim, J., et al. Human immune reactivity of GGTA1/CMAH/A3GALT2 triple knockout Yucatan miniature pigs. Transgenic Res. 30 (5), 619-634 (2021).
  19. Glanzner, W. G., Rissi, V. B., Bordignon, V. Somatic cell nuclear transfer in pigs. Methods Mol Biol. 2647, 197-210 (2023).
  20. Kim, J. H., et al. Analysis of production efficiency of cloned transgenic Yucatan miniature pigs according to recipient breeds with embryo transfer conditions. Theriogenology. 218, 193-199 (2024).
  21. Navarro-Serna, S., Piñeiro-Silva, C., Romar, R., Parrington, J., Gadea, J. Generation of Gene Edited Pigs. , 71-130 (2022).
  22. Geisert, R. D., et al. Rapid conceptus elongation in the pig: An interleukin 1 beta 2 and estrogen-regulated phenomenon. Mol Reprod Dev. 84 (9), 760-774 (2017).
  23. Besenfelder, U., Mödl, J., Müller, M., Brem, G. Endoscopic embryo collection and embryo transfer into the oviduct and the uterus of pigs. Theriogenology. 47 (5), 1051-1060 (1997).
  24. Hazeleger, W., Kemp, B. Recent developments in pig embryo transfer. Theriogenology. 56 (8), 1321-1331 (2001).
  25. Youngs, C. R. Factors influencing the success of embryo transfer in the pig. Theriogenology. 56 (8), 1311-1320 (2001).
  26. Wieczorek, J., Koseniuk, J., Mandryk, I., Poniedziałek-Kempny, K. Piglets born after intrauterine laparoscopic embryo transfer. Pol J Vet Sci. 18 (2), 425-431 (2015).
  27. Brüssow, K. P., Rátky, J., Antosik, P., Kempisty, B., Jaśkowski, J. M. Embryo transfer in swine - an indispensable key for the application of reproduction techniques. Electron J Pol Agric Univ. 21 (3), (2018).
  28. Cadwallader, J. A., Alley, M. R. Malignant hyperthermia in a crossbred landrace-large white pig. N Z Vet J. 23 (9), 207-211 (1975).
  29. Fatehi Hassanabad, A., et al. Prevention of postoperative adhesions: A comprehensive review of present and emerging strategies. Biomolecules. 11 (7), 1027(2021).
  30. Shi, J., et al. Influence of embryo handling and transfer method on pig cloning efficiency. Anim Reprod Sci. 154, 121-127 (2015).
  31. Castagna, C. D., et al. Ovarian cysts and their consequences on the reproductive performance of swine herds. Anim Reprod Sci. 81 (1-2), 115-123 (2004).
  32. Knox, R. V. Factors influencing follicle development in gilts and sows and management strategies used to regulate growth for control of estrus and ovulation. J Anim Sci. 97 (4), 1433-1445 (2019).
  33. Galvin, J. M., Killian, D. B., Stewart, A. N. V. A procedure for successful nonsurgical embryo transfer in swine. Theriogenology. 41 (6), 1279-1289 (1994).
  34. Lins, R. D. A. U., et al. Use of cyanoacrylate in the coaptation of edges of surgical wounds. An Bras Dermatol. 87 (6), 871-876 (2012).
  35. Horvath-Pereira, B. deO., et al. Case report: An innovative non-invasive technique to manage shell injuries in C. carbonarius. Front Vet Sci. 9, 930419(2022).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Laparotomiaklonowane zarodki winitransfer j der kom rek somatycznychsynchronizacja lochtransfer do jajowodudiagnostyka ci owazrosty pooperacyjneopieka pooperacyjnarogi macicy

Powiązane artykuły