Opracowanie pudełka behawioralnego do oceny hamowania prepulsu i aktywności neuronalnej w psychiatrycznych modelach zwierzęcych

Summary

Protokół ten przedstawia skrzynkę behawioralną opartą na mikrokontrolerze do oceny hamowania przedimpulsowego (PPI) poprzez zbieranie danych o przyspieszeniu z czujnika znajdującego się pod skrzynką. Dane te oceniają deficyty bramkowania sensorycznego u społecznie izolowanych szczurów, z dodatkową metodą synchronizacji danych z aktywnością neuronalną w celu przyspieszenia badań neurofizjologicznych nad zaburzeniami zachowania.

Abstract

Stres we wczesnym okresie życia jest uznawany za potencjalny prekursor zaburzeń neurorozwojowych. Jednym z podejść do badania tego stanu w modelach zwierzęcych jest izolacja społeczna po odsadzeniu. Wykazano, że ten niepokój we wczesnym okresie życia u gryzoni prowadzi do zmian neuronalnych podobnych do tych obserwowanych u pacjentów ze schizofrenią, w tym zmniejszonej objętości kory przedczołowej, zmniejszonej gęstości kolców dendrytycznych i zwiększonej aktywności dopaminergicznej w brzusznej okolicy nakrywki. Paradygmat hamowania przedimpulsowego (PPI) jest uznaną metodą oceny deficytów bramkowania sensorycznego zarówno w modelach ludzkich, jak i zwierzęcych. PPI odnosi się do tłumienia odruchu zaskoczenia na silniejszy bodziec akustyczny (np. impuls 120 dB), gdy jest on poprzedzony słabszym akustycznym bodźcem wstępnym (np. impuls 65 dB). Zjawisko to jest często redukowane u pacjentów psychiatrycznych i zwierzęcych modeli zaburzeń psychicznych. W artykule przedstawiono protokół budowy pudełka behawioralnego dla badań IPP, umożliwiający wykorzystanie dostępnego, opłacalnego modelu zwierzęcego schizofrenii i synchronizację pudełka behawioralnego z zapisami neuronalnymi z modelu (np. zapisami elektrofizjologicznymi). To spersonalizowane pudełko behawioralne skutecznie wykrywało reakcje zaskoczenia i ułatwiało ocenę PPI z jednoczesnym rejestrowaniem neuronów u swobodnie zachowujących się gryzoni poddanych izolacji po odsadzeniu.

Introduction

Osoby, u których zdiagnozowano schizofrenię (SCZ), często wykazują deficyty sensomotoryczne. Zmniejszona reakcja na stymulację sensoryczną i trudności w rozróżnianiu istotnych informacji z różnych bodźców sensorycznych są często zgłaszane u tych pacjentów ^1,2. W przypadku osób zdrowych dostarczenie słabszego bodźca przed silniejszym zmniejsza zwykły odruch zaskoczenia na silniejszy bodziec³. Zjawisko to jest znane jako hamowanie przedimpulsowe (PPI) i zostało wykorzystane do zbadania deficytów bramkowania sensorycznego u pacjentów z SCZ i zwierzęcych modelach SCZ⁴.

W zadaniu akustycznym PPI reakcja zaskoczenia na pojedynczy silny impuls akustyczny (np. ~120 dB) jest porównywana z reakcją na przerażenie, gdy ten sam bodziec jest poprzedzony w krótkim odstępie czasu (od 30 do 500) słabszym bodźcem (np. ~65 dB)^3,4. U zdrowych osób reakcja przerażenia na impuls jest zmniejszona, gdy prezentowany jest słabszy impuls wstępny (w porównaniu z reakcją przerażenia na pojedynczy silny impuls). Zjawisko to jest zaburzone u osób z SCZ, które wykazują mniejsze tłumienie reakcji zaskoczenia nawet wtedy, gdy słabszy impuls poprzedza silny impuls 1,5,6,7,8.

Podobnie jak pacjenci z SCZ, szczury z nadaktywnością mezolimbicznej dopaminy również wykazują zmniejszony akustyczny PPI⁹, co czyni ten paradygmat użytecznym narzędziem do badania behawioralnych i fizjologicznych zmian w zwierzęcych modelach schizofrenii. Ogólnie rzecz biorąc, komercyjna aparatura do PPI składa się z komory akustycznej zawierającej czujniki, głośniki i oprogramowanie do ustawiania parametrów eksperymentalnych (np. interwału między impulsami i intensywności bodźców), rejestrowania reakcji gryzoni na przerażenie i przetwarzania danych. Jednak systemy komercyjne często oferują ograniczone opcje dostosowywania i są kosztowne. Podejście "zrób to sam" (DIY) do budowy elastycznej aparatury badawczej zwiększa dostęp do sprzętu i transfer wiedzy¹⁰. Rozwiązania typu "zrób to sam" do badania mechanizmów bramkowania sensomotorycznego, takie jak PPI, muszą uwzględniać kilka kluczowych czynników, aby zapewnić skuteczność i niezawodność. Niektóre istotne kwestie obejmują specyfikacje projektowe, kontrolę środowiska i światła, tłumienie dźwięku, systemy dostarczania bodźców, czujniki pomiaru behawioralnego oraz akwizycję i analizę danych.

Rozwiązania dla majsterkowiczów dla pudełek behawioralnych zostały opracowane dla różnych funkcji, takich jak eksperymenty z lizaniem instrumentalnym¹¹, zadania dyskryminacji słuchowej^{12 i funkcja} kończyn przednich¹³. Chociaż kilka podejść typu "zrób to sam" koncentruje się na śledzeniu wideo¹⁴, tego typu dane wymagają dużych zasobów obliczeniowych do analizy. Platforma sprzętowo-programowa typu open source może być wykorzystana do zbudowania taniego pudełka behawioralnego PPI z elastycznością testowania niestandardowych eksperymentów 15,16,17 i synchronizacji nagrań neuronalnych swobodnie zachowujących się zwierząt.

W tym artykule przedstawiono metodę opracowywania pola behawioralnego do oceny IPP za pomocą taniej platformy do badania modelu izolacji szczurów po odsadzeniu, stresu we wczesnym okresie życia przyczyniającego się do rozwoju objawów podobnych do SCZ, który może być również stosowany z jednoczesnym elektrofizjologicznym zapisem mózgu.

Protocol

Badania na zwierzętach przeprowadzono zgodnie z Przewodnikiem dotyczącym opieki nad zwierzętami laboratoryjnymi i ich wykorzystywania. Projekt ten został zatwierdzony przez Komisję Etyki Instytutu CEUA Santos Dumont (numer zatwierdzenia 04/2016). Do testów IPP 35 szczurów Wistar (3 miesiące, 290-490 g; 19 samców i 16 samic) oceniano indywidualnie w pudełku PPI. Wszystkie 35 szczurów poddano protokołowi izolacji po odsadzeniu, w którym trzymano je indywidualnie w 12/12-godzinnym cyklu świetlnym w temperaturze 23 °C i wilgotności 70% w kontrolowanym obiekcie z dostępem ad libitum do pożywienia i wody. Szczegółowe informacje na temat odczynników i sprzętu użytego w badaniu znajdują się w Tabeli Materiałów.

1. Pudełko PPI

1. Zrób akrylowe przezroczyste pudełko o długości 25 cm, szerokości 20 cm i wysokości 25 cm, aby utrzymać swobodnie zachowującego się szczura z przewodową sceną główną. Ta wysokość jest ważna, aby zapobiec ucieczce szczurów i utrzymać scenę główną wolną i bezpieczną dla nagrań neuronalnych.
   1. Użyj samoprzylepnych gumowych podkładek, aby odizolować akrylowe pudełko od zewnętrznych wibracji mechanicznych (np. stół laboratoryjny z innym sprzętem) i utrzymać akcelerometr przymocowany pod pudełkiem bez fizycznego kontaktu z innymi częściami (np. ławką lub drutami).
      UWAGA: Dostosuj rozmiar przezroczystego akrylowego pudełka do wymagań zadania (np. mysz, szczur, marmozeta).
2. taśmowy (26 AWG) bezpośrednio do czterech otworów na piny płytki akcelerometru: VCC (napięcie), GND (masa), SCL (zegar szeregowy) i SDA (dane szeregowe). Oczyść środek akrylu i płaską ścianę czołową akcelerometru. Użyj kleju cyjanoakrylowego lub żywicy epoksydowej, aby mocno przymocować akcelerometr pod akrylowym pudełkiem.
   1. Poczekaj, aż zostanie całkowicie utwardzony (Rysunek 1). Podłącz drugą stronę taśmowego do mikrokontrolera w następujący sposób: VCC do 3,3 V, GND do GND, SCL do SCL (I2C SCL) i SDA do SDA (I2C SDA). Trzymaj akcelerometr podłączony pod pudełkiem bez fizycznego kontaktu z innymi częściami (np. ławką lub przewodami).
      UWAGA: Istnieje kilka marek akcelerometrów i mikrokontrolerów DYI. Rozmiar i typ mikrokontrolera i akcelerometru zależą od przeznaczenia i wymiarów/specyfikacji obudowy. Rozważ procedury czyszczenia po każdej sesji testowej i, jeśli to konieczne, nałóż warstwę lakieru elektronicznego na złącza lutowane i obwody, aby zaizolować i chronić przed przypadkowymi rozpryskami metalowych części akcelerometru. Dla celów porównawczych akcelerometr DYI i akcelerometr komercyjny zostały przymocowane obok siebie pod skrzynką.
3. Wykonaj dźwiękoszczelną komorę z przednimi drzwiami i krawędziami o grubości 80 cm z płyty pilśniowej (MDF) o grubości 15 mm. Wyłóż wnętrze pudełka pianką akustyczną. Umieść głośnik 20 cm nad akrylową skrzynką w taki sposób, aby scena czołowa i mogły się swobodnie poruszać.
   1. Podłącz komputerowe wyjście audio do płytki mikrokontrolera (wejście analogowe i GND) oraz głośnika za pomocą komercyjnego detektora dźwięku, który odbiera bodźce akustyczne z głośnika i generuje znaczniki zdarzeń TTL (logika tranzystor-tranzystor) w celu synchronizacji danych behawioralnych i neuronalnych (ilustracja 2).
      UWAGA: Zbuduj komorę akustyczną zgodnie z wymaganiami eksperymentalnymi (np. rozważ potrzebę zainstalowania kamer, dodatkowego światła i głośników). Użyj dzielnika rezystorów (np. rezystory 10 kΩ i 10 kΩ), aby utrzymać dźwięk z komputera na zewnątrz do analogowego zakresu wejściowego mikrokontrolera 0-5 V. Komercyjny detektor dźwięku odbiera sygnał wejściowy audio i wysyła TTL (Transistor-Transistor-Logic) jako znacznik początku bodźca dla każdej stymulacji akustycznej wysłanej przez komputer (0-0,4 V jest uważane za stan niski, a 2,8-5 V za stan wysoki). Ogólnie rzecz biorąc, systemy elektrofizjologiczne mają żeńskie porty wejściowe BNC do odbioru sygnałów TTL lub analogowych (np. bodźców audiologicznych).
4. Podłącz płytkę mikrokontrolera do komputera za pomocą USB. Otwórz zintegrowane oprogramowanie środowiska programistycznego dla płytki mikrokontrolera.
   1. Wybierz odpowiednią płytkę mikrokontrolera, port COM i szybkość transmisji. Otwórz szkic pliku, skompiluj i prześlij kod na płytkę mikrokontrolera. Kliknij port szeregowy monitora , aby sprawdzić przychodzące dane. Zamknij oprogramowanie środowiska programistycznego.
      UWAGA: W przypadku podłączenia płytki mikrokontrolera do komputera przez USB, jest ona przypisana do portu COM. Otwórz menedżera urządzeń w panelu sterowania systemu Windows i kliknij Porty (COM i LPT), aby zobaczyć mikrokontroler przypisany do portu COM (numer COM). Numer COM musi być zgodny z ustawieniem portu COM oprogramowania deweloperskiego. Przykładowy szkic jest dostępny na stronie https://github.com/neurodeveloperISD.
5. Umieść cyfrowy miernik dźwigni dźwięku w tym samym miejscu, w którym zwierzę będzie znajdować się w pudełku. Sprawdź hałas tła w komorze przy zamkniętych drzwiach. Odtwarzaj bodźce akustyczne i dostosuj zakres wykrywania miernika poziomu dźwięku (30-80 dB lub 80-130 dB), aby skalibrować poziomy bodźców akustycznych wysyłanych przez komputer.
   UWAGA: Zgodnie z protokołem eksperymentalnym, różne sekwencje bodźców mogą być tworzone przy użyciu preferowanego języka open source (np. Pythona). W tym badaniu biały szum o natężeniu 68 dB był prezentowany przez 7 minut z losowymi kombinacjami impulsów wstępnych i impulsów. Wyeksportuj plik jako plik falowy i sekwencję tabeli kombinacji impulsu wstępnego/impulsu do analizy w trybie offline.
6. Otwórz preferowany program typu open source, aby uzyskać i zapisać dane portu szeregowego. Skonfiguruj port COM, płytę mikrokontrolera i szybkość transmisji. Kliknij Połącz , aby odczytać surowe dane lub wykres. Kliknij przycisk Zapisz , aby rozpocząć rejestrowanie danych eksperymentu.
   UWAGA: Istnieje oprogramowanie typu open source do nagrywania portów szeregowych (np. CoolTerm, Python) i dostępne na rynku (np. Matlab).
7. Przed umieszczeniem zwierzęcia upewnij się, że każdy element (dostarczanie bodźca, wykrywanie reakcji) działa prawidłowo. Sprawdź czas i sekwencję bodźców (zgodnie z wybranym protokołem PPI). Sprawdź, czy odpowiedzi akcelerometru są dokładnie wykrywane i rejestrowane.
8. Zbierz i przeanalizuj dane odpowiedzi, aby ocenić efekt PPI (krok 5). Użyj narzędzi statystycznych do interpretacji wyników i oceny deficytów bramkowania sensoryczno-motorycznego.

Rysunek 1: Akcelerometr mocno przymocowany pod skrzynką behawioralną. Rysunek przedstawia tanią płytkę akcelerometru (po lewej) i wysokiej klasy komercyjny akcelerometr (po prawej) w celu porównania danych. Akcelerometr musi być mocno przymocowany do akrylowego pudełka, a płaski musi być przymocowany do akrylu, aby uniknąć jego pęknięcia z powodu procedur czyszczenia i zmian zwierząt. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Zintegrowana skrzynka behawioralna oparta na mikrokontrolerze. Schemat przedstawiający szczura w akrylowym pudełku z przewodową sceną czołową podłączoną do systemu rejestracji elektrofizjologii mózgu. Akcelerometr znajdujący się pod skrzynką podłączony do mikrokontrolera wysyła dane akcelerometru trójosiowego do komputera i pobiera znaczniki wyzwalania bodźców do przetwarzania danych w trybie offline. Głośnik odtwarza szum tła i impulsy dźwiękowe, które wyzwalają znaczniki danych akcelerometru. Mikrofon zbiera bodźce akustyczne, aby zsynchronizować się z danymi elektrofizjologicznymi (np. nabywając zachowanie wokalizacyjne podczas zadań). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

2. Procedura izolacji po odsadzeniu u szczurów

1. Odizoluj młode szczurów w oddzielnych klatkach natychmiast po odsadzeniu (od 17^do 21^{dnia po} urodzeniu) i trzymaj je w izolacji przez co najmniej 90 dni po urodzeniu.
2. Implant neurochirurgicznej matrycy mikroelektrod należy wykonać po 90 dniach po urodzeniu, stosując ustalone protokoły^18,19.
3. Wykonaj zadanie IPP po 7-10 dniach od operacji (patrz krok 4).

3. Zabieg chirurgiczny implantacji mózgu z matrycą elektrod

1. Układ mikroelektrod musi być wcześniej wysterylizowany (w tym badaniu wykorzystano 32 druty wolframowe o średnicy 50 μm, rysunek 3A). Umieścić zwierzę w izolowanym pudełku ze znieczuleniem izofluranem (5% w 0,5 l/min O₂, zgodnie z instytucjonalnie zatwierdzonymi protokołami).
2. Wyjąć zwierzę z pudełka i przechowywać je w znieczuleniu izofluranem ze znieczulonym stożkiem nosowym (1% w 0,5 l/min O₂). Atropinę należy podawać domięśniowo w dawce 0,05 mg/kg. Ogol głowę zwierzęcia blaszką za pomocą płynu antyseptycznego. Po 5 minutach podawać ketaminę dootrzewnowo w dawce 70 mg/kg mc., a ksylazynę domięśniowo w dawce 3 mg/kg.
3. Umieścić zwierzę na poduszce grzewczej w temperaturze 37 ± 0,2 °C w wieloosiowym urządzeniu stereotaktycznym pod wdychanym izofluranem (1%-5% w 0,5 l/min O₂). Włóż czujnik doodbytniczy, aby sterować poduszką grzewczą wraz z czujnikiem doodbytniczym, aby monitorować nasycenie PO₂ i tętno. Upewnij się, że nasycenie tlenem przekracza 95%, a tętno wynosi od 200 do 300 uderzeń na minutę.
   UWAGA: Należy obserwować te parametry przez cały czas trwania zabiegu chirurgicznego i, jeśli to konieczne, dostosować stężenie izofluranu.
4. Nałóż sterylny lubrykant okulistyczny na oczy zwierzęcia i przykryj zwierzę sterylnym obłożeniem chirurgicznym.
   UWAGA: Wszystkie poniższe zabiegi chirurgiczne należy wykonywać w warunkach aseptycznych.
5. Otwórz pole operacyjne w okolicy głowy zwierzęcia i przymocuj je do skóry za pomocą szwów (4-0). Nałóż lidokainę 20% podskórnie na czaszkę zwierzęcia i wykonaj podłużne nacięcie (~1,5 cm) skóry głowy, a następnie usuń okostną kalwarii. Oczyść powierzchnię kości wodą utlenioną.
6. Ustaw bregmę i lambdę w tej samej płaszczyźnie poziomej, aby uzyskać lepszą dokładność kraniotomii, zwłaszcza jeśli nagrywasz z wielu obszarów mózgu (to badanie zarejestrowano z brzusznego obszaru nakrywki, ciała migdałowatego, jądra półleżącego, hipokampa i kory przedczołowej, ryc. 3B).
7. Zaznacz pozycje otworów w zadziorach za pomocą wiertarki robotycznej i wkręć od 3 do 4 w rozmieszczone miejsca na czaszce, odległe miejsce kraniotomii bez perforacji opony twardej (ryc. 3C,D).
8. Wykonaj manualną kraniektomię¹⁹, wiercąc obwód kraniotomii za pomocą wiertła dentystycznego z maksymalną prędkością dla celów mózgowych (ryc. 3E).
9. Usuń kość, trzymaj oponę twardą w sterylnej soli fizjologicznej i usuń oponę twardą.
   UWAGA: Zwróć uwagę na cały proces ekstrakcji opony twardej, aby zapobiec uszkodzeniom mózgu, które mogą zagrozić dokładności głębokości.
10. Umieść elektrody matrycy w pozycjach kraniektomii i przesuwaj się w dół matrycy elektrod, aż elektrody o najgłębszym położeniu lekko dotkną tkanki mózgowej. Użyj przewodu do elektrycznego uziemienia elektrod, umieszczonego na powierzchni czaszki, ułożonego wokół czterech (rysunek 3F).
    UWAGA: Zobacz szkolenie dotyczące implantu neurochirurgicznego w modelu^{zwierzęcym 19} z wykorzystaniem alternatywnego tematu.
11. Wkładaj elektrody co 100 μm do miejsca docelowego i przymocuj je cementem dentystycznym, aby łącznik był mocno przymocowany do czaszki i poza skórą.
    UWAGA: Uważaj, aby nie upuszczać cementu dentystycznego na tkankę mózgową lub w otworach na kołki złącza.
12. Podawać tramadol (5 mg/kg; podskórnie, [SC]), enrofloksacynę (5 mg/kg; SC) i ibuprofenu (5 mg/kg; doustnie) dwa razy na dobę przez trzy kolejne dni.
    UWAGA: Monitoruj zwierzę podczas rekonwalescencji anestezjologicznej w odstępach 5-10 minut przez co najmniej godzinę. Upewnij się, że zwierzę wykazuje zdolność do wyprostowania się, gdy leży na boku, utrzymania mostkowej pozycji ciała i wykazywania spontanicznych ruchów w odpowiedzi na stymulację środowiskową, taką jak manipulacja klatką.

Rysunek 3: Implant układu mikroelektrod . (A) Układ mikroelektrod z 32 drutami wolframowymi o średnicy 50 μm dla przedlimbicznego i podlimbicznego PFC, VTA, AMY, NAcc i hipc. (B) Czaszka szczura pokazująca cele mózgowe, bregmę i lambdę. (C) Pozycje wiercenia dla kraniektomii i. (D) podtrzymujące implant matrycy mikroelektrod i rysunek kraniektomii. (E) Otwory czaszki bez opony twardej. (F) Mikroelektrody przenikające do mózgu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

4. PPI i zapisy neuronalne

1. Bardzo ostrożnie podłącz scenę czołową do implantu łączącego na czaszce szczura.
   UWAGA: Przed poddaniem się jakimkolwiek procedurom doświadczalnym należy zaaklimatyzować zwierzęta przez 10 minut w odpowiednim pomieszczeniu testowym i komorze rejestracyjnej, aby zminimalizować stres.
   Ten krok jest kluczowy, aby uniknąć złamania mikro pinów męskiego złącza stopnia głównego lub uszkodzenia akrylu dentystycznego na czaszce. Aby połączyć stopień głowy z implantem czaszkowym u przytomnych zwierząt, wykonaj 3 sesje habituacyjne trwające 10 minut obsługi. Pierwsza sesja: przyzwyczaj zwierzę do trzymania go w dłoni, z kciukiem i palcami wskazującymi delikatnie podtrzymującymi głowę, a ciałem opartym o eksperymentatora. Drugą ręką wykonuj lekkie i powtarzalne ruchy nad głową zwierzęcia i obszarem łącznika, aż zwierzę przyzwyczai się do obsługi. Druga sesja: Wprowadź stopień głowy i wykonuj małe, delikatne ruchy symulujące proces łączenia. Stopniowo zwiększaj kontakt, aż zwierzę przyzwyczai się do łagodnego nacisku wywieranego na głowę podczas ustawiania. Trzecia sesja: Zakończ proces łączenia, trzymając głowę zwierzęcia bezpiecznie, ale pozwalając na lekkie naturalne ruchy, aby zapobiec stresowi. Jeśli zwierzę poruszy głową, przerwij procedurę i przywróć przyzwyczajenie, trzymając zwierzę w dłoni z głową między palcami. Po uspokojeniu uruchom ponownie proces połączenia.
   Zwierzę można umieścić w pudełku ze znieczuleniem izofluranem (5% w 0,5 l/min O₂), aby w razie potrzeby pomóc w podłączeniu. Używając znieczulenia do połączenia stopnia głównego, poczekaj, aż izofluran zostanie wypłukany, aby nie wpływał na zachowanie IPP i aktywność mózgu.
2. Włącz system akwizycji danych neuronalnych i upewnij się, że odbiera on dane z bodźców akustycznych przez mikrokontroler lub generator TTL podłączony do detektora dźwięku lub mikrofonu. Włącz rejestrator typu open source z portem szeregowym, który został wcześniej sprawdzony w kroku 1.6.
   UWAGA: W zależności od placówki laboratoryjnej te procedury synchronizacji mogą się różnić.
3. Rozpocznij pozyskiwanie danych elektrofizjologicznych (skoki i potencjał pola lokalnego) i akcelerometru za pomocą oprogramowania do akwizycji elektrofizjologicznej.
   UWAGA: Sprawdź przychodzące dane i dostosuj ustawienie wzmocnienia, aby uniknąć obcięcia sygnału lub niewykrycia przebiegów skoków i progu wykrywania skoków. W zależności od systemu nagrywania i rejestrowanych danych, wzmocnienie i próg można regulować tylko w trybie online. Upewnij się, że ustawienia filtra dla sygnałów o niskiej częstotliwości (LFP), zwykle od 0.5 Hz do 100 Hz, wysokiej częstotliwości (skoki), zwykle od 300 Hz do 5000 Hz i szumów o niskiej częstotliwości, zwykle 50/60 Hz, są prawidłowo określone, aby umożliwić analizę w trybie offline.
4. Wystaw zwierzę na działanie białego szumu tła (~68 dB) przez 7 minut z losową prezentacją wszystkich rodzajów impulsów, 10 razy każdy rodzaj (ryc. 4). Rysunek 4 przedstawia pięć typów impulsów używanych w tym protokole: impuls 1 (impuls wstępny 75 dB, interwał 30 ms i impuls 120 dB), impuls 2 (impuls wstępny 85 dB, interwał 30 ms i impuls 120 dB), impuls 3 (impuls wstępny 75 dB, interwał 100 ms i impuls 120 dB), impuls 4 (impuls wstępny 85 dB, interwał 100 ms i impuls 120 dB), i impuls 5 (pojedynczy impuls 120 dB).
5. Pod koniec sesji nagraniowej wyłącz oprogramowanie akwizycyjne i odłącz złącze headstage.

Rycina 4: Rodzaje bodźców słuchowych. Ilustrowana sesja składająca się z 7-minutowego białego szumu z 5 rodzajami kombinacji prepulsu + impulsu została przedstawiona losowo. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

5. Analiza elektrofizjologiczna i behawioralna

1. Zaimportuj surowe dane zawierające dane o mózgu, przyspieszeniu i bodźcach akustycznych na platformie przetwarzania sygnałów. Wyodrębnij epoki skoncentrowane na każdym bodźcu akustycznym.
2. Odpowiednio znormalizuj środki, aby porównać wartości między zwierzętami. Użyj pojedynczego impulsu (impuls 5 w tym protokole) jako maksymalnej odpowiedzi i znormalizuj odruch na inne impulsy do tej wartości.
3. Rozważ amplitudę przestraszenia dla impulsu 5 jako 100%, a pozostałe impulsy jako funkcję impulsu 5.
   UWAGA: Amplitudy są wyodrębniane przy użyciu średniej kwadratowej (RMS) trzech osi akcelerometru (rysunek 5A) w celu wyrażenia wielkości zaskoczenia (rysunek 5B) w zestawie n wartości. RMS jest wzorem matematycznym²⁰, gdzie:
   
   ax = oś x akcelerometru, ay = oś y akcelerometru, az = oś z akcelerometru
   t = początek bodźca akustycznego plus 200 ms
   n = wartości kolekcji
   Aby obliczyć procentowy udział skutecznej przestraszenia impulsów od 1 do 4 w odniesieniu do impulsu 5:
   
   _Impuls RMS = RMSostrzeżenie dla impulsu 1, 2, 3, 4
   RMS_pulse5 = RMSzaklęk dla impulsu 5
4. Wykorzystaj TTL wysyłane do systemu akwizycji danych neuronalnych, aby odpowiednio przeanalizować dane mózgowe otaczające bodźce akustyczne i reakcje odruchowe.

Rysunek 5: Dane z akcelerometru trójosiowego i wartość skuteczna. (A) Ilustracyjne dane akcelerometru trójosiowego (oś x, y, z (g)) zarejestrowano podczas 6 minut stymulacji wyjściowej i losowego białego szumu 80 PPI. (B) Zaskakujące obliczenia RMS z trzech osi akcelerometru (x, y, z podświetlona szara kolumna, rozwinięta w B). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Results

Hamowanie przed impulsem nie wykazało różnicy dla impulsu 1 i 3 w porównaniu z impulsem 5 (tylko 120 dB), ale wykazało różnicę statystyczną dla impulsu 2 i 4 (p < 0,05) (ryc. 6).

Ryc. 6: Średnie amplitudy odpowiedzi na bodziec słuchowy w pięciu typach impulsów. P...

Discussion

W protokole tym przedstawiono pudełko behawioralne DIY do badania zadań hamowania prepulsów u swobodnie zachowujących się szczurów Wistar podczas rejestrowania danych mózgowych (w tym przykładzie potencjału pola lokalnego i aktywności impulsowej). Pudełko można zbudować i dostosować za pomocą komponentów powszechnie spotykanych w laboratoriach neurobiologicznych, dzięki czemu jest dostępne i tanie. Takie rozwiązania typu "zrób to sam" pozwalają również na większą elastyczność w projektowaniu i personalizacji eksperymentó...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Pudełko akrylowe	Wykonane na zamówienie		Arkusz akrylowy o grubości 5 mm, 20 cm x 25 cm x 25 cm
Samoprzylepne gumowe nakładki na odbojniki	Ziarnistość goryla	MPU6050	Średnica 0,8 cala i wysokość 0,38 cala. Gumowe podkładki stabilizujące akrylowe pudełko i izolujące od wibracji zewnętrznych. Wysokość powinna być większa niż 5 mm ze względu na MPU6050 pod pudełkiem.
Arduino Uno	Arduino	ATmega328P	Płytka mikrokontrolera Arduino oparta na procesorze ATmega328P z 14 cyfrowymi pinami wejścia/wyjścia, 6 wejściami analogowymi i częstotliwością taktowania 16 MHz.
Cedrus stim tracker (detektor dźwięku)	Cedrus	https://cedrus.com/stimtracker/index.htm	Cedrus stim tracker wykrywa bodźce akustyczne i wysyła znaczniki TTL do danych akcelerometru.
System badawczy Cineplex	Plexon (plekson)	https://plexon.com/plexon-systems/cineplex-behavioral-research-system/	Nagranie wideo zwierzęcia zsynchronizowane z danymi elektrofizjologicznymi.
Klej cyjanoakrylowy		MPU6050	Super klej, aby mocno przymocować MPU6050 pod pudełkiem.
Cyfrowy miernik dźwigni dźwięku			Miernik decybeli do kalibracji bodźców ustawionych przed eksperymentem.
IBM SPSS	SPSS (Pakiet Statystyczny dla Nauk Społecznych, USA)		Platforma oprogramowania IBM SPSS Statistics.
Matlab (Matlab)	MathWorks (Prace matematyczne)	https://www.mathworks.com/products/matlab.html	Platforma MATLAB do analizy danych, tworzenia algorytmów i tworzenia modeli.
Mikro śruba ze stali nierdzewnej			do okularów o średnicy 1,2 mm i długości 4 mm.
Tablica mikroeletrody	Na zamówienie		Wykorzystuje złącze omnetics i druty wolframowe o grubości 50 mikronów pokryte parylenem California Fine Wire.
Mikrofon			Mikrofon do akwizycji stymulacji akustycznej zsynchronizowanej z danymi elektrofizjologicznymi.
Zobacz materiał MPU-6050	InvenSense	https://invensense.tdk.com/products/motion-tracking/6-axis/mpu-6050/	MPU-6050 to 3-osiowy żyroskop i 3-osiowy akcelerometr
Wielokanałowy procesor akwizycji	Plexon (plekson)	SPIKE/LFP	MAP Plexon do pozyskiwania neuronalnych danych elektrofilologicznych SPIKE/LFP oraz kanałów pomocniczych (mikrofon, markery TTL, akcelerometr).
NeuroEksplorator	Nex	https://www.neuroexplorer.com/	Program do analizy danych NeuroExplorer dla stale rejestrowanych sygnałów i znaczników czasu (pociągi impulsowe, zdarzenia behawioralne)
Neuroodkrywca	Nex Technolgie	https://www.neuroexplorer.com/	Oprogramowanie do analizy danych neurofizjologicznych SPIKE i LFP.
Sortownik offline	Plexon (plekson)	https://plexon.com/products/offline-sorter/#38957t34842	Oprogramowanie do sortowania spajków w trybie offline.
Sorter offLineSorter	Sortownik offline	https://plexon.com/products/offline-sorter/	Sortownik offline to oprogramowanie do sortowania spajków w trybie offline
Doodbytniczy weterynaryjny czujnik SpO2	KTMED (Międzynarodowa Federacja Związków	FS-03	Czujnik SpO2 dla małych zwierząt
Taśmę			Cienki taśmowy do podłączenia MPU6050 do Arduino.
Wiertarka robota	Gwiazda Neuro	https://robot-stereotaxic.com/drill-injection-robot/	Wiertarka robotyczna używana ze stereotaktycznym Neurostar. Można go zastąpić wiertarką ręczną.
Głośnik			Głośnik ma zakres od 100 do 40 kHz i natężenie do 150 dB.
Aparatura stereotaktyczna	Gwiazda Neuro		Stereotaktyka stosowana w neurochirurgii u gryzoni