Artykuł metodologiczny

Postępy w technologii organoidów bydlęcych z wykorzystaniem jednowarstwowych interfejsów jelita cienkiego i grubego

DOI:

10.3791/67010

⸱

14 czerwca 2024

 ,  , 
1Department of Veterinary Microbiology and Pathology, College of Veterinary Medicine, Washington State University, 2Department of Veterinary Clinical Sciences, College of Veterinary Medicine, Washington State University

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To badanie przedstawia protokół generowania monowarstw 2D jelit bydlęcych z organoidów, oferując lepszy dostęp do badania interakcji gospodarz-patogen. Obejmuje on metody oceny integralności i funkcjonalności błony, rozwijając modele in vitro, które naśladują fizjologię przewodu pokarmowego bydła. Podejście to obiecuje znaczące korzyści biomedyczne i rolnicze, w tym ulepszone strategie leczenia.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Postęp wiedzy na temat fizjologii przewodu pokarmowego i jego chorób zależy przede wszystkim od opracowania precyzyjnych, specyficznych dla gatunku modeli in vitro, które wiernie naśladują in vivo tkanki jelitowe. Jest to szczególnie istotne dla badania interakcji gospodarz-patogen u bydła, które jest znaczącym rezerwuarem patogenów stanowiących poważne zagrożenie dla zdrowia publicznego. Tradycyjne organoidy 3D oferują ograniczony dostęp do powierzchni wierzchołkowej nabłonka jelitowego, co jest przeszkodą pokonaną przez pojawienie się kultur jednowarstwowych 2D. Kultury te, pochodzące z komórek organoidowych, zapewniają odsłoniętą powierzchnię świetlną dla bardziej dostępnych badań. W tym badaniu przedstawiono szczegółowy protokół tworzenia i utrzymywania jednowarstwowych kultur 2D z komórek organoidów jelita cienkiego i grubego bydła. Metoda ta obejmuje protokoły oceny integralności błony poprzez transepiteliczny opór elektryczny i przepuszczalność parakomórkową wraz z technikami barwienia immunocytochemicznego. Protokoły te stanowią podstawę do ustanowienia i scharakteryzowania jednowarstwowego systemu hodowli bydła 2D, przesuwając granice zastosowań tych metod w badaniach biomedycznych i translacyjnych o znaczeniu dla zdrowia publicznego. Zastosowanie tego innowacyjnego podejścia umożliwia opracowanie fizjologicznie istotnych modeli in vitro do badania zarówno normalnych, jak i chorobowych stanów fizjologii jelit bydła. Implikacje dla postępu biomedycznego i rolniczego są głębokie, torując drogę do skuteczniejszego leczenia dolegliwości jelitowych u bydła, poprawiając w ten sposób zarówno dobrostan zwierząt, jak i bezpieczeństwo żywności.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hodowla komórek macierzystych nabłonka jelitowego w trójwymiarowych (3D) hodowlach, znanych jako organoidy jelitowe, stanowi znaczący postęp w technologii in vitro do badania funkcji jelit, odżywiania i interakcji z patogenami1,2. Te organoidy naśladują złożoną strukturę nabłonka jelitowego in vivo poprzez samoreplikację i organizowanie się w formacje 3D, które obejmują różne linie komórek jelitowych3. Ta cecha podkreśla ich znaczny potencjał w zakresie pogłębiania wiedzy na temat biologii jelit.

Rosnące zainteresowanie zastosowaniem technologii organoidów jelitowych u zwierząt hodowlanych wymaga udoskonalenia technik hodowli i konserwacji4,5. Znaczenie tej technologii podkreśla jej potencjalny wpływ na badanie zdrowia jelit zwierząt hodowlanych, które odgrywa kluczową rolę w ich produktywności, a w konsekwencji w ekonomice przemysłu spożywczego i zwierzęcego, wpływając na dobrostan zwierząt i koszty operacyjne6,7. W szczególności wykorzystanie kultur organoidów jelitowych do zbadania funkcji jelit bydła ma ogromne znaczenie, biorąc pod uwagę ich rolę jako rezerwuarów odzwierzęcych patogenów jelitowych, takich jak Salmonella spp. i Escherichia coli (E. coli) O157:H78. Patogeny te są zlokalizowane w określonych segmentach jelita, co sprawia, że konieczne jest różnicowanie metod hodowli organoidów jelitowych w zależności od segmentu jelita, aby zwiększyć precyzję badań9.

Istotną przeszkodą w badaniu organoidów jelitowych jest ograniczony dostęp do powierzchni wierzchołkowej komórki nabłonkowej10. Podczas hodowli w macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) komórki naturalnie orientują się tak, że powierzchnia podstawowa jest skierowana na zewnątrz, a powierzchnia wierzchołkowa jest skierowana do wewnątrz10. Aby sprostać temu wyzwaniu, przedstawiono metody, które polegają na dysocjacji organoidów 3D na pojedyncze komórki i zasiewaniu ich w półprzepuszczalnych wkładkach do hodowli komórkowych. Ta konfiguracja ustanawia interfejs między powierzchnią wierzchołkową a przedziałem podstawno-bocznym. Protokół ten pokazuje, że komórki pochodzące z organoidów jelitowych bydła mogą tworzyć spójną monowarstwę 2D, o czym świadczą pomiary przeznabłonkowego oporu elektrycznego (TEER) i testy przepuszczalności parakomórkowej. Dodatkowo, rozwój polaryzacji komórkowej z obrzeżami szczoteczek i ścisłymi połączeniami w komórkach jednowarstwowych 2D pochodzących z organoidów został potwierdzony za pomocą immunofluorescencji i mikroskopii elektronowej, odzwierciedlając właściwości nabłonka jelitowego in vivo.

W tym badaniu jelito kręte reprezentuje przewód cienki, a odbytnica oznacza przewód pokarmowy gruby. Selekcje te opierają się na odpowiednich patogenach jelitowych, takich jak Salmonella spp., które mogą translokować jelito kręte11, oraz E. coli O157:H7, o których wiadomo, że głównie kolonizują odbytnicę9 u bydła. Wybór tych konkretnych segmentów jelit podkreśla konieczność dostosowania metod hodowli organoidów jelitowych do obszaru jelitowego w celu zapewnienia precyzji badań. Metody te szczegółowo opisują procedurę skutecznego hodowania jednowarstwowego interfejsu 2D pochodzącego z organoidów z tych segmentów jelita, zapewniając solidny model do badania zdrowia jelit bydła, infekcji patogennych i interakcji między mikrobiomem jelitowym a gospodarzem.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Krypty jelitowe zostały pozyskane z nadwyżek próbek jelitowych pochodzących z lokalnej rzeźni, a sygnalizacja dawców znajduje się w Tabeli Uzupełniającej 1. Organoidy zostały wygenerowane przy użyciu tkanek pochodzących od zwierząt, które zostały humanitarnie uśpione w rzeźni, a zwierzęta nie były pozyskiwane wyłącznie do tych badań; w związku z tym badanie to jest zwolnione z oceny IACUC, a oświadczenie etyczne nie ma zastosowania.

1. Powłoka ECM na wkładkach do hodowli komórkowych do jednowarstwowej hodowli 2D pochodzącej z organoidów

UWAGA: Wszystkie procedury są przeprowadzane przy użyciu wysterylizowanych materiałów i technik aseptycznych w komorze bezpieczeństwa biologicznego. Wszystkie odczynniki są przechowywane na lodzie przez cały czas trwania zabiegu, chyba że zaznaczono inaczej.

  1. Przygotować 100 μl ECM do pokrycia każdej wkładki do hodowli komórkowej o średnicy 0,33cm2, dokładnie mieszając podłoże podstawowe z 2% (v/v) hydrożelem na bazie ECM w mikroprobówce.
  2. Wyjmij pojedynczą wkładkę do hodowli komórkowej z opakowania za pomocą wysterylizowanych kleszczyków i umieść pojedynczo w dołkach 24-dołkowej przezroczystej płytki do hodowli komórkowej z płaskim dnem.
  3. Nałożyć 100 μl powłoki ECM przygotowanej w kroku 1.1 na komorę wierzchołkową każdej wkładki do hodowli komórkowej przygotowanej w kroku 1.2.
  4. Założyć pokrywę i inkubować płytkę do hodowli komórkowej zawierającą powlekaną wkładkę (wkładki) do hodowli komórkowych w nawilżanym inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 1 godzinę.
    1. W przypadku komórek organoidów jelita krętego wkładka jest gotowa do użycia po 1 godzinie inkubacji. W przypadku komórek organoidów odbytniczych, po 1 godzinie inkubacji, zastąp powłokę ECM monowarstwową pożywką hodowlaną doodbytniczą i inkubuj przez noc (tabela 1). Przygotować dodatkowe wkładki do hodowli komórkowych do ślepej próby kontrolnej, jeśli są przeznaczone do wykonywania pomiarów TEER.
. hodowlanych
jelito kręteodbytnica
Czas inkubacji powłoki ECM1 godz1 godzina, a następnie
przez noc w jednowarstwowych pożywkach
Uzupełnienia do
Pożywka do hodowli organoidów
CHIR99021
LY2157299LY2157299
Y-27632Y-27632
Surowica bydlęca płoduSurowica bydlęca płodu
Gęstość wysiewu komórek (komórki/studzienkę)5 x 1053 x 105

Tabela 1: Podsumowanie zoptymalizowanego protokołu tworzenia monowarstw 2D pochodzących z organoidów jelita krętego i odbytnicy dorosłego bydła.

2. Wysiewanie komórek organoidowych bydlęcych i/lub odbytniczych oraz hodowla jednowarstwowa 2D

UWAGA: Protokół opisany w tej sekcji wykorzystuje organoidy jelita krętego i odbytnicy bydlęcej, które były hodowane i utrzymywane na 48-dołkowych płytkach przy użyciu opisanych technik5. W celu uzyskania optymalnych wyników zaleca się stosowanie stabilnie utrzymywanych organoidów, które przeszły więcej niż 3 razy po początkowym założeniu i były hodowane przez ponad 3 dni po ostatnim pasażowaniu.

  1. Nie naruszając kopuły hydrożelowej na bazie ECM zawierającej dojrzałe organoidy, usunąć pożywkę do hodowli organoidów za pomocą jednorazowej szklanej pipety Pasteura podłączonej do systemu próżniowego i dodać 300 μl lodowatego roztworu do depolimeryzacji ECM do dołka. Inkubować przez co najmniej 1 godzinę w temperaturze 4 °C.
    UWAGA: Alternatywnie, po dodaniu roztworu depolimeryzacyjnego ECM należy mechanicznie rozbić organoid zawierający kopułę hydrożelową na bazie ECM i zebrać zawiesinę w stożkowej probówce o pojemności 15 ml przed inkubacją w temperaturze 4 °C. Ta metoda jest zalecana, gdy organoidy, które nie są przeznaczone do hodowli jednowarstwowej 2D, są hodowane jednocześnie na tej samej płytce. Gęstość kultur organoidów znacząco wpływa na liczbę wymaganych dołków do hodowli organoidów w celu optymalnego wysiewu do wkładek do kultur komórkowych.
    1. W przypadku kultur organoidów o dużej gęstości (rysunek uzupełniający 1A), wkładki do hodowli komórek odbytnicy wykorzystują współczynnik wysiewu w zakresie od 1:1 do 1:2, co oznacza, że jedna studzienka hodowlana może wysiać jedną do dwóch studzienek. W przypadku jelita krętego utrzymuj stosunek 1:1. W przeciwieństwie do tego, kultury o mniejszej gęstości (rysunek uzupełniający 1B) wymagają większej liczby studzienek hodowlanych; Użyj 3-4 dołków do hodowli organoidów odbytniczych dla jednej wkładki do hodowli komórek odbytnicy (stosunek 3-4:1) i 4-5 dołków do hodowli organoidów jelita krętego dla jednej wkładki do hodowli komórek jelita krętego (stosunek 4-5:1).
  2. Sprawdzić wzrokowo, czy hydrożel na bazie ECM całkowicie się rozpuścił i zebrać zawiesinę organoidów do stożkowej probówki o pojemności 15 ml.
  3. Organoidy osadu należy odwirować w temperaturze 200 x g i w temperaturze 4 °C przez 5 minut. Odrzucić supernatant. Zawiesić osad w 1 ml roztworu enzymu dysocjacji komórek rekombinowanych uzupełnionego 10 μM Y-27632.
  4. Zawiesinę organoidów inkubować w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C przez 10 minut z przerywanym wytrząsaniem przez 3-5 s z wirem co 2-3 minuty, aby ułatwić skuteczną dysocjację organoidów.
  5. Po mineralizacji enzymatycznej dodać 5 ml podłoża podstawowego i agresywnie pipetować mikropipetą P1000, aby jeszcze bardziej rozbić organoidy na pojedyncze komórki. Sprawdzić zawiesinę pod kątem grudek organoidów i jeśli nadal są one widoczne wizualnie, powtórzyć pipetowanie, aby zwiększyć dysocjację pojedynczych komórek.
  6. Przygotuj stożkową probówkę o pojemności 50 ml z sitkiem o pojemności 70 μm. Wstępnie zwilż sitko, nakładając 1-2 ml podłoża podstawowego.
  7. Przefiltruj zawiesinę komórkową przez sitko, aby usunąć resztki hydrożelu na bazie ECM i duże grudki komórek. Przepłukać oryginalną probówkę o pojemności 15 ml i sitko o pojemności 70 μm dodatkowym 10 ml podłoża podstawowego.
    UWAGA: Jeśli zawiesina komórkowa nie przechodzi łatwo przez sitko, może to wskazywać na niepełną dysocjację organoidów. Można podjąć próbę ponownego przepuszczenia zawiesiny pobranych komórek przez ten sam sitko o średnicy 70 μm. Konieczne może być dodatkowe zakłócenie enzymatyczne lub mechaniczne.
  8. Zawiesina jednokomórkowa w postaci osadu przez odwirowanie w temperaturze 200 x g i w temperaturze 4 °C przez 5 minut. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić komórki odpowiednią objętością podłoża podstawowego w celu przeprowadzenia zliczania komórek.
  9. Policz żywe komórki za pomocą hemocytometru po barwieniu błękitem trypanowym, aby obliczyć całkowitą liczbę pobranych komórek.
  10. Zawiesina jednokomórkowa w postaci osadu przez odwirowanie w temperaturze 200 x g i w temperaturze 4 °C przez 5 minut. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić komórki do odpowiedniej gęstości wysiewu w odpowiedniej jednowarstwowej pożywce hodowlanej (tabela 1).
    1. W przypadku komórek organoidów jelita krętego ponownie zawieś komórki do stężenia 2,5 x 106 komórek/ml, aby uzyskać gęstość wysiewu 5 x 105 komórek na hodowlę komórkową, wprowadź w 200 μl jednowarstwowej pożywki hodowlanej jelita krętego, która jest organoidowym podłożem hodowlanym uzupełnionym 500 nM LY2157299, 10 μM Y-27632 i 20% płodowej surowicy bydlęcej (FBS).
    2. W przypadku komórek organoidów odbytniczych zawiesić komórki do stężenia 1,5 x 106 komórek/ml w celu uzyskania gęstości wysiewu 3 x 105 komórek na wkładkę do hodowli komórkowej w 200 μl monowarstwowej pożywki hodowlanej doodbytniczej, która jest organoidowym podłożem hodowlanym uzupełnionym 100 nM CHIR99021, 500 nM LY2157299, 10 μM Y-27632, i 20% FBS.
  11. Pobrać 24-dołkową płytkę do hodowli komórkowej z wkładką (wkładkami) do hodowli komórkowej pokrytą ECM i opróżnić komorę wierzchołkową wkładki do hodowli komórkowej za pomocą ostrożnego odsysania próżniowego, aby nie naruszyć powłoki.
  12. Delikatnie nanieść 200 μl zawiesiny jednokomórkowej przygotowanej w kroku 2.10 do komory wierzchołkowej wkładki do hodowli komórkowej. W przypadku ślepej próby dodać 200 μl pożywki hodowlanej bez komórek w komorze wierzchołkowej. W przypadku ślepej próby dodać 200 μl pożywki hodowlanej bez komórek w komorze wierzchołkowej.
  13. Nałożyć 500 μl odpowiednio uzupełnionej jednowarstwowej pożywki hodowlanej (w zależności od komórek jelita krętego i odbytnicy) do komory podstawno-bocznej każdej studzienki.
  14. Inkubować w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 w celu ułatwienia adhezji i wzrostu komórek w celu utworzenia zlewającej się monowarstwy 2D na wkładce do hodowli komórkowej.
  15. Zmieniaj pożywki hodowlane zarówno w komorze wierzchołkowej, jak i podstawno-bocznej co drugi dzień, począwszy od 48 godzin po wysiewie komórek. Zapewnić równy czas inkubacji dla ślepej próby kontrolnej i wkładki zawierającej komórkę.

3. Pomiar TEER

UWAGA: Opisana tutaj metoda wykorzystuje dostępny na rynku ręczny system pomiarowy TEER znany jako woltomierz nabłonkowy z parą elektrod Ag/AgCl (Rysunek 1A). Określenie TEER w monowarstwie 2D wymaga pomiaru ślepych studzienek. Upewnij się, że ślepa próba odczytu została wykonana w taki sam sposób, jak próbka.

  1. Pobrać z inkubatora płytkę zawierającą wkładki do hodowli komórkowych z monowarstwą 2D pochodzącą z organoidów i ślepą próbą. Pozwól talerzowi osiągnąć temperaturę pokojową przez około 10 minut.
  2. Zdezynfekuj elektrody 70% etanolem i pozostaw do całkowitego wyschnięcia.
  3. Ostrożnie wprowadź elektrody z krótkim końcem w komorze wierzchołkowej, a długim końcem w komorze podstawno-bocznej (Rysunek 1A).
    UWAGA: Należy zachować szczególną ostrożność, aby nie zakłócić działania monowarstwy ogniwa.
  4. Poczekaj, aż odczyt się zrównoważy i zapisz wartość w omach, gdy się ustabilizuje.
    UWAGA: Czułość woltoomomierza jest taka, że podczas wykonywania pomiaru oporu elektrycznego wystąpią wahania wartości oma. Wiarygodny odczyt uzyskuje się, gdy pomiary stabilizują się i konsekwentnie oscylują wokół wartości plateau.
  5. Określ TEER monowarstwy 2D za pomocą następującego wzoru:
    TEER (Ω x cm2) = powierzchnia wkładek do hodowli komórkowych (cm2) x opór elektryczny netto
    Gdzie Rezystancja elektryczna netto jest równa zmierzonej rezystancji wkładki jednowarstwowej ogniwa minus zmierzonej rezystancji wkładki ślepej. Wkładki do hodowli komórkowych do płytek 24-dołkowych mają powierzchnię 0,33cm2.

figure-protocol-1
Rysunek 1: Ocena integralności bariery nabłonkowej monowarstwy 2D pochodzącej z organoidów jelitowych bydła. (A) Schemat właściwego rozmieszczenia elektrod w komorze wierzchołkowej i podstawno-bocznej wkładki do hodowli komórkowej do pomiarów TEER. Krótką elektrodę wkłada się do komory wierzchołkowej, a długą elektrodę umieszcza się w komorze podstawno-bocznej, uważając, aby uniknąć kontaktu z membraną. (B) Schemat procesu oznaczania przepuszczalności. Komory do hodowli komórkowych przemywa się 2x podgrzanym PBS, a następnie do komory wierzchołkowej nakłada się znacznik FITC-dekstranu o stężeniu 0,5 mg/ml 4 kDa rozpuszczony w PBS. Wielokrotne pobieranie próbek o objętości 50 μl z komory podstawno-bocznej z zastąpieniem równej objętości PBS w celu utrzymania całkowitej objętości w komorze podstawno-bocznej przez cały okres inkubacji. Intensywność fluorescencji podwielokrotności mierzy się za pomocą czytnika mikropłytek w celu ilościowego określenia dyfuzji znacznika FITC-dekstranu 4 kDa przez monowarstwę komórki. (C) Dynamiczny rozwój integralności bariery w monowarstwach jelita krętego i odbytnicy w czasie oceniono za pomocą pomiarów TEER (reprezentowanych przez zamknięte okręgi dla jelita krętego i zamknięte kwadraty dla odbytnicy) oraz testów przepuszczalności (oznaczonych przez otwarte okręgi dla jelita krętego i otwarte kwadraty dla odbytnicy) za pomocą znacznika FITC-dekstranu 4 kDa. Do 3 dnia hodowli oba typy monowarstw wykazywały ustanowienie stabilnych i funkcjonalnych barier nabłonkowych, o czym świadczą ich odpowiednie profile TEER i przepuszczalności. Wyniki są średnią z co najmniej dwóch niezależnych eksperymentów z dwoma powtórzeniami technicznymi. Słupki błędów reprezentują SEM pomiarów. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

4. Test przepuszczalności parakomórkowej

UWAGA: Ten test polega na określeniu intensywności fluorescencji wynikającej z dyfuzji izotiocyjanianu fluoresceiny (FITC)-dekstranu z komory wierzchołkowej do komory podstawno-bocznej przez monowarstwy 2D przez 120 minut (Rysunek 1B). W celu uzyskania optymalnych wyników zaleca się zminimalizowanie ekspozycji na światło podczas testu i wykonywanie pomiarów w czytniku mikropłytek natychmiast po każdym pobraniu próbki, aby zapobiec spadkowi lub wygaszeniu fluorescencji. Każda studzienka może być użyta tylko raz i nie może być ponownie wykorzystana w kolejnych testach. Przygotować co najmniej 2 studzienki, które posłużą jako kontrpróby techniczne dla każdego testu. Na przykład, do uzyskania wyników przedstawionych w Rysunek 1C, potrzebnych jest łącznie 6 dołków, gdzie testy przeprowadzono w dwóch egzemplarzach w 3 różnych punktach czasowych (dzień 1, 3 i 5 hodowli).

  1. Przygotować serię rozcieńczeń krzywej wzorcowej z 4 kDa FITC-dekstranem w roztworze soli fizjologicznej buforowanym fosforanami (PBS). Do każdego rozcieńczenia odpipetować pipetą 50 μl do trzykrotnie ułożonej płytki 96-dołkowej.
    UWAGA: Zaleca się wykonanie serii 5-7 rozcieńczeń w zakresie od 0 do 0,5 mg/ml.
  2. Oznaczyć intensywność fluorescencji wzorców we wstępnie skalibrowanym czytniku mikropłytek przy długości fali wzbudzenia 495 nm i długości fali emisji 535 nm.
  3. Oblicz regresję liniową z wynikami intensywności fluorescencji, aby utworzyć krzywą standardową.
  4. Pobrać z inkubatora płytkę zawierającą wkładki do hodowli komórkowych z monowarstwą 2D pochodzącą z organoidów. Usunąć jednowarstwową pożywkę hodowlaną z komory wierzchołkowej i podstawno-bocznej wkładki do hodowli komórkowej zawierającej monowarstwę 2D pochodzącą z organoidów, która ma być poddana ocenie.
  5. Delikatnie umyj każdą komorę 2x odpowiednio 200 μL (komora wierzchołkowa) i 500 μL (komora podstawno-boczna) wstępnie podgrzanego PBS.
  6. Usunąć roztwór płuczący z komory wierzchołkowej i nanieść 200 μl znacznika FITC-dekstranu o stężeniu 0,5 mg/ml 4 kDa w PBS do komory wierzchołkowej wkładki do hodowli komórkowej.
  7. Inkubować w nawilżanym inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 20 minut.
  8. Pobrać próbkę o objętości 50 μl z komory podstawno-bocznej inkubowanej płytki 24-dołkowej i przenieść na płytkę 96-dołkową kompatybilną z czytnikiem mikropłytek.
  9. Umieścić 50 μl świeżego PBS w komorze podstawno-bocznej studzienki, z której pobierane są próbki.
  10. Natychmiast wykonać pomiar intensywności fluorescencji we wstępnie skalibrowanym czytniku mikropłytek przy długości fali wzbudzenia 495 nm i długości fali emisji 535 nm.
  11. Powtarzaj kroki 4.6-4.10 co 20 minut aż do 120 min. Pod koniec testu, jeśli pożądane jest zachowanie monowarstwy 2D, przepłukać zarówno komorę wierzchołkową, jak i podstawno-boczną świeżym PBS 2x, zastąpić świeżą jednowarstwową pożywką hodowlaną i inkubować.
    UWAGA: Można przeprowadzić dalszą ocenę monowarstw 2D, tj. pomiary TEER, barwienie immunofluorescencyjne itp.; Nie jest to jednak zalecane, ponieważ jest prawdopodobne, że resztkowy znacznik fluorescencyjny może mieć wpływ na analizę.
  12. Określić współczynnik przepuszczalności pozornej (Papp) za pomocą następującego wzoru:
    figure-protocol-2
    ΔQ / Δt = stężenie znacznika fluorescencyjnego, które przeszło przez monowarstwę do komory podstawno-bocznej wkładki do hodowli komórkowej w określonym czasie, mierzone intensywnością fluorescencji i ekstrapolowane do μg/ml za pomocą krzywej wzorcowej
    A = pole powierzchni wkładek do hodowli komórkowych
    Co = stężenie znacznika fluorescencyjnego dodanego do komory wierzchołkowej wkładki do hodowli komórkowej w μg/ml

5. Barwienie immunofluorescencyjne jednowarstwy 2D pochodzącej z organoidów

  1. Usuń jednowarstwową pożywkę hodowlaną z wkładki do hodowli komórkowej za pomocą odsysania próżniowego i dodaj 200 μl 4% paraformaldehydu (PFA). Inkubować w temperaturze pokojowej przez 15-30 minut w celu utrwalenia komórek.
  2. Usunąć PFA za pomocą odsysania próżniowego i umyć 100 μl PBS 2x.
  3. Przepuszczalność komórek za pomocą 100 μl 0,3% Triton X-100 w 2% albuminie surowicy bydlęcej (BSA) w PBS przez inkubację w temperaturze pokojowej przez 10 minut.
  4. Usunąć supernatant za pomocą odsysania próżniowego i przemyć 100 μl PBS 2x.
  5. Usunąć supernatant i zastąpić 2% BSA w PBS i inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę w celu zablokowania.
  6. Usunąć supernatant, nałożyć 100 μl przeciwciała pierwszorzędowego rozcieńczonego w 2% BSA w PBS i inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę lub przez noc w temperaturze 4 °C.
    UWAGA: Stężenia zastosowanych przeciwciał pierwszorzędowych znajdują się w Tabeli Materiałów. O ile nie określono inaczej, przestrzegane są zalecenia producenta.
  7. Usunąć supernatant i przemyć 100 μl PBS 3x.
  8. Zastosować 100 μl przeciwciała drugorzędowego rozcieńczonego w 2% BSA w PBS i inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę lub przez noc w temperaturze 4 °C.
    UWAGA: Ten krok można pominąć, jeśli użyte przeciwciało pierwszorzędowe jest sprzężone z sondą fluorescencyjną. Stężenia zastosowanych przeciwciał drugorzędowych znajdują się w tabeli materiałów. O ile nie określono inaczej, przestrzegane są zalecenia producenta.
  9. Usunąć supernatant i przemyć 100 μl PBS 3x.
  10. Opcjonalnie: Do barwienia przeciwstawnego F-aktyny i jąder (DAPI) należy przygotować mieszając obie sondy w odpowiednim rozcieńczeniu (zgodnie z zaleceniem producenta) w PBS, zastosować 100 μl i inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 min. Usunąć supernatant i przemyć 100 μL PBS 3x.
  11. Ostrożnie wyciąć membranę wkładu do hodowli komórkowej za pomocą ostrza skalpela i zamontować na szklanym szkiełku z roztworem montażowym. Umieść szkiełko nakrywkowe i obserwuj.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół niezawodnie generuje solidne monowarstwy 2D pochodzące z organoidów jelitowych bydła z przewodu cienkiego i grubego, naśladując złożoność nabłonka jelitowego in vivo. Metoda ta wykorzystuje dojrzałe organoidy opracowane z próbek krypt jelitowych zdrowego bydła hodowanego w zoptymalizowanych warunkach. Co ciekawe, udane i powtarzalne warunki dla monowarstw 2D pochodzących z organoidów są unikalne dla segmentu jelita (Tabela 1). Podkreśla to znaczenie zoptymalizowanych technik hodowli dla interesującego segmentu jelitowego.

W 1 dniu po wysianiu zdysocjowanych dojrzałych organoidów na wkładkę do hodowli komórkowej, pojawiła się monowarstwa 2D (Rysunek 2A). Jednak pomimo tego początkowego wyglądu, pomiary TEER zarówno dla monowarstw jelita krętego, jak i odbytnicy pozostały na tym etapie niskie (Rysunek 1C). Co więcej, test przepuszczalności parakomórkowej wykazał, że monowarstwa, po zaledwie 1 dniu hodowli, pozwoliła na przejście znacznika FITC-dekstranu o masie 4 kDa przez warstwę komórkową (Figura 1C). Do 3. dnia hodowli oba typy monowarstw 2D pochodzących z organoidów wykazały znaczne dojrzewanie, o czym świadczą zwiększone wartości TEER i odporność na znacznik 4 kDa FITC-dekstran, tendencja, która utrzymywała się do 5 dnia hodowli.

Szczególnie godna uwagi jest zmienność międzygatunkowa, gdzie pomimo niższych wartości TEER jednowarstwowych kultur 2D pochodzących z organoidów bydlęcych w porównaniu do ludzkich i psich odpowiedników w podobnych warunkach12,13,14,15, integralność membrany pozostaje nienaruszona. Wniosek ten wyciągnięto na podstawie odpowiedniej reakcji monowarstw w testach przepuszczalności, co sugeruje, że niskie wartości TEER w próbkach bydła niekoniecznie odzwierciedlają brak funkcji barierowej. Integralność ta ma kluczowe znaczenie dla funkcjonalnej bariery nabłonkowej i jest skutecznie wykazywana poprzez staranną interpretację wyników testów przepuszczalności wraz z pomiarami TEER.

Wizualizacja rozgraniczenia komórkowego i dobrze rozwiniętych mikrokosmków na wierzchołkowej powierzchni monowarstw 2D za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej, ukazująca wyspecjalizowane struktury mikroanatomiczne, dodatkowo wzmocnione dojrzewanie monowarstw 2D pochodzących z organoidów krętych i odbytniczych (Rysunek 2B). Dodatkowo, barwienie immunofluorescencyjne monowarstw 2D potwierdziło obecność wierzchołkowej granicy szczoteczki, podstawno-bocznych połączeń adherencji i komórek kubkowych wytwarzających śluz zarówno w monowarstwach organoidowych 2D pochodzących z jelita krętego (Figura 3A), jak i odbytnicy (Figura 3B). Wyniki te potwierdzają, że opracowana monowarstwa 2D jest złożona pod względem składu i formacji, nie tylko wyrażając kluczowe cechy nienaruszonego nabłonka jelitowego, ale także składając się z wieloliniowej populacji komórkowej.

Pomyślny rozwój monowarstwy 2D polega na przyleganiu komórek do ECM i wzroście do konfluencji, aby stworzyć nienaruszoną warstwę nabłonkową. Warto zauważyć, że nierównomierny rozkład ECM lub nieoptymalne warunki podczas inkubacji na wkładce do hodowli komórkowej mogą spowodować częściowe oderwanie warstwy komórkowej, szczególnie zauważalne wzdłuż jej krawędzi (Rysunek 4Ai). Problem ten jest dodatkowo skomplikowany, jeśli komórki są wysiewane z gęstością wyższą niż optymalna lub komórki wysiewające nie są równomiernie rozmieszczone na powierzchni hodowli, co często wynika z niepełnej dysocjacji organoidów w zawiesinę pojedynczej komórki. Taki nierównomierny rozkład może prowadzić do powstawania luk w morfogenezie monowarstwy i/lub 3D na wkładce do hodowli komórkowej (Rysunek 4Aii). W przeciwieństwie do tego, niedostateczne wysiew komórek może również skutkować nieudanym lub opóźnionym rozwojem monowarstwy w oczekiwanym okresie hodowli, co nieumyślnie wpływa na efektywność kolejnych badań z wykorzystaniem systemu jednowarstwowego 2D (Rysunek 4Aiii). Co więcej, zanieczyszczenie systemu hodowli może również prowadzić do powstawania luk w monowarstwie, zakłócając raz utworzoną zlewającą się monowarstwę na późniejszym etapie hodowli (Rysunek 4Aiv). Na trwałe wartości TEER i odpowiedź przepuszczalności parakomórkowej mogą mieć wpływ zakłócenia w warstwie komórkowej spowodowane agresywnymi technikami mycia lub obchodzenia się, nawet jeśli wyżej wymienione potencjalne przyczyny awarii nie zostały napotkane przed tymi testami (Rysunek 4B). W związku z tym staranne obchodzenie się z komórkami i ocena powstawania lub rozrywania monowarstw ma zasadnicze znaczenie dla pomyślnego rozwoju monowarstw 2D pochodzących z organoidów poprzez skuteczne zastosowanie strategii rozwiązywania problemów.

figure-results-1
Rysunek 2: Charakterystyka mikroskopowa monowarstw 2D pochodzących z organoidów bydlęcych jelit krętych i odbytniczych. (A) Reprezentatywne obrazy z mikroskopii kontrastowej 2D monowarstw w dniu 1 i 3 (D1 i D3) hodowli na wkładce do hodowli komórkowej. Podziałka = 100 μm. (B) Reprezentatywne obrazy monowarstw 2D ze skaningowej mikroskopii elektronowej z dolnymi (po lewej) i większymi (prawymi) powiększeniami. Szczegółową strukturę powierzchni komórek, w tym mikrokosmków, można dostrzec zarówno w monowarstwach jelita krętego (góra), jak i odbytnica (dół). Lewy pasek skali = 10 μm, prawy pasek skali = 2 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 3: Charakterystyka immunofluorescencyjna monowarstw 2D pochodzących z organoidów jelita krętego i odbytnicy. (A, B) Panel (A) pokazuje jelito kręte, a panel (B) pokazuje organoidy odbytnicze. Po lewej stronie włókna F-aktyny są podświetlone falloidyną (na czerwono), co ilustruje architekturę cytoszkieletu i tworzenie się wierzchołkowej granicy szczoteczki. Środkowy obraz przedstawia podstawno-boczną lokalizację połączeń adheren, oznaczoną przez E-kadherynę (zieloną), wskazującą na adhezję komórka-komórka i integralność monowarstwy. Po prawej stronie obecność komórek kubkowych wytwarzających mucynę jest identyfikowana przez SNA (zielony), z obrazem z-stack przedstawiającym wierzchołkowe wydzielanie mucyny w monowarstwie jelita krętego. Jądra na wszystkich obrazach zostały wybarwione przeciwstawnie DAPI (kolor niebieski). Dodatkowo, obrazowanie z-stack na wszystkich obrazach dodatkowo pokazuje tworzenie się pojedynczej warstwy komórkowej we wstawce hodowlanej. Podziałka = 25 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 4: Charakterystyka nieoptymalnego tworzenia monowarstw 2D. (A) Reprezentatywne obrazy kontrastu fazowego pokazujące (i) częściowe oderwanie monowarstwy wzdłuż krawędzi wkładki do hodowli komórkowej; (ii) rozwój wyrostków 3D i tworzenie się szczelin w monowarstwie; (iii) niepełne lub opóźnione tworzenie się monowarstwy z powodu mniejszej niż optymalna gęstości wysiewu, co oznacza niejednolite przyleganie komórek; oraz (iv) powstawanie szczelin w raz utworzonej monowarstwie 2D na późniejszym etapie, prawdopodobnie wynikające z podejrzenia zanieczyszczenia. Podziałka = 100 μm. (B) Spadające pomiary TEER w połączeniu ze wzrostem profili przepuszczalności po 3 dniu wskazują na brak ustanowienia stabilnych i funkcjonalnych barier nabłonkowych. Wyniki przedstawiono jako średni błąd ± standardowy średniej (SEM) z pojedynczego eksperymentu z dwiema powtórzeniami technicznymi. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek uzupełniający 1: Różnice gęstości w hodowlach organoidów jelitowych bydła w hydrożelu na bazie ECM. organoidy jelitowe bydła hodowane w hydrożelu na bazie ECM; (A) wysoka gęstość i (B) niska gęstość. Podziałka = 100 μm. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Tabela uzupełniająca 1: Podsumowanie sygnałów dawcy tkanki. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zdrowie przewodu pokarmowego ma zasadnicze znaczenie zarówno dla produktywności, jak i ogólnego dobrostanu bydła16. Wykorzystując technologię jednowarstwową 2D pochodzącą z organoidów, naukowcy mogą teraz dokładniej naśladować złożoną strukturę nabłonka jelitowego bydła w warunkach in vitro 5. To innowacyjne podejście nie tylko odtwarza zróżnicowany skład komórkowy wyściółki jelita, w tym jego wielokomórkowe linie, ale także pozwala uchwycić kluczowe cechy funkcjonalne, takie jak wydzielanie śluzu i obecność mikrokosmków, które są niezbędne do zrozumienia fizjologii i patologii jelit3. Opracowanie dostosowanych do potrzeb protokołów hodowli segmentów jelita krętego i odbytnicy dało początek zaawansowanej platformie, która znacznie zwiększa możliwości badania zdrowia jelit bydła. To wyrafinowane podejście umożliwia szczegółowe badania interakcji między patogenami odzwierzęcymi a środowiskiem jelitowym bydła. Możliwość dokładnego odtworzenia i zbadania unikalnych aspektów ekosystemu jelitowego bydła in vitro jest znaczącym krokiem w kierunku opracowania ukierunkowanych strategii poprawy zdrowia zwierząt gospodarskich i ograniczenia rozprzestrzeniania się chorób odzwierzęcych.

Niemniej jednak, aby zapewnić pomyślny rozwój monowarstw 2D przy użyciu organoidów jelitowych bydła, kluczowe znaczenie ma utrzymanie zdrowia i witalności zarówno organoidów, jak i ich zdysocjowanych pojedynczych komórek. Ostrożne obchodzenie się i minimalizacja stresu mają zasadnicze znaczenie dla zachowania integralności i funkcjonalności komórek, które są niezbędne do efektywnego wzrostu organoidów, a następnie stworzenia działającej monowarstwy. Co więcej, uzyskanie jednolitej monowarstwy opiera się na udanej dysocjacji organoidów na pojedyncze komórki bez tworzenia dużych grudek. Takie grudki mogą zakłócać dystrybucję komórek i naruszać strukturę monowarstwy. Dlatego kluczowe znaczenie ma zastosowanie precyzyjnych technik płynnej dysocjacji, co skutkuje spójną zawiesiną pojedynczej komórki. Dodatkowo korzystne staje się zminimalizowanie zakłóceń podczas adhezji komórek i podczas wypłukiwania nadmiaru komórek nieprzylegających. Takie podejście jest szczególnie ważne dla rozwiązywania potencjalnych problemów z morfogenezą 3D, poprawiając w ten sposób ogólną jakość monowarstwy.

Zauważalnym wyzwaniem związanym z hydrożelami na bazie ECM, które są pochodzenia biologicznego, jest zmienność składu między partiami17. Chociaż nie zaobserwowano tego przy użyciu opisanych protokołów i materiałów, różnice w składzie ECM z partii na partię mogą stanowić wyzwanie dla pomyślnego opracowania monowarstw. Jeśli tworzenie monowarstwy jest zakłócone, gdy zmieniają się produkty ECM, marki lub numery partii, konieczne mogą być kroki optymalizacyjne w celu określenia odpowiedniego stężenia ECM wymaganego do powlekania wkładek do hodowli komórkowych.

Co więcej, dostosowanie pożywki hodowlanej do temperatury pokojowej przed wprowadzeniem jakichkolwiek zmian jest krytycznym krokiem, który pomaga złagodzić szok termiczny, chronić zdrowie komórek i utrzymać jakość zarówno kultur organoidowych, jak i jednowarstwowych. Delikatne praktyki mycia mają również zasadnicze znaczenie dla utrzymania integralności monowarstwy podczas jej formowania i późniejszych testów, a unikanie zakłóceń może zapobiec niedokładnościom wyników. Zastąpienie PBS zrównoważonym roztworem soli Hanka (HBSS) okazało się pomocne w minimalizowaniu oderwania monowarstwy, gdy stało się to problemem podczas wielokrotnego mycia lub długotrwałej ekspozycji na PBS, na przykład w testach przepuszczalności parakomórkowej. Wreszcie, dostosowanie pożywki hodowlanej do specyficznych potrzeb komórek z różnych segmentów przewodu pokarmowego, takich jak jelito kręte i odbytnica, ma zasadnicze znaczenie dla dokładnej replikacji w warunkach in vivo . Ta specyfika zapewnia optymalne zdrowie i funkcjonalność komórek, ułatwiając precyzyjne modelowanie fizjologii jelit bydła i interakcji z patogenami, podkreślając w ten sposób te kluczowe etapy badań nad organoidami.

Oprócz zastosowania delikatnej praktyki obchodzenia się z komórkami, budowanie dobrych kompetencji technicznych związanych z liczeniem komórek i pomiarami TEER ma kluczowe znaczenie dla pomyślnego opracowania działającej monowarstwy 2D. Ponieważ zarówno zbyt niska, jak i zbyt wysoka gęstość wysiewu wynikająca odpowiednio z nadmiernego lub niedoszacowania komórek może prowadzić do upośledzonego wzrostu monowarstwy. Zaleca się dokładne przejrzenie liczby komórek i zapewnienie odpowiedniej gęstości wysiewu w sytuacjach, gdy podejrzewa się niedokładne zagęszczenie wysiewu. Dodatkowo, nieodpowiednie techniki pomiaru TEER mogą spowodować rozerwanie monowarstwy przez niezamierzone zarysowania elektrod. Ostrożne wprowadzenie elektrod do komory wierzchołkowej i zwrócenie szczególnej uwagi na utrzymanie ich pionowej orientacji względem powierzchni membrany może pomóc w ograniczeniu ryzyka przypadkowego uszkodzenia monowarstw.

Opisane tutaj metody oznaczania przepuszczalności parakomórkowej zostały zaadaptowane z poprzedniego protokołu18. Modyfikacje zgłoszonego protokołu, które obejmują wielokrotne pobieranie próbek w ciągu 120 minut i zastąpienie pobranej próbki podwielokrotności równą ilością PBS, mają na celu poprawę dokładności i wiarygodności wyników. Utrzymanie całkowitej objętości w komorze ma kluczowe znaczenie z kilku powodów: zachowuje równowagę osmotyczną, zapewnia integralność komórek, utrzymuje gradient stężeń niezbędny do dokładnej oceny przepuszczalności i zapobiega zmianom ciśnienia hydrostatycznego, które mogłyby wpływać na szybkość transportu. Ta praktyka uzupełniania komory podstawno-bocznej świeżym PBS odpowiadającym objętości pobranego PBS zawierającego znacznik fluorescencyjny ma kluczowe znaczenie dla zachowania tych warunków, umożliwiając dokładną i miarodajną ocenę przepuszczalności jednowarstwowej. Test przepuszczalności parakomórkowej służy jako uzupełnienie pomiaru TEER poprzez ocenę ruchu cząsteczek znacznikowych bezpośrednio przez monowarstwę. Co więcej, porównywanie wartości TEER w różnych laboratoriach może nie przynieść odpowiednich wniosków, ponieważ na wartości te może mieć wpływ wiele zmiennych, takich jak temperatura i specyficzne warunki, w których hoduje się komórki, w tym typy komórek, liczby pasaży i skład pożywkihodowlanej 19. Test przepuszczalności parakomórkowej zapewnia funkcjonalną ocenę in vitro skutecznej ekspresji adherenów i ścisłych połączeń w obrębie bariery nabłonkowej20.

Chociaż opracowanie monowarstw 2D z organoidów 3D stanowi znaczący postęp w technologii hodowli, ważne jest, aby zdać sobie sprawę z ograniczeń związanych z monowarstwami 2D. Jedną z głównych wad jest to, że pozostaje to statycznym systemem hodowli, pozbawionym dynamicznej stymulacji występującej w środowisku in vivo . Ponadto modyfikacja zawartości tlenu w systemie hodowli stanowi wyzwanie ze względu na jego otwartą konfigurację obejmującą płytki hodowlane z pokrywkami, co sprawia, że jest on mniej odpowiedni do długotrwałej kohodowli z bakteriami beztlenowymi. Ograniczeniom tym można potencjalnie zaradzić, przyjmując bardziej dynamiczne platformy hodowlane, takie jak systemy mikroprzepływowe21, które oferują bardziej kontrolowane i fizjologicznie odpowiednie środowisko. Ponadto ważne jest, aby zdać sobie sprawę, że chociaż obecne warunki hodowli są bogate w składniki odżywcze korzystne dla utrzymania wzrostu komórek macierzystych, mogą nie być optymalne dla indukowania fizjologicznego różnicowania komórek nabłonka. Ta rozbieżność podkreśla potrzebę optymalizacji w przyszłych badaniach, aby ściśle naśladować warunki in vivo i wspierać proces różnicowania. Usuwając te ograniczenia i udoskonalając te podejścia, zwiększa się użyteczność i możliwość zastosowania technologii hodowli organoidów, co przybliża nas do odtworzenia złożonej dynamiki i interakcji w przewodzie pokarmowym in vitro.

Protokół generowania monowarstw 2D z tkanek jelita krętego i odbytnicy bydła oferuje naukowcom cenny model in vitro interfejsu świetlnego zarówno nabłonka jelita cienkiego, jak i grubego. Model ten otwiera szerokie możliwości zastosowania w podstawowych badaniach nad żywieniem zwierząt, w szczególności w badaniu, w jaki sposób składniki odżywcze są wchłaniane w różnych warunkach. Godnym uwagi obszarem zainteresowania jest badanie zespołu nieszczelnego jelita, charakteryzującego się nieprawidłowym wzrostem przepuszczalności przewodu pokarmowego, często wywoływanym przez zmiany w diecie i ekstremalne temperatury otoczenia22,23. Co więcej, model ten służy jako niezbędne narzędzie do badania złożonych interakcji między mikrobiomem jelitowym a jego gospodarzem. Pozwala to na zbadanie, w jaki sposób mikroorganizmy komensalne mogą wpływać na zdrowie organizmu gospodarza, odnosząc się do kluczowego aspektu nauk weterynaryjnych i medycznych 1,24. Ponadto patogeny przenoszone przez żywność dla ludzi są często znajdowane jako komensale w różnych segmentach jelit bydła 8,9,25, protokół ten umożliwia szczegółowe badania specyficznych warunków, które pozwalają tym odzwierzęcym czynnikom rozwijać się w odpowiednich niszach.

W trakcie tego badania zaobserwowano, że monowarstwy pochodzące z organoidów odbytniczych i krętych wymagają różnych warunków do pomyślnego rozwoju. W szczególności, gdy monowarstwy pochodzące z organoidów odbytniczych początkowo wysiewano na wkładkach do hodowli komórkowych przygotowanych z 2% hydrożelem na bazie ECM w pożywkach podstawowych przez 1 godzinę, zauważono duże i złuszczanie się komórek. Problem ten został rozwiązany poprzez przejście na specjalistyczne monowarstwowe podłoże hodowlane doodbytnicze i wydłużenie okresu inkubacji do nocy przed siewem, podczas gdy monowarstwy pochodzące z organoidów jelita krętego z powodzeniem opracowano przy użyciu krótszego protokołu przygotowania. Ponadto dodanie CHIR99021 do pożywki hodowlanej konsekwentnie poprawiało tworzenie monowarstw doodbytniczych26 , ale nie było konieczne w przypadku monowarstw jelita krętego27. Ponadto monowarstwy jelita krętego wymagały większej gęstości komórek do pomyślnego rozwoju w porównaniu z organoidami doodbytniczymi27. W tych zoptymalizowanych warunkach (Tabela 1) wielokrotnie opracowano monowarstwy, które utrzymują odporność na integralność bariery, co podkreśla znaczenie dostosowania warunków hodowli do określonego segmentu jelita.

Dostęp do modelu, który dokładnie odzwierciedla złożoność wielokomórkowej linii jelita in vivo , ma kluczowe znaczenie dla tych badań. Pozwala to naukowcom na dokładne naśladowanie naturalnych warunków środowiska jelitowego, zapewniając bardziej wiarygodną podstawę do eksperymentów. Dzięki temu protokołowi badacze są wyposażeni w solidny model, który zwiększa ich możliwości badawcze, potencjalnie prowadząc do przełomowych odkryć w ich dziedzinach nauki. Takie podejście nie tylko przyczynia się do zrozumienia zdrowia i chorób jelit, ale także pomaga w opracowywaniu strategii mających na celu poprawę zarządzania zwierzętami gospodarskimi i bezpieczeństwa żywności.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają do zadeklarowania żadnego konfliktu interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To badanie było częściowo wspierane przez Biuro Dyrektora Narodowych Instytutów Zdrowia (K01OD030515 i R21OD031903 do YMA) oraz WSU VCS Resident and Graduate Student Research Grant (do GDD). Autorzy pragną podziękować rzeźni uczestniczącej w projekcie za dostarczenie bydła dawcy.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Basal Średni
Zaawansowany DMEM/F12 (1X)Gibco12634-010n/a
GlutaMAX-I (100X)Gibco35050-0612 mM
HEPES (1M)Gibco15630-08010 mM
Pen Strep Glutamina (100X)Gibco10378-0161X
Organoid Culture Medium (suplementy do podłoża podstawowego)
A-83-01Sigma-AldrichSML0788-5MG500 nM
B27 Suplement (50X)Gibco17504-0011X
[Leu15]-Gastrin I człowiekSigma-AldrichG9145-.5MG10 nM
Mysz EGFPeproTech315-09-500UG50 ng/ml
Murine Wnt-3aPeproTech315-20-10UG100 ng/mL
N-acetylo-L-cysteinaMP Biomedicals1946031 mM
N-2 MAX Suplement na podłoża (100X)R& D SystemsAR0091X
NikotynamidSigma-AldrichN0636-100G10 mM
Noggin Kondycjonowane mediumn/a/d10 vol/vol %
PrimocinInvivoGenant-pm-2100 µ g / ml
R-Spondin-1 Kondycjonowane podłożen/anie dotyczy 20 obj./obj.%
SB202190Sigma-AldrichS7067-25MG10 &mikro; M
Monolayer Culture Medium (Suplementy do pożywki do hodowli organoidów)
CHIR99021Sigma-AldrichSML1046-5MG2,5 µ M
HI FBSGibco10438-03420 vol/vol %
LY2157299Sigma-AldrichSML2851-5MG500 nM
Y-27632StemCellTechnologies7230810 µ M
Odczynniki
Alexa Fluor 488 Mysia anty-E-kadherynaBD Biosciences560061rozcieńczenie 1:200
Alexa Fluor 647 PhalloidinInvitrogenA22287:400 rozcieńczenie
BSACytivaSH30574.022 w/vol %
Roztwór do odzyskiwania komórekCorning354253nie dotyczy
Roztwór DAPI (1 mg / ml)Thermo Scientific62248rozcieńczenie 1:1000
DPBS (1X)Gibco14190-144n/a
Izotiocyjanian fluoresceiny– DekstranSigma-AldrichFD4-100MG0,5 mg/ml
Matrigel MatrixCorning354234bez
dodatku Roztwór paraformaldehydu (4%)Thermo ScientificJ19943K2nie dotyczy
odczynnika przeciwblaknięcia ProLong GoldInvitrogenP36930n/a
SNA, EBL, FluoresceinaVector LaboratoriesFL-1301rozcieńczenie
1:100Triton X-100Thermo ScientificA16046.AE0,3 obj./obj. %
TrypLE ExpressGibco12605-028n/d
roztwór błękitu trypanowego, 0,4%VWR Life ScienceK940-100MLn/a
Materiały i urządzenia
0,4 i mikro; m Wkładka do hodowli komórkowychFalcon353095
24-dołkowa płytka do hodowli komórkowychCorning3524
48-dołkowa płytka do hodowli komórkowychThermo Scientific150687
70 µ m Sterylne sitko komórkoweFisher Scientific22-363-548
96-dołkowa płytka do hodowli komórkowych WirówkaGreiner Bio-One
Eppendorf5910Ri
Inkubator CO2Thermo Scientific370
Nabłonkowy miernik woltowo-omowyMilliporeMillicell ERS-2
HemocytometrLW ScientificCTL-HEMM-GLDR
Odwrócony mikroskop konfokalnyLeica MicrosystemsSP8-X
Mikroskop z odwróconym kontrastem fazowymLeica MicrosystemsDMi1
Szklana osłona mikroskopuFisher Scientific12-540-B
Czytnik mikropłytekUrządzenia molekularneSpecrtraMax i3x
Szkiełka mikroskopoweFisher Scientific22-034-486
Pipety PasteuraFisher Scientific13-678-20C
Ostrze skalpelaiMed Scientific-#11
mieszalnik wirowyScientific IndustriesSI-0236
Software
LAS XOprogramowanie czytnika mikropłytek Leica MicrosystemsLAS X 3.7.6.25997
Molecular DevcesSoftMax Pro 7.1.2
n 1 do 655086 ze stali węglowej

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Min, S., Kim, S., Cho, S. W. Gastrointestinal tract modeling using organoids engineered with cellular and microbiota niches. Exp Mol Med. 52 (2), 227-237 (2020).
  2. Fitzgerald, S. F., et al. Shiga toxin sub-type 2a increases the efficiency of Escherichia coli O157 transmission between animals and restricts epithelial regeneration in bovine enteroids. PLoS Pathogens. 15 (10), e1008003(2019).
  3. Dutta, D., Heo, I., Clevers, H. Disease modeling in stem cell-derived 3D organoid systems. Trend Mol Med. 23 (5), 393-410 (2017).
  4. Beaumont, M., et al. Intestinal organoids in farm animals. Vet Res. 52 (1), 33(2021).
  5. Kawasaki, M., Dykstra, G. D., McConnel, C. S., Burbick, C. R., Ambrosini, Y. M. Adult bovine-derived small and large intestinal organoids: In vitro development and maintenance. J Tissue Eng Regene Med. 2023, e3095002(2023).
  6. Kvidera, S. K., et al. Intentionally induced intestinal barrier dysfunction causes inflammation, affects metabolism, and reduces productivity in lactating Holstein cows. J Dairy Sci. 100 (5), 4113-4127 (2017).
  7. Crawford, C. K., et al. Inflammatory cytokines directly disrupt the bovine intestinal epithelial barrier. Sci Rep. 12 (1), 14578(2022).
  8. Heredia, N., García, S. Animals as sources of food-borne pathogens: A review. Animal Nutri. 4 (3), 250-255 (2018).
  9. Naylor, S. W., et al. Lymphoid follicle-dense mucosa at the terminal rectum is the principal site of colonization of enterohemorrhagic Escherichia coli O157:H7 in the bovine host. Infect Immun. 71 (3), 1505-1512 (2003).
  10. Co, J. Y., et al. Controlling epithelial polarity: A human enteroid model for host-pathogen interactions. Cell Rep. 26 (9), 2509-2520 (2019).
  11. Pullinger, G. D., et al. Systemic translocation of Salmonella enterica Serovar Dublin in cattle occurs predominantly via efferent lymphatics in a cell-free niche and requires type III secretion system 1 (T3SS-1) but not T3SS-2. Infect Immun. 75 (11), 5191-5199 (2007).
  12. Nickerson, K. P., et al. A versatile human intestinal organoid-derived epithelial monolayer model for the study of enteric pathogens. Microbiol Spectr. 9 (1), e0000321(2021).
  13. Varani, J., McClintock, S. D., Aslam, M. N. Cell-matrix interactions contribute to barrier function in human colon organoids. Front Med. 9, 838975(2022).
  14. Freire, R., et al. Human gut derived-organoids provide model to study gluten response and effects of microbiota-derived molecules in celiac disease. Sci Rep. 9, 7029(2019).
  15. Ambrosini, Y. M., et al. Recapitulation of the accessible interface of biopsy-derived canine intestinal organoids to study epithelial-luminal interactions. PLoS ONE. 15 (4), e0231423(2020).
  16. Kogut, M. H., Arsenault, R. J. Editorial: Gut health: The new paradigm in food animal production. Front Vet Sci. 3, 71(2016).
  17. Lingard, E., et al. Optimising a self-assembling peptide hydrogel as a Matrigel alternative for 3-dimensional mammary epithelial cell culture. Biomater Adv. 160, 213847(2024).
  18. Turksen, K. Permeability Barrier: Methods and Protocols. , Springer protocols, Humana Press. (2011).
  19. Srinivasan, B., et al. TEER measurement techniques for in vitro barrier model systems. J Lab Autom. 20 (2), 107-126 (2015).
  20. Frost, T. S., Jiang, L., Lynch, R. M., Zohar, Y. Permeability of epithelial/endothelial barriers in Transwells and microfluidic bilayer devices. Micromachines. 10 (8), 533(2019).
  21. Bein, A., et al. Microfluidic organ-on-a-chip models of human intestine. Cell Mol Gastroenterol Hepatol. 5 (4), 659(2018).
  22. Sanz-Fernandez, M. V., et al. Targeting the hindgut to improve health and performance in cattle. Animals. 10 (10), 1817(2020).
  23. Gressley, T. F., Hall, M. B., Armentano, L. E. Ruminant nutrition symposium: Productivity, digestion, and health responses to hindgut acidosis in ruminants. J Anim Sci. 89 (4), 1120-1130 (2011).
  24. O'Hara, E., Neves, A. L. A., Song, Y., Guan, L. L. The role of the gut microbiome in cattle production and health: Driver or passenger. Ann Rev Animal Biosci. 8 (2020), 199-220 (2020).
  25. Beach, J. C., Murano, E. A., Acuff, G. R. Prevalence of Salmonella and Campylobacter in beef cattle from transport to slaughter. J Food Protect. 65 (11), 1687-1693 (2002).
  26. Kawasaki, M., Ambrosini, Y. M. Accessible luminal interface of bovine rectal organoids generated from cryopreserved biopsy tissues. PLoS One. 19 (3), e0301079(2024).
  27. Kawasaki, M., McConnel, C. S., Burbick, C. R., Ambrosini, Y. M. Pathogen-epithelium interactions and inflammatory responses in Salmonella Dublin infections using ileal monolayer models derived from adult bovine organoids. Scientific Reports. 14 (1), 11479(2024).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Organoidy bydl cemonowarstwy jelitowemonowarstwa pochodz ca z organoid wbariera nab onkowatransepitelialna oporno elektrycznaprzepuszczalno parakom rkowabarwienie immunocytochemiczneinterakcje gospodarz patogenorganoidy jelita cienkiegoorganoidy jelita grubego

Powiązane artykuły