Artykuł metodologiczny

Postępy w technologii organoidów bydlęcych z wykorzystaniem jednowarstwowych interfejsów jelita cienkiego i grubego

2.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/67010

⸱

14 czerwca 2024

 ,  , 
1Department of Veterinary Microbiology and Pathology, College of Veterinary Medicine, Washington State University, 2Department of Veterinary Clinical Sciences, College of Veterinary Medicine, Washington State University

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

To badanie przedstawia protokół generowania monowarstw 2D jelit bydlęcych z organoidów, oferując lepszy dostęp do badania interakcji gospodarz-patogen. Obejmuje on metody oceny integralności i funkcjonalności błony, rozwijając modele in vitro, które naśladują fizjologię przewodu pokarmowego bydła. Podejście to obiecuje znaczące korzyści biomedyczne i rolnicze, w tym ulepszone strategie leczenia.

Streszczenie

Postęp wiedzy na temat fizjologii przewodu pokarmowego i jego chorób zależy przede wszystkim od opracowania precyzyjnych, specyficznych dla gatunku modeli in vitro, które wiernie naśladują in vivo tkanki jelitowe. Jest to szczególnie istotne dla badania interakcji gospodarz-patogen u bydła, które jest znaczącym rezerwuarem patogenów stanowiących poważne zagrożenie dla zdrowia publicznego. Tradycyjne organoidy 3D oferują ograniczony dostęp do powierzchni wierzchołkowej nabłonka jelitowego, co jest przeszkodą pokonaną przez pojawienie się kultur jednowarstwowych 2D. Kultury te, pochodzące z komórek organoidowych, zapewniają odsłoniętą powierzchnię świetlną dla bardziej dostępnych badań. W tym badaniu przedstawiono szczegółowy protokół tworzenia i utrzymywania jednowarstwowych kultur 2D z komórek organoidów jelita cienkiego i grubego bydła. Metoda ta obejmuje protokoły oceny integralności błony poprzez transepiteliczny opór elektryczny i przepuszczalność parakomórkową wraz z technikami barwienia immunocytochemicznego. Protokoły te stanowią podstawę do ustanowienia i scharakteryzowania jednowarstwowego systemu hodowli bydła 2D, przesuwając granice zastosowań tych metod w badaniach biomedycznych i translacyjnych o znaczeniu dla zdrowia publicznego. Zastosowanie tego innowacyjnego podejścia umożliwia opracowanie fizjologicznie istotnych modeli in vitro do badania zarówno normalnych, jak i chorobowych stanów fizjologii jelit bydła. Implikacje dla postępu biomedycznego i rolniczego są głębokie, torując drogę do skuteczniejszego leczenia dolegliwości jelitowych u bydła, poprawiając w ten sposób zarówno dobrostan zwierząt, jak i bezpieczeństwo żywności.

Wprowadzenie

Hodowla komórek macierzystych nabłonka jelitowego w trójwymiarowych (3D) hodowlach, znanych jako organoidy jelitowe, stanowi znaczący postęp w technologii in vitro do badania funkcji jelit, odżywiania i interakcji z patogenami1,2. Te organoidy naśladują złożoną strukturę nabłonka jelitowego in vivo poprzez samoreplikację i organizowanie się w formacje 3D, które obejmują różne linie komórek jelitowych3. Ta cecha podkreśla ich znaczny potencjał w zakresie pogłębiania wiedzy na temat biologii jelit.

Rosnące zainteresowanie zastosowaniem technologii organoidów jelitowych u zwierząt hodowlanych wymaga udoskonalenia technik hodowli i konserwacji4,5. Znaczenie tej technologii podkreśla jej potencjalny wpływ na badanie zdrowia jelit zwierząt hodowlanych, które odgrywa kluczową rolę w ich produktywności, a w konsekwencji w ekonomice przemysłu spożywczego i zwierzęcego, wpływając na dobrostan zwierząt i koszty operacyjne6,7. W szczególności wykorzystanie kultur organoidów jelitowych do zbadania funkcji jelit bydła ma ogromne znaczenie, biorąc pod uwagę ich rolę jako rezerwuarów odzwierzęcych patogenów jelitowych, takich jak Salmonella spp. i Escherichia coli (E. coli) O157:H78. Patogeny te są zlokalizowane w określonych segmentach jelita, co sprawia, że konieczne jest różnicowanie metod hodowli organoidów jelitowych w zależności od segmentu jelita, aby zwiększyć precyzję badań9.

Istotną przeszkodą w badaniu organoidów jelitowych jest ograniczony dostęp do powierzchni wierzchołkowej komórki nabłonkowej10. Podczas hodowli w macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) komórki naturalnie orientują się tak, że powierzchnia podstawowa jest skierowana na zewnątrz, a powierzchnia wierzchołkowa jest skierowana do wewnątrz10. Aby sprostać temu wyzwaniu, przedstawiono metody, które polegają na dysocjacji organoidów 3D na pojedyncze komórki i zasiewaniu ich w półprzepuszczalnych wkładkach do hodowli komórkowych. Ta konfiguracja ustanawia interfejs między powierzchnią wierzchołkową a przedziałem podstawno-bocznym. Protokół ten pokazuje, że komórki pochodzące z organoidów jelitowych bydła mogą tworzyć spójną monowarstwę 2D, o czym świadczą pomiary przeznabłonkowego oporu elektrycznego (TEER) i testy przepuszczalności parakomórkowej. Dodatkowo, rozwój polaryzacji komórkowej z obrzeżami szczoteczek i ścisłymi połączeniami w komórkach jednowarstwowych 2D pochodzących z organoidów został potwierdzony za pomocą immunofluorescencji i mikroskopii elektronowej, odzwierciedlając właściwości nabłonka jelitowego in vivo.

W tym badaniu jelito kręte reprezentuje przewód cienki, a odbytnica oznacza przewód pokarmowy gruby. Selekcje te opierają się na odpowiednich patogenach jelitowych, takich jak Salmonella spp., które mogą translokować jelito kręte11, oraz E. coli O157:H7, o których wiadomo, że głównie kolonizują odbytnicę9 u bydła. Wybór tych konkretnych segmentów jelit podkreśla konieczność dostosowania metod hodowli organoidów jelitowych do obszaru jelitowego w celu zapewnienia precyzji badań. Metody te szczegółowo opisują procedurę skutecznego hodowania jednowarstwowego interfejsu 2D pochodzącego z organoidów z tych segmentów jelita, zapewniając solidny model do badania zdrowia jelit bydła, infekcji patogennych i interakcji między mikrobiomem jelitowym a gospodarzem.

Protokół

Krypty jelitowe pozyskano z nadmiarowych próbek jelit pochodzących z lokalnej rzeźni, a dane opisowe dawców znajdują się w Uzupełniającej Tabeli 1. Organoidy wygenerowano z tkanek zwierząt, które zostały humanitarnie uśmiercone w rzeźni; zwierzęta nie były pozyskiwane wyłącznie na potrzeby tych badań, w związku z czym badanie to jest zwolnione z przeglądu IACUC, a oświadczenie etyczne nie ma zastosowania.

1. Powlekanie ECM wkładkami do hodowli komórkowych dla 2D hodowli monowarstwy pochodzącej z organoidów

UWAGA: Wszystkie procedury są przeprowadzane przy użyciu sterylnych materiałów i technik aseptycznych w komorze z laminarnym przepływem powietrza. Wszystkie odczynniki są przechowywane w lodu przez cały czas trwania procedury, chyba że zaznaczono inaczej.

  1. Przygotować 100 µL ECM do powlekania każdego wkładu do hodowli komórkowej o powierzchni 0,33 cm2, dokładnie mieszając podłoże podstawowe z 2% (v/v) hydrożelem na bazie ECM w mikroprobówce.
  2. Wyjąć poszczególne wkłady do hodowli komórkowej z opakowania za pomocą wysterylizowanej pęsety i umieścić je pojedynczo w dołkach przezroczystej płytki do hodowli komórkowej z 24 dołkami o płaskim dnie.
  3. Nanieść 100 µL powłoki ECM przygotowanej w kroku 1.1 do komory apikalnej każdego wkładu do hodowli komórkowej przygotowanego w kroku 1.2.
  4. Założyć pokrywkę i inkubować płytkę do hodowli komórkowej zawierającą powlekane wkłady w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 1 h.
    1. W przypadku komórek organoidów jelita krętego wkład jest gotowy do użycia po 1 h inkubacji. W przypadku komórek organoidów odbytnicy, po 1 h inkubacji należy zastąpić powłokę ECM podłożem do hodowli monowarstwy odbytnicy i inkubować przez noc (Tabela 1). Jeśli planowane jest przeprowadzenie pomiarów TEER, należy przygotować dodatkowe wkłady do hodowli komórkowej jako kontrole ślepe.
JejunumKratownica
Czas inkubacji z powłoką ECM1 h1 h, a następnie
 nocleg w pożywce do hodowli monowarstwy
Suplementy do
pożywki do hodowli organoidów
CHIR99021
LY2157299LY2157299
Y-27632Y-27632
Płodowa surowica bydlęcaPłodowa surowica bydlęca
Gęstość zasiewu komórek (komórek/dołek)5 x 1053 x 105

Tabela 1: Podsumowanie zoptymalizowanego protokołu tworzenia dwuwymiarowych (2D) monowarstw pochodzących z dorosłych organoidów jelita krętego i odbytnicy bydlęcej.

2. Wysiewanie komórek organoidów jelita krętego i/lub odbytnicy bydlęcej oraz hodowla dwuwymiarowej (2D) monowarstwy

UWAGA: Protokół opisany w tej sekcji wykorzystuje organoidy jelita krętego i odbytnicy bydlęcej, które były hodowane i utrzymywane na płytkach 48-dołkowych przy użyciu opisanych technik5. Dla uzyskania optymalnych wyników zaleca się stosowanie stabilnie utrzymywanych organoidów, które zostały przepasażowane ponad 3x po początkowym ustanowieniu i były hodowane przez ponad 3 dni po ostatnim pasażu.

  1. Bez naruszania kopułki hydrożelu na bazie ECM zawierającej dojrzałe organoidy, należy usunąć pożywkę do hodowli organoidów za pomocą jednorazowej szklanej pipety Pasteura podłączonej do systemu próżniowego, a następnie dodać 300 µL lodowatego roztworu do depolimeryzacji ECM na każdą studzienkę. Inkubować przez co najmniej 1 h w temperaturze 4 °C.
    UWAGA: Alternatywnie, po dodaniu roztworu do depolimeryzacji ECM, można mechanicznie rozbić organoid zawierający kopułkę hydrożelu na bazie ECM i zebrać zawiesinę do probówki stożkowej o pojemności 15 ml przed inkubacją w 4 °CMetoda ta jest zalecana w przypadku, gdy na tej samej płytce jednocześnie hodowane są organoidy, które nie są przeznaczone do hodowli w monowarstwie 2D. Gęstość kultur organoidów znacząco wpływa na liczbę studni z kulturą organoidów wymaganych do optymalnego wysiewu na wkładki do hodowli komórkowych.
    1. Dla hodowli organoidów o wysokiej gęstości (Rycina uzupełniająca 1A), w przypadku wstawek do hodowli komórek odbytnicy stosuje się stosunek wysiewu w zakresie od 1:1 do 1:2, co oznacza, że jedna studnia hodowlana pozwala na wysiew do jednej lub dwóch studni. W przypadku jelita cienkiego (ileum) należy zachować stosunek 1:1. Z kolei hodowle o mniejszej gęstości (Rycina uzupełniająca 1B) wymagają większej liczby dołków hodowlanych; należy użyć 3-4 dołków do hodowli organoidów odbytnicy na jeden insert do hodowli komórek odbytnicy (stosunek 3-4:1) oraz 4-5 dołków do hodowli organoidów jelita krętego na jeden insert do hodowli komórek jelita krętego (stosunek 4-5:1).
  2. Wizualnie sprawdź, czy hydrożel oparty na ECM uległ całkowitemu rozpuszczeniu, a następnie przenieś zawiesinę organoidów do konicznej probówki o pojemności 15 ml.
  3. Odwirować organoidy w wirówce przy 200 x g g i 4 °C przez 5 min. Odrzucić nadsącz. Osad zawiesić ponownie w 1 ml roztworu rekombinowanego enzymu do dysocjacji komórek uzupełnionego o 10 µM Y-27632.
  4. Inkubować zawiesinę organoidów w 37 °C inkubować w kąpieli wodnej przez 10 min, wykonując co 2–3 min przerywane mieszanie za pomocą vortexa przez 3–5 s w celu usprawnienia dysocjacji organoidów.
  5. Po trawieniu enzymatycznym dodać 5 ml pożywki podstawowej i intensywnie pipetować za pomocą mikropipety P1000, aby doprowadzić do dalszej dysocjacji organoidów do pojedynczych komórek. Sprawdzić zawiesinę pod kątem obecności skupisk organoidów; jeśli są one nadal widoczne, powtórzyć pipetowanie w celu zwiększenia stopnia dysocjacji do pojedynczych komórek.
  6. Przygotuj probówkę stożkową o pojemności 50 ml z 70 µm sitko do komórek. Nawilż sitko, aplikując 1-2 ml pożywki podstawowej.
  7. Przefiltruj zawiesinę komórkową przez sitko, aby usunąć pozostałości odłamków hydrożelu na bazie ECM oraz duże skupiska komórek. Przepłucz oryginalną probówkę 15 ml i 70 µm sito do oddzielania komórek z dodatkowymi 10 ml pożywki podstawowej.
    UWAGA: Jeśli zawiesina komórkowa nie przechodzi łatwo przez sitko, może to świadczyć o niepełnej dysocjacji organoidów. W takim przypadku należy ponownie przepuścić zebraną zawiesinę komórkową przez to samo 70 µm można spróbować zastosować sitko do komórek. Może być konieczne dodatkowe rozbicie enzymatyczne lub mechaniczne.
  8. Odwirować zawiesinę pojedynczych komórek przy 200 x g. g i 4 °C przez 5 min. Odpiąć supernatant i resuspendować komórki w odpowiedniej objętości medium podstawowego w celu wykonania liczenia komórek.
  9. Należy policzyć żywe komórki za pomocą hemocytometru po barwieniu błękitem trypanu, aby obliczyć całkowitą liczbę zebranych komórek.
  10. Odwirować zawiesinę pojedynczych komórek w wirowarce przy 200 x g i 4 °C przez 5 min. Usunąć nadsącz i resuspendować komórki do odpowiedniej gęstości wysiewu w odpowiednim medium do hodowli monowarstwowej (Tabela 1).
    1. W przypadku komórek organoidów jelita krętego, resuspendować komórki do stężenia 2,5 x 106 komórek/ml, aby uzyskać gęstość wysiewu 5 x 105 liczba komórek na wkładkę do hodowli komórkowej w 200 µL pożywki do hodowli monowarstwy jelita krętego, która stanowi pożywkę do hodowli organoidów uzupełnioną o 500 nM LY2157299, 10 µM Y-27632 oraz 20% płodowej surowicy bydlęcej (FBS).
    2. W przypadku komórek organoidów odbytnicy, resuspender komórki do stężenia 1,5 x 106 komórek/ml, aby uzyskać gęstość wysiewu 3 x 105 liczba komórek na insert do hodowli komórkowych w 200 µL pożywki do hodowli monowarstwy odbytnicy, która stanowi pożywkę do hodowli organoidów uzupełnioną o 100 nM CHIR99021, 500 nM LY2157299, 10 µM Y-27632 oraz 20% FBS.
  11. Wyjmij 24-dołkową płytkę do hodowli komórkowej z insertami do hodowli komórkowej pokrytymi ECM i opróżnij komorę apikalną insertu za pomocą ostrożnego odsysania próżniowego, aby nie uszkodzić powłoki.
  12. Delikatnie nanieś 200 µL zawiesiny pojedynczych komórek przygotowanej w kroku 2.10 do komory apikalnej wkładki do hodowli komórkowej. W przypadku kontroli ujemnej należy dodać 200 µL pożywek hodowlanych bez komórek do komory apikalnej. W przypadku kontroli ślepej należy dodać 200 µL pożywek hodowlanych bez komórek w komorze apikalnej.
  13. Zastosuj 500 µL odpowiednio uzupełnionej pożywki do hodowli monolayerowych (w zależności od tego, czy są to komórki jelita krętego, czy odbytnicy) do komory podstawnej każdej studzienki.
  14. Inkubować w inkubatorze z nawilżaczem w temperaturze 37 °C oraz 5% CO22 aby ułatwić adhezję i wzrost komórek w celu utworzenia konfluencyjnej monowarstwy 2D na wkładce do hodowli komórkowych.
  15. Wymieniać pożywkę hodowlaną w komorach apikalnej i bazolateralnej co drugi dzień, zaczynając od 48 h po wysiewie komórek. Należy zapewnić taki sam czas inkubacji dla kontroli pustej (blank), jak i dla insertu zawierającego komórki.

3. Pomiar TEER

UWAGA: Metoda opisana w niniejszym opracowaniu wykorzystuje dostępny komercyjnie manualny system pomiaru TEER, znany jako woltomierz nabłonkowy, z parą elektrod Ag/AgCl (Rysunek 1A). Wyznaczenie TEER w monowarstwie 2D wymaga pomiaru studzienek pustych. Należy upewnić się, że odczyt tła jest wykonywany w ten sam sposób, co pomiar próbki.

  1. Wyjmij z inkubatora płytkę zawierającą wkłady do hodowli komórkowej z 2D monowarstwą(ami) pochodzącymi z organoidów oraz próbkę kontrolną (blank). Pozostaw płytkę w temperaturze pokojowej przez około 10 min.
  2. Zdezynfekuj elektrody 70% etanolem i poczekaj do ich całkowitego wyschnięcia.
  3. Ostrożnie wprowadź elektrody tak, aby krótki koniec znajdował się w komorze apikalnej, a długi koniec w komorze basolateralnej (Rysunek 1A).
    UWAGA: Należy zachować szczególną ostrożność, aby nie uszkodzić monowarstwy komórek.
  4. Odczekaj do wyrównania odczytu i zapisz wartość w omach, gdy ulegnie ona stabilizacji.
    UWAGA: Czułość woltomierza jest na tyle wysoka, że podczas pomiaru rezystancji elektrycznej będą występować wahania wartości omów. Wiarygodny odczyt uzyskuje się, gdy pomiary się stabilizują i konsekwentnie utrzymują wokół wartości plateau.
  5. Wyznacz TEER monowarstwy 2D za pomocą następującego wzoru:
    TEER (Ω x cm2) = powierzchnia wkładów do hodowli komórkowej (cm2) x Net electrical resistance
    Gdzie Net electrical resistance jest równy zmierzonej rezystancji wkładu z monowarstwą komórek pomniejszonej o zmierzoną rezystancję wkładu kontrolnego. Wkłady do hodowli komórkowej dla płytek 24-dołkowych mają powierzchnię 0,33 cm2.

Schemat pomiaru oporu elektrycznego przeznabłonkowego (TEER); wykresy danych TEER w ciągu siedmiu dni.
Rycina 1: Ocena integralności bariery nabłonkowej dwuwymiarowej warstwy komórkowej pochodzącej z byczych organoidów jelitowych. (A) Schemat właściwego rozmieszczenia elektrod w komorach apikalnej i bazalnej insertu do hodowli komórkowej podczas pomiarów TEER. Krótką elektrodę wprowadza się do komory apikalnej, a długą elektrodę umieszcza się w komorze bazalnej, dbając o to, aby nie stykała się ona z membraną. (B) Schemat procesu badania przepuszczalności. Komory hodowli komórkowej przemywa się dwukrotnie podgrzanym PBS, a do komory apikalnej aplikuje się 0,5 mg/mL znacznika FITC-dekstran 4 kDa rozpuszczonego w PBS. Z komory bazalnej pobierane są powtarzalne aliquoty o objętości 50 µL, z zastępowaniem ich równą objętością PBS w celu utrzymania całkowitej objętości w komorze bazalnej przez cały okres inkubacji. Intensywność fluorescencji aliquotu mierzy się za pomocą czytnika płytek mikrotytracyjnych, aby ilościowo określić dyfuzję znacznika FITC-dekstran 4 kDa przez warstwę komórkową. (C) Dynamiczny rozwój integralności bariery w warstwach komórkowych jelita cienkiego i odbytnicy w czasie oceniano za pomocą pomiarów TEER (reprezentowanych przez zamknięte koła dla jelita cienkiego i zamknięte kwadraty dla odbytnicy) oraz badań przepuszczalności (oznaczonych otwartymi kołami dla jelita cienkiego i otwartymi kwadratami dla odbytnicy) z użyciem znacznika FITC-dekstran 4 kDa. Do 3. dnia hodowli oba typy warstw wykazały utworzenie stabilnych i funkcjonalnych barier nabłonkowych, co potwierdzają odpowiednie profile TEER i przepuszczalności. Wyniki stanowią średnią z co najmniej dwóch niezależnych eksperymentów z dwoma powtórzeniami technicznymi. Słupki błędu reprezentują SEM pomiarów. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.

4. Analiza przepuszczalności parakomórkowej

UWAGA: Analiza ta polega na oznaczeniu intensywności fluorescencji wynikającej z dyfuzji dekstranu z izotiocyjanianem fluoresceiny (FITC)-dextran z komory apikalnej do komory basolateralnej przez monowarstwy 2D w czasie 120 min (Rysunek 1B). Aby uzyskać optymalne wyniki, zaleca się zminimalizowanie ekspozycji na światło podczas analizy oraz dokonywanie pomiarów w czytniku płytek mikrotitracyjnych bezpośrednio po każdym pobraniu próbki, aby zapobiec spadkowi lub gaszeniu fluorescencji. Każda studzienka może być użyta tylko raz i nie może być ponownie wykorzystana w kolejnych analizach. Należy przygotować co najmniej 2 studzienki jako powtórzenia techniczne dla każdej analizy. Przykładowo, do uzyskania wyników przedstawionych na Rysunku 1C potrzeba łącznie 6 studzienek, ponieważ analizy przeprowadzono w dubletach w 3 różnych punktach czasowych (1, 3 i 5 dzień hodowli).

  1. Przygotować serię rozcieńczeń do krzywej wzorcowej z użyciem 4 kDa FITC-dekstranu w roztworze soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS). Dla każdego rozcieńczenia nanieść pipetą 50 µL do płytki 96-dołkowej w trzech powtórzeniach.
    UWAGA: Zaleca się przygotowanie serii 5-7 rozcieńczeń w zakresie od 0 do 0,5 mg/mL.
  2. Wyznaczyć intensywność fluorescencji wzorców w skalibrowanym czytniku mikropłytek przy długości fali wzbudzenia 495 nm i długości fali emisji 535 nm.
  3. Obliczyć regresję liniową na podstawie wyników intensywności fluorescencji w celu stworzenia krzywej wzorcowej.
  4. Wyjąć z inkubatora płytkę zawierającą inserty do hodowli komórkowej z pochodnymi od organoidów 2D monowarstwami. Usunąć pożywkę z komory apikalnej i bazolateralnej insertu do hodowli komórkowej zawierającego badaną 2D monowarstwę pochodną od organoidów.
  5. Każdą komorę delikatnie przemyć 2x odpowiednio 200 µL (komora apikalna) i 500 µL (komora bazolateralna) uprzednio ogrzanego PBS.
  6. Usunąć roztwór płuczący z komory apikalnej i nanieść do niej 200 µL znacznika 4 kDa FITC-dekstranu o stężeniu 0,5 mg/mL w PBS.
  7. Inkubować w inkubatorze z nawilżaniem w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 20 min.
  8. Pobrać próbkę 50 µL z komory bazolateralnej inkubowanej płytki 24-dołkowej i przenieść do płytki 96-dołkowej kompatybilnej z czytnikiem mikropłytek.
  9. Uzupełnić 50 µL świeżego PBS do komory bazolateralnej w dołku, z którego pobrano próbkę.
  10. Niezwłocznie zmierzyć intensywność fluorescencji w skalibrowanym czytniku mikropłytek przy długości fali wzbudzenia 495 nm i długości fali emisji 535 nm.
  11. Powtarzać kroki 4.6-4.10 co 20 min aż do upływu 120 min. Po zakończeniu analizy, jeśli planowane jest zachowanie 2D monowarstwy, przemyć obie komory (apikalną i bazolateralną) świeżym PBS 2x, zastąpić świeżą pożywką do hodowli monowarstw i inkubować.
    UWAGA: Można przeprowadzić dalszą ocenę 2D monowarstw, np. pomiary TEER, barwienie immunofluorescencyjne itd.; nie jest to jednak zalecane, ponieważ prawdopodobna jest obecność pozostałości fluorescencyjnego znacznika, co może wpłynąć na analizę.
  12. Wyznaczyć pozorny współczynnik przepuszczalności (Papp) za pomocą następującego wzoru:
    Równanie przepuszczalności P_app=ΔQ/ΔtA×C_o; schemat analizy równowagi statycznej.
    ΔQ / Δt = stężenie znacznika fluorescencyjnego, który przeszedł przez monowarstwę do komory bazolateralnej insertu do hodowli komórkowej w określonym czasie, zmierzone poprzez intensywność fluorescencji i przeliczone na µg/mL za pomocą krzywej wzorcowej
    A = powierzchnia insertów do hodowli komórkowej
    Co = stężenie znacznika fluorescencyjnego dodanego do komory apikalnej insertu do hodowli komórkowej w µg/mL

5. Barwienie immunofluorescencyjne dwuwymiarowej monowarstwy pochodzącej z organoidów

  1. Usunąć medium hodowlane z monowarstwy z wkładki do hodowli komórkowej za pomocą odsysania próżniowego i dodać 200 µL 4% paraformaldehydu (PFA). Inkubować w temperaturze pokojowej przez 15-30 min w celu fiksacji komórek.
  2. Usunąć PFA za pomocą odsysania próżniowego i przemyć 100 µL PBS (2x).
  3. Przeprowadzić permeabilizację komórek, stosując 100 µL 0,3% Triton X-100 w 2% albuminie wołowej (BSA) w PBS, inkubując w temperaturze pokojowej przez 10 min.
  4. Usunąć nadsącz za pomocą odsysania próżniowego i przemyć 100 µL PBS (2x).
  5. Usunąć nadsącz, zastąpić go 2% BSA w PBS i inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 h w celu blokowania.
  6. Usunąć nadsącz, nanieść 100 µL przeciwciała pierwszorzędowego rozcieńczonego w 2% BSA w PBS i inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 h lub przez noc w 4 °C.
    UWAGA: Stężenia użytych przeciwciał pierwszorzędowych znajdują się w Tabeli Materiałów. O ile nie określono inaczej, stosuje się zalecenia producenta.
  7. Usunąć nadsącz i przemyć 100 µL PBS (3x).
  8. Nanieść 100 µL przeciwciała wtórnego rozcieńczonego w 2% BSA w PBS i inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 h lub przez noc w 4 °C.
    UWAGA: Ten krok można pominąć, jeśli użyte przeciwciało pierwszorzędowe jest sprzężone z sondą fluorescencyjną. Stężenia użytych przeciwciał wtórnych znajdują się w Tabeli Materiałów. O ile nie określono inaczej, stosuje się zalecenia producenta.
  9. Usunąć nadsącz i przemyć 100 µL PBS (3x).
  10. Opcjonalnie: W celu barwienia kontrastowego F-aktyny i jąder (DAPI), przygotować oba znaczniki w odpowiednim rozcieńczeniu (zgodnie z zaleceniem producenta) w PBS, nanieść 100 µL i inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 min. Usunąć nadsącz i przemyć 100 µL PBS (3x).
  11. Ostrożnie wyciąć membranę wkładki do hodowli komórkowej za pomocą ostrza skalpela i zamocować na szkiełku przedmiotowym przy użyciu medium montażowego. Nałożyć szkiełko nakrywkowe i poddać obserwacji.

Wyniki

Niniejszy protokół pozwala na wiarygodne generowanie trwałych dwuwymiarowych monowarstw 2D pochodzących z bydlęcych organoidów jelitowych, wywodzących się z jelita cienkiego i grubego, co naśladuje złożoność nabłonka jelitowego in vivo. Metoda ta wykorzystuje dojrzałe organoidy rozwinięte z preparatów krypt jelitowych zdrowego bydła hodowanych w zoptymalizowanych warunkach. Co ciekawe, skuteczne i powtarzalne warunki dla 2D monowarstw pochodzących z organoidów są specyficzne dla danego odcinka jelita (Tabela 1). Potwierdza to znaczenie stosowania zoptymalizowanych technik hodowli dla interesującego nas odcinka jelita.

W ciągu 1 dnia po wysianiu rozproszonych dojrzałych organoidów na wkładkę do hodowli komórkowej wydawało się, że uformowała się dwuwymiarowa warstwa pojedyncza (Rycina 2A). Jednakże, mimo tych początkowych pozorów, pomiary TEER dla monowarstw jelita krętego i odbytnicy pozostały na tym etapie niskie (Rysunek 1C). Ponadto analiza przepuszczalności parakomórkowej wykazała, że monowarstwa, już po 1 dniu hodowli, umożliwiała przenikanie znacznika FITC-dekstranu o masie 4 kDa przez warstwę komórkową (Rycina 1C). Do 3.rd dnia hodowli obie wersje dwuwymiarowych monowarstw pochodzących z organoidów wykazywały znaczną maturację, o czym świadczyły zwiększone wartości TEER oraz oporność na znacznik FITC-dekstran 4 kDa; trend ten utrzymywał się do 5. dnia hodowli.

Szczególnie istotna jest zmienność międzygatunkowa; mimo niższych wartości TEER w przypadku kultur 2D monowarstw pochodzących z organoidów bydlęcych w porównaniu z odpowiednikami ludzkimi i psimi w podobnych warunkach12,13,14,15, integralność błony pozostaje zachowana. Wniosek ten wynika z prawidłowej odpowiedzi monowarstw w testach przepuszczalności, co sugeruje, że niskie wartości TEER w próbkach bydlęcych nie muszą oznaczać braku funkcji barierowej. Integralność ta jest kluczowa dla funkcjonalnej bariery nabłonkowej i zostaje skutecznie wykazana poprzez staranną interpretację wyników testów przepuszczalności wraz z pomiarami TEER.

Wizualizacja demarkacji komórkowej oraz dobrze rozwiniętych mikrokosmków na powierzchni apikalnej monowarstw 2D za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej, wykazująca wyspecjalizowane struktury mikroanatomiczne, dodatkowo potwierdziła dojrzałość monowarstw 2D pochodzących zarówno z organoidów jelita krętego, jak i odbytnicy (Rycyna 2B). Ponadto barwienie immunofluorescencyjne monowarstw 2D potwierdziło obecność apikalnego rąbka szczoteczkowego, połączeń przylegających boczno-podstawnych oraz produkujących śluz komórek kubkowych w monowarstwach 2D pochodzących z organoidów jelita krętego (Rycina 3A) oraz odbytnicy (Rycina 3B). Wyniki te potwierdzają, że opracowana monowarstwa 2D charakteryzuje się złożonym składem i budową, nie tylko wykazując kluczowe cechy nienaruszonego nabłonka jelitowego, ale składając się z wieloliniowej populacji komórek.

Pomyślne wytworzenie dwuwymiarowej (2D) monowarstwy zależy od adhezji komórek do ECM oraz wzrostu do stanu konfluencji w celu stworzenia nienaruszonej warstwy nabłonkowej. Warto zauważyć, że nierównomierny rozkład ECM lub nieoptymalne warunki podczas inkubacji na wkładce do hodowli komórkowych mogą prowadzić do częściowego odklejenia się warstwy komórkowej, co jest szczególnie widoczne wzdłuż jej krawędzi (Rysunek 4Ai). Problem ten potęguje sytuacja, gdy komórki są wysiewane z gęstością wyższą niż optymalna lub gdy nie są one równomiernie rozłożone na powierzchni hodowli, co często wynika z niepełnej dysocjacji organoidów do zawiesiny pojedynczych komórek. Taki nierównomierny rozkład może prowadzić do powstania luk w monowarstwie i/lub do morfogenezy 3D na wkładce do hodowli komórkowych (Rysunek 4Aii). Z kolei zbyt mała gęstość wysiewu komórek może również skutkować niepowodzeniem lub opóźnieniem rozwoju monowarstwy w przewidzianym okresie hodowli, co nieumyślnie wpływa na wydajność późniejszych badań wykorzystujących system monowarstwy 2D (Rysunek 4Aiii). Ponadto kontaminacja systemu hodowli może prowadzić do powstania luk w monowarstwie, niszcząc wcześniej uformowaną konfluentną warstwę na późniejszym etapie hodowli (Rysunek 4Aiv). Stabilne wartości TEER oraz odpowiedź przepuszczalności parakomórkowej mogą zostać zaburzone przez uszkodzenia warstwy komórkowej wynikające z agresywnych technik mycia lub manipulacji, nawet jeśli wspomniane potencjalne przyczyny niepowodzeń nie wystąpiły przed tymi analizami (Rysunek 4B). Zatem ostrożne obchodzenie się z komórkami oraz ocena tworzenia się lub zakłóceń monowarstwy są kluczowe dla pomyślnego wytworzenia monowarstw 2D pochodzących z organoidów poprzez efektywne stosowanie strategii rozwiązywania problemów.

Obrazy mikroskopowe tkanki jelita końcowego i odbytnicy; porównanie w dniach D1, D3; mikrografie świetlne i elektronowe.
Rycina 2: Charakterystyka mikroskopowa dwuwymiarowych (2D) monowarstw pochodzących z organoidów jelita końcowego i odbytnicy bydła. (A) Reprezentatywne obrazy z mikroskopii kontrastowej monowarstw 2D w 1. i 3. dniu (D1 i D3) hodowli na wkładce do hodowli komórkowej. Pasek skali = 100 µm. (B) Reprezentatywne obrazy z transmisyjnej mikroskopii elektronowej monowarstw 2D przy mniejszym (lewo) i większym (prawo) powiększeniu. Szczegółowa struktura powierzchni komórek, w tym mikrokosmki, jest widoczna zarówno w monowarstwie jelita końcowego (góra), jak i odbytnicy (dół). Lewy pasek skali = 10 µm, prawy pasek skali = 2 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Obraz mikroskopii konfokalnej; rozkład F-aktyny, E-kadheryny i markera SNA; porównanie tkanki jelita cienkiego (ileum) i odbytnicy.
Rysunek 3: Charakterystyka immunofluorescencyjna dwuwymiarowych monowarstw pochodzących z organoidów jelita cienkiego i odbytnicy. (A, B) Panel (A) przedstawia organoidy jelita cienkiego, a panel (B) organoidy odbytnicy. Po lewej stronie włókna F-aktyny są zaznaczone faloidyną (czerwony), co ilustruje architekturę cytoszkieletu i formowanie się apikalnego rąbka szczoteczkowego. Środkowy obraz przedstawia basolateralną lokalizację złączy przylegających, zaznaczonych E-kadheryną (zielony), co wskazuje na adhezję międzykomórkową i integralność monowarstwy. Po prawej stronie obecność produkujących mucynę komórek kubkowych zidentyfikowano za pomocą SNA (zielony), przy czym obraz z serii z-stack przedstawia apikalną sekrecję mucyny w monowarstwie jelita cienkiego. Jądra we wszystkich obrazach zostały przeciwbarwione DAPI (niebieski). Ponadto obrazy z serii z-stack we wszystkich panelach dodatkowo demonstrują powstanie pojedynczej warstwy komórkowej wewnątrz insertu hodowlanego. Pasek skali = 25 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Obrazy mikroskopowe hodowli komórkowych i wykres TEER; ocena faz wzrostu i zmian przepuszczalności.
Rycina 4: Charakterystyka suboptimalnego tworzenia dwuwymiarowej (2D) warstwy monowarstwowej. (A) Reprezentatywne obrazy w kontraście fazowym pokazujące (i) częściowe oddzielenie monowarstwy wzdłuż krawędzi insertu do hodowli komórkowych; (ii) rozwój wypustek trójwymiarowych (3D) i powstawanie przerw w monowarstwie; (iii) niepełne lub opóźnione tworzenie monowarstwy z powodu gęstości zasiewu niższej niż optymalna, objawiające się płatowym przyleganiem komórek; oraz (iv) powstawanie przerw w uprzednio uformowanej monowarstwie 2D na późniejszym etapie, prawdopodobnie w wyniku podejrzenia kontaminacji. Paski skali = 100 µm. (B) Spadające wartości pomiarów TEER powiązane z rosnącymi profilami przepuszczalności po 3. dniu wskazują na brak możliwości ustanowienia stabilnych i funkcjonalnych barier nabłonkowych. Wyniki przedstawiono jako średnia ± błąd standardowy średniej (SEM) z jednego eksperymentu z dwoma powtórzeniami technicznymi. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Rycina uzupełniająca 1: Zróżnicowanie gęstości w kulturach organoidów jelita bydlęcego w hydrożelu opartym na ECM.Organoidy jelita bydlęcego hodowane w hydrożelu opartym na ECM; (A) wysoka gęstość i (B) niska gęstość. Pasek skali = 100 µm. Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.

Tabela uzupełniająca 1: Podsumowanie danych sygnalacyjnych dawców tkanek. Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

Zdrowie przewodu pokarmowego ma zasadnicze znaczenie zarówno dla produktywności, jak i ogólnego dobrostanu bydła16. Wykorzystując technologię jednowarstwową 2D pochodzącą z organoidów, naukowcy mogą teraz dokładniej naśladować złożoną strukturę nabłonka jelitowego bydła w warunkach in vitro 5. To innowacyjne podejście nie tylko odtwarza zróżnicowany skład komórkowy wyściółki jelita, w tym jego wielokomórkowe linie, ale także pozwala uchwycić kluczowe cechy funkcjonalne, takie jak wydzielanie śluzu i obecność mikrokosmków, które są niezbędne do zrozumienia fizjologii i patologii jelit3. Opracowanie dostosowanych do potrzeb protokołów hodowli segmentów jelita krętego i odbytnicy dało początek zaawansowanej platformie, która znacznie zwiększa możliwości badania zdrowia jelit bydła. To wyrafinowane podejście umożliwia szczegółowe badania interakcji między patogenami odzwierzęcymi a środowiskiem jelitowym bydła. Możliwość dokładnego odtworzenia i zbadania unikalnych aspektów ekosystemu jelitowego bydła in vitro jest znaczącym krokiem w kierunku opracowania ukierunkowanych strategii poprawy zdrowia zwierząt gospodarskich i ograniczenia rozprzestrzeniania się chorób odzwierzęcych.

Niemniej jednak, aby zapewnić pomyślny rozwój monowarstw 2D przy użyciu organoidów jelitowych bydła, kluczowe znaczenie ma utrzymanie zdrowia i witalności zarówno organoidów, jak i ich zdysocjowanych pojedynczych komórek. Ostrożne obchodzenie się i minimalizacja stresu mają zasadnicze znaczenie dla zachowania integralności i funkcjonalności komórek, które są niezbędne do efektywnego wzrostu organoidów, a następnie stworzenia działającej monowarstwy. Co więcej, uzyskanie jednolitej monowarstwy opiera się na udanej dysocjacji organoidów na pojedyncze komórki bez tworzenia dużych grudek. Takie grudki mogą zakłócać dystrybucję komórek i naruszać strukturę monowarstwy. Dlatego kluczowe znaczenie ma zastosowanie precyzyjnych technik płynnej dysocjacji, co skutkuje spójną zawiesiną pojedynczej komórki. Dodatkowo korzystne staje się zminimalizowanie zakłóceń podczas adhezji komórek i podczas wypłukiwania nadmiaru komórek nieprzylegających. Takie podejście jest szczególnie ważne dla rozwiązywania potencjalnych problemów z morfogenezą 3D, poprawiając w ten sposób ogólną jakość monowarstwy.

Zauważalnym wyzwaniem związanym z hydrożelami na bazie ECM, które są pochodzenia biologicznego, jest zmienność składu między partiami17. Chociaż nie zaobserwowano tego przy użyciu opisanych protokołów i materiałów, różnice w składzie ECM z partii na partię mogą stanowić wyzwanie dla pomyślnego opracowania monowarstw. Jeśli tworzenie monowarstwy jest zakłócone, gdy zmieniają się produkty ECM, marki lub numery partii, konieczne mogą być kroki optymalizacyjne w celu określenia odpowiedniego stężenia ECM wymaganego do powlekania wkładek do hodowli komórkowych.

Co więcej, dostosowanie pożywki hodowlanej do temperatury pokojowej przed wprowadzeniem jakichkolwiek zmian jest krytycznym krokiem, który pomaga złagodzić szok termiczny, chronić zdrowie komórek i utrzymać jakość zarówno kultur organoidowych, jak i jednowarstwowych. Delikatne praktyki mycia mają również zasadnicze znaczenie dla utrzymania integralności monowarstwy podczas jej formowania i późniejszych testów, a unikanie zakłóceń może zapobiec niedokładnościom wyników. Zastąpienie PBS zrównoważonym roztworem soli Hanka (HBSS) okazało się pomocne w minimalizowaniu oderwania monowarstwy, gdy stało się to problemem podczas wielokrotnego mycia lub długotrwałej ekspozycji na PBS, na przykład w testach przepuszczalności parakomórkowej. Wreszcie, dostosowanie pożywki hodowlanej do specyficznych potrzeb komórek z różnych segmentów przewodu pokarmowego, takich jak jelito kręte i odbytnica, ma zasadnicze znaczenie dla dokładnej replikacji w warunkach in vivo . Ta specyfika zapewnia optymalne zdrowie i funkcjonalność komórek, ułatwiając precyzyjne modelowanie fizjologii jelit bydła i interakcji z patogenami, podkreślając w ten sposób te kluczowe etapy badań nad organoidami.

Oprócz zastosowania delikatnej praktyki obchodzenia się z komórkami, budowanie dobrych kompetencji technicznych związanych z liczeniem komórek i pomiarami TEER ma kluczowe znaczenie dla pomyślnego opracowania działającej monowarstwy 2D. Ponieważ zarówno zbyt niska, jak i zbyt wysoka gęstość wysiewu wynikająca odpowiednio z nadmiernego lub niedoszacowania komórek może prowadzić do upośledzonego wzrostu monowarstwy. Zaleca się dokładne przejrzenie liczby komórek i zapewnienie odpowiedniej gęstości wysiewu w sytuacjach, gdy podejrzewa się niedokładne zagęszczenie wysiewu. Dodatkowo, nieodpowiednie techniki pomiaru TEER mogą spowodować rozerwanie monowarstwy przez niezamierzone zarysowania elektrod. Ostrożne wprowadzenie elektrod do komory wierzchołkowej i zwrócenie szczególnej uwagi na utrzymanie ich pionowej orientacji względem powierzchni membrany może pomóc w ograniczeniu ryzyka przypadkowego uszkodzenia monowarstw.

Opisane tutaj metody oznaczania przepuszczalności parakomórkowej zostały zaadaptowane z poprzedniego protokołu18. Modyfikacje zgłoszonego protokołu, które obejmują wielokrotne pobieranie próbek w ciągu 120 minut i zastąpienie pobranej próbki podwielokrotności równą ilością PBS, mają na celu poprawę dokładności i wiarygodności wyników. Utrzymanie całkowitej objętości w komorze ma kluczowe znaczenie z kilku powodów: zachowuje równowagę osmotyczną, zapewnia integralność komórek, utrzymuje gradient stężeń niezbędny do dokładnej oceny przepuszczalności i zapobiega zmianom ciśnienia hydrostatycznego, które mogłyby wpływać na szybkość transportu. Ta praktyka uzupełniania komory podstawno-bocznej świeżym PBS odpowiadającym objętości pobranego PBS zawierającego znacznik fluorescencyjny ma kluczowe znaczenie dla zachowania tych warunków, umożliwiając dokładną i miarodajną ocenę przepuszczalności jednowarstwowej. Test przepuszczalności parakomórkowej służy jako uzupełnienie pomiaru TEER poprzez ocenę ruchu cząsteczek znacznikowych bezpośrednio przez monowarstwę. Co więcej, porównywanie wartości TEER w różnych laboratoriach może nie przynieść odpowiednich wniosków, ponieważ na wartości te może mieć wpływ wiele zmiennych, takich jak temperatura i specyficzne warunki, w których hoduje się komórki, w tym typy komórek, liczby pasaży i skład pożywkihodowlanej 19. Test przepuszczalności parakomórkowej zapewnia funkcjonalną ocenę in vitro skutecznej ekspresji adherenów i ścisłych połączeń w obrębie bariery nabłonkowej20.

Chociaż opracowanie monowarstw 2D z organoidów 3D stanowi znaczący postęp w technologii hodowli, ważne jest, aby zdać sobie sprawę z ograniczeń związanych z monowarstwami 2D. Jedną z głównych wad jest to, że pozostaje to statycznym systemem hodowli, pozbawionym dynamicznej stymulacji występującej w środowisku in vivo . Ponadto modyfikacja zawartości tlenu w systemie hodowli stanowi wyzwanie ze względu na jego otwartą konfigurację obejmującą płytki hodowlane z pokrywkami, co sprawia, że jest on mniej odpowiedni do długotrwałej kohodowli z bakteriami beztlenowymi. Ograniczeniom tym można potencjalnie zaradzić, przyjmując bardziej dynamiczne platformy hodowlane, takie jak systemy mikroprzepływowe21, które oferują bardziej kontrolowane i fizjologicznie odpowiednie środowisko. Ponadto ważne jest, aby zdać sobie sprawę, że chociaż obecne warunki hodowli są bogate w składniki odżywcze korzystne dla utrzymania wzrostu komórek macierzystych, mogą nie być optymalne dla indukowania fizjologicznego różnicowania komórek nabłonka. Ta rozbieżność podkreśla potrzebę optymalizacji w przyszłych badaniach, aby ściśle naśladować warunki in vivo i wspierać proces różnicowania. Usuwając te ograniczenia i udoskonalając te podejścia, zwiększa się użyteczność i możliwość zastosowania technologii hodowli organoidów, co przybliża nas do odtworzenia złożonej dynamiki i interakcji w przewodzie pokarmowym in vitro.

Protokół generowania monowarstw 2D z tkanek jelita krętego i odbytnicy bydła oferuje naukowcom cenny model in vitro interfejsu świetlnego zarówno nabłonka jelita cienkiego, jak i grubego. Model ten otwiera szerokie możliwości zastosowania w podstawowych badaniach nad żywieniem zwierząt, w szczególności w badaniu, w jaki sposób składniki odżywcze są wchłaniane w różnych warunkach. Godnym uwagi obszarem zainteresowania jest badanie zespołu nieszczelnego jelita, charakteryzującego się nieprawidłowym wzrostem przepuszczalności przewodu pokarmowego, często wywoływanym przez zmiany w diecie i ekstremalne temperatury otoczenia22,23. Co więcej, model ten służy jako niezbędne narzędzie do badania złożonych interakcji między mikrobiomem jelitowym a jego gospodarzem. Pozwala to na zbadanie, w jaki sposób mikroorganizmy komensalne mogą wpływać na zdrowie organizmu gospodarza, odnosząc się do kluczowego aspektu nauk weterynaryjnych i medycznych 1,24. Ponadto patogeny przenoszone przez żywność dla ludzi są często znajdowane jako komensale w różnych segmentach jelit bydła 8,9,25, protokół ten umożliwia szczegółowe badania specyficznych warunków, które pozwalają tym odzwierzęcym czynnikom rozwijać się w odpowiednich niszach.

W trakcie tego badania zaobserwowano, że monowarstwy pochodzące z organoidów odbytniczych i krętych wymagają różnych warunków do pomyślnego rozwoju. W szczególności, gdy monowarstwy pochodzące z organoidów odbytniczych początkowo wysiewano na wkładkach do hodowli komórkowych przygotowanych z 2% hydrożelem na bazie ECM w pożywkach podstawowych przez 1 godzinę, zauważono duże i złuszczanie się komórek. Problem ten został rozwiązany poprzez przejście na specjalistyczne monowarstwowe podłoże hodowlane doodbytnicze i wydłużenie okresu inkubacji do nocy przed siewem, podczas gdy monowarstwy pochodzące z organoidów jelita krętego z powodzeniem opracowano przy użyciu krótszego protokołu przygotowania. Ponadto dodanie CHIR99021 do pożywki hodowlanej konsekwentnie poprawiało tworzenie monowarstw doodbytniczych26 , ale nie było konieczne w przypadku monowarstw jelita krętego27. Ponadto monowarstwy jelita krętego wymagały większej gęstości komórek do pomyślnego rozwoju w porównaniu z organoidami doodbytniczymi27. W tych zoptymalizowanych warunkach (Tabela 1) wielokrotnie opracowano monowarstwy, które utrzymują odporność na integralność bariery, co podkreśla znaczenie dostosowania warunków hodowli do określonego segmentu jelita.

Dostęp do modelu, który dokładnie odzwierciedla złożoność wielokomórkowej linii jelita in vivo , ma kluczowe znaczenie dla tych badań. Pozwala to naukowcom na dokładne naśladowanie naturalnych warunków środowiska jelitowego, zapewniając bardziej wiarygodną podstawę do eksperymentów. Dzięki temu protokołowi badacze są wyposażeni w solidny model, który zwiększa ich możliwości badawcze, potencjalnie prowadząc do przełomowych odkryć w ich dziedzinach nauki. Takie podejście nie tylko przyczynia się do zrozumienia zdrowia i chorób jelit, ale także pomaga w opracowywaniu strategii mających na celu poprawę zarządzania zwierzętami gospodarskimi i bezpieczeństwa żywności.

Oświadczenia

Autorzy nie mają do zadeklarowania żadnego konfliktu interesów.

Podziękowania

To badanie było częściowo wspierane przez Biuro Dyrektora Narodowych Instytutów Zdrowia (K01OD030515 i R21OD031903 do YMA) oraz WSU VCS Resident and Graduate Student Research Grant (do GDD). Autorzy pragną podziękować rzeźni uczestniczącej w projekcie za dostarczenie bydła dawcy.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Basal Średni
Zaawansowany DMEM/F12 (1X)Gibco12634-010n/a
GlutaMAX-I (100X)Gibco35050-0612 mM
HEPES (1M)Gibco15630-08010 mM
Pen Strep Glutamina (100X)Gibco10378-0161X
Organoid Culture Medium (suplementy do podłoża podstawowego)
A-83-01Sigma-AldrichSML0788-5MG500 nM
B27 Suplement (50X)Gibco17504-0011X
[Leu15]-Gastrin I człowiekSigma-AldrichG9145-.5MG10 nM
Mysz EGFPeproTech315-09-500UG50 ng/ml
Murine Wnt-3aPeproTech315-20-10UG100 ng/mL
N-acetylo-L-cysteinaMP Biomedicals1946031 mM
N-2 MAX Suplement na podłoża (100X)R& D SystemsAR0091X
NikotynamidSigma-AldrichN0636-100G10 mM
Noggin Kondycjonowane mediumn/a/d10 vol/vol %
PrimocinInvivoGenant-pm-2100 µ g / ml
R-Spondin-1 Kondycjonowane podłożen/anie dotyczy 20 obj./obj.%
SB202190Sigma-AldrichS7067-25MG10 &mikro; M
Monolayer Culture Medium (Suplementy do pożywki do hodowli organoidów)
CHIR99021Sigma-AldrichSML1046-5MG2,5 µ M
HI FBSGibco10438-03420 vol/vol %
LY2157299Sigma-AldrichSML2851-5MG500 nM
Y-27632StemCellTechnologies7230810 µ M
Odczynniki
Alexa Fluor 488 Mysia anty-E-kadherynaBD Biosciences560061rozcieńczenie 1:200
Alexa Fluor 647 PhalloidinInvitrogenA22287:400 rozcieńczenie
BSACytivaSH30574.022 w/vol %
Roztwór do odzyskiwania komórekCorning354253nie dotyczy
Roztwór DAPI (1 mg / ml)Thermo Scientific62248rozcieńczenie 1:1000
DPBS (1X)Gibco14190-144n/a
Izotiocyjanian fluoresceiny– DekstranSigma-AldrichFD4-100MG0,5 mg/ml
Matrigel MatrixCorning354234bez
dodatku Roztwór paraformaldehydu (4%)Thermo ScientificJ19943K2nie dotyczy
odczynnika przeciwblaknięcia ProLong GoldInvitrogenP36930n/a
SNA, EBL, FluoresceinaVector LaboratoriesFL-1301rozcieńczenie
1:100Triton X-100Thermo ScientificA16046.AE0,3 obj./obj. %
TrypLE ExpressGibco12605-028n/d
roztwór błękitu trypanowego, 0,4%VWR Life ScienceK940-100MLn/a
Materiały i urządzenia
0,4 i mikro; m Wkładka do hodowli komórkowychFalcon353095
24-dołkowa płytka do hodowli komórkowychCorning3524
48-dołkowa płytka do hodowli komórkowychThermo Scientific150687
70 µ m Sterylne sitko komórkoweFisher Scientific22-363-548
96-dołkowa płytka do hodowli komórkowych WirówkaGreiner Bio-One
Eppendorf5910Ri
Inkubator CO2Thermo Scientific370
Nabłonkowy miernik woltowo-omowyMilliporeMillicell ERS-2
HemocytometrLW ScientificCTL-HEMM-GLDR
Odwrócony mikroskop konfokalnyLeica MicrosystemsSP8-X
Mikroskop z odwróconym kontrastem fazowymLeica MicrosystemsDMi1
Szklana osłona mikroskopuFisher Scientific12-540-B
Czytnik mikropłytekUrządzenia molekularneSpecrtraMax i3x
Szkiełka mikroskopoweFisher Scientific22-034-486
Pipety PasteuraFisher Scientific13-678-20C
Ostrze skalpelaiMed Scientific-#11
mieszalnik wirowyScientific IndustriesSI-0236
Software
LAS XOprogramowanie czytnika mikropłytek Leica MicrosystemsLAS X 3.7.6.25997
Molecular DevcesSoftMax Pro 7.1.2
n 1 do 655086 ze stali węglowej

Bibliografia

  1. Min, S., Kim, S., Cho, S. W. Gastrointestinal tract modeling using organoids engineered with cellular and microbiota niches. Exp Mol Med. 52 (2), 227-237 (2020).
  2. Fitzgerald, S. F., et al. Shiga toxin sub-type 2a increases the efficiency of Escherichia coli O157 transmission between animals and restricts epithelial regeneration in bovine enteroids. PLoS Pathogens. 15 (10), e1008003(2019).
  3. Dutta, D., Heo, I., Clevers, H. Disease modeling in stem cell-derived 3D organoid systems. Trend Mol Med. 23 (5), 393-410 (2017).
  4. Beaumont, M., et al. Intestinal organoids in farm animals. Vet Res. 52 (1), 33(2021).
  5. Kawasaki, M., Dykstra, G. D., McConnel, C. S., Burbick, C. R., Ambrosini, Y. M. Adult bovine-derived small and large intestinal organoids: In vitro development and maintenance. J Tissue Eng Regene Med. 2023, e3095002(2023).
  6. Kvidera, S. K., et al. Intentionally induced intestinal barrier dysfunction causes inflammation, affects metabolism, and reduces productivity in lactating Holstein cows. J Dairy Sci. 100 (5), 4113-4127 (2017).
  7. Crawford, C. K., et al. Inflammatory cytokines directly disrupt the bovine intestinal epithelial barrier. Sci Rep. 12 (1), 14578(2022).
  8. Heredia, N., García, S. Animals as sources of food-borne pathogens: A review. Animal Nutri. 4 (3), 250-255 (2018).
  9. Naylor, S. W., et al. Lymphoid follicle-dense mucosa at the terminal rectum is the principal site of colonization of enterohemorrhagic Escherichia coli O157:H7 in the bovine host. Infect Immun. 71 (3), 1505-1512 (2003).
  10. Co, J. Y., et al. Controlling epithelial polarity: A human enteroid model for host-pathogen interactions. Cell Rep. 26 (9), 2509-2520 (2019).
  11. Pullinger, G. D., et al. Systemic translocation of Salmonella enterica Serovar Dublin in cattle occurs predominantly via efferent lymphatics in a cell-free niche and requires type III secretion system 1 (T3SS-1) but not T3SS-2. Infect Immun. 75 (11), 5191-5199 (2007).
  12. Nickerson, K. P., et al. A versatile human intestinal organoid-derived epithelial monolayer model for the study of enteric pathogens. Microbiol Spectr. 9 (1), e0000321(2021).
  13. Varani, J., McClintock, S. D., Aslam, M. N. Cell-matrix interactions contribute to barrier function in human colon organoids. Front Med. 9, 838975(2022).
  14. Freire, R., et al. Human gut derived-organoids provide model to study gluten response and effects of microbiota-derived molecules in celiac disease. Sci Rep. 9, 7029(2019).
  15. Ambrosini, Y. M., et al. Recapitulation of the accessible interface of biopsy-derived canine intestinal organoids to study epithelial-luminal interactions. PLoS ONE. 15 (4), e0231423(2020).
  16. Kogut, M. H., Arsenault, R. J. Editorial: Gut health: The new paradigm in food animal production. Front Vet Sci. 3, 71(2016).
  17. Lingard, E., et al. Optimising a self-assembling peptide hydrogel as a Matrigel alternative for 3-dimensional mammary epithelial cell culture. Biomater Adv. 160, 213847(2024).
  18. Turksen, K. Permeability Barrier: Methods and Protocols. , Springer protocols, Humana Press. (2011).
  19. Srinivasan, B., et al. TEER measurement techniques for in vitro barrier model systems. J Lab Autom. 20 (2), 107-126 (2015).
  20. Frost, T. S., Jiang, L., Lynch, R. M., Zohar, Y. Permeability of epithelial/endothelial barriers in Transwells and microfluidic bilayer devices. Micromachines. 10 (8), 533(2019).
  21. Bein, A., et al. Microfluidic organ-on-a-chip models of human intestine. Cell Mol Gastroenterol Hepatol. 5 (4), 659(2018).
  22. Sanz-Fernandez, M. V., et al. Targeting the hindgut to improve health and performance in cattle. Animals. 10 (10), 1817(2020).
  23. Gressley, T. F., Hall, M. B., Armentano, L. E. Ruminant nutrition symposium: Productivity, digestion, and health responses to hindgut acidosis in ruminants. J Anim Sci. 89 (4), 1120-1130 (2011).
  24. O'Hara, E., Neves, A. L. A., Song, Y., Guan, L. L. The role of the gut microbiome in cattle production and health: Driver or passenger. Ann Rev Animal Biosci. 8 (2020), 199-220 (2020).
  25. Beach, J. C., Murano, E. A., Acuff, G. R. Prevalence of Salmonella and Campylobacter in beef cattle from transport to slaughter. J Food Protect. 65 (11), 1687-1693 (2002).
  26. Kawasaki, M., Ambrosini, Y. M. Accessible luminal interface of bovine rectal organoids generated from cryopreserved biopsy tissues. PLoS One. 19 (3), e0301079(2024).
  27. Kawasaki, M., McConnel, C. S., Burbick, C. R., Ambrosini, Y. M. Pathogen-epithelium interactions and inflammatory responses in Salmonella Dublin infections using ileal monolayer models derived from adult bovine organoids. Scientific Reports. 14 (1), 11479(2024).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Organoidy bydlęcemonowarstwy jelitowemonowarstwa pochodząca z organoidówbariera nabłonkowatransepitelialna oporność elektrycznaprzepuszczalność parakomórkowabarwienie immunocytochemiczneinterakcje gospodarz-patogenorganoidy jelita cienkiegoorganoidy jelita grubego
Postępy w technologii organoidów bydlęcych z wykorzystaniem jednowarstwowych interfejsów jelita cienkiego i grubego
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.