Składanie organoidów siatkówki z mikroglejem

Summary

Mikroglej to unikalne komórki odpornościowe rezydentne w siatkówce, odgrywające kluczową rolę w różnych chorobach zwyrodnieniowych siatkówki. Stworzenie modelu kohodowli organoidów siatkówki z mikroglejem może ułatwić lepsze zrozumienie patogenezy i postępów w rozwoju chorób siatkówki.

Abstract

Ze względu na ograniczony dostęp do ludzkiej siatkówki, organoidy siatkówki (RO) są najlepszym modelem do badania chorób siatkówki u ludzi, co może ujawnić mechanizm rozwoju siatkówki i występowanie chorób siatkówki. Mikroglej (MG) to unikalne makrofagi rezydujące w siatkówce i ośrodkowym układzie nerwowym (OUN), pełniące kluczowe funkcje odpornościowe. Jednak organoidy siatkówki nie mają mikrogleju, ponieważ ich źródłem różnicowania jest woreczek żółtkowy. Specyficzna patogeneza mikrogleju w tych chorobach siatkówki pozostaje niejasna; Dlatego konieczne okazuje się stworzenie modelu organoidu siatkówki z udziałem mikrogleju. W tym przypadku udało nam się skonstruować model współhodowlany organoidów siatkówki z mikroglejem pochodzącym z ludzkich komórek macierzystych. W tym artykule rozróżniliśmy mikroglej, a następnie wspólnie wyhodowaliśmy go z organoidami siatkówki we wczesnym stadium. Jako inkorporacja komórek odpornościowych, model ten zapewnia zoptymalizowaną platformę do modelowania chorób siatkówki i badań przesiewowych leków, aby ułatwić dogłębne badania nad patogenezą i leczeniem chorób siatkówki i chorób związanych z OUN.

Introduction

Jako ograniczone źródło ludzkiej siatkówki, różnicowanie ludzkich komórek macierzystych w trójwymiarowe (3D) organoidy siatkówki stanowi obiecujący model in vitro do symulacji siatkówki¹. Zawiera różne typy komórek w siatkówce, w tym fotoreceptory, komórki zwojowe siatkówki, komórki dwubiegunowe, komórki Müllera, komórki poziome i astrocyty². Model ten umożliwia emulację i badanie zarówno mechanizmów rozwoju siatkówki, jak i patogenezy chorób siatkówki. Jednak ze względu na metodę różnicowania kierunkowego, organoidy siatkówki pochodziły z neuroektodermy³, bez wielu innych typów komórek pochodzących z różnych listków rozrodczych, takich jak mikroglej z woreczka żółtkowego i komórki okołonaczyniowe z mezodermy^4,5,6.

Obecnie udowodniono, że wiele chorób siatkówki, takich jak barwnikowe zwyrodnienie siatkówki⁷, jaskra^8, oraz retinoblastoma⁹, są ściśle związane z mikroglejem w siatkówce. Jednak ze względu na brak odpowiednich modeli badawczych konkretne mechanizmy ilustrujące związek między mikroglejem a tymi chorobami nadal pozostają niejasne. Podczas gdy myszy służyły jako korzystny model do badania chorób siatkówki, ostatnie badania wykazały znaczące różnice między mysim a ludzkim mikroglejem pod względem długości życia, tempa proliferacji i braku ludzkich genów homologicznych^10,11. Odkrycia te sugerują, że wnioski wyciągnięte z modeli mysich mogą nie być w pełni wiarygodne, co podkreśla znaczenie konstruowania ludzkich organoidów siatkówki zawierających mikroglej.

W ciągu ostatnich kilku dekad opracowano różne metody różnicowania 3D organoidów siatkówki^12,13. Aby ułatwić kohodowlę mikrogleju w organoidach siatkówki, wybraliśmy metodę różnicowania polegającą na przejściu od hodowli przylegającej do zawiesiny. Takie podejście z powodzeniem umożliwia włączenie mikrogleju do organoidów siatkówki, utrzymując je przez co najmniej 60 dni¹⁴.

Protocol

To badanie zostało zatwierdzone przez Instytucjonalną Komisję Etyki Szpitala Tongren w Pekinie, Stołecznego Uniwersytetu Medycznego. Linia komórkowa H9 HESC pochodziła z Instytutu Badawczego WiCell. Przed eksperymentem należy wstępnie podgrzać pożywkę do hodowli komórkowych w temperaturze pokojowej (RT) przez 30 minut.

1. Wytwarzanie ludzkiego mikrogleju

1. Hoduj hESC w pożywce dla komórek macierzystych, aż gęstość komórek osiągnie 80%-90%. Wysiewaj co najmniej 1 x 10⁶ komórek w każdym dołku.
2. Odessać pożywkę z komórkami macierzystymi i przepłukać komórki 1x DPBS (1 ml / dołek z płytką 6-dołkową). Następny krok wymaga 2 x 10^7-1 x 10⁸ komórek. Jeśli to nie wystarczy, połącz komórki z 2-5 dołków, aby wykonać następujące czynności.
3. Oddzielić kolonie komórek macierzystych za pomocą 0,5 mM roztworu EDTA przez około 5 minut w inkubatorze o temperaturze 37 °C (1 ml / dołek na płytce 6-dołkowej).
4. Sprawdź morfologię kolonii po 5 minutach. Kiedy krawędzie kolonii są lekko zwinięte z luźnymi przerwami, komórki są gotowe do różnicowania i aspiracji EDTA. Jeśli nie, inkubować komórki w temperaturze 37 °C przez kolejne 1-2 minuty. Nie inkubować dłużej niż 8 minut.
5. Delikatnie przepłukać komórki w każdym dołku za pomocą 6 ml pożywki A (Tabela 1) z 6 μl 10 mM roztworu inhibitora ROCK Y-27632. Delikatnie postukaj w dno naczynia, aby wypłukać komórki. Ustaw dzień jako dzień 0.
   UWAGA: Nie pipetuj komórek. Następnego dnia komórki utworzą ciała zarodkowe (EB).
6. Po 24 godzinach obserwuj komórki pod mikroskopem, aby potwierdzić tworzenie się EB. Zebrać EB do 15 ml probówki odśrodkowej z pipetą o pojemności 10 ml i poczekać, aż EB osiądną na dnie w ciągu 5 minut.
7. Ostrożnie odessać supernatant i ponownie zawiesić EB za pomocą 6 ml świeżego podłoża A i przenieść je do nowej studzienki 6-dołkowej o niskiej przyczepności. Hodowla w inkubatorze w temperaturze 37 °C.
   UWAGA: Celem przeniesienia studzienki w dniu 1 jest zmniejszenie wpływu dużej liczby martwych komórek podczas procesu tworzenia EB, co może wpływać na stan wzrostu komórek.
8. Odświeżaj świeżą pożywkę A codziennie do 4 dnia (6 ml / dołek na płytce 6-dołkowej).
9. W dniu 4 należy pokryć 10-centymetrowe naczynie 3 ml 0,1% roztworu żelatyny rybnej przez co najmniej 1 godzinę w inkubatorze o stężeniu 5% CO₂ i temperaturze 37 °C.
   UWAGA: Jeśli czas powlekania jest krótszy niż 1 godzina, trudno jest wykonać następujące kroki.
10. Ostrożnie zebrać EB do 15 ml probówki odśrodkowej z pipetą 10 ml i poczekać, aż EB osiądną w ciągu 5 minut.
11. Usuń 0,1% roztwór żelatyny i opłucz naczynie o średnicy 10 cm 5-6 ml 1x DPBS. Usuń DPBS.
12. Delikatnie zawiesić EBs z 15 ml pożywki B (Tabela 1) w probówce odśrodkowej o pojemności 15 ml i przenieść je do powlekanej 10-centymetrowej szalki. Hodowla w inkubatorze o temperaturze 37 °C, 5% CO₂ przez 1 tydzień.
    UWAGA: W ciągu pierwszych 7 dni nie przesuwaj naczynia.
13. Odświeżaj świeżą pożywką B raz w tygodniu do 49 dnia (naczynie 15 ml/10 cm) i badaj komórki pod mikroskopem raz w tygodniu.
    UWAGA: Po 49 dniu w supernatancie w naczyniu hodowlanym można znaleźć kilka komórek wydzielniczych.
14. Odwirować komórki sklarowane nad osadem przy 200 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
15. Ostrożnie odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki z 2 ml świeżej pożywki B i przenieść do nowej studzienki o niskiej przyczepności na płytce 6-dołkowej. Inkubować w inkubatorze o stężeniu 5%_CO2 i temperaturze 37 °C.
    UWAGA: W ciągu najbliższych 7 dni nie przesuwaj płytki. Mikroglej może przylegać do dna studni o niskiej przyczepności.
16. W 56 dniu zastąp pożywką C (Tabela 1) (2 ml / dołek płytki 6-dołkowej). Mikroglej przylega do dna studzienki o niskiej przyczepności i pod mikroskopem będzie wyglądał na rozgałęziony.
    UWAGA: Zmieniając pożywkę C co 3 dni (2 ml / dołek na płytce 6-dołkowej), mikroglej można hodować w podłożu C przez około 15 dni.

2. Wytwarzanie ludzkich RO i współhodowla RO z mikroglejem

1. Hodowano hESC w pożywce z komórek macierzystych, aż gęstość komórek osiągnie 80%-90%. Wysiewaj co najmniej 1 x 10⁶ komórek w każdym dołku.
2. Dodać Dispazę (1 ml / dołek z płytki 6-dołkowej) do komórki hodowlanej. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 5 minut. Odessać roztwór Dispase ze studni.
3. Dodaj pożywkę D (Tabela 1) (1 ml / dołek z płytką 6-dołkową) do dołka. Pokrój komórkę na małe kawałki za pomocą pipety o pojemności 10 μl.
4. Delikatnie zbierz wszystkie kawałki komórek i pożywkę w probówce do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml.
5. Wirować przy 200 x g przez 5 minut i usunąć supernatant.
6. Delikatnie zawieś komórki w 200 μl zimnej matrycy. Przenieś probówkę do mikrowirówki 1,5 do inkubatora na 20 minut. Pracuj szybko, ponieważ matryca zestala się w temperaturze pokojowej (RT). Po 20 minutach w inkubatorze matryca zestala się.
7. Przygotuj 10-centymetrowe naczynie z 15 ml pożywki D. Ponownie zawiesić matrycę z pożywką D i delikatnie wstrząsnąć szalką Petriego.
8. Następnie umieść naczynie w inkubatorze na 5 dni. Nie przesuwaj płyty. Ustaw dzień jako dzień 0 (RO). Komórki przylegają w ciągu 3 dni.
9. W dniu 5 (RO) i dniu 10 (RO) odśwież pożywkę za pomocą Medium D.
10. W dniu 12 (RO) usuń pożywkę i dodaj 3 ml Dispase do każdego dania przez 5 minut.
11. Odessać Dyspazę i dodać 15 ml pożywki E (Tabela 1).
12. Zbiór mikrogleju: W 56 dniu (MG) delikatnie odessać pożywkę C, dodać Akutazę (1 ml/dołek z płytki 6-dołkowej) i inkubować w temperaturze 37 °C przez 3 minuty.
13. Zebrać komórki mikrogleju do probówki odśrodkowej o pojemności 15 ml z pipetą o pojemności 5 ml. Odwirować komórki przy 200 x g przy temperaturze pokojowej przez 5 min.
14. Delikatnie odessać supernatant i zawiesić mikroglej za pomocą 1 ml pożywki E. Dodać mikroglej do strawionych RO w dniu 12.
    UWAGA: W dniu 12 (RO) komórki są adhezyjne. W dniu 13 (RO) komórki znajdują się zawieszone w podłożu E. Jeśli podłoże zmieni kolor na żółty od dnia 12 (RO) do dnia 19 (ROs), odśwież podłoże za pomocą Medium E.
15. W dniu 19 (RO) agreguj organoidy do środka naczynia, delikatnie obracając płytkę. Delikatnie zassać Medium E i odświeżyć pożywkę za pomocą Medium F.
16. Przenieść organoidy z pożywką F do nowego naczynia do zawiesiny.
17. Zmieniaj pożywkę raz w tygodniu i wybieraj organoidy do eksperymentów.

Results

Procedura generowania organoidów siatkówki jest opisana w naszym poprzednim badaniu¹⁵. Tutaj pokazujemy reprezentatywne wyniki mikrogleju i kokultur mikrogleju oraz organoidów siatkówki.

Tutaj pokazujemy każdy etap różnicowania mikrogleju (Rysunek 1A). Dzień 0 reprezentuje etap hodowli komórek macierzystych. Następnie komórki macierzyste zostały strawione i wyhodowane w celu wytworzenia EB. W ciągu pierwszych 4 dni procesu komórki utworzą EB ( Rysunek 1B). Następnie przenosimy zawieszone EB do przylegających 10 cm naczyń. Po około 7 dniach komórki są podobne do tych pokazanych na Rysunek 1C. W miarę postępu hodowli komórki adherentne wydzielają hematopoetyczne komórki progenitorowe do supernatantu (Rysunek 1D). Proces ten trwa około 45 dni. W tym momencie komórki można pobrać z supernatantu i przenieść na płytki 6-dołkowe. W ciągu najbliższych 7 dni mikroglej stanie się dojrzały (Ryc. 1E) i będzie gotowy do dalszych eksperymentów.

W 12 dniu różnicowania organoidów siatkówki, przylegające komórki są trawione do hodowli zawiesinowej, a do organoidów siatkówki dodawane jest pożywka E zawierająca mikroglej. Mikroglej będzie migrował do organoidów siatkówki. Aby wyraźnie zaobserwować morfologię mikrogleju, dodaliśmy transfekcję EGFP-lentiwirusa do hESC, co spowodowało, że zróżnicowany mikroglej ekspresyjny GFP ma autofluorescencję (zielony) (Figura 2A-C). Zbadaliśmy również strukturę tkankową organoidów siatkówki hodowanych wspólnie z mikroglejem przy użyciu markera komórek fotoreceptora CRX i markera komórek mikrogleju IBA1 za pomocą testu immunofluorescencyjnego w organoidach siatkówki z mikroglejem po różnicowaniu przez 50 dni (Rysunek 2D).

Rysunek 1: Schemat ideowy i oś czasu komórki mikrogleju pochodzącej z hESC. (A) Protokół rozpoczyna się od rozmrożenia i pasażowania hESC na płytce 6-dołkowej. (B) Utworzone jednorodne EB zawierające pożywkę A. (C) EB przenosi się do powlekanego naczynia, a hematopoetyczne komórki progenitorowe powstają w dniach 4-56. (D,E) W dniu 56 supernatant z komórkami jest pobierany (D) i przenoszony na 6-dołkową płytkę o niskiej przyczepności, aby utworzyć mikroglej w dniu 63 (E). Podziałka skali: 500 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Reprezentatywne obrazy na osi czasu podczas wspólnej hodowli organoidów mikrogleju i siatkówki. (A) Reprezentatywne obrazy komórek mikrogleju pochodzące z EGFP-hESC. (B) Jednoczesna hodowla mikrogleju EGFP⁺ z organoidami siatkówki po różnicowaniu przez 18 dni. (C) Jednoczesna hodowla mikrogleju EGFP⁺ z organoidami siatkówki po różnicowaniu przez 30 dni. Podziałka: 300 μm. (D) CRX (marker komórek fotoreceptora; czerwony) i IBA1 (marker mikrogleju; zielony) użyto do wykrycia struktury tkankowej organoidów siatkówki hodowanych jednocześnie z mikroglejem po 50 dniach różnicowania. DAPI (niebieski) barwi jądro. Podziałka skali: 30 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Tabela 1: Skład mediów użytych w tym badaniu. Składniki wymagane do przygotowania 500 ml objętości każdej pożywki są wymienione w tabeli. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Discussion

Ze względu na ograniczoną dostępność ludzkiej siatkówki, nasze obecne zrozumienie reakcji zapalnych siatkówki pochodzi prawie z modeli zwierzęcych. Aby przezwyciężyć to ograniczenie, zróżnicowano organoidy siatkówki. Rozwój modeli organoidów siatkówki jest aktywnym obszarem badań, mających na celu podsumowanie złożoności ludzkiej siatkówki w celu modelowania chorób i rozwoju terapeutycznego. Kilka badań wykazało pomyślne wygenerowanie organoidów siatkówki z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych 1,2,12,13. Jednak większość z tych modeli nie uwzględnia obecności mikrogleju, o którym wiadomo, że odgrywa kluczową rolę w rozwoju siatkówki i patogenezie choroby. Ostatnie badania próbowały zintegrować mikroglej z organoidami siatkówki lub modelami organoidów mózgu 16,17,18, ale szczegółowa metoda jest niejasna. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy protokół krok po kroku dotyczący kohodowli mikrogleju z organoidami siatkówki we wczesnym stadium, które pochodzą z tej samej linii hESC. Podczas gdy niektóre badania badały rolę mikrogleju w chorobach siatkówki przy użyciu modeli zwierzęcych lub systemów hodowli komórkowych ^7,8,9, przedstawiony tutaj model kohodowli oferuje bardziej fizjologicznie istotny system oparty na człowieku do badania interakcji mikrogleju-siatkówki i ich implikacji w patogenezie choroby.

Krytycznymi etapami są stan komórkowy ludzkich komórek macierzystych oraz różnicowanie mikrogleju i organoidów siatkówki. Mikroglej i RO należy rozróżniać krok po kroku, a na różnych etapach należy stosować odpowiednie odczynniki i szalkę (naczynie poddane hodowli tkankowej lub naczynie zawiesinowe). Model ten może pomóc nam zrozumieć proces, w jaki sposób mikroglej przyczynia się do występowania chorób siatkówki. Ma to istotne implikacje dla przyszłych badań przesiewowych leków i badań nad mechanizmami choroby. Jednak metody, które obecnie publikujemy, nadal mają pewne ograniczenia. Ze względu na wydłużony okres różnicowania mikrogleju i brak odpowiednich metod kriokonserwacji, powinniśmy mądrze planować nasz czas na różnicowanie mikrogleju i organoidów siatkówki do kohodowli.

Oprócz organoidów siatkówki uważamy, że integracja komórek odpornościowych z innymi modelami organoidów może również sprzyjać rozwojowi organoidów. Dlatego kluczowe znaczenie ma testowanie innych układów organoidowych. Integracja różnych typów komórek i organoidów w celu utworzenia kompletnych narządów stanowi obiecujący model na przyszłość.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acctuase	Stemcell Technologies	07920
Advanced DMEM/F12	Thermo	12634-010
anty-CRX(M02)	abnova	H00001406-M02	; rozcieńczenie zgodnie z zaleceniami producenta
anty-IBA1	Abcam	ab5076	; rozcieńczenie zgodnie z instrukcjami producenta
B27	Life Technologie	17105-041
Dypaza (1U/ml)	Technologie komórek macierzystych	07923
DMEM basic	Gibco	10566-016
DMEM/F12	Gibco	10565-042
DPBS	Gibco	C141905005BT
EDTA	Thermo	15575020
F12	Gibco	11765-054
FBS	Przemysł biologiczny	04-002-1A
Żelatyna	Sigma	G7041-100G	Solid
Glutamax	Gibco	35050-061
H9 linia komórkowa	WiCell Research Institute
IL-3	RD Systems	203-IL-050
IL-34	PeproTech	200-34-50UG
KSR	Gibco	10828028
Matrix	Corning	356231
M-CSF	RD Systems	216-MC-500
MEM Nieistotny roztwór aminokwasów	Sigma	M7145
N2	Life Technologies	17502-048
Neurobasal	Gibco	21103-049
Pióro/paciorkowiec	Gibco	15140-122
Pożywka dla komórek macierzystych	Stemcell Technologies	5990
Tauryna	Sigma	T-8691-25G
X-ViVO	LONZA	04-418Q
Y27632	Selleck	S1049
β-merkaptoetanol	Life Technologies	21985-023