Artykuł metodologiczny

Składanie organoidów siatkówki z mikroglejem

2.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/67016

⸱

26 lipca 2024

 ,  , 
1Beijing Institute of Ophthalmology, Beijing Tongren Hospital, Capital Medical University

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Mikroglej to unikalne komórki odpornościowe rezydentne w siatkówce, odgrywające kluczową rolę w różnych chorobach zwyrodnieniowych siatkówki. Stworzenie modelu kohodowli organoidów siatkówki z mikroglejem może ułatwić lepsze zrozumienie patogenezy i postępów w rozwoju chorób siatkówki.

Streszczenie

Ze względu na ograniczony dostęp do ludzkiej siatkówki, organoidy siatkówki (RO) są najlepszym modelem do badania chorób siatkówki u ludzi, co może ujawnić mechanizm rozwoju siatkówki i występowanie chorób siatkówki. Mikroglej (MG) to unikalne makrofagi rezydujące w siatkówce i ośrodkowym układzie nerwowym (OUN), pełniące kluczowe funkcje odpornościowe. Jednak organoidy siatkówki nie mają mikrogleju, ponieważ ich źródłem różnicowania jest woreczek żółtkowy. Specyficzna patogeneza mikrogleju w tych chorobach siatkówki pozostaje niejasna; Dlatego konieczne okazuje się stworzenie modelu organoidu siatkówki z udziałem mikrogleju. W tym przypadku udało nam się skonstruować model współhodowlany organoidów siatkówki z mikroglejem pochodzącym z ludzkich komórek macierzystych. W tym artykule rozróżniliśmy mikroglej, a następnie wspólnie wyhodowaliśmy go z organoidami siatkówki we wczesnym stadium. Jako inkorporacja komórek odpornościowych, model ten zapewnia zoptymalizowaną platformę do modelowania chorób siatkówki i badań przesiewowych leków, aby ułatwić dogłębne badania nad patogenezą i leczeniem chorób siatkówki i chorób związanych z OUN.

Wprowadzenie

Jako ograniczone źródło ludzkiej siatkówki, różnicowanie ludzkich komórek macierzystych w trójwymiarowe (3D) organoidy siatkówki stanowi obiecujący model in vitro do symulacji siatkówki1. Zawiera różne typy komórek w siatkówce, w tym fotoreceptory, komórki zwojowe siatkówki, komórki dwubiegunowe, komórki Müllera, komórki poziome i astrocyty2. Model ten umożliwia emulację i badanie zarówno mechanizmów rozwoju siatkówki, jak i patogenezy chorób siatkówki. Jednak ze względu na metodę różnicowania kierunkowego, organoidy siatkówki pochodziły z neuroektodermy3, bez wielu innych typów komórek pochodzących z różnych listków rozrodczych, takich jak mikroglej z woreczka żółtkowego i komórki okołonaczyniowe z mezodermy4,5,6.

Obecnie udowodniono, że wiele chorób siatkówki, takich jak barwnikowe zwyrodnienie siatkówki7, jaskra8, oraz retinoblastoma9, są ściśle związane z mikroglejem w siatkówce. Jednak ze względu na brak odpowiednich modeli badawczych konkretne mechanizmy ilustrujące związek między mikroglejem a tymi chorobami nadal pozostają niejasne. Podczas gdy myszy służyły jako korzystny model do badania chorób siatkówki, ostatnie badania wykazały znaczące różnice między mysim a ludzkim mikroglejem pod względem długości życia, tempa proliferacji i braku ludzkich genów homologicznych10,11. Odkrycia te sugerują, że wnioski wyciągnięte z modeli mysich mogą nie być w pełni wiarygodne, co podkreśla znaczenie konstruowania ludzkich organoidów siatkówki zawierających mikroglej.

W ciągu ostatnich kilku dekad opracowano różne metody różnicowania 3D organoidów siatkówki12,13. Aby ułatwić kohodowlę mikrogleju w organoidach siatkówki, wybraliśmy metodę różnicowania polegającą na przejściu od hodowli przylegającej do zawiesiny. Takie podejście z powodzeniem umożliwia włączenie mikrogleju do organoidów siatkówki, utrzymując je przez co najmniej 60 dni14.

Protokół

To badanie zostało zatwierdzone przez Instytucjonalną Komisję Etyki Szpitala Tongren w Pekinie, Stołecznego Uniwersytetu Medycznego. Linia komórkowa H9 HESC pochodziła z Instytutu Badawczego WiCell. Przed eksperymentem należy wstępnie podgrzać pożywkę do hodowli komórkowych w temperaturze pokojowej (RT) przez 30 minut.

1. Wytwarzanie ludzkiego mikrogleju

  1. Hoduj hESC w pożywce dla komórek macierzystych, aż gęstość komórek osiągnie 80%-90%. Wysiewaj co najmniej 1 x 106 komórek w każdym dołku.
  2. Odessać pożywkę z komórkami macierzystymi i przepłukać komórki 1x DPBS (1 ml / dołek z płytką 6-dołkową). Następny krok wymaga 2 x 107-1 x 108 komórek. Jeśli to nie wystarczy, połącz komórki z 2-5 dołków, aby wykonać następujące czynności.
  3. Oddzielić kolonie komórek macierzystych za pomocą 0,5 mM roztworu EDTA przez około 5 minut w inkubatorze o temperaturze 37 °C (1 ml / dołek na płytce 6-dołkowej).
  4. Sprawdź morfologię kolonii po 5 minutach. Kiedy krawędzie kolonii są lekko zwinięte z luźnymi przerwami, komórki są gotowe do różnicowania i aspiracji EDTA. Jeśli nie, inkubować komórki w temperaturze 37 °C przez kolejne 1-2 minuty. Nie inkubować dłużej niż 8 minut.
  5. Delikatnie przepłukać komórki w każdym dołku za pomocą 6 ml pożywki A (Tabela 1) z 6 μl 10 mM roztworu inhibitora ROCK Y-27632. Delikatnie postukaj w dno naczynia, aby wypłukać komórki. Ustaw dzień jako dzień 0.
    UWAGA: Nie pipetuj komórek. Następnego dnia komórki utworzą ciała zarodkowe (EB).
  6. Po 24 godzinach obserwuj komórki pod mikroskopem, aby potwierdzić tworzenie się EB. Zebrać EB do 15 ml probówki odśrodkowej z pipetą o pojemności 10 ml i poczekać, aż EB osiądną na dnie w ciągu 5 minut.
  7. Ostrożnie odessać supernatant i ponownie zawiesić EB za pomocą 6 ml świeżego podłoża A i przenieść je do nowej studzienki 6-dołkowej o niskiej przyczepności. Hodowla w inkubatorze w temperaturze 37 °C.
    UWAGA: Celem przeniesienia studzienki w dniu 1 jest zmniejszenie wpływu dużej liczby martwych komórek podczas procesu tworzenia EB, co może wpływać na stan wzrostu komórek.
  8. Odświeżaj świeżą pożywkę A codziennie do 4 dnia (6 ml / dołek na płytce 6-dołkowej).
  9. W dniu 4 należy pokryć 10-centymetrowe naczynie 3 ml 0,1% roztworu żelatyny rybnej przez co najmniej 1 godzinę w inkubatorze o stężeniu 5% CO2 i temperaturze 37 °C.
    UWAGA: Jeśli czas powlekania jest krótszy niż 1 godzina, trudno jest wykonać następujące kroki.
  10. Ostrożnie zebrać EB do 15 ml probówki odśrodkowej z pipetą 10 ml i poczekać, aż EB osiądną w ciągu 5 minut.
  11. Usuń 0,1% roztwór żelatyny i opłucz naczynie o średnicy 10 cm 5-6 ml 1x DPBS. Usuń DPBS.
  12. Delikatnie zawiesić EBs z 15 ml pożywki B (Tabela 1) w probówce odśrodkowej o pojemności 15 ml i przenieść je do powlekanej 10-centymetrowej szalki. Hodowla w inkubatorze o temperaturze 37 °C, 5% CO2 przez 1 tydzień.
    UWAGA: W ciągu pierwszych 7 dni nie przesuwaj naczynia.
  13. Odświeżaj świeżą pożywką B raz w tygodniu do 49 dnia (naczynie 15 ml/10 cm) i badaj komórki pod mikroskopem raz w tygodniu.
    UWAGA: Po 49 dniu w supernatancie w naczyniu hodowlanym można znaleźć kilka komórek wydzielniczych.
  14. Odwirować komórki sklarowane nad osadem przy 200 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
  15. Ostrożnie odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki z 2 ml świeżej pożywki B i przenieść do nowej studzienki o niskiej przyczepności na płytce 6-dołkowej. Inkubować w inkubatorze o stężeniu 5%CO2 i temperaturze 37 °C.
    UWAGA: W ciągu najbliższych 7 dni nie przesuwaj płytki. Mikroglej może przylegać do dna studni o niskiej przyczepności.
  16. W 56 dniu zastąp pożywką C (Tabela 1) (2 ml / dołek płytki 6-dołkowej). Mikroglej przylega do dna studzienki o niskiej przyczepności i pod mikroskopem będzie wyglądał na rozgałęziony.
    UWAGA: Zmieniając pożywkę C co 3 dni (2 ml / dołek na płytce 6-dołkowej), mikroglej można hodować w podłożu C przez około 15 dni.

2. Wytwarzanie ludzkich RO i współhodowla RO z mikroglejem

  1. Hodowano hESC w pożywce z komórek macierzystych, aż gęstość komórek osiągnie 80%-90%. Wysiewaj co najmniej 1 x 106 komórek w każdym dołku.
  2. Dodać Dispazę (1 ml / dołek z płytki 6-dołkowej) do komórki hodowlanej. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 5 minut. Odessać roztwór Dispase ze studni.
  3. Dodaj pożywkę D (Tabela 1) (1 ml / dołek z płytką 6-dołkową) do dołka. Pokrój komórkę na małe kawałki za pomocą pipety o pojemności 10 μl.
  4. Delikatnie zbierz wszystkie kawałki komórek i pożywkę w probówce do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml.
  5. Wirować przy 200 x g przez 5 minut i usunąć supernatant.
  6. Delikatnie zawieś komórki w 200 μl zimnej matrycy. Przenieś probówkę do mikrowirówki 1,5 do inkubatora na 20 minut. Pracuj szybko, ponieważ matryca zestala się w temperaturze pokojowej (RT). Po 20 minutach w inkubatorze matryca zestala się.
  7. Przygotuj 10-centymetrowe naczynie z 15 ml pożywki D. Ponownie zawiesić matrycę z pożywką D i delikatnie wstrząsnąć szalką Petriego.
  8. Następnie umieść naczynie w inkubatorze na 5 dni. Nie przesuwaj płyty. Ustaw dzień jako dzień 0 (RO). Komórki przylegają w ciągu 3 dni.
  9. W dniu 5 (RO) i dniu 10 (RO) odśwież pożywkę za pomocą Medium D.
  10. W dniu 12 (RO) usuń pożywkę i dodaj 3 ml Dispase do każdego dania przez 5 minut.
  11. Odessać Dyspazę i dodać 15 ml pożywki E (Tabela 1).
  12. Zbiór mikrogleju: W 56 dniu (MG) delikatnie odessać pożywkę C, dodać Akutazę (1 ml/dołek z płytki 6-dołkowej) i inkubować w temperaturze 37 °C przez 3 minuty.
  13. Zebrać komórki mikrogleju do probówki odśrodkowej o pojemności 15 ml z pipetą o pojemności 5 ml. Odwirować komórki przy 200 x g przy temperaturze pokojowej przez 5 min.
  14. Delikatnie odessać supernatant i zawiesić mikroglej za pomocą 1 ml pożywki E. Dodać mikroglej do strawionych RO w dniu 12.
    UWAGA: W dniu 12 (RO) komórki są adhezyjne. W dniu 13 (RO) komórki znajdują się zawieszone w podłożu E. Jeśli podłoże zmieni kolor na żółty od dnia 12 (RO) do dnia 19 (ROs), odśwież podłoże za pomocą Medium E.
  15. W dniu 19 (RO) agreguj organoidy do środka naczynia, delikatnie obracając płytkę. Delikatnie zassać Medium E i odświeżyć pożywkę za pomocą Medium F.
  16. Przenieść organoidy z pożywką F do nowego naczynia do zawiesiny.
  17. Zmieniaj pożywkę raz w tygodniu i wybieraj organoidy do eksperymentów.

Wyniki

Procedura generowania organoidów siatkówki została opisana w naszej poprzedniej pracy15. Poniżej przedstawiamy reprezentatywne wyniki dla mikrogleju oraz kokultury mikrogleju z organoidami siatkówki.

W niniejszej pracy przedstawiamy każdy etap różnicowania mikrogleju (Rysunek 1A). Dzień 0 reprezentuje etap hodowli komórek macierzystych. Następnie komórki macierzyste poddano trawieniu i hodowli w celu formowania ciał embroidalnych (EB). W ciągu pierwszych 4 dni procesu komórki formują EB (Rysunek 1B). Następnie zawiesinę EB przenosimy na adherentne szalki 10 cm. Po około 7 dniach komórki przypominają te przedstawione na Rysunku 1C. W miarę postępu hodowli komórki adherentne wydzielają progenitorów hematopoetycznych do nadsączu (Rysunek 1D). Proces ten trwa około 45 dni. Na tym etapie komórki można zebrać z nadsączu i przenieść na płytki 6-dołkowe. W ciągu kolejnych 7 dni mikroglej dojrzeje (Rysunek 1E) i będzie gotowy do dalszych doświadczeń.

W 12. dniu różnicowania organoidów siatkówki komórki adherentne poddaje się trawieniu w celu uzyskania hodowli zawiesinowej, a następnie do organoidów siatkówki dodaje się Medium E zawierające mikroglej. Mikroglej migruje do wnętrza organoidów siatkówki. Aby wyraźnie zaobserwować morfologię mikrogleju, przeprowadzono transfekcję hESC lentiwirusem EGFP, dzięki czemu zróżnicowany mikroglej wykazuje ekspresję GFP i autofluorescencję (zieloną) (Rysunek 2A-C). Zbadzano również strukturę tkankową organoidów siatkówki współhodowanych z mikroglejem, wykorzystując marker fotoreceptorów CRX oraz marker mikrogleju IBA1 w analizie immunofluorescencyjnej organoidów siatkówki z mikroglejem po 50 dniach różnicowania (Rysunek 2D).

Schemat procesu różnicowania komórek macierzystych; hESC do mikrogleju z wymianą pośrodków w ciągu 63 dni.
Rysunek 1: Schemat i oś czasu powstawania komórek mikrogleju pochodzących z hESC. (A) Protokół rozpoczyna się od rozmrożenia i pasażowania hESC w płytce 6-dołkowej. (B) Tworzenie jednorodnych ciał embrioidalnych (EB) w obecności Medium A. (C) EB są przenoszone do powlekanej płytki, a w dniach 4–56 tworzą się progenitorzy hematopoetyczne. (D, E) W 56. dniu pobiera się supernatant z komórkami (D) i przenosi go do 6-dołkowej płytki o niskiej adhezji, aby w 63. dniu uzyskać mikroglej (E). Pasek skali: 500 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Eksperyment różnicowania komórek; mikroskopia fluorescencyjna EGFP; analiza organoidów, porównanie wyników.
Rycina 2: Reprezentatywne obrazy w czasie trwania współhodowli mikrogleju i organoidów siatkówki. (A) Reprezentatywne obrazy komórek mikrogleju pochodzących z EGFP-hESC. (B) Współhodowla mikrogleju EGFP+ z organoidami siatkówki po 18 dniach różnicowania. (C) Współhodowla mikrogleju EGFP+ z organoidami siatkówki po 30 dniach różnicowania. Pasek skali: 300 µm. (D) Do wykrycia struktury tkankowej organoidów siatkówki współhodowanych z mikroglejem po 50 dniach różnicowania zastosowano CRX (marker komórek fotoreceptorowych; czerwony) i IBA1 (marker mikrogleju; zielony). DAPI (niebieski) barwi jądra komórkowe. Pasek skali: 30 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Tabela 1: Skład pożywek użytych w niniejszym badaniu.W tabeli wymieniono składniki niezbędne do przygotowania 500 mL każdej z pożywek. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Dyskusja

Ze względu na ograniczoną dostępność ludzkiej siatkówki, nasze obecne zrozumienie reakcji zapalnych siatkówki pochodzi prawie z modeli zwierzęcych. Aby przezwyciężyć to ograniczenie, zróżnicowano organoidy siatkówki. Rozwój modeli organoidów siatkówki jest aktywnym obszarem badań, mających na celu podsumowanie złożoności ludzkiej siatkówki w celu modelowania chorób i rozwoju terapeutycznego. Kilka badań wykazało pomyślne wygenerowanie organoidów siatkówki z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych 1,2,12,13. Jednak większość z tych modeli nie uwzględnia obecności mikrogleju, o którym wiadomo, że odgrywa kluczową rolę w rozwoju siatkówki i patogenezie choroby. Ostatnie badania próbowały zintegrować mikroglej z organoidami siatkówki lub modelami organoidów mózgu 16,17,18, ale szczegółowa metoda jest niejasna. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy protokół krok po kroku dotyczący kohodowli mikrogleju z organoidami siatkówki we wczesnym stadium, które pochodzą z tej samej linii hESC. Podczas gdy niektóre badania badały rolę mikrogleju w chorobach siatkówki przy użyciu modeli zwierzęcych lub systemów hodowli komórkowych 7,8,9, przedstawiony tutaj model kohodowli oferuje bardziej fizjologicznie istotny system oparty na człowieku do badania interakcji mikrogleju-siatkówki i ich implikacji w patogenezie choroby.

Krytycznymi etapami są stan komórkowy ludzkich komórek macierzystych oraz różnicowanie mikrogleju i organoidów siatkówki. Mikroglej i RO należy rozróżniać krok po kroku, a na różnych etapach należy stosować odpowiednie odczynniki i szalkę (naczynie poddane hodowli tkankowej lub naczynie zawiesinowe). Model ten może pomóc nam zrozumieć proces, w jaki sposób mikroglej przyczynia się do występowania chorób siatkówki. Ma to istotne implikacje dla przyszłych badań przesiewowych leków i badań nad mechanizmami choroby. Jednak metody, które obecnie publikujemy, nadal mają pewne ograniczenia. Ze względu na wydłużony okres różnicowania mikrogleju i brak odpowiednich metod kriokonserwacji, powinniśmy mądrze planować nasz czas na różnicowanie mikrogleju i organoidów siatkówki do kohodowli.

Oprócz organoidów siatkówki uważamy, że integracja komórek odpornościowych z innymi modelami organoidów może również sprzyjać rozwojowi organoidów. Dlatego kluczowe znaczenie ma testowanie innych układów organoidowych. Integracja różnych typów komórek i organoidów w celu utworzenia kompletnych narządów stanowi obiecujący model na przyszłość.

Oświadczenia

Autorzy nie są świadomi żadnych powiązań, członkostwa, grantów ani udziałów finansowych, które mogłyby wpłynąć na obiektywność tego badania.

Podziękowania

To badanie jest wspierane przez Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (82101145) oraz Pekińską Fundację Nauk Przyrodniczych (Z200014).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
AcctuaseStemcell Technologies07920
Advanced DMEM/F12Thermo12634-010
anty-CRX(M02)abnovaH00001406-M02; rozcieńczenie zgodnie z zaleceniami producenta
anty-IBA1Abcamab5076; rozcieńczenie zgodnie z instrukcjami producenta
B27Life Technologie17105-041
Dypaza (1U/ml)Technologie komórek macierzystych07923
DMEM basicGibco10566-016
DMEM/F12Gibco10565-042
DPBSGibcoC141905005BT
EDTAThermo15575020
F12Gibco11765-054
FBSPrzemysł biologiczny04-002-1A
ŻelatynaSigmaG7041-100GSolid
GlutamaxGibco35050-061
H9 linia komórkowaWiCell Research Institute
IL-3RD Systems 203-IL-050
IL-34PeproTech200-34-50UG
KSRGibco10828028
MatrixCorning356231
M-CSFRD Systems 216-MC-500 
MEM Nieistotny roztwór aminokwasówSigmaM7145
N2Life Technologies17502-048
NeurobasalGibco21103-049
Pióro/paciorkowiecGibco15140-122
Pożywka dla komórek macierzystych Stemcell Technologies5990
TaurynaSigmaT-8691-25G
X-ViVOLONZA04-418Q
Y27632SelleckS1049
β-merkaptoetanolLife Technologies21985-023
PrzeciwciałoPrzeciwciało

Bibliografia

  1. Cowan, C. S., et al. Cell types of the human retina and its organoids at single-cell resolution. Cell. 182 (6), 1623-1640.e34 (2020).
  2. Zhang, X., Jin, Z. B. Directed induction of retinal organoids from human pluripotent stem cells. J Vis Exp. (170), e62298(2021).
  3. Eiraku, M., et al. Self-organizing optic-cup morphogenesis in three-dimensional culture. Nature. 472 (7341), 51-56 (2011).
  4. Ginhoux, F., et al. Fate mapping analysis reveals that adult microglia derive from primitive macrophages. Science. 330 (6005), 841-845 (2010).
  5. Kierdorf, K., et al. Microglia emerge from erythromyeloid precursors via pu.1- and irf8-dependent pathways. Nat Neurosci. 16 (3), 273-280 (2013).
  6. Schulz, C., et al. A lineage of myeloid cells independent of myb and hematopoietic stem cells. Science. 336 (6077), 86-90 (2012).
  7. O'koren, E. G., et al. Microglial function is distinct in different anatomical locations during retinal homeostasis and degeneration. Immunity. 50 (3), 723-737.e7 (2019).
  8. Margeta, M. A., et al. Apolipoprotein E4 impairs the response of neurodegenerative retinal microglia and prevents neuronal loss in glaucoma. Immunity. 55 (9), 1627-1644.e7 (2022).
  9. Xu, J., et al. Enhanced innate responses in microglia derived from retinoblastoma patient-specific IPSCs. Glia. 72 (5), 872-884 (2024).
  10. Gosselin, D., et al. An environment-dependent transcriptional network specifies human microglia identity. Science. 356 (6344), eaal3222(2017).
  11. Galatro, T. F., et al. Transcriptomic analysis of purified human cortical microglia reveals age-associated changes. Nat Neurosci. 20 (8), 1162-1171 (2017).
  12. Nakano, T., et al. Self-formation of optic cups and storable stratified neural retina from human ESCs. Cell Stem Cell. 10 (6), 771-785 (2012).
  13. Kim, S., et al. transcriptome profiling, and functional validation of cone-rich human retinal organoids. Proc Natl Acad Sci U S A. 116 (22), 10824-10833 (2019).
  14. Gao, M. L., et al. Functional microglia derived from human pluripotent stem cells empower retinal organ. Sci China Life Sci. 65 (6), 1057-1071 (2022).
  15. Zhang, X., Jin, Z. B. Reconstruct human retinoblastoma in vitro. J Vis Exp. (188), e62629(2022).
  16. Park, D. S., et al. IPS-cell-derived microglia promote brain organoid maturation via cholesterol transfer. Nature. 623 (7986), 397-405 (2023).
  17. Usui-Ouchi, A., et al. Integrating human ipsc-derived macrophage progenitors into retinal organoids to generate a mature retinal microglial niche. Glia. 71 (10), 2372-2382 (2023).
  18. Chichagova, V., et al. Incorporating microglia-like cells in human induced pluripotent stem cell-derived retinal organoids. J Cell Mol Med. 27 (3), 435-445 (2023).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Włączanie mikroglejuludzkie komórki macierzystemodel kokulturymodelowanie chorób siatkówkiróżnicowanie mikroglejuanaliza immunofluorescencyjnamarker fotoreceptorówmarker mikroglejuośrodkowy układ nerwowy
Składanie organoidów siatkówki z mikroglejem
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.