Artykuł metodologiczny

Dwukolorowa korelacyjna mikroskopia świetlna i elektronowa do wizualizacji interakcji między mitochondriami a lizosomami

DOI:

10.3791/67020

⸱

27 września 2024

 , 
1Neural circuit research group, Korea Brain Research Institute

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół opisuje mechanizm użycia światła korelacyjnego i mikroskopii elektronowej do wizualizacji interakcji mitochondriów i lizosomów znakowanych odpowiednio mEosEM i APEX2.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Organelle komórkowe, takie jak mitochondria i lizosomy, wykazują dynamiczne struktury. Pomimo wyższej rozdzielczości transmisyjnej mikroskopii elektronowej do analizy strukturalnej, mikroskopia świetlna jest niezbędna do wizualizacji dynamicznych organelli poprzez znakowanie specyficzne dla celu. Poniższy protokół opisuje metodę, która łączy dwukolorową korelacyjną mikroskopię świetlną i mikroskopię elektronową (CLEM) w celu obserwacji interakcji między mitochondriami a lizosomami. W tym badaniu mitochondria oznaczono mEosEM (Mito-mEosEM), a lizosomy TMEM192-V5-APEX2. Wyniki uzyskane z obrazów CLEM pozwalają na obserwację zmian w oddziaływaniach między mitochondriami a lizosomami w warunkach stresu zewnętrznego. Leczenie bafilomycyną (BFA), która hamuje funkcję lizosomów, spowodowało zwiększenie kontaktu między mitochondriami a lizosomami, co doprowadziło do powstania rozdrobnionych mitochondriów uwięzionych w lizosomach. I odwrotnie, leczenie U18666A, które hamuje eksport cholesterolu z lizosomów, spowodowało, że lizosomy zostały otoczone mitochondriami, co wskazuje na odrębną formę interakcji. W pracy przedstawiono skuteczną metodę obserwacji interakcji między mitochondriami a lizosomami w komórkach stałych. Co więcej, obrazowanie CLEM za pomocą dwukolorowych sond stanowi potężne narzędzie do przyszłych badań dynamiki organelli i ich implikacji dla funkcji komórek i patologii.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mitochondria i lizosomy to główne organelle związane z błoną, które są niezbędne do utrzymania homeostazy komórkowej. Mitochondria to wysoce dynamiczne organelle komórkowe modulowane przez zdarzenia rozszczepienia i fuzji1. Ogólnie rzecz biorąc, mitochondria są określane jako elektrownia komórki i są znane ze swojej ważnej roli w fosforylacji oksydacyjnej, produkcji ATP i magazynowaniu metabolitów, takich jak calcium2. Oprócz swojej roli w metabolizmie energetycznym, mitochondria biorą udział w wielu innych procesach sygnalizacji komórkowej, w tym w apoptozie3,4, sygnalizacji wapniowej5,6 i metabolizmie lipidów7,8. Podobnie, lizosomy są wysoce dynamicznymi organellami komórkowymi, które odgrywają wiele ról jako centra recyklingu komórkowego w celu utrzymania czystości komórkowej poprzez degradację białek, autofagię, endocytozę i fagocytozę9. Oprócz roli w degradacji, lizosomy odgrywają również role w fizjologii komórkowej, takie jak wykrywanie składników odżywczych, homeostaza10, metabolizm lipidów11 i dedyferencjacja komórkowa12.

Pomimo istnienia licznych badań nad funkcjami poszczególnych organelli komórkowych, nasze ostatnie badania skupiły się na mniej zrozumiałym wzajemnym oddziaływaniu między mitochondriami a lizosomami, co jak wykazano, wpływa zarówno na fizjologię komórkową, jak i patologię. Kontakty między mitochondriami a lizosomami zaobserwowano w różnych typach komórek, w tym w komórkach rakowych, neuronach i komórkach pochodzących z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC)13, i są one głównie obserwowane pod wpływem stresu komórkowego lub w chorobach neurodegeneracyjnych, takich jak choroba Parkinsona13,14 i choroba Charcota-Marie-Tootha15. Kontakt między mitochondriami a lizosomami odgrywa ważną rolę w utrzymaniu homeostazy metabolicznej poprzez wymianę jonów (np. Ca2+)16, cholesterol17, a iron18 między dwoma organellami. Ponadto kontakt między mitochondriami a lizosomami odgrywa kluczową rolę w kontroli jakości organelli komórkowych. Na przykład uszkodzone mitochondria mogą być ukierunkowane na degradację w procesie mitofagii, w którym są pochłaniane przez autofagosomy i dostarczane do lizosomów w celu degradacji. W związku z tym usunięcie dysfunkcyjnych mitochondriów może być ułatwione, zanim spowodują one dalsze uszkodzenia komórki lub normalnych mitochondriów. Ta interakcja między mitochondriami a lizosomami ma kluczowe znaczenie dla utrzymania homeostazy komórkowej i zapobiegania gromadzeniu się dysfunkcyjnych organelli. W ten sposób tylko uszkodzone mitochondria są selektywnie usuwane, umożliwiając zdrowemu mitochondriom optymalne funkcjonowanie w komórce.

Korelacyjna mikroskopia świetlna i elektronowa (CLEM) to technika obrazowania, która ostatnio zyskała uwagę jako metoda badawcza, łącząc zalety mikroskopii świetlnej (LM) i mikroskopii elektronowej (EM) w celu dostarczenia szczegółowych informacji strukturalnych w różnych skalach. W CLEM próbka jest najpierw obrazowana za pomocą LM w celu zidentyfikowania określonych obszarów zainteresowania, a następnie następuje etapy przygotowania próbki EM, takie jak utrwalanie, odwadnianie i osadzanie. Ta sama próbka jest następnie obserwowana pod mikroskopem elektronowym. Chociaż ostatnio opisano metody CLEM z żywymi komórkami19,20,21,22, dokładne połączenie obrazów optycznych wysoce dynamicznych próbek biologicznych z obrazami mikroskopii elektronowej nieruchomych komórek w jednej płaszczyźnie pozostaje wyzwaniem. W przypadku wysoce dynamicznych organelli, takich jak mitochondria i lizosomy, ich dokładna lokalizacja może się zmieniać, gdy są obserwowane na żywo pod mikroskopem świetlnym i nadal się poruszają nawet podczas krótkiego czasu opóźnienia wymaganego do utrwalenia.

Dlatego w tym protokole, dwa różne znaczniki molekularne, które pozostają aktywne nawet w roztworach utrwalających, zostały użyte do wizualizacji interakcji między mitochondriami a lizosomami, które odgrywają ważną rolę w utrzymaniu homeostazy metabolicznej poprzez wymianę jonów (np. Ca2+)16, cholesterol17, oraz iron18 między tymi organellami. Konstrukty TMEM192-V5-APEX2 i Mito-mEosEM wykorzystano do obserwacji interakcji mitochondriów i lizosomów w hodowanych komórkach zarówno na poziomie EM, jak i LM. W przypadku mitochondriów znacznik mEosEM został wybrany ze względu na jego zdolność do zachowania sygnału fluorescencji podczas przygotowywania próbki EM w roztworze utrwalającym i OsO423. W przypadku lizosomów znacznik APEX2, białko o masie około 28 kDa, wykorzystano do zbadania lokalizacji określonego białka zarówno na poziomie EM, jak i LM24. W obecności nadtlenku wodoru, substrat APEX2, Amplex-Red, tworzy nierozpuszczalny polimer, który można zaobserwować za pomocą mikroskopii konfokalnej w miejscu docelowym znacznika. W tym protokole dwukolorowy CLEM został wykorzystany do wizualizacji struktury interakcji między lizosomami a mitochondriami w stałych komórkach.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przebieg pracy krok po kroku dla przygotowania próbki jest pokazany w Rysunek 1.

1. Hodowla komórkowa i transfekcja

  1. Hodować komórki HeLa o gęstości 1 × 105 komórek na szklanych szalkach hodowlanych o średnicy 35 mm z siatką, zawierających DMEM, z 10% płodową surowicą bydlęcą i 100 U/ml penicyliny i streptomycyny w temperaturze 37 °C.
  2. Dzień po wysianiu komórek należy przeprowadzić transfekcję komórek przy 30%-40% konfluencji z plazmidami TMEM192-V5-APEX2 i Mito-mEosEM za pomocą odczynnika do transfekcji zgodnie z instrukcjami producenta (po 1 μg plazmidowego DNA TMEM192-V5-APEX2 i Mito-mEosEM z 3 μl odczynnika do transfekcji). Po transfekcji potraktuj komórki DMSO lub U18666A (2 μg/ml) i bafilomycyną A1 (100 nM) przez 18 godzin.

2. Konfokalne obrazowanie mikroskopowe

  1. Po potraktowaniu komórek bafilomycyną i U18666A przez 18 godzin, usunąć pożywkę hodowlaną i natychmiast dodać 250 μl ciepłego (30 °C-37 °C) roztworu utrwalającego (2,5% aldehydu glutarowego i 2% paraformaldehydu w 0,1 M roztworze kakodylanu sodu [pH 7,0]) przez delikatne pipetowanie. Natychmiast usunąć utrwalacz, zastąpić go 1,5 ml świeżego utrwalacza i inkubować na lodzie przez 30 minut. Następnie myj komórki przez 3 x 10 minut w 1 ml lodowatego 0,1 M buforu kakodylanu sodu.
    UWAGA: Opary aldehydu są toksyczne. Wszystkie eksperymenty powinny być przeprowadzane w wentylowanym dygestorium.
  2. Dodać 1 ml zimnego 20 mM roztworu glicyny w celu ugaszenia aldehydu i inkubować na lodzie przez 10 minut. Przemyć 3 x 10 min w zimnym 0,1 M buforze kakodylanu sodu.
  3. Przygotować świeży roztwór zawierający 300 μM Amplex-Red, dodając 10 mM H2O2 do 0,1 M roztworu kakodylanu. Dodać 500 μl roztworu Amplex-Red do naczynia na próbkę i inkubować przez 5 minut na lodzie.
  4. Usunąć roztwór Amplex-Red i przepłukać 3 x 10 minut 0,1 M buforem kakodylanu sodu.
  5. Po barwieniu Amplex-Red użyj mikroskopu konfokalnego, aby zobrazować obszar wokół interesujących komórek w trybie skanowania kafelków 3 x 3. Uchwyć zarówno różnicowy kontrast interferencyjny (DIC), jak i sygnał fluorescencyjny, aby zidentyfikować i zarejestrować siatkę i litery na czaszy siatki za pomocą obiektywu 40x (lub 60x).
    UWAGA: Te obrazy poglądowe służą jako mapa do identyfikacji określonych komórek docelowych w próbkach osadzonych w plastiku.
  6. Zobrazuj komórki docelowe w dużym powiększeniu za pomocą obiektywu 40x (lub 60x) i uzyskaj obraz Z-stack.
    UWAGA: Ten obraz w dużym powiększeniu jest nakładany na obraz z mikroskopu elektronowego w celu utworzenia obrazu korelacyjnego.

3. Przygotowanie próbki do bloku EM

  1. Po obrazowaniu LM dodać 1 ml 1% zredukowanego tetratlenku osmu (przygotowanego przez zawartość 3% żelazocyjanku potasu w 0,3 M buforze kakodylowym o równej objętości 2% wodnego roztworu tetratlenku osmu) w celu końcowego utrwalenia w temperaturze 4 °C przez 1 godzinę, a następnie płukać przez 3 x 10 minut wodą destylowaną o temperaturze 4 °C.
    UWAGA: Opary tetratlenku osmu są toksyczne. Wszystkie eksperymenty powinny być wykonywane w wentylowanym dygestorium.
  2. Płukać 3 x 10 minut wodą destylowaną o temperaturze pokojowej, a następnie odwadniać w sortowanym etanolu przez 15 minut za każdym razem (50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 100% i 100%) w temperaturze pokojowej.
  3. Wymieszaj etanol z żywicą epoksydową w proporcjach objętościowych 3:1, 1:1 i 1:3, przygotowując łącznie 300 μl każdej mieszanki. Wlej każdą żywicę epoksydową do naczynia, pozwalając jej inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę. Następnie użyj 100% żywicy epoksydowej do impregnacji przez noc.
  4. Przygotuj kapsułkę do zatapiania lub probówkę do PCR, wypełniając ją świeżą żywicą epoksydową, umieść probówkę lub kapsułkę do góry nogami w obszarze zainteresowania i umieść w piekarniku w temperaturze 60 °C na 48 godzin w celu polimeryzacji.

4. Przekroje i obrazowanie TEM

  1. Po całkowitej polimeryzacji żywicy epoksydowej należy oddzielić dolne szkło od bloku polimerowego, zanurzając je w ciekłym azocie.
  2. Umieść blok próbki w uchwycie na próbkę ultramikrotomu i umieść go w bloku przycinania. Użyj żyletki, aby przyciąć żywicę do kształtu trapezowego lub prostokątnego wokół interesującego obiektu.
  3. Umieść przycięty blok próbki w uchwycie na próbkę i wyreguluj tarczę diamentową. Upewnij się, że krawędź przednia bloku próbki jest idealnie równoległa do krawędzi tarczy diamentowej.
  4. Za pomocą ultramikrotomu wytnij ultracienkie odcinki około 60-70 nm od płasko osadzonych komórek. Zbierz sekcje szeregowe na siatce szczelinowej pokrytej formvarem i wysusz je na płycie grzejnej.
  5. Zabarwić skrawek barwnikiem kontrastowym przez 2 minuty i cytrynianem ołowiu przez 1 minutę.
  6. Umieścić siatkę w uchwycie na próbkę TEM w celu obserwacji. Zidentyfikuj komórkę docelową zainteresowania na podstawie obrazu DIC z mikroskopu świetlnego. Zobrazuj cały obszar komórki za pomocą kafelkowych, nakładających się obrazów w powiększeniu 1,700x.

5. Łączenie obrazów za pomocą imageJ Fidżi.

  1. Aby rozpocząć zszywanie obrazów, uruchom imageJ Fiji25 i kliknij Plik | Nowość | TrakEM2 (pusty) | Wybierz folder przechowywania, aby utworzyć nowy projekt TrakEM226 (Rysunek 2A1).
  2. Otwórz zestaw danych obrazu kafelka, przeciągając i upuszczając nieprzetworzone dane obrazu kafelka do obszaru roboczego (Rysunek 2A2).
  3. Kliknij prawym przyciskiem myszy i wybierz Wyrównaj | Montaż wszystkich obrazów w tej warstwie | sprężysty (nieliniowe korespondencje blokowe), a następnie kliknij przycisk OK, aby zaakceptować wartości domyślne pozostałych parametrów (Rysunek 2A3).
  4. Kliknij prawym przyciskiem myszy i wybierz Eksportuj | Utwórz płaski obraz, aby utworzyć zszyty obraz, a następnie kliknij Plik | Zapisz jako, aby zapisać obraz.

6. Zmiana rozmiaru obrazu fluorescencji

  1. Otwórz oprogramowanie do powiększania zdjęć (patrz Spis materiałów). Kliknij Plik | Otwórz i wybierz obraz fluorescencyjny.
  2. Wprowadź szerokość i wysokość tak, aby miały taki sam rozmiar jak obraz z mikroskopu elektronowego, a następnie wybierz algorytm, który ma zostać zastosowany w metodzie zmiany rozmiaru ( Rysunek 2B1).
  3. Kliknij Plik | Zapisz jako, aby zapisać obraz o zmienionym rozmiarze.

7. Rejestracja obrazu na podstawie punktów orientacyjnych za pomocą wtyczki Big Warp

  1. Otwórz ImageJ Fiji i przeciągnij i upuść mikrofotografię fluorescencyjną o zmienionym rozmiarze (obraz FM) oraz zszytą mikrofotografię elektronową (obraz EM).
  2. Kliknij Wtyczki | Przeglądarka BigData | Big Wrap, aby rozpocząć rejestrację, a następnie kliknij menu rozwijane, aby wybrać obraz FM jako ruchomy obraz i obraz EM jako obraz docelowy (Rysunek 2C1).
    UWAGA: Każdy obraz FM i EM będzie miał trzy nowe wyskakujące okienka (ruchomy obraz BigWrap, stały obraz BigWrap i punkty orientacyjne) do wyświetlania punktów orientacyjnych.
  3. Porównaj obrazy FM i EM za pomocą takich funkcji, jak powiększanie (kółko myszy), obracanie obrazu (poruszanie myszą przy przytrzymaniu lewego przycisku) i poruszanie (poruszanie myszą przy przytrzymaniu prawego przycisku), a następnie naciśnij spację na klawiaturze, aby włączyć tryb punktu orientacyjnego, a następnie naciśnij lewy przycisk myszy, aby zaznaczyć co najmniej trzy punkty orientacyjne zidentyfikowane na obrazach FM i EM ( Rysunek 2C2, różowe kropki i czerwona strzałka).
  4. Po zaznaczeniu wszystkich zidentyfikowanych punktów orientacyjnych przejdź do punktu menu Plik | Eksport ruchomego obrazu | OK i pojawi się nowe wyskakujące okienko z przekształconym obrazem FM (Rysunek 2C3).
    UWAGA: Nowo utworzone wyskakujące okienko to obraz FM przekształcony na podstawie punktu orientacyjnego. Przejrzyj wyrównanie i w razie potrzeby wprowadź poprawki, dodając lub modyfikując punkty orientacyjne i ponownie obliczając transformację.
  5. Kliknij Plik | Zapisz jako, aby zapisać przekształcony obraz FM.

8. Nakładanie obrazów CLEM

  1. W ImageJ przeciągnij i upuść przekształcony obraz FM oraz zszyty obraz EM.
  2. Kliknij na Obrazek | Rodzaj | Kolor 8-bitowy, aby ustawić ten sam typ obrazu zarówno dla obrazów LM, jak i EM (Rysunek 2D1).
    UWAGA: Obraz EM musi być konwertowany dwukrotnie w następującej kolejności: 8-bit -> RGB Color -> 8-bit Color.
  3. Kliknij na Obrazek | Kolor >| Scal kanały, aby połączyć obrazy w obraz kompozytowy, wybierając odpowiednio obrazy FM i EM z menu rozwijanego ( Rysunek 2D2).
  4. Kliknij Plik | Zapisz jako, aby zapisać obraz CLEM.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aby zobrazować interakcje między mitochondriami a lizosomami za pomocą tego dwukolorowego protokołu CLEM, użyliśmy Mito-mEosEM i TMEM192-V5-APEX2. Stałe komórki zostały najpierw zobrazowane za pomocą mikroskopu świetlnego, a następnie pobrano próbki EM i zobrazowano. Wyniki skorelowanych obrazów są pokazane w Rysunek 3A,B i Rysunek 4A. Postępując zgodnie z opisanym powyżej protokołem, sprawdziliśmy, czy możemy zaobserwować zmiany w interakcji między mitochondriami a lizosomami pod wpływem stresu zewnętrznego.

Leczenie komórek BFA, lizosomalnym inhibitorem V-ATPazy, hamuje autofagię, co skutkuje obniżeniem jakości mitochondriów i zwiększonymi interakcjami między mitochondriami a lizosomami27. W komórkach traktowanych BFA zaobserwowaliśmy mitochondria uwięzione w lizosomach (Figura 3B), w porównaniu z komórkami kontrolnymi traktowanymi DMSO (Figura 3A). Chociaż trudno jest rozróżnić pofragmentowane mitochondria o dużej gęstości elektronów i przedziały komórkowe w lizosomach na samych mikrofotografiach elektronowych, można je łatwo odróżnić na skorelowanych obrazach (Rysunek 3B1,B2). Struktura zakłóceń mitochondrialnych (Rysunek 3A1,A2; niebieska strzałka) obserwowana w mitochondriach komórek traktowanych DMSO nie jest związana z lizosomami, a struktura na obrazie fluorescencyjnym, która wydaje się być lizosomem uwięzionym w dużym mitochondrium, jest strukturą, w której mitochondrium otacza lizosom (Figura 3A2; czerwona strzałka).

Następnie przetestowaliśmy działanie U18666A (2 μg/ml przez 18 h), dobrze znanego inhibitora NPC1, który blokuje ruch cholesterolu z lizosomów28. Komórki leczone U18666A wykazywały zwiększoną bezpośrednią interakcję między mitochondriami a lizosomami (Ryc. 4). Ponadto kontakty między mitochondriami a lizosomami w próbkach poddanych działaniu U18666A różniły się od tych w próbkach poddanych działaniu BFA. W komórkach HeLa traktowanych BFA rozdrobniony mitochondrium jest całkowicie uwięziony w lizosomie, wcześniej opisanej morfologii mitofagii12,29. Jednak w grupie leczonej U18666A niektóre z TMEM192-dodatnich lizosomów wydają się być pochłonięte przez mitochondrium ( Rysunek 4D,E)30,31.

figure-results-1
Rysunek 1: Schematyczny przegląd CLEM opartego na TEM przy użyciu genetycznie znakowanej sondy fluorescencyjnej. (A) Komórki HeLa hodowano w 35-milimetrowych szklanych szalkach hodowlanych z siatką. (B) Utrwalone komórki znakowano Amplex-Red przez białko APEX2. (C) Obrazy fluorescencyjne uzyskano za pomocą mikroskopu konfokalnego. Zmotoryzowany stolik i funkcja skanowania kafelków zostały wykorzystane do przechwycenia dużego obrazu przeglądowego i obrazu komórki docelowej w wysokiej rozdzielczości. Duży obraz służy jako mapa nawigacyjna do identyfikacji lokalizacji komórki docelowej w próbkach osadzonych w plastiku. (D) Kontynuuj osadzanie po utrwaleniu i odwodnieniu. (E) Osadzanie odbywało się za pomocą probówki do PCR lub kapsułki BEEM wypełnionej żywicą nad komórką docelową na szkiełku nakrywkowym. (F) Po polimeryzacji żywicy, usunięcie szkiełka nakrywkowego pozostawiło nadrukowany wzór siatki na dolnej powierzchni bloku. (G) Komórka docelowa została zidentyfikowana na podstawie wzoru odciśniętego na powierzchni żywicy, a komórka docelowa została podzielona na sekcje o grubości około 60 nm za pomocą ultramikrotomu. (H) Sekcje szeregowe zostały zebrane na miedzianej siatce szczelinowej pokrytej formvarem. (I) Siatki zostały zobrazowane za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej. Skróty: TEM = transmisyjna mikroskopia elektronowa; CLEM = korelacyjny mikroskop świetlny i elektronowy; ROI = obszar zainteresowania. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Przetwarzanie obrazu i generowanie obrazu CLEM za pomocą imageJ Fiji. (A1) Główny graficzny interfejs użytkownika Fiji i TrakEM2. (A2) Import zestawu danych obrazu kafelka uzyskanego za pomocą TEM w powiększeniu 1 700x. (A3) Wyrównanie i przykład zszytego obrazu przy użyciu metody wyrównywania obrazu TrakeEM2. (B1-B3) Konwersja małego mikroskopu świetlnego na duże obrazy o wysokiej jakości za pomocą oprogramowania do powiększania zdjęć. (C1-C3) Przepływ pracy do rejestracji obrazów z mikroskopii świetlnej i obrazów z mikroskopii elektronowej za pomocą oprogramowania wtykowego Big Wrap. (D1-D3) Proces nakładania przekształconego obrazu FM i obrazu EM w celu syntezy skorelowanego obrazu mikroskopowego. Skróty: TEM = transmisyjna mikroskopia elektronowa; CLEM = korelacyjny mikroskop świetlny i elektronowy; FM = mikroskopia fluorescencyjna. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3: Obrazy CLEM mitochondrialnych i lizosomalnych miejsc kontaktu leczonych bafilomycyną A1 lub bez niej. Komórki HeLa były współtransfekowane Mito-mEosEM (mitochondria; zielony) i TMEM192-APEX2 (lizosomy; czerwone), a następnie barwione barwnikiem Amplex-Red. (A) Nieleczone komórki HeLa. Informacje molekularne z sygnału fluorescencyjnego (lewy panel) i informacje ultrastrukturalne uzyskane przez TEM (panel środkowy) nałożono na siebie (prawy panel) w oparciu o sygnał mitochondrialny i morfologię. (A1,A2) W nieleczonych komórkach HeLa wewnętrzna błona mitochondrialna jest zakłócona (niebieska strzałka) lub mitochondria i lizosomy znajdują się bardzo blisko siebie (czerwona strzałka). (B1,B2) W komórkach HeLa traktowanych bafilomycyną A1 przez 18 godzin zaobserwowano mitofagię, charakteryzującą się uwięzieniem niezdegradowanych mitochondriów w lizosomach (zielona strzałka). Podziałka = 1 μm (A1,A2,B1,B2). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rysunek 4: Obrazy CLEM mitochondrialnych i lizosomalnych miejsc kontaktu potraktowanych U18666A (A) Dwukolorowe obrazy CLEM komórek Mito-mEosEM i TMEM192-V5-APEX2 (znakowanych Amplex-Red) pod U18666A traktowaniem (2 μg/ml przez 18 godzin). (A1,A2) Czerwone strzałki wskazują miejsca kontaktu między mitochondriami a lizosomami. Paski skali = 1 μm. (B1-B3,C1-C3) Czerwona strzałka wskazuje pojawienie się fuzji międzyorganelli między mitochondriami a lizosomami za pomocą obrazów seryjnych. Podziałka = 500 nm (B1-B3). Podziałka = 1 μm (C1-C3). (D,E) Obrazy TEM w dużym powiększeniu miejsc fuzji między mitochondriami a lizosomami. Pseudokolory służą do rozróżnienia mitochondrium (zielony) i lizosomu (czerwony). Podziałka liniowa = 100 nm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół ten opisuje dwukolorowy CLEM do obserwacji interakcji mitochondriów i lizosomów w stałych komórkach za pomocą genetycznie kodowanych znaczników mEosEM i APEX2. W ciągu ostatnich kilku dekad postępy w mikroskopii znacznie poprawiły zdolność do obserwowania zmian w sieciach organelli32,33, a badanie interakcji organelli staje się coraz bardziej interesujące. Mikroskopia superrozdzielcza została wykorzystana do obserwacji zmian w wysoce dynamicznych kontaktach między mitochondriami a lizosomami 34,35,36. Jednak pomimo zastosowania mikroskopii superrozdzielczej trudno jest odróżnić zmiany grubości wewnętrznej i zewnętrznej błony mitochondrialnej (ok. 22 nm) oraz połączeń grzebieniowych (ok. 28 nm)37. Transmisyjna mikroskopia elektronowa ma tę zaletę, że umożliwia obserwację struktury próbek biologicznych w bardzo wysokiej rozdzielczości, ale ma tę wadę, że obrazy można oglądać tylko w czerni i bieli, co utrudnia rozróżnienie organelli na złożonych obrazach. W naszym protokole zastosowaliśmy metodę CLEM, która łączy zalety mikroskopii świetlnej i elektronowej do monitorowania interakcji dwóch różnych organelli poprzez barwienie ich różnymi kolorami. W szczególności dwukolorowy CLEM jest nieocenionym narzędziem do obserwacji i analizy mitofagii, procesu degradacji mitochondriów w lizosomach, jak pokazano na rysunku 3.

Obrazowanie żywych komórek jest zwykle wykonywane w warunkach fizjologicznych, co umożliwia naukowcom obserwację dynamicznych procesów komórkowych w czasie rzeczywistym. Jednak techniki mikroskopii elektronowej często wymagają czasochłonnych procedur przygotowania próbki, w tym utrwalania i barwienia. Opóźnienie czasowe między obrazowaniem żywych komórek a przygotowaniem próbki za pomocą mikroskopii elektronowej ogranicza rozdzielczość czasową techniki i może skutkować potencjalnie pominiętymi dynamicznymi zdarzeniami komórkowymi. Aby przezwyciężyć ograniczenia CLEM z żywymi komórkami, opracowaliśmy dwukolorową metodę CLEM, w której sonda mEosEM23 i barwnik chemiczny (Amplex-Red) są barwione enzymem znakowania zbliżeniowego APEX238 bez utraty sygnału fluorescencji nawet w trudnych warunkach utrwalających. W poprzednim badaniu CLEM na żywych komórkach39 stwierdzono rozbieżności między sygnałami fluorescencji a obrazami EM ze względu na problemy z rozdzielczością czasową w próbkowaniu TEM po obrazowaniu żywych komórek i ograniczenia techniczne w przygotowaniu próbki. Jednak uzyskując obrazy fluorescencyjne nieruchomych komórek przez wystarczająco długi czas (obrazowanie z-stack całych komórek w dużym powiększeniu), możemy rozwiązać problem rozdzielczości czasowej i poprawić korelację między obrazami LM i EM (ryc. 3 i ryc. 4).

Innym kluczowym czynnikiem wpływającym na pomyślne wyniki CLEM jest to, jak dokładnie zarejestrować obraz LM z obrazem EM. Aby to zrobić, najpierw zastosowaliśmy kombinację trybów obrazowania DIC i fluorescencji podczas obrazowania za pomocą mikroskopii świetlnej, aby stworzyć mapę nawigacyjną wokół komórek docelowych. Korzystając z tej mapy nawigacyjnej, mogliśmy łatwo zidentyfikować interesujące nas komórki na ultramikrotomie i TEM. Po drugie, pozyskując obrazy całych komórek na kafelkach TEM w dużym powiększeniu, byliśmy w stanie uzyskać wiele punktów orientacyjnych, które można było wykorzystać do rejestracji obrazu. Z naszego doświadczenia wynika, że im większa liczba punktów orientacyjnych, tym lepsza dokładność wyrównania obrazów LM i EM we wtyczce Big Warp.

W tym badaniu pokazaliśmy domeny interakcji lizosomów i mitochondriów z wynikami CLEM o wysokiej rozdzielczości. Ponadto dwukolorowa sonda pozwoliła na precyzyjne rozróżnienie mitochondriów i lizosomów. Ta metoda ma jednak pewne ograniczenia. Po pierwsze, jeśli czas reakcji podczas proksymalnego znakowania Amplex-Red przez enzym APEX2 jest zbyt długi, Amplex-Red będzie dyfundować i barwić się szerzej niż docelowe położenie białka38. Po drugie, grubość (objętość w osi z) obszaru, w którym lizosom jest pochłonięty w mitochondriach, jest dość mała, więc nie można określić fuzji dwóch błon organelli w odcinku szeregowym o grubości 50 nm. Ponadto poważnym wyzwaniem jest dokładne ustawienie osi Z przekroju optycznego za pomocą mikroskopu świetlnego i przekroju mechanicznego za pomocą ultramikrotomu. Aby przezwyciężyć te ograniczenia, dwukolorowy CLEM może być stosowany w połączeniu z konwencjonalną tomografią elektronową40 lub objętością sekcji szeregowej CLEM41.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To badanie było wspierane przez podstawowy program badawczy KBRI przez Korea Brain Research Institute finansowany przez Ministerstwo Nauki i ICT (24-BR-01-03). Plazmidy TMEM192-V5-APEX2 zostały dostarczone dzięki uprzejmości Hyun-Woo Rhee (Seoul National University). Dane TEM uzyskano w Brain Research Core Facilities w KBRI.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Chemikalia i odczynniki
25% Aldehyd glutarowyMikroskopia elektronowa Sciences16200Opary aldehydu są niezwykle toksyczne. Stosować tylko w dygestorium.
30% roztwór nadtlenku wodoruMerck107210
4% roztwór paraformaldehyduBiosesangPC2031-100-00są niezwykle toksyczne. Stosować tylko w dygestorium.
Amplex RedThermoFisherA12222
Epon 812Mikroskopia elektronowa Nauki14120
EtanolMerck100983
Fugene HDPromegaE2311Transfekcja plazmidu
GlicynaSIGMAG8898
Cytrynian ołowiu 3%Mikroskopia elektronowa Nauki22410
Tetratlenek osmu 4 % roztwór wodnyMikroskopia elektronowa Nauki16320Bardzo toksyczny. Stosować tylko w dygestorium.
Heksacyjanożelazian(II) potasu trójwodny SIGMAP3289
Kakodylan sodu trójwodnySigma-AldrichC0250-500G
Octan uranyluMikroskopia elektronowa Sciences22400
Barwienie EM UranyLessMikroskopia elektronowa Nauki22409
Budowa plazmidu
Mito-mEosEMaddgene132706DOI:  10.1016/j.chembiol.2024.02.007
TMEM192-V5-APEX2Sharma N.  i wsp.Nie dotyczyDOI:  10.1016/j.chembiol.2024.02.007
Tools
0,22 um Filtr strzykawkowySartorius16534
35 mm Naczynie nakrywkowe z kratkąMattekP35G-1.5-14-CGRD BEEM
Kapsułki do zatapianiaTed Pella130
Obsługiwane formvar Siatka miedziana z pojedynczym gniazdemTed Pella01705
Nóż diamentowyDiATOMEDU4530
UltramikrotomLeicaARTOS 3D
mikroskopy
Odwrócona mikroskopia konfokalnaNikonA1 Rsi/Ti-E
Transmisyjna mikroskopia elektronowaFEITecnai G2
Software i Algorytmy
Fiji/Image JNIH / open sourcehttps://imagej.nih.gov/ij/
Pakiet oprogramowania ImageJ BigWarpNIH / open source
https://imagej.net/plugins/bigwarp Photozoom Pro 8 BenVistahttps://www.benvista.com/photozoompro

Alternatywne oprogramowanie
Image Resizer : https://imageresizer.com/
Gigapixel AI : https://www.topazlabs.com/gigapixel
ON1 zmień rozmiar : https://www.on1.com/products/resize-ai/
Opary ldehydu

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Giacomello, M., Pyakurel, A., Glytsou, C., Scorrano, L. The cell biology of mitochondrial membrane dynamics. Nat Rev Mol Cell Biol. 21 (4), 204-224 (2020).
  2. Spinelli, J. B., Haigis, M. C. The multifaceted contributions of mitochondria to cellular metabolism. Nat Cell Biol. 20 (7), 745-754 (2018).
  3. Lopez, J., Tait, S. W. G. Mitochondrial apoptosis: Killing cancer using the enemy within. Br J Cancer. 112 (6), 957-962 (2015).
  4. Wang, C., Youle, R. J. The role of mitochondria in apoptosis*. Annu Rev Genet. 43, 95-118 (2009).
  5. Rossi, A., Pizzo, P., Filadi, R. Calcium, mitochondria and cell metabolism: A functional triangle in bioenergetics. Biochim Biophys Acta Mol Cell Res. 1866 (7), 1068-1078 (2019).
  6. Giorgi, C., Marchi, S., Pinton, P. The machineries, regulation and cellular functions of mitochondrial calcium. Nat Rev Mol Cell Biol. 19 (11), 713-730 (2018).
  7. Talari, N. K., et al. Lipid-droplet associated mitochondria promote fatty-acid oxidation through a distinct bioenergetic pattern in male wistar rats. Nat Commun. 14 (1), 766(2023).
  8. Enkler, L., et al. Arf1 coordinates fatty acid metabolism and mitochondrial homeostasis. Nat Cell Biol. 25 (8), 1157-1172 (2023).
  9. Trivedi, P. C., Bartlett, J. J., Pulinilkunnil, T. Lysosomal biology and function: Modern view of cellular debris bin. Cells. 9 (5), 1131(2020).
  10. Mony, V. K., Benjamin, S., O'Rourke, E. J. A lysosome-centered view of nutrient homeostasis. Autophagy. 12 (4), 619-631 (2016).
  11. Thelen, A. M., Zoncu, R. Emerging roles for the lysosome in lipid metabolism. Trends Cell Biol. 27 (11), 833-850 (2017).
  12. Ma, X., et al. Mitochondria-lysosome-related organelles mediate mitochondrial clearance during cellular dedifferentiation. Cell Rep. 42 (10), 113291(2023).
  13. Kim, S., Wong, Y. C., Gao, F., Krainc, D. Dysregulation of mitochondria-lysosome contacts by gba1 dysfunction in dopaminergic neuronal models of Parkinson's disease. Nat Commun. 12 (1), 1807(2021).
  14. Pickrell, A. M., Youle, R. J. The roles of pink1, parkin, and mitochondrial fidelity in parkinson's disease. Neuron. 85 (2), 257-273 (2015).
  15. Wong, Y. C., Peng, W., Krainc, D. Lysosomal regulation of inter-mitochondrial contact fate and motility in charcot-marie-tooth type 2. Dev Cell. 50 (3), 339-354.e4 (2019).
  16. Peng, W., Wong, Y. C., Krainc, D. Mitochondria-lysosome contacts regulate mitochondrial Ca(2+) dynamics via lysosomal trpml1. Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (32), 19266-19275 (2020).
  17. Juhl, A. D., et al. Quantitative imaging of membrane contact sites for sterol transfer between endo-lysosomes and mitochondria in living cells. Sci Rep. 11 (1), 8927(2021).
  18. Khalil, S., et al. A specialized pathway for erythroid iron delivery through lysosomal trafficking of transferrin receptor 2. Blood Adv. 1 (15), 1181-1194 (2017).
  19. Russell, M. R., et al. 3d correlative light and electron microscopy of cultured cells using serial blockface scanning electron microscopy. J Cell Sci. 130 (1), 278-291 (2017).
  20. Van Rijnsoever, C., Oorschot, V., Klumperman, J. Correlative light-electron microscopy (clem) combining live-cell imaging and immunolabeling of ultrathin cryosections. Nat Methods. 5 (11), 973-980 (2008).
  21. Loginov, S. V., et al. Correlative organelle microscopy: Fluorescence guided volume electron microscopy of intracellular processes. Front Cell Dev Biol. 10, 829545(2022).
  22. De Beer, M., et al. Visualizing biological tissues: A multiscale workflow from live imaging to 3D cryo-CLEM. Microscopy and Microanalysis. 27 (S2), 11-12 (2021).
  23. Fu, Z., et al. Meosem withstands osmium staining and epon embedding for super-resolution clem. Nat Methods. 17 (1), 55-58 (2020).
  24. Lam, S. S., et al. Directed evolution of apex2 for electron microscopy and proximity labeling. Nat Methods. 12 (1), 51-54 (2015).
  25. Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  26. Cardona, A., et al. Trakem2 software for neural circuit reconstruction. PLoS One. 7 (6), e38011(2012).
  27. Redmann, M., et al. Inhibition of autophagy with bafilomycin and chloroquine decreases mitochondrial quality and bioenergetic function in primary neurons. Redox Biol. 11, 73-81 (2017).
  28. Lu, F., et al. Identification of npc1 as the target of u18666a, an inhibitor of lysosomal cholesterol export and ebola infection. eLife. 4, e12177(2015).
  29. Jung, M., Choi, H., Mun, J. Y. The autophagy research in electron microscopy. Appl Microsc. 49 (1), 11(2019).
  30. Hao, T., et al. Hypoxia-reprogramed megamitochondrion contacts and engulfs lysosome to mediate mitochondrial self-digestion. Nat Commun. 14 (1), 4105(2023).
  31. Hoglinger, D., et al. Npc1 regulates ER contacts with endocytic organelles to mediate cholesterol egress. Nat Commun. 10 (1), 4276(2019).
  32. Jung, M., Mun, J. Y. Mitochondria and endoplasmic reticulum imaging by correlative light and volume electron microscopy. J Vis Exp. (149), e59750(2019).
  33. Ohta, K., Hirashima, S., Miyazono, Y., Togo, A., Nakamura, K. I. Correlation of organelle dynamics between light microscopic live imaging and electron microscopic 3d architecture using fib-sem. Microscopy (Oxf). 70 (2), 161-170 (2021).
  34. Wang, H., et al. Lysosome-targeted biosensor for the super-resolution imaging of lysosome-mitochondrion interaction. Front Pharmacol. 13, 865173(2022).
  35. Chen, Q., et al. Quantitative analysis of interactive behavior of mitochondria and lysosomes using structured illumination microscopy. bioRxiv. , (2018).
  36. Wong, Y. C., Ysselstein, D., Krainc, D. Mitochondria-lysosome contacts regulate mitochondrial fission via rab7 gtp hydrolysis. Nature. 554 (7692), 382-386 (2018).
  37. Perkins, G., et al. Electron tomography of neuronal mitochondria: Three-dimensional structure and organization of cristae and membrane contacts. J Struc Biol. 119 (3), 260-272 (1997).
  38. Sharma, N., Jung, M., Mishra, P. K., Mun, J. Y., Rhee, H. -W. Flex: Genetically encodable enzymatic fluorescence signal amplification using engineered peroxidase. Cell Chem Biol. 31 (3), 502-513.e506 (2024).
  39. Jung, M., Choi, H., Kim, J., Mun, J. Y. Correlative light and transmission electron microscopy showed details of mitophagy by mitochondria quality control in propionic acid treated sh-sy5y cell. Materials (Basel). 13 (19), (2020).
  40. Mourik, M. J., et al. Methods Cell Biol. Müller-Reichert, T., Verkade, P. 124, Academic Press. 71-92 (2014).
  41. Hegermann, J., et al. Volume-clem: A method for correlative light and electron microscopy in three dimensions. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 317 (6), L778-L784 (2019).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Correlative Light MicroscopyMitochondria Lysosome InteractionDual Color CLEMOrganelle DynamicsConfocal MicroscopyTransmission Electron MicroscopyHeLa CellsMitochondrial Quality ControlOrganelle Labeling

Powiązane artykuły