Połączenie obrazowania i elektrofizjologii w celu wizualizacji i rejestrowania rozprzestrzeniających się depolaryzacji u myszy

Podsumowanie

Ten protokół demonstruje połączenie obrazowania i elektrofizjologii w celu niezawodnego wykrywania rozprzestrzeniających się depolaryzacji u dorosłych myszy po łagodnym urazowym uszkodzeniu mózgu.

Streszczenie

Rozprzestrzenianie depolaryzacji (SDs) to masowe zdarzenia w mózgu, które często pozostają niewykryte ze względu na ich powolne rozprzestrzenianie się przez istotę szarą. Ponieważ detekcja SD może być nieuchwytna, jest optymalnie potwierdzana przy użyciu wielu metod. Protokół ten opisuje metody łączenia obrazowania i elektrofizjologii w celu wykrywania SD w sposób, który większość laboratoriów może niezawodnie i łatwo zastosować. SD występują po urazowych urazach mózgu, udarze, krwotokach podpajęczynówkowych, niedokrwieniu i aurze migrenowej. Historycznie rzecz biorąc, SD były rejestrowane przy użyciu wzmacniaczy prądu stałego, które mogą rozwiązać powolne przesunięcie zewnątrzkomórkowe i depresję aktywności o wysokiej częstotliwości. Jednak wzmacniacze prądu stałego są prawie niemożliwe do użycia w przypadku przewlekłych nagrań in vivo. Protokół ten wykorzystuje wspólny wzmacniacz prądu przemiennego do zapisów elektrofizjologii in vivo w celu potwierdzenia depresji wysokiej częstotliwości, wraz z nieinwazyjnym obrazowaniem niezbędnym do wykrycia rozchodzącej się fali SD. Metody te mogą być wiarygodnie stosowane i/lub modyfikowane dla większości podejść eksperymentalnych w celu potwierdzenia obecności lub braku SD po uszkodzeniu mózgu.

Wprowadzenie

Rozprzestrzenianie depolaryzacji (SDs) jest związane z różnymi schorzeniami neurologicznymi, w tym urazowym uszkodzeniem mózgu (TBI), udarem, krwotokami podpajęczynówkowymi, niedokrwieniem i aurą migrenową¹. SD są zaangażowane w postęp uszkodzeń tkanek w udarach i TBIs². Dokładny mechanizm leżący u podstaw postępu utraty tkanek pozostaje niejasny^3,4. Jednak SD występują, gdy wymagania metaboliczne neuronów nie są zaspokajane przez wystarczającą ilość tlenu i glukozy, ponieważ funkcja zależnej od ATP pompy sodowo-potasowej staje się niewystarczająca do utrzymania gradientów jonów. Aby zrozumieć rolę SD w utracie tkanek, potrzebne są precyzyjne techniki ich pomiaru i badania, co ma kluczowe znaczenie dla postępu wiedzy naukowej. SD są istotnymi zdarzeniami neurologicznymi, które często mogą pozostać niewykryte ze względu na ograniczenia projektu eksperymentu i/lub oprzyrządowania.

Rola rozprzestrzeniania się depolaryzacji (SDs) w postępie urazów jest obecnie wyjaśniana, ale ich rola w łagodnych urazowych uszkodzeniach mózgu (mTBI) pozostaje niejasna. Ostatnie badania z wykorzystaniem technik opisanych w tym manuskrypcie wykazały, że SD są inicjowane w modelach myszy mTBI z zamkniętą czaszką, nawet jeśli nie ma jawnego uszkodzenia tkanek lub krwawienia^{5, 6}. Badania te sugerują, że SD mogą przyczyniać się do ostrych zaburzeń neurologicznych i zapalenia nerwów. Dodatkowo, obecność SD indukowanych przez mTBI jest ściśle związana z ostrymi deficytami behawioralnymi^6,7. W związku z tym jest prawdopodobne, że SD są inicjowane we wszystkich modelach TBI, ale ich rola pozostaje trudna do ustalenia bez potwierdzenia. Potwierdzenie obecności SD ma kluczowe znaczenie dla dokładnej oceny wyników mTBI.

Rozprzestrzenianie się depolaryzacji (SDs) jest identyfikowane przez znaczny spadek potencjału zewnątrzkomórkowego, znany jako "przesunięcie DC", oraz przez depresję aktywności o wysokiej częstotliwości⁸. Rozwiązanie "przesunięcia DC" zwykle trwa sekundy (~10 s)⁹. Aby uchwycić "przesunięcie DC", wymagany jest wzmacniacz prądu stałego i elektrody ze srebrnym drutem. Jednak elektrofizjologia in vivo jest zwykle wykonywana za pomocą wzmacniaczy prądu przemiennego, które są zaprojektowane do filtrowania zdarzeń o niskiej częstotliwości w celu zmniejszenia artefaktów ruchu. Niestety, to filtrowanie niskich częstotliwości usuwa również "przesunięcie DC". Dodatkowo srebro jest toksyczne i nie nadaje się do przewlekłych nagrań. Powszechnie stosowane wzmacniacze prądu przemiennego mogą wykrywać depresję aktywności o wysokiej częstotliwości, ale bez towarzyszącego jej "przesunięcia DC" potwierdzenie obecności SD jest trudne.

Depolaryzacja rozprzestrzeniania się (SDs) może być również wykrywana za pomocą różnych technik obrazowania. Najczęściej SD są obrazowane za pomocą laserowego obrazowania z kontrastem plamkowym, które mierzy przepływ krwi przez nienaruszoną czaszkę¹⁰. SD znacząco wpływają na unaczynienie mózgu i przepływ krwi. U większości gatunków innych niż myszy, SD indukują rozchodzącą się falę hiperperfuzji, która przemieszcza się wraz z krawędzią natarcia klasy SD11. SD mogą być również obrazowane za pomocą wskaźników fluorescencyjnych wapnia lub glutaminianu¹², choć wymaga to obciążenia tkanki barwnikami lub genetycznie zakodowanymi wskaźnikami fluorescencyjnymi^12,13. Co ciekawe, SD można zaobserwować gołym okiem dzięki wewnętrznym sygnałom optycznym (iOS) powiązanym z klasą SD14. iOS to złożone sygnały złożone z cząsteczek autofluorescencyjnych, takich jak NAD(P)H i FADH^15,16, obrzęk tkanek¹⁷ i potencjalne zmiany w przepływie krwi w mózgu. Pomimo swojej złożoności, sygnały iOS są niezawodne i mogą być przechwytywane przez myszy typu dzikiego¹⁸. Protokół ten opisuje metodę obrazowania iOS, ponieważ technikę tę można wdrożyć w dowolnym laboratorium bez konieczności stosowania specjalistycznych wirusów lub zwierząt transgenicznych.

Ogólnym celem tej metody jest eksperymentalne potwierdzenie obecności lub braku rozprzestrzeniającej się depolaryzacji (SD) po łagodnym urazowym uszkodzeniu mózgu (mTBI) za pomocą jednoczesnego obrazowania i elektrofizjologii. Powszechnie stosowaną techniką jest elektrofizjologia in vivo, wspomagana przez zaawansowane wzmacniacze. Jednak wzmacniacze te nie są w stanie wykryć charakterystycznego "przesunięcia DC". Dlatego techniki obrazowania, opisane w tym protokole, są stosowane w celu pewnego potwierdzenia obecności lub braku SD. Zaletą połączenia obrazowania i elektrofizjologii jest to, że obrazowanie może wykryć propagację SD, podczas gdy elektrofizjologia może zidentyfikować związaną z tym depresję o wysokiej częstotliwości.

Ogólnie rzecz biorąc, ta metoda jest odpowiednia do badania obecności rozprzestrzeniających się depolaryzacji (SD) po urazowym uszkodzeniu mózgu (TBI). Jego zastosowanie może przyczynić się do lepszego zrozumienia funkcji sieci korowej po TBI i SDs. Protokół ten można dostosować z modelu uderzenia zamkniętej czaszki do innych modeli, takich jak kontrolowane uderzenie korowe, płynna stymulacja lub spadek ciężaru. Wdrożenie tego protokołu w wielu laboratoriach może wyjaśnić rolę SD w przypadku różnych nasileń TBI. Można użyć dowolnego ustalonego modelu TBI, a następnie wykonać procedury obrazowania i elektrofizjologii iOS opisane w tym protokole.

Protokół

Wszystkie procedury zostały przeprowadzone zgodnie z Instytutem Komitetu ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania (IACUC) na Uniwersytecie Nowego Meksyku. Myszy C57BL/6J uzyskano ze źródła komercyjnego. Użyto równej liczby samców i samic myszy w wieku 8-14 tygodni. Wszystkie myszy ważyły około 20 g. Szczegółowe informacje na temat zwierząt, odczynników i sprzętu użytego w tym badaniu są wymienione w Tabeli materiałów. Plik uzupełniający 1 zawiera wykaz skrótów.

1. Przygotowanie czaszki do obrazowania i elektrofizjologii

1. Znieczulenie zwierzęcia w pudełku indukcyjnym izofluranu z 2%-3% izofluranem w 100% tlenie, zapewniając odpowiednią głębokość znieczulenia bez drgnięcia z powodu uszczypnięcia łapy.
2. Przedoperacyjne leki przeciwbólowe (buprenorfina o powolnym uwalnianiu, 3,25 mg/kg, SQ) przed umieszczeniem zwierzęcia w ramie stereotaktycznej i utrzymuj znieczulenie (2% izofluranu).
3. Dodaj maść okulistyczną i utrzymuj temperaturę ciała zwierzęcia za pomocą poduszki grzewczej, która ma sprzężenie zwrotne o temperaturze ciała.
4. Ogol włosy nad czaszką, gdzie będzie nacięcie, wzdłuż linii środkowej od szczeliny oka do lambda.
5. Usuń obcięte włosy przed sterylizacją skóry za pomocą antyseptycznego i dezynfekującego peelingu i roztworu. Na koniec dodaj 70% etanolu i powtórz trzy razy, aby zapewnić sterylne miejsce operacji.
6. Używając ostrza skalpela #10, wykonaj nacięcie wzdłuż linii środkowej od rostralu do ogona, a natychmiast po nim nałóż klej cyjanoakrylowy klasy medycznej na nacięcie. Rozłóż skórę na boki, aby odsłonić czaszkę.
7. Dodaj kolejną kroplę lub dwie kleju cyjanoakrylowego na czaszkę, aby zapewnić dodatkową ochronę czaszki.
   UWAGA: Nakładanie kleju jest wrażliwe na czas, ponieważ czaszka zacznie stawać się nieprzezroczysta, gdy zostanie wystawiona na działanie powietrza dłużej niż 10 sekund. Spowoduje to zaciemnienie wizualizacji SD za pomocą metod obrazowania.
8. Podczas wysychania kleju użyj sterylnych nożyczek chirurgicznych, aby zwiększyć rozmiar nacięcia nad móżdżkiem. Po związaniu kleju rozpocznij implantację elektrod śrubowych czaszki.
   1. Sterylizuj czaszki za pomocą sterylizatora koralików przez 20-30 s przed implantacją.
   2. Umieść czaszki w obszarze odległym od miejsca inicjacji SD, aby utrzymać otwarte okno wizualne.
      UWAGA: W przypadku przewlekłych nagrań w pierwszorzędowej korze wzrokowej stosuje się trzy czaszki. Pierwsza śruba jest umieszczona w przybliżeniu w odległości y = -6,00 mm od bregmy w móżdżku, służąc jako elektroda odniesienia. Elektrody rejestrujące są umieszczone w odległości y = -2,79 mm od bregmy i x = ±2,5 mm od linii środkowej, w obrębie lewej i prawej półkuli.
   3. Za pomocą wiertła o średnicy 0,8 mm wywierć otwory prowadzące przez czaszkę. Aby zapewnić brak uszkodzeń tkanki leżącej pod spodem, idealne jest -0,5 mm w z. Użyj #00-90, które są wstępnie przylutowane do złotych pinów za pomocą drutu ze stali nierdzewnej.
   4. Przekręć w dół do czaszki.1,5-2 pełne obroty sprawią, że śruba przejdzie przez czaszkę i zetknie się z powierzchnią kory mózgowej.
   5. Nawiń nadmiar drutu wokół, pozostawiając pewien luz w przewodzie do późniejszego umieszczenia na głowicy.
   6. Korzystając z tych samych procedur, umieść pozostałe czaszki.
   7. Gdy wszystkie czaszki są na swoim miejscu, podłącz wszystkie złote piny do żądanego złącza headstage. Przytrzymaj złącze na miejscu za pomocą ramienia stereotaktycznego i przytrzymaj styki złącza blisko nad, upewniając się, że przewody się nie stykają.
   8. Uszczelnij cały obszar klejem cyjanoakrylowym, uważając, aby nie zakłócić obszaru obrazowania przed czaszki.
   9. Zbuduj cement dentystyczny wokół podstawy złotych szpilek, upewniając się, że złote kołki ze czaszki nie są połączone ze złotymi szpilkami w stopniu głowy.
   10. Poczekaj, aż cement dentystyczny utwardzi się przed wyjęciem łącznika headstage.
   11. Wyjmij zwierzę z ramy stereotaktycznej i umieść je z powrotem w klatce domowej, aby mogło dojść do siebie. Postępuj zgodnie ze standardową opieką pooperacyjną i trzymaj zwierzęta na poduszce grzewczej podczas rekonwalescencji po znieczuleniu.
       UWAGA: Po operacji zwierzęta były trzymane samotnie i codziennie monitorowane pod kątem bólu. Postępuj zgodnie z lokalnymi wytycznymi instytucjonalnymi dotyczącymi analgezji. W przypadku stosowania buprenorfiny o powolnym uwalnianiu należy stosować monitor bólu i ewentualnie podać dodatkową dawkę po 72 godzinach.
9. Usuń wszelkie przedmioty, które mogą zaczepić się o elektrody, w tym obudowę i wzbogacenie. Używaj standardowej pościeli z dostępem ad libium do jedzenia i wody.
   UWAGA: Pozwól na dwudniowy okres rekonwalescencji między zabiegiem a nagraniem.

2. Wykrywanie rozprzestrzeniających się depolaryzacji za pomocą obrazowania wewnętrznego sygnału optycznego (iOS) i elektrofizjologii prądu przemiennego

1. Znieczulić zwierzęta 2% izofluranem w 100% tlenie.
   UWAGA: Część obrazowa tej procedury powinna trwać ~5 minut, a ilość ekspozycji na izofluran powinna być stała.
2. Umieść zwierzę w stereotaktycznej ramce. Przez stożek nosowy utrzymuj 1%-2% izofluranu w tlenie.
   UWAGA: Bardzo ważne jest utrzymanie odpowiedniej głębokości znieczulenia, ponieważ wiadomo, że izofluran zmniejsza SD. Zaleca się utrzymanie 60-70 oddechów/min przez cały czas trwania eksperymentu.
3. Umieść zwierzę pod aparatem i upewnij się, że aparat jest skupiony na powierzchni kory mózgowej, regulując pierścień ostrości.
4. Nałóż olej mineralny na obszar obrazowania, aby zwiększyć przezroczystość.
5. Włącz komputery, tablicę LED i sprzęt do elektrofizjologii.
   UWAGA: Tablica panelowa LED działa najlepiej, gdy jest umieszczona przed zwierzęciem, aby oświetlić okno obrazowania, gdy światła górne są wyłączone. Światło zostało ustawione na ~2,400 luksów (95% mocy) z chłodnym ustawieniem temperatury 4000K.
6. Załaduj ustawienie dla systemu iOS za pomocą Micro-Manager^19,20,21,22.
   1. Naciśnij przycisk Na żywo, aby wyświetlić mysz pod kamerą i wyśrodkować czaszkę zwierzęcia pod kamerą. Zamknij okno "Na żywo".
   2. Naciśnij przycisk Multi-D Acq.
   3. W oknie Akwizycja wielowymiarowa wybierz żądane punkty czasowe.
      UWAGA: Zalecana jest liczba 750 obrazów w odstępie 250 ms.
   4. Zapisz obrazy w żądanej ścieżce pliku i prefiksie nazwy.
7. Podłącz złote piny od zwierzęcia do złącza headstage, a następnie do headstage.
8. Ustawienie obciążenia dla oprogramowania Intan.
   1. Kliknij ikonę Wybierz format pliku, a następnie w wyskakującym oknie wybierz Jeden plik na format typu sygnału. Spowoduje to zapisanie pliku jako ".dat" do dalszego wykorzystania w MATLAB.
   2. Na karcie BW w obszarze Hardware Bandwidth (Przepustowość sprzętowa) wybierz pasmo wzmacniacza 0.13-500 Hz.
   3. W obszarze Filter Display Selector (Selektor wyświetlania filtra) wybierz opcję WIDE (Szeroki), aby objąć najszerszy zakres sygnałów.
   4. Aby wybrać żądaną ścieżkę pliku do zapisania, kliknij ikonę Wybierz nazwę pliku.
9. Wykonaj uderzenie za pomocą udaru elektromagnetycznego.
   UWAGA: Ustawienia udaru to prędkość uderzenia 4 m/s i ugięcie 5 mm.
   1. Włącz impaktor i upewnij się, że końcówka odpowiednio się chowa i wysuwa, przesuwając 3-kierunkowy przełącznik, aby schować końcówkę i wysunąć końcówkę. Końcówkę należy wysunąć przed umieszczeniem zwierzęcia pod końcówką.
   2. Poruszając się szybko, połóż zwierzę na piankowym łóżku i wsuń legowisko pod końcówkę.
   3. Ustawić końcówkę impaktora na linii środkowej i 1 mm szerokości bocznej bregmy.
   4. Opuść końcówkę impaktora, aż mocno dotknie czubka głowy zwierzęcia.
      UWAGA: Nie wciskaj końcówki w dół do głowicy.
   5. Naciśnij dźwignię, aby schować końcówkę udaru, a następnie ręcznie opuść ją o 5 mm przed uruchomieniem dźwigni udarowej.
   6. Natychmiast wyjmij zwierzę z piankowego łóżka i umieść je pod kamerą w celu zobrazowania w ciągu 5 sekund, gdy SD jest inicjowane od uderzenia.
10. Rozpocznij obrazowanie iOS, klikając Acquire! w oknie Multi-Dimensional Acquisition. Obraz przez 4 minuty, aby uchwycić całą kartę SD.
11. Rozpocznij zapis elektrofizjologiczny, klikając ikonę Record w oprogramowaniu Intan.
12. Wyjmij zwierzę z podkładki piankowej i pozwól mu dojść do siebie na otwartej arenie lub w klatce domowej.
    UWAGA: Zaleca się rejestrowanie elektrofizjologii przez co najmniej 1 godzinę, aby umożliwić przywrócenie funkcji sieci korowej.
13. Po zakończeniu nagrywania odłącz zwierzę od sceny czołowej i złącza, a następnie umieść zwierzę z powrotem w klatce.
    UWAGA: Zaleca się pozostawienie 24 godzin między każdym uderzeniem a sesją nagrywania. Zwierzę może przebywać w swojej domowej klatce przez cały czas poza sesjami nagraniowymi.

3. Wizualizacja obrazu iOS i kwantyfikacja

1. W ImageJ^19,20,21,22, otwórz stos obrazów, klikając sekwencję Plik > importuj > obrazu.
2. Ręcznie przewijaj obrazy, aby upewnić się, że nie ma ruchu ani żadnych innych artefaktów.
3. Aby wygenerować wykres SD, utwórz ROI, używając kursora do narysowania kwadratu.
   UWAGA: Zaleca się użycie kwadratu o wymiarach 30 x 30 pikseli. Można użyć dowolnego kształtu lub rozmiaru, ale upewnij się, że wielkość ROI nie zmienia się u zwierząt.
4. Utwórz wykres, klikając Obraz > stosy > Profil osi Z wykresu. Na nowo utworzonym wykresie kliknij przycisk na żywo. Wróć do stosu obrazów SD i przesuwaj ROI, aż wykres pokaże krzywą SD. Wykres powinien wyglądać jak fala grzechu z początkowym wzrostem, po którym następuje spadek poniżej linii bazowej i powolny powrót do linii bazowej w ciągu kilku minut.
   UWAGA: Wykresy mogą być wyrażone jako dowolne jednostki (AU) lub jako procentowa linia bazowa, przy użyciu kilku pierwszych obrazów jako średniej linii bazowej.
5. Na wygenerowanym wykresie kliknij Lista, aby wygenerować listę wartości, które można wykreślić w innym oprogramowaniu do generowania wykresów lub Matlabie.
6. Aby uzyskać wizualizację, przekształć obraz w skali szarości w tabelę przeglądową w programie ImageJ za pomocą funkcji Image > Lookup Tables > Fire.

4. Analiza elektrofizjologiczna

UWAGA: Zaleca się, aby doświadczenie laboratorium Buzsaki i ich kod wygenerowany przez MATLAB były intensywnie wykorzystywane do wizualizacji i analizy danych elektrofizjologicznych. Analiza będzie wymagała pobrania MATLABa z instytucjonalnym kodem aktywacyjnym i plikiem zip "Buzcode" laboratorium Buzsaki za pośrednictwem GitHub (https://github.com/buzsakilab/buzcode).

1. W oprogramowaniu do elektrofizjologii Intan upewnij się, że wyeksportowane surowe dane są zapisane w formacie ".dat".
   UWAGA: Matlab można zainstalować ze strony internetowej MathWorks. Do zakupu i korzystania z Matlaba niezbędny jest instytucjonalny lub indywidualny kod aktywacyjny. Do przeprowadzenia tej analizy niezbędne jest pewne wcześniejsze doświadczenie w uruchamianiu kodu w Matlabie.
2. Użyj funkcji bz_LoadBinary kodu Buzaki, aby załadować dane do Matlab.
   UWAGA: Przykład "'data' = bz_LoadBinary ('pełna ścieżka do pliku danych','częstotliwość', częstotliwość próbkowania, nChannels, liczba kanałów);
3. Filtruj szumy AC za pomocą filtra wycinającego wyśrodkowanego na 60 Hz.
   UWAGA: Przykład notch_freq = 60; [b,a] = iirnotch(notch_freq/(sampling_frequency/2), notch_bandwidth/(sampling_frequency/2)); filtered_data = filtfilt(b, a, dane);
4. Wyizoluj aktywność wysokiej częstotliwości za pomocą filtra pasmowoprzepustowego o zakresie 0,5-100 Hz, zgodnie z zaleceniami grupy COSBID do analizy i wizualizacji rozprzestrzeniania się depolaryzacji (SD).
5. Oblicz spektrogram mocy za pomocą polecenia pspectrum w MatLab.
6. Aby to zobrazować, wykreśl spektrogram wysokiej częstotliwości i mocy na tej samej skali czasowej i w jednej kolumnie.
   UWAGA: Z wykresów nastąpi przedłużenie depresji wysokiej częstotliwości i utraty mocy.

Wyniki

Rysunek 1 ilustruje graficzną reprezentację eksperymentalnego układu. Rejestrujące czaszki są umieszczone w pierwszorzędowej korze wzrokowej, przy czym jedna elektroda czaszki jest umieszczona w robaku móżdżku jako elektroda masowa. czaszki i złote szpilki są przymocowane do czaszki za pomocą kleju cyjanoakrylowego i cementu dentystycznego. Bardzo ważne jest, aby ograniczyć cement dentystyczny do ogonowej części czaszki, aby pozostawić miejsce na uderzenie i obrazowanie. Miejsce uderzenia, wyśrodkowane na linii środkowej i około 1 mm rostral od bregmy, jest wskazane na Rysunek 1.

Reprezentatywne obrazy wewnętrznych sygnałów optycznych (iOS) są pokazane w Rysunek 2A. Obrazy w skali szarości są konwertowane przy użyciu tabeli przeglądowej Fire Lookup Table w celu ulepszenia wizualizacji rozprzestrzeniania się depolaryzacji (SD). iOS obejmuje różne sygnały, w tym NAD(P)H, FADH i odbicie tkankowe, co sprawia, że interpretacja i porównywanie tych sygnałów jest trudne. Duże naczynia powinny być wyraźnie widoczne przez okienko super glue (oznaczone strzałkami), podczas gdy przerywana linia w Rysunek 2A oznacza rozchodzącą się falę SD. Chociaż obrazy SD są trudne do zaobserwowania w czasie rzeczywistym, stają się bardziej widoczne, gdy obrazy są przyspieszane (patrz Dodatkowy film 1). Niektóre małe gałęzie mogą wydawać się "znikać" z powodu zwężenia naczyń krwionośnych (Rysunek 2A). Mały obszar zainteresowania (ROI) wyodrębniony ze stosu obrazów powinien dać wykres osi Z podobny do Rysunek 2B. Z zapisów elektrofizjologicznych wydobyty sygnał o wysokiej częstotliwości powinien przypominać górne panele Rysunek 2C,D. Zapisy te rozpoczęto natychmiast po łagodnym urazowym uszkodzeniu mózgu (mTBI), a zwierzęta pozostawały w znieczuleniu izofluranem podczas 4-minutowego obrazowania iOS. Po usunięciu izofluranu, aktywność o wysokiej częstotliwości powinna szybko powrócić w ciągu minuty u zwierząt pozorowanych, jak pokazano na Rysunek 2C (czerwona ramka). I odwrotnie, jeśli wystąpi SD, aktywność o wysokiej częstotliwości pozostanie obniżona przez kilka minut przed powrotem do zdrowia (Rysunek 2D, czerwona ramka). Dolne panele Rysunek 2C,D wyświetlają obliczoną moc (V²) dla każdego wykresu wysokiej częstotliwości. Te wykresy mocy pomagają zidentyfikować tłumienie i odzyskiwanie aktywności o wysokiej częstotliwości przez szybki wzrost mocy (wskazywany przez prawą krawędź czerwonych pól).

Rysunek 1: Eksperymentalna konfiguracja i lokalizacja uderzeniowych i czaszkowych. Grzbietowa powierzchnia czaszki jest odsłonięta przez nacięcie skóry. Czaszka i skóra są uszczelnione klejem cyjanoakrylowym w celu zwiększenia przezroczystości. Otwór na zadziory do ziemi wierci się przy y = -6,00 i x = 0 od bregmy. Otwory zadziorowe do rejestrowania elektrod są umieszczone na y = -2,79 i x = ±2,5 od bregmy. ze stali nierdzewnej są przekręcane przez czaszkę i przylutowane do złotych kołków za pomocą niepowlekanego drutu ze stali nierdzewnej. Zwraca się uwagę, aby nie dopuścić do nadmiernego pokrycia powierzchni czaszki cementem dentystycznym, aby zapewnić odpowiednią przestrzeń do uderzenia i obrazowania. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Reprezentatywne obrazy iOS i nagrania AC. (A) Reprezentatywne obrazy iOS ze strzałkami wskazującymi naczynia krwionośne. Obrazy w skali szarości są konwertowane na tabelę przeglądową Fire w programie ImageJ w celu ulepszenia wizualizacji. Przerywana linia oznacza rozchodzące się SD, wizualizowane jako fala o zwiększonej intensywności w systemie iOS. SD jest wyraźnie widoczne podczas szybkiego przewijania całego stosu obrazów. Sygnał iOS odzwierciedla różne zmiany fizjologiczne i metaboliczne związane z SD, w tym mitochondrialną produkcję NAD(P)H i FADH oraz obrzęk neuronów. Czarne pole podświetla obszar zainteresowania (ROI) używany do generowania śladu w (B). Podziałka liniowa: 1 mm. (B) Reprezentatywny ślad SD systemu iOS wyrażony jako procent linii podstawowej. Sygnał iOS wzrasta i powraca w pobliżu linii bazowej w ciągu około 60 sekund. Chociaż zmiany w sygnałach iOS są niewielkie (około 10%), są wystarczające do identyfikacji karty SD. W nagraniach prądu przemiennego zarówno dla zwierząt pozorowanych (C), jak i SD (D), górne ślady pokazują aktywność o wysokiej częstotliwości, a dolne ślady reprezentują moc (V²). Niebieskie pola wskazują okresy znieczulenia izofluranem, podczas gdy czerwone pole oznacza okres rekonwalescencji po aktywności o wysokiej częstotliwości po izofluranie i SD. Przedłużająca się depresja wywołana przez SD kontrastuje z szybkim powrotem do aktywności po zastosowaniu samego izofluranu (pozorowanego). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dodatkowe wideo 1: Wizualizacja rozchodzącej się fali. Plik wideo jest przyspieszany do około 8-krotnej prędkości, aby ułatwić wizualną identyfikację rozchodzącej się fali. Obraz w skali szarości został przekonwertowany na tabelę przeglądową Fire i zapisany jako plik .AVI w programie ImageJ. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 1: Lista skrótów. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

Rozprzestrzenianie się depolaryzacji ma kluczowe znaczenie w różnych modelach chorób, w tym w urazowym uszkodzeniu mózgu (TBI), udarze mózgu i migrenie¹. Dokładne wykrycie SD jest niezbędne do zrozumienia ich roli w ostrych deficytach behawioralnych i/lub aktywacji układu neuroimmunologicznego po łagodnych urazowych uszkodzeniach mózgu (mTBI)^23,24. Aby zminimalizować ryzyko braku kart SD w przypadku korzystania z jednej metody, konieczne jest podejście wielometodyczne do skutecznej wizualizacji i rejestrowania kart SD.

Podczas gdy łączenie technik umożliwia potwierdzenie rozprzestrzeniania się depolaryzacji (SD), każda technika może mieć potencjalne pułapki. Techniki obrazowania opisane w tym protokole są dostępne dla większości laboratoriów i są szczegółowo opisane przez Zepedę i współpracowników²⁵. Przygotowanie okienka czaszkowego ma kluczowe znaczenie, ponieważ nieprzezroczyste okienka mogą prowadzić do niejednoznacznych obrazów²⁶. Problem ten można złagodzić, minimalizując ekspozycję czaszki na powietrze przed nałożeniem kleju cyjanoakrylowego. Dodatkowo przezroczystość okna można poprawić za pomocą kropli oleju mineralnego przed obrazowaniem. Artefakty ruchu mogą również komplikować potwierdzenie SD, więc zminimalizowanie tych artefaktów jest niezbędne do uzyskania wyraźnego obrazu. Aby temu zaradzić, ważne jest, aby zwierzę było poddawane izofluranowi przez cały proces obrazowania²⁷. Zastosowanie stożka nosowego ułatwia sprawne przenoszenie zwierzęcia między impaktorem a zestawem nagrywającym. Bardzo ważne jest, aby po uderzeniu szybko umieścić zwierzę z powrotem pod stożkiem nosowym, aby uchwycić jak najwięcej propagacji SD. W tym modelu łagodnego urazowego uszkodzenia mózgu (mTBI) nagrywanie przez około 4 minuty jest zwykle wystarczające do uchwycenia całej SD. Jednak w cięższych TBI spontaniczne SD mogą być generowane przez uszkodzenie tkanek²⁸. Ciągłe obrazowanie może wykryć te spontaniczne SD, ale przedłużone znieczulenie izofluranem może utrudnić obserwację depresji o wysokiej częstotliwości. Spontaniczne SD mogą być wykryte za pomocą elektrofizjologii przez dodatkowe depresje w aktywności o wysokiej częstotliwości, ale potwierdzenie związku między depresją a SD jest trudne bez obrazowania.

Wraz z rozwojem wzmacniaczy Open-Ephys i Intan, elektrofizjologia in vivo jest obecnie dostępna dla wielu laboratoriów. Wszystkie zapisy elektrofizjologiczne wymagają wszczepienia czaszkowych i/lub elektrod. W tym protokole występuje dwudniowy okres opóźnienia między wszczepieniem czaszki a nagrywaniem w celu wsparcia powrotu do zdrowia. Chociaż okres ten może nie być wystarczający, aby mózg w pełni zregenerował się po implantacji, uszkodzenia powinny być minimalne, ponieważ czaszki nie wnikają w tkankę mózgową. Dodatkowo przezroczystość czaszki uszczelnionej cyjanoakrylanem zmniejsza się z czasem, dlatego obrazowanie należy wykonać jak najszybciej, aby uzyskać optymalną przezroczystość. W elektrofizjologii kluczowe znaczenie ma minimalizacja szumów o częstotliwości 60 Hz. Upewnij się, że obszar eksperymentalny jest odizolowany od zasilania prądem zmiennym i prawidłowo uziemiony do Intan amplifier. Chociaż artefaktów ruchu nie można całkowicie wyeliminować, akcelerometry na scenie głowy mogą pomóc w identyfikacji i usuwaniu okresów ruchu podczas przetwarzania końcowego. Ogólnie rzecz biorąc, techniki te mogą dostarczyć cennych informacji na temat odzyskiwania SD i funkcji sieci korowej po łagodnych urazowych uszkodzeniach mózgu (mTBI).

Jednym z ograniczeń tych technik jest to, że zwierzęta są pod narkozą podczas obrazowania. Jednak większość modeli TBI wymaga znieczulenia, a rozszerzone znieczulenie prawdopodobnie nie wpłynie znacząco na projekt eksperymentalny. Izofluran znacznie zmniejsza aktywność o wysokiej częstotliwości²⁷. Jeśli ekspozycja na izofluran wykracza poza okres obrazowania, może to utrudnić wykrycie powrotu do aktywności o wysokiej częstotliwości po SD. Dlatego tak ważne jest, aby w projekcie eksperymentalnym uwzględnić grupę pozorowaną lub zawierającą sam izofluran, aby porównać odzyskiwanie aktywności o wysokiej częstotliwości, jak pokazano na rysunku 2. Kolejnym ograniczeniem jest to, że zapisy elektrofizjologiczne nie wykrywają przesunięcia DC. Amplituda i czas trwania przesunięcia DC są wskaźnikami zdrowia tkanek i regeneracji po SD²⁸. Niemniej jednak potwierdzenie SD za pomocą tych technik nadal dostarczy cennych informacji na temat badań nad TBI.

Wszyscy badacze TBI odnieśliby korzyści z opisanych tutaj technik, ponieważ jest wysoce prawdopodobne, że wszystkie modele TBI wytwarzają depolaryzacje rozprzestrzeniające się (SD). Dziedzina TBI znacznie zyskałaby na zrozumieniu roli SD w urazach, progresji urazu, aktywacji neuroimmunologicznej i powrocie do zdrowia. Ostatnie badania sugerują, że SD przyczyniają się do deficytów behawioralnych i mogą być mechanizmem leżącym u podstaw upośledzenia neurologicznego ^5,7. Techniki przedstawione w tym protokole pomogą w wyjaśnieniu związku między TBI i SD. Przyszłe zastosowania tych technik mogą rozszerzyć się na inne dziedziny badań, w tym udar, epilepsję i migrenę.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
#00-90 x .118 Śruba maszynowa	US Micro Screw	00.90-118-M-SS-P, Amazon
Wiertło o średnicy 0,8 mm	Wiertło do PCB	WYTP21, Amazon
16-A Headstage	Intan	C3335
2,1 mm Frezy mikrowiertło	Fine Science Tools	19007-21
Wzmacniacz AC		Intan	RHD
Myszki C57BL/6J	Laboratorium Jacksona	Kamera CCD Jax#000664
	Mightex	TCE-1304-U
Obiektyw przedłużający	Zeikos	ZE-ETN
Ethiqa XR (buprenorfina o powolnym uwalnianiu)	Midwest Veterinary Supply	Numer produktu 267.10000.3
Złoty pin złącza (żeński)	A-M Systems	520100
Złoty pin złącza (męski)	A-M Systems	520200
ImageJ2/Fiji	Image J	NA
Impaktor Jeden		Leica 39463930
Tablica panelowa LED	Supon	L122t
MATLAB	MathWorks	Instytucjonalny lub indywidualny kod
Klej cyjanoakrylowy klasy medycznej	MasterBond	MB287
Micro-Manager Camera Software	Obraz J	NA
Wiertarka do paznokci / polerka	Makartt Wiertarka do paznokci Elektryczny pilnik do paznokci	JD700
Złącza Omnetic	Omnetics	A79014-001
Oprogramowanie do akwizycji danych RHX	Intan	NA
Drut niepowlekany ze stali nierdzewnej (0,005")	Systemy AM	792800
Rama stereotaktyczna	Kopf Intruments	1923-B
Trójniki "utwardzany na zimno" cement dentystyczny	Systemy AM	525000, 526000
Obiektyw XLR do aparatu	Nikon	NIKKOR 50 mm f/1.8-16