Ten protokół demonstruje połączenie obrazowania i elektrofizjologii w celu niezawodnego wykrywania rozprzestrzeniających się depolaryzacji u dorosłych myszy po łagodnym urazowym uszkodzeniu mózgu.
Artykuł metodologiczny
Połączenie obrazowania i elektrofizjologii w celu wizualizacji i rejestrowania rozprzestrzeniających się depolaryzacji u myszy
* These authors contributed equally
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Rozprzestrzenianie depolaryzacji (SDs) to masowe zdarzenia w mózgu, które często pozostają niewykryte ze względu na ich powolne rozprzestrzenianie się przez istotę szarą. Ponieważ detekcja SD może być nieuchwytna, jest optymalnie potwierdzana przy użyciu wielu metod. Protokół ten opisuje metody łączenia obrazowania i elektrofizjologii w celu wykrywania SD w sposób, który większość laboratoriów może niezawodnie i łatwo zastosować. SD występują po urazowych urazach mózgu, udarze, krwotokach podpajęczynówkowych, niedokrwieniu i aurze migrenowej. Historycznie rzecz biorąc, SD były rejestrowane przy użyciu wzmacniaczy prądu stałego, które mogą rozwiązać powolne przesunięcie zewnątrzkomórkowe i depresję aktywności o wysokiej częstotliwości. Jednak wzmacniacze prądu stałego są prawie niemożliwe do użycia w przypadku przewlekłych nagrań in vivo. Protokół ten wykorzystuje wspólny wzmacniacz prądu przemiennego do zapisów elektrofizjologii in vivo w celu potwierdzenia depresji wysokiej częstotliwości, wraz z nieinwazyjnym obrazowaniem niezbędnym do wykrycia rozchodzącej się fali SD. Metody te mogą być wiarygodnie stosowane i/lub modyfikowane dla większości podejść eksperymentalnych w celu potwierdzenia obecności lub braku SD po uszkodzeniu mózgu.
Wprowadzenie
Rozprzestrzenianie depolaryzacji (SDs) jest związane z różnymi schorzeniami neurologicznymi, w tym urazowym uszkodzeniem mózgu (TBI), udarem, krwotokami podpajęczynówkowymi, niedokrwieniem i aurą migrenową1. SD są zaangażowane w postęp uszkodzeń tkanek w udarach i TBIs2. Dokładny mechanizm leżący u podstaw postępu utraty tkanek pozostaje niejasny3,4. Jednak SD występują, gdy wymagania metaboliczne neuronów nie są zaspokajane przez wystarczającą ilość tlenu i glukozy, ponieważ funkcja zależnej od ATP pompy sodowo-potasowej staje się niewystarczająca do utrzymania gradientów jonów. Aby zrozumieć rolę SD w utracie tkanek, potrzebne są precyzyjne techniki ich pomiaru i badania, co ma kluczowe znaczenie dla postępu wiedzy naukowej. SD są istotnymi zdarzeniami neurologicznymi, które często mogą pozostać niewykryte ze względu na ograniczenia projektu eksperymentu i/lub oprzyrządowania.
Rola rozprzestrzeniania się depolaryzacji (SDs) w postępie urazów jest obecnie wyjaśniana, ale ich rola w łagodnych urazowych uszkodzeniach mózgu (mTBI) pozostaje niejasna. Ostatnie badania z wykorzystaniem technik opisanych w tym manuskrypcie wykazały, że SD są inicjowane w modelach myszy mTBI z zamkniętą czaszką, nawet jeśli nie ma jawnego uszkodzenia tkanek lub krwawienia5, 6. Badania te sugerują, że SD mogą przyczyniać się do ostrych zaburzeń neurologicznych i zapalenia nerwów. Dodatkowo, obecność SD indukowanych przez mTBI jest ściśle związana z ostrymi deficytami behawioralnymi6,7. W związku z tym jest prawdopodobne, że SD są inicjowane we wszystkich modelach TBI, ale ich rola pozostaje trudna do ustalenia bez potwierdzenia. Potwierdzenie obecności SD ma kluczowe znaczenie dla dokładnej oceny wyników mTBI.
Rozprzestrzenianie się depolaryzacji (SDs) jest identyfikowane przez znaczny spadek potencjału zewnątrzkomórkowego, znany jako "przesunięcie DC", oraz przez depresję aktywności o wysokiej częstotliwości8. Rozwiązanie "przesunięcia DC" zwykle trwa sekundy (~10 s)9. Aby uchwycić "przesunięcie DC", wymagany jest wzmacniacz prądu stałego i elektrody ze srebrnym drutem. Jednak elektrofizjologia in vivo jest zwykle wykonywana za pomocą wzmacniaczy prądu przemiennego, które są zaprojektowane do filtrowania zdarzeń o niskiej częstotliwości w celu zmniejszenia artefaktów ruchu. Niestety, to filtrowanie niskich częstotliwości usuwa również "przesunięcie DC". Dodatkowo srebro jest toksyczne i nie nadaje się do przewlekłych nagrań. Powszechnie stosowane wzmacniacze prądu przemiennego mogą wykrywać depresję aktywności o wysokiej częstotliwości, ale bez towarzyszącego jej "przesunięcia DC" potwierdzenie obecności SD jest trudne.
Depolaryzacja rozprzestrzeniania się (SDs) może być również wykrywana za pomocą różnych technik obrazowania. Najczęściej SD są obrazowane za pomocą laserowego obrazowania z kontrastem plamkowym, które mierzy przepływ krwi przez nienaruszoną czaszkę10. SD znacząco wpływają na unaczynienie mózgu i przepływ krwi. U większości gatunków innych niż myszy, SD indukują rozchodzącą się falę hiperperfuzji, która przemieszcza się wraz z krawędzią natarcia klasy SD11. SD mogą być również obrazowane za pomocą wskaźników fluorescencyjnych wapnia lub glutaminianu12, choć wymaga to obciążenia tkanki barwnikami lub genetycznie zakodowanymi wskaźnikami fluorescencyjnymi12,13. Co ciekawe, SD można zaobserwować gołym okiem dzięki wewnętrznym sygnałom optycznym (iOS) powiązanym z klasą SD14. iOS to złożone sygnały złożone z cząsteczek autofluorescencyjnych, takich jak NAD(P)H i FADH15,16, obrzęk tkanek17 i potencjalne zmiany w przepływie krwi w mózgu. Pomimo swojej złożoności, sygnały iOS są niezawodne i mogą być przechwytywane przez myszy typu dzikiego18. Protokół ten opisuje metodę obrazowania iOS, ponieważ technikę tę można wdrożyć w dowolnym laboratorium bez konieczności stosowania specjalistycznych wirusów lub zwierząt transgenicznych.
Ogólnym celem tej metody jest eksperymentalne potwierdzenie obecności lub braku rozprzestrzeniającej się depolaryzacji (SD) po łagodnym urazowym uszkodzeniu mózgu (mTBI) za pomocą jednoczesnego obrazowania i elektrofizjologii. Powszechnie stosowaną techniką jest elektrofizjologia in vivo, wspomagana przez zaawansowane wzmacniacze. Jednak wzmacniacze te nie są w stanie wykryć charakterystycznego "przesunięcia DC". Dlatego techniki obrazowania, opisane w tym protokole, są stosowane w celu pewnego potwierdzenia obecności lub braku SD. Zaletą połączenia obrazowania i elektrofizjologii jest to, że obrazowanie może wykryć propagację SD, podczas gdy elektrofizjologia może zidentyfikować związaną z tym depresję o wysokiej częstotliwości.
Ogólnie rzecz biorąc, ta metoda jest odpowiednia do badania obecności rozprzestrzeniających się depolaryzacji (SD) po urazowym uszkodzeniu mózgu (TBI). Jego zastosowanie może przyczynić się do lepszego zrozumienia funkcji sieci korowej po TBI i SDs. Protokół ten można dostosować z modelu uderzenia zamkniętej czaszki do innych modeli, takich jak kontrolowane uderzenie korowe, płynna stymulacja lub spadek ciężaru. Wdrożenie tego protokołu w wielu laboratoriach może wyjaśnić rolę SD w przypadku różnych nasileń TBI. Można użyć dowolnego ustalonego modelu TBI, a następnie wykonać procedury obrazowania i elektrofizjologii iOS opisane w tym protokole.
Protokół
Wszystkie procedury zostały przeprowadzone zgodnie z Instytutem Komitetu ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania (IACUC) na Uniwersytecie Nowego Meksyku. Myszy C57BL/6J uzyskano ze źródła komercyjnego. Użyto równej liczby samców i samic myszy w wieku 8-14 tygodni. Wszystkie myszy ważyły około 20 g. Szczegółowe informacje na temat zwierząt, odczynników i sprzętu użytego w tym badaniu są wymienione w Tabeli materiałów. Plik uzupełniający 1 zawiera wykaz skrótów.
1. Przygotowanie czaszki do obrazowania i elektrofizjologii
- Znieczulenie zwierzęcia w pudełku indukcyjnym izofluranu z 2%-3% izofluranem w 100% tlenie, zapewniając odpowiednią głębokość znieczulenia bez drgnięcia z powodu uszczypnięcia łapy.
- Przedoperacyjne leki przeciwbólowe (buprenorfina o powolnym uwalnianiu, 3,25 mg/kg, SQ) przed umieszczeniem zwierzęcia w ramie stereotaktycznej i utrzymuj znieczulenie (2% izofluranu).
- Dodaj maść okulistyczną i utrzymuj temperaturę ciała zwierzęcia za pomocą poduszki grzewczej, która ma sprzężenie zwrotne o temperaturze ciała.
- Ogol włosy nad czaszką, gdzie będzie nacięcie, wzdłuż linii środkowej od szczeliny oka do lambda.
- Usuń obcięte włosy przed sterylizacją skóry za pomocą antyseptycznego i dezynfekującego peelingu i roztworu. Na koniec dodaj 70% etanolu i powtórz trzy razy, aby zapewnić sterylne miejsce operacji.
- Używając ostrza skalpela #10, wykonaj nacięcie wzdłuż linii środkowej od rostralu do ogona, a natychmiast po nim nałóż klej cyjanoakrylowy klasy medycznej na nacięcie. Rozłóż skórę na boki, aby odsłonić czaszkę.
- Dodaj kolejną kroplę lub dwie kleju cyjanoakrylowego na czaszkę, aby zapewnić dodatkową ochronę czaszki.
UWAGA: Nakładanie kleju jest wrażliwe na czas, ponieważ czaszka zacznie stawać się nieprzezroczysta, gdy zostanie wystawiona na działanie powietrza dłużej niż 10 sekund. Spowoduje to zaciemnienie wizualizacji SD za pomocą metod obrazowania. - Podczas wysychania kleju użyj sterylnych nożyczek chirurgicznych, aby zwiększyć rozmiar nacięcia nad móżdżkiem. Po związaniu kleju rozpocznij implantację elektrod śrubowych czaszki.
- Sterylizuj czaszki za pomocą sterylizatora koralików przez 20-30 s przed implantacją.
- Umieść czaszki w obszarze odległym od miejsca inicjacji SD, aby utrzymać otwarte okno wizualne.
UWAGA: W przypadku przewlekłych nagrań w pierwszorzędowej korze wzrokowej stosuje się trzy czaszki. Pierwsza śruba jest umieszczona w przybliżeniu w odległości y = -6,00 mm od bregmy w móżdżku, służąc jako elektroda odniesienia. Elektrody rejestrujące są umieszczone w odległości y = -2,79 mm od bregmy i x = ±2,5 mm od linii środkowej, w obrębie lewej i prawej półkuli. - Za pomocą wiertła o średnicy 0,8 mm wywierć otwory prowadzące przez czaszkę. Aby zapewnić brak uszkodzeń tkanki leżącej pod spodem, idealne jest -0,5 mm w z. Użyj #00-90, które są wstępnie przylutowane do złotych pinów za pomocą drutu ze stali nierdzewnej.
- Przekręć w dół do czaszki.1,5-2 pełne obroty sprawią, że śruba przejdzie przez czaszkę i zetknie się z powierzchnią kory mózgowej.
- Nawiń nadmiar drutu wokół, pozostawiając pewien luz w przewodzie do późniejszego umieszczenia na głowicy.
- Korzystając z tych samych procedur, umieść pozostałe czaszki.
- Gdy wszystkie czaszki są na swoim miejscu, podłącz wszystkie złote piny do żądanego złącza headstage. Przytrzymaj złącze na miejscu za pomocą ramienia stereotaktycznego i przytrzymaj styki złącza blisko nad, upewniając się, że przewody się nie stykają.
- Uszczelnij cały obszar klejem cyjanoakrylowym, uważając, aby nie zakłócić obszaru obrazowania przed czaszki.
- Zbuduj cement dentystyczny wokół podstawy złotych szpilek, upewniając się, że złote kołki ze czaszki nie są połączone ze złotymi szpilkami w stopniu głowy.
- Poczekaj, aż cement dentystyczny utwardzi się przed wyjęciem łącznika headstage.
- Wyjmij zwierzę z ramy stereotaktycznej i umieść je z powrotem w klatce domowej, aby mogło dojść do siebie. Postępuj zgodnie ze standardową opieką pooperacyjną i trzymaj zwierzęta na poduszce grzewczej podczas rekonwalescencji po znieczuleniu.
UWAGA: Po operacji zwierzęta były trzymane samotnie i codziennie monitorowane pod kątem bólu. Postępuj zgodnie z lokalnymi wytycznymi instytucjonalnymi dotyczącymi analgezji. W przypadku stosowania buprenorfiny o powolnym uwalnianiu należy stosować monitor bólu i ewentualnie podać dodatkową dawkę po 72 godzinach.
- Usuń wszelkie przedmioty, które mogą zaczepić się o elektrody, w tym obudowę i wzbogacenie. Używaj standardowej pościeli z dostępem ad libium do jedzenia i wody.
UWAGA: Pozwól na dwudniowy okres rekonwalescencji między zabiegiem a nagraniem.
2. Wykrywanie rozprzestrzeniających się depolaryzacji za pomocą obrazowania wewnętrznego sygnału optycznego (iOS) i elektrofizjologii prądu przemiennego
- Znieczulić zwierzęta 2% izofluranem w 100% tlenie.
UWAGA: Część obrazowa tej procedury powinna trwać ~5 minut, a ilość ekspozycji na izofluran powinna być stała. - Umieść zwierzę w stereotaktycznej ramce. Przez stożek nosowy utrzymuj 1%-2% izofluranu w tlenie.
UWAGA: Bardzo ważne jest utrzymanie odpowiedniej głębokości znieczulenia, ponieważ wiadomo, że izofluran zmniejsza SD. Zaleca się utrzymanie 60-70 oddechów/min przez cały czas trwania eksperymentu. - Umieść zwierzę pod aparatem i upewnij się, że aparat jest skupiony na powierzchni kory mózgowej, regulując pierścień ostrości.
- Nałóż olej mineralny na obszar obrazowania, aby zwiększyć przezroczystość.
- Włącz komputery, tablicę LED i sprzęt do elektrofizjologii.
UWAGA: Tablica panelowa LED działa najlepiej, gdy jest umieszczona przed zwierzęciem, aby oświetlić okno obrazowania, gdy światła górne są wyłączone. Światło zostało ustawione na ~2,400 luksów (95% mocy) z chłodnym ustawieniem temperatury 4000K. - Załaduj ustawienie dla systemu iOS za pomocą Micro-Manager19,20,21,22.
- Naciśnij przycisk Na żywo, aby wyświetlić mysz pod kamerą i wyśrodkować czaszkę zwierzęcia pod kamerą. Zamknij okno "Na żywo".
- Naciśnij przycisk Multi-D Acq.
- W oknie Akwizycja wielowymiarowa wybierz żądane punkty czasowe.
UWAGA: Zalecana jest liczba 750 obrazów w odstępie 250 ms. - Zapisz obrazy w żądanej ścieżce pliku i prefiksie nazwy.
- Podłącz złote piny od zwierzęcia do złącza headstage, a następnie do headstage.
- Ustawienie obciążenia dla oprogramowania Intan.
- Kliknij ikonę Wybierz format pliku, a następnie w wyskakującym oknie wybierz Jeden plik na format typu sygnału. Spowoduje to zapisanie pliku jako ".dat" do dalszego wykorzystania w MATLAB.
- Na karcie BW w obszarze Hardware Bandwidth (Przepustowość sprzętowa) wybierz pasmo wzmacniacza 0.13-500 Hz.
- W obszarze Filter Display Selector (Selektor wyświetlania filtra) wybierz opcję WIDE (Szeroki), aby objąć najszerszy zakres sygnałów.
- Aby wybrać żądaną ścieżkę pliku do zapisania, kliknij ikonę Wybierz nazwę pliku.
- Wykonaj uderzenie za pomocą udaru elektromagnetycznego.
UWAGA: Ustawienia udaru to prędkość uderzenia 4 m/s i ugięcie 5 mm.- Włącz impaktor i upewnij się, że końcówka odpowiednio się chowa i wysuwa, przesuwając 3-kierunkowy przełącznik, aby schować końcówkę i wysunąć końcówkę. Końcówkę należy wysunąć przed umieszczeniem zwierzęcia pod końcówką.
- Poruszając się szybko, połóż zwierzę na piankowym łóżku i wsuń legowisko pod końcówkę.
- Ustawić końcówkę impaktora na linii środkowej i 1 mm szerokości bocznej bregmy.
- Opuść końcówkę impaktora, aż mocno dotknie czubka głowy zwierzęcia.
UWAGA: Nie wciskaj końcówki w dół do głowicy. - Naciśnij dźwignię, aby schować końcówkę udaru, a następnie ręcznie opuść ją o 5 mm przed uruchomieniem dźwigni udarowej.
- Natychmiast wyjmij zwierzę z piankowego łóżka i umieść je pod kamerą w celu zobrazowania w ciągu 5 sekund, gdy SD jest inicjowane od uderzenia.
- Rozpocznij obrazowanie iOS, klikając Acquire! w oknie Multi-Dimensional Acquisition. Obraz przez 4 minuty, aby uchwycić całą kartę SD.
- Rozpocznij zapis elektrofizjologiczny, klikając ikonę Record w oprogramowaniu Intan.
- Wyjmij zwierzę z podkładki piankowej i pozwól mu dojść do siebie na otwartej arenie lub w klatce domowej.
UWAGA: Zaleca się rejestrowanie elektrofizjologii przez co najmniej 1 godzinę, aby umożliwić przywrócenie funkcji sieci korowej. - Po zakończeniu nagrywania odłącz zwierzę od sceny czołowej i złącza, a następnie umieść zwierzę z powrotem w klatce.
UWAGA: Zaleca się pozostawienie 24 godzin między każdym uderzeniem a sesją nagrywania. Zwierzę może przebywać w swojej domowej klatce przez cały czas poza sesjami nagraniowymi.
3. Wizualizacja obrazu iOS i kwantyfikacja
- W ImageJ19,20,21,22, otwórz stos obrazów, klikając sekwencję Plik > importuj > obrazu.
- Ręcznie przewijaj obrazy, aby upewnić się, że nie ma ruchu ani żadnych innych artefaktów.
- Aby wygenerować wykres SD, utwórz ROI, używając kursora do narysowania kwadratu.
UWAGA: Zaleca się użycie kwadratu o wymiarach 30 x 30 pikseli. Można użyć dowolnego kształtu lub rozmiaru, ale upewnij się, że wielkość ROI nie zmienia się u zwierząt. - Utwórz wykres, klikając Obraz > stosy > Profil osi Z wykresu. Na nowo utworzonym wykresie kliknij przycisk na żywo. Wróć do stosu obrazów SD i przesuwaj ROI, aż wykres pokaże krzywą SD. Wykres powinien wyglądać jak fala grzechu z początkowym wzrostem, po którym następuje spadek poniżej linii bazowej i powolny powrót do linii bazowej w ciągu kilku minut.
UWAGA: Wykresy mogą być wyrażone jako dowolne jednostki (AU) lub jako procentowa linia bazowa, przy użyciu kilku pierwszych obrazów jako średniej linii bazowej. - Na wygenerowanym wykresie kliknij Lista, aby wygenerować listę wartości, które można wykreślić w innym oprogramowaniu do generowania wykresów lub Matlabie.
- Aby uzyskać wizualizację, przekształć obraz w skali szarości w tabelę przeglądową w programie ImageJ za pomocą funkcji Image > Lookup Tables > Fire.
4. Analiza elektrofizjologiczna
UWAGA: Zaleca się, aby doświadczenie laboratorium Buzsaki i ich kod wygenerowany przez MATLAB były intensywnie wykorzystywane do wizualizacji i analizy danych elektrofizjologicznych. Analiza będzie wymagała pobrania MATLABa z instytucjonalnym kodem aktywacyjnym i plikiem zip "Buzcode" laboratorium Buzsaki za pośrednictwem GitHub (https://github.com/buzsakilab/buzcode).
- W oprogramowaniu do elektrofizjologii Intan upewnij się, że wyeksportowane surowe dane są zapisane w formacie ".dat".
UWAGA: Matlab można zainstalować ze strony internetowej MathWorks. Do zakupu i korzystania z Matlaba niezbędny jest instytucjonalny lub indywidualny kod aktywacyjny. Do przeprowadzenia tej analizy niezbędne jest pewne wcześniejsze doświadczenie w uruchamianiu kodu w Matlabie. - Użyj funkcji bz_LoadBinary kodu Buzaki, aby załadować dane do Matlab.
UWAGA: Przykład "'data' = bz_LoadBinary ('pełna ścieżka do pliku danych','częstotliwość', częstotliwość próbkowania, nChannels, liczba kanałów); - Filtruj szumy AC za pomocą filtra wycinającego wyśrodkowanego na 60 Hz.
UWAGA: Przykład notch_freq = 60; [b,a] = iirnotch(notch_freq/(sampling_frequency/2), notch_bandwidth/(sampling_frequency/2)); filtered_data = filtfilt(b, a, dane); - Wyizoluj aktywność wysokiej częstotliwości za pomocą filtra pasmowoprzepustowego o zakresie 0,5-100 Hz, zgodnie z zaleceniami grupy COSBID do analizy i wizualizacji rozprzestrzeniania się depolaryzacji (SD).
- Oblicz spektrogram mocy za pomocą polecenia pspectrum w MatLab.
- Aby to zobrazować, wykreśl spektrogram wysokiej częstotliwości i mocy na tej samej skali czasowej i w jednej kolumnie.
UWAGA: Z wykresów nastąpi przedłużenie depresji wysokiej częstotliwości i utraty mocy.
Wyniki
Rysunek 1 przedstawia schematyczną reprezentację układu eksperymentalnego. Śruby czaszkowe do rejestracji są rozmieszczone w pierwotnej korze wzrokowej, przy czym jedna elektroda w postaci śruby czaszkowej została umieszczona w robaku móżdżku jako elektroda uziemiająca. Śruby czaszkowe i złote piny są mocowane do czaszki za pomocą kleju cyjanoakrylowego i cementu dentystycznego. Kluczowe jest ograniczenie aplikacji cementu dentystycznego do tylnej części czaszki, aby pozostawić miejsce na zadanie uderzenia oraz obrazowanie. Miejsce uderzenia, zlokalizowane w linii środkowej i około 1 mm rostralnie od bregmy, wskazano na Rysunku 1.
Reprezentatywne obrazy sygnałów optycznych wewnętrznych (iOS) przedstawiono na Rysunku 2A. Obrazy w skali szarości przekształcono za pomocą tabeli wyszukiwania Fire, aby usprawnić wizualizację rozprzestrzeniających się depolaryzacji (SD). iOS obejmuje różne sygnały, w tym NAD(P)H, FADH oraz odbicie tkankowe, co utrudnia interpretację i porównywanie tych sygnałów. Duże naczynia powinny być wyraźnie widoczne przez okno z kleju super glue (oznaczone strzałkami), natomiast linia przerywana na Rysunku 2A oznacza propagującą się falę SD. Chociaż SD są trudne do zaobserwowania w czasie rzeczywistym, stają się bardziej widoczne po przyspieszeniu obrazów (patrz Supplementary Video 1). Niektóre małe odgałęzienia mogą wydawać się „znikać” z powodu skurczu naczyń (Rysunek 2A). Mały obszar zainteresowania (ROI) wyekstrahowany ze stosu obrazów powinien przynieść wykres osi Z podobny do Rysunku 2B. Z rejestracji elektrofizjologicznych wyekstrahowany sygnał wysokiej częstotliwości powinien przypominać górne panele na Rysunku 2C,D. Rejestracje te rozpoczęto natychmiast po łagodnym urazie czaszkowo-mózgowym (mTBI), przy czym zwierzęta pozostawały pod znieczuleniem izofluranem podczas 4 min obrazowania iOS. Po odstawieniu izofluranu aktywność wysokiej częstotliwości powinna szybko powrócić w ciągu minuty u zwierząt w grupie sham, jak pokazano na Rysunku 2C (czerwona ramka). Ilekroć wystąpiła SD, aktywność wysokiej częstotliwości pozostawała stłumiona przez kilka minut przed regeneracją (Rysunek 2D, czerwona ramka). Dolne panele na Rysunku 2C,D przedstawiają obliczoną moc (V²) dla każdego wykresu wysokiej częstotliwości. Wykresy mocy te pomagają zidentyfikować supresję i powrót aktywności wysokiej częstotliwości poprzez gwałtowny wzrost mocy (wskazany prawą krawędzią czerwonych ramek).
Rysunek 1: Układ eksperymentalny oraz lokalizacja miejsca uderzenia i śrub czaszkowych. Grzbietna powierzchnia czaszki zostaje odsłonięta poprzez nacięcie skóry. Czaszka i skóra są uszczelnione klejem cyjanoakrylowym w celu zwiększenia przejrzystości. Otwór trepanacyjny dla uziemienia jest wiercony w punkcie y = -6.00 i x = 0 względem bregmy. Otwory trepanacyjne dla elektrod rejestrujących są umieszczone w punktach y = -2.79 i x = ±2.5 względem bregmy. Śruby ze stali nierdzewnej są wkręcane w czaszkę i lutowane do złotych pinów za pomocą niepowlekanego drutu ze stali nierdzewnej. Należy zadbać o to, aby nie pokryć zbyt dużego obszaru powierzchni czaszki cementem dentystycznym, aby zapewnić odpowiednią przestrzeń do uderzenia i obrazowania. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Rysunek 2: Reprezentatywne obrazy iOS i zapisy AC. (A) Reprezentatywne obrazy iOS ze strzałkami wskazującymi naczynia krwionośne. Obrazy w skali szarości zostały przekonwertowane na tabelę wyszukiwania Fire w programie ImageJ w celu poprawy wizualizacji. Czarna przerywana linia oznacza rozprzestrzeniającą się SD, wizualizowaną jako fala zwiększonej intensywności w iOS. SD jest wyraźnie widoczna podczas szybkiego przewijania całego stosu obrazów. Sygnał iOS odzwierciedla różne zmiany fizjologiczne i metaboliczne związane z SD, w tym mitochondrialną produkcję NAD(P)H i FADH oraz obrzęk neuronalny. Czarna ramka zaznacza obszar zainteresowania (ROI) wykorzystany do wygenerowania śladu w (B). Pasek skali: 1 mm. (B) Reprezentatywny ślad SD w iOS wyrażony jako procent wartości bazowej. Sygnał iOS wzrasta i powraca do poziomu bliskiego bazowemu w ciągu około 60 s. Choć zmiany sygnałów iOS są niewielkie (około 10%), są one wystarczające do zidentyfikowania SD. W zapisach AC dla zwierząt z grupy kontrolnej (sham) (C) oraz SD (D), górne ślady pokazują aktywność wysokiej częstotliwości, a dolne ślady reprezentują moc (V²). Niebieskie ramki wskazują okresy znieczulenia izofluranem, natomiast czerwona ramka oznacza okres powrotu aktywności wysokiej częstotliwości po izofluranie i SD. Przedłużone zahamowanie wywołane przez SD kontrastuje z szybkim powrotem aktywności po samym izofluranie (sham). Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.
Wideo uzupełniające 1: Wizualizacja fali propagującej. Plik wideo został przyspieszony do około 8-krotnej prędkości, aby ułatwić wizualną identyfikację propagującej się fali. Obraz w skali szarości przekształcono za pomocą tabeli wyszukiwania Fire i zapisano jako plik .AVI w programie ImageJ. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.
Plik uzupełniający 1: Lista skrótów. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.
Dyskusja
Rozprzestrzenianie się depolaryzacji ma kluczowe znaczenie w różnych modelach chorób, w tym w urazowym uszkodzeniu mózgu (TBI), udarze mózgu i migrenie1. Dokładne wykrycie SD jest niezbędne do zrozumienia ich roli w ostrych deficytach behawioralnych i/lub aktywacji układu neuroimmunologicznego po łagodnych urazowych uszkodzeniach mózgu (mTBI)23,24. Aby zminimalizować ryzyko braku kart SD w przypadku korzystania z jednej metody, konieczne jest podejście wielometodyczne do skutecznej wizualizacji i rejestrowania kart SD.
Podczas gdy łączenie technik umożliwia potwierdzenie rozprzestrzeniania się depolaryzacji (SD), każda technika może mieć potencjalne pułapki. Techniki obrazowania opisane w tym protokole są dostępne dla większości laboratoriów i są szczegółowo opisane przez Zepedę i współpracowników25. Przygotowanie okienka czaszkowego ma kluczowe znaczenie, ponieważ nieprzezroczyste okienka mogą prowadzić do niejednoznacznych obrazów26. Problem ten można złagodzić, minimalizując ekspozycję czaszki na powietrze przed nałożeniem kleju cyjanoakrylowego. Dodatkowo przezroczystość okna można poprawić za pomocą kropli oleju mineralnego przed obrazowaniem. Artefakty ruchu mogą również komplikować potwierdzenie SD, więc zminimalizowanie tych artefaktów jest niezbędne do uzyskania wyraźnego obrazu. Aby temu zaradzić, ważne jest, aby zwierzę było poddawane izofluranowi przez cały proces obrazowania27. Zastosowanie stożka nosowego ułatwia sprawne przenoszenie zwierzęcia między impaktorem a zestawem nagrywającym. Bardzo ważne jest, aby po uderzeniu szybko umieścić zwierzę z powrotem pod stożkiem nosowym, aby uchwycić jak najwięcej propagacji SD. W tym modelu łagodnego urazowego uszkodzenia mózgu (mTBI) nagrywanie przez około 4 minuty jest zwykle wystarczające do uchwycenia całej SD. Jednak w cięższych TBI spontaniczne SD mogą być generowane przez uszkodzenie tkanek28. Ciągłe obrazowanie może wykryć te spontaniczne SD, ale przedłużone znieczulenie izofluranem może utrudnić obserwację depresji o wysokiej częstotliwości. Spontaniczne SD mogą być wykryte za pomocą elektrofizjologii przez dodatkowe depresje w aktywności o wysokiej częstotliwości, ale potwierdzenie związku między depresją a SD jest trudne bez obrazowania.
Wraz z rozwojem wzmacniaczy Open-Ephys i Intan, elektrofizjologia in vivo jest obecnie dostępna dla wielu laboratoriów. Wszystkie zapisy elektrofizjologiczne wymagają wszczepienia czaszkowych i/lub elektrod. W tym protokole występuje dwudniowy okres opóźnienia między wszczepieniem czaszki a nagrywaniem w celu wsparcia powrotu do zdrowia. Chociaż okres ten może nie być wystarczający, aby mózg w pełni zregenerował się po implantacji, uszkodzenia powinny być minimalne, ponieważ czaszki nie wnikają w tkankę mózgową. Dodatkowo przezroczystość czaszki uszczelnionej cyjanoakrylanem zmniejsza się z czasem, dlatego obrazowanie należy wykonać jak najszybciej, aby uzyskać optymalną przezroczystość. W elektrofizjologii kluczowe znaczenie ma minimalizacja szumów o częstotliwości 60 Hz. Upewnij się, że obszar eksperymentalny jest odizolowany od zasilania prądem zmiennym i prawidłowo uziemiony do Intan amplifier. Chociaż artefaktów ruchu nie można całkowicie wyeliminować, akcelerometry na scenie głowy mogą pomóc w identyfikacji i usuwaniu okresów ruchu podczas przetwarzania końcowego. Ogólnie rzecz biorąc, techniki te mogą dostarczyć cennych informacji na temat odzyskiwania SD i funkcji sieci korowej po łagodnych urazowych uszkodzeniach mózgu (mTBI).
Jednym z ograniczeń tych technik jest to, że zwierzęta są pod narkozą podczas obrazowania. Jednak większość modeli TBI wymaga znieczulenia, a rozszerzone znieczulenie prawdopodobnie nie wpłynie znacząco na projekt eksperymentalny. Izofluran znacznie zmniejsza aktywność o wysokiej częstotliwości27. Jeśli ekspozycja na izofluran wykracza poza okres obrazowania, może to utrudnić wykrycie powrotu do aktywności o wysokiej częstotliwości po SD. Dlatego tak ważne jest, aby w projekcie eksperymentalnym uwzględnić grupę pozorowaną lub zawierającą sam izofluran, aby porównać odzyskiwanie aktywności o wysokiej częstotliwości, jak pokazano na rysunku 2. Kolejnym ograniczeniem jest to, że zapisy elektrofizjologiczne nie wykrywają przesunięcia DC. Amplituda i czas trwania przesunięcia DC są wskaźnikami zdrowia tkanek i regeneracji po SD28. Niemniej jednak potwierdzenie SD za pomocą tych technik nadal dostarczy cennych informacji na temat badań nad TBI.
Wszyscy badacze TBI odnieśliby korzyści z opisanych tutaj technik, ponieważ jest wysoce prawdopodobne, że wszystkie modele TBI wytwarzają depolaryzacje rozprzestrzeniające się (SD). Dziedzina TBI znacznie zyskałaby na zrozumieniu roli SD w urazach, progresji urazu, aktywacji neuroimmunologicznej i powrocie do zdrowia. Ostatnie badania sugerują, że SD przyczyniają się do deficytów behawioralnych i mogą być mechanizmem leżącym u podstaw upośledzenia neurologicznego 5,7. Techniki przedstawione w tym protokole pomogą w wyjaśnieniu związku między TBI i SD. Przyszłe zastosowania tych technik mogą rozszerzyć się na inne dziedziny badań, w tym udar, epilepsję i migrenę.
Podziękowania
Ta praca była wspierana przez granty P20GM109089 NIGMS PR200891 i Departamentu Obrony.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| #00-90 x .118 Śruba maszynowa | US Micro Screw | 00.90-118-M-SS-P, Amazon | |
| Wiertło o średnicy 0,8 mm | Wiertło do PCB | WYTP21, Amazon | |
| 16-A Headstage | Intan | C3335 | |
| 2,1 mm Frezy mikrowiertło | Fine Science Tools | 19007-21 | |
| Wzmacniacz AC | Intan | RHD | |
| Myszki C57BL/6J | Laboratorium Jacksona | Kamera CCD Jax#000664 | |
| Mightex | TCE-1304-U | ||
| Obiektyw przedłużający | Zeikos | ZE-ETN | |
| Ethiqa XR (buprenorfina o powolnym uwalnianiu) | Midwest Veterinary Supply | Numer produktu 267.10000.3 | |
| Złoty pin złącza (żeński) | A-M Systems | 520100 | |
| Złoty pin złącza (męski) | A-M Systems | 520200 | |
| ImageJ2/Fiji | Image J | NA | |
| Impaktor Jeden | Leica 39463930 | ||
| Tablica panelowa LED | Supon | L122t | |
| MATLAB | MathWorks | Instytucjonalny lub indywidualny kod | |
| Klej cyjanoakrylowy klasy medycznej | MasterBond | MB287 | |
| Micro-Manager Camera Software | Obraz J | NA | |
| Wiertarka do paznokci / polerka | Makartt Wiertarka do paznokci Elektryczny pilnik do paznokci | JD700 | |
| Złącza Omnetic | Omnetics | A79014-001 | |
| Oprogramowanie do akwizycji danych RHX | Intan | NA | |
| Drut niepowlekany ze stali nierdzewnej (0,005") | Systemy AM | 792800 | |
| Rama stereotaktyczna | Kopf Intruments | 1923-B | |
| Trójniki "utwardzany na zimno" cement dentystyczny | Systemy AM | 525000, 526000 | |
| Obiektyw XLR do aparatu | Nikon | NIKKOR 50 mm f/1.8-16 |
Bibliografia
- Pietrobon, D., Moskowitz, M. Chaos and commotion in the wake of cortical spreading depression and spreading depolarizations. Nat Rev Neurosci. 15 (6), 379-393 (2014).
- Hartings, J. A., et al. Repetitive cortical spreading depolarizations in a case of severe brain trauma. Neurological Res. 30 (8), 876-882 (2008).
- Andrew, R. D., et al. Questioning glutamate excitotoxicity in acute brain damage: The importance of spreading depolarization. Neurocrit Care. 37, 11-30 (2022).
- Andrew, R. D., et al. Thecritical role of spreading depolarizations in early brain injury: Consensus and contention. Neurocrit Care. 37, 83-101 (2022).
- Pacheco, J., et al. Spreading depolarizations are associated with concussion-like behavior. eNeuro. 6 (6), (2019).
- Bouley, J., Chung, D. Y., Ayata, C. Y., Brown, R. H., Henninger, N. Cortical spreading depression denotes concussion injury. J Neurotrauma. 35, 1-10 (2018).
- Pinkowski, N. J., et al. Spreading depolarizations contribute to the acute behavior deficits associated with a mild traumatic brain injury in mice. J Neurotrauma. 41 (1-2), 271-291 (2023).
- Dreier, J. P., et al. Recording, analysis, and interpretation of spreading depolarizations in neurointensive care: Review and recommendations of the COSBID research group. J Cereb Blood Flow and Metab. 37 (5), 1595-1625 (2017).
- Herreras, O., Somjen, G. G. Analysis of potential shifts associated with recurrent spreading depression and prolonged unstable spreading depression induced by microdialysis of elevated K+ in hippocampus of anesthetized rats. Brain Res. 610 (2), 283-294 (1993).
- Boas, D. A., Dunn, A. K. Laser speckle contrast imaging in biomedical optics. J Biomed Opt. 15 (1), 011109(2014).
- Hadjikhani, N., et al. Mechanisms of migraine aura revealed by functional MRI in human visual cortex. PNAS. 98 (8), 4687-4692 (2001).
- Dietz, R. M., Weis, J. H., Shuttleworth, C. W. Contributions of Ca2+ and Zn2+ to spreading depression-like events and neuronal injury. J Neurochem. 109 (Suppl 1), 145-152 (2009).
- Reinhart, K. M., Shuttleworth, C. W. Ketamine reduces deleterious consequences of spreading depolarizations. Exp Neurol. 305, 121-128 (2018).
- Mané, M., Müller, M. Temporo-spectral imaging of intrinsic optical signals during hypoxia-induced spreading depression-like depolarization. PLoS One. 7 (8), (2012).
- Brennan, A. M., Connor, J. A., Shuttleworth, C. W. NAD(P)H fluorescence transients after synaptic activity in brain slices: predominant role of mitochondrial function. J Cereb Blood Flow and Metab. 26 (11), 1389-1406 (2006).
- Shuttleworth, C. W., Brennan, A. M., Connor, J. A NAD(P)H fluorescence imaging of postsynaptic neuronal activation in murine hippocampal slices. J Neurosci. 23 (8), 3196-3208 (2003).
- Sword, J., Croom, D., Wang, P. L., Thompson, R. J., Kirov, S. A. Neuronal pannexin-1 channels are not molecular routes of water influx during spreading depolarization-induced dendritic beading. J Cereb Blood Flow and Metab. 37 (5), 1626-1633 (2017).
- Chung, D. Y., et al. Real-time non-invasive in vivo visible light detection of cortical spreading depolarizations in mice. J Neurosci Methods. 309, 143-146 (2018).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Rueden, C. T., et al. ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data. BMC Bioinform. 18 (1), 1-26 (2017).
- Edelstein, A., Amodaj, N., Hoover, K., Vale, R., Stuurman, N. Computer control of microscopes using µManager. Curr Protoc Mol Biol. 14, (2010).
- Edelstein, A. D., et al. Advanced methods of microscope control using µManager software. J of Biol Methods. 1 (2), e10(2014).
- Soldozy, S., et al. Cortical spreading depression in the setting of traumatic brain injury. World Neurosurg. 134, 50-57 (2020).
- Zepeda, A., Arias, C., Sengpiel, F. Optical imaging of intrinsic signals: Recent developments in the methodology and its applications. J Neurosci Methods. 136 (1), 1-21 (2004).
- Steinzeig, A., Molotkov, D., Castrén, E. Chronic imaging through "transparent skull" in mice. PLoS One. 12 (8), (2017).
- Sword, J., Masuda, T., Croom, D., Kirov, S. A. Evolution of neuronal and astroglial disruption in the peri-contusional cortex of mice revealed by in vivo two-photon imaging. Brain. 136 (5), 1446-1461 (2013).
- Hudetz, A. G., Vizuete, J. A., Pillay, S. Differential effects of isoflurane on high-frequency and low-frequency oscillations in the cerebral cortex and hippocampus in freely moving rats. Anesthesiology. 114 (3), 1588-1595 (2011).
- Reinhart, K. M., Morton, R. A., Brennan, K. C., Carlson, A. P., Shuttleworth, C. W. Ketamine improves neuronal recovery following spreading depolarization in peri-infarct tissues. J Neurochem. 168 (5), 855-867 (2023).
Przedruki i uprawnienia
