Tutaj opisana jest metoda wysokosprawnej chromatografii cieczowej fazy normalnej, mająca na celu wykrywanie i ilościowe określanie krytycznych retinoidów zaangażowanych w ułatwianie funkcji wzrokowych zarówno w tkance ocznej, jak i ogólnoustrojowej, w kontekście ogólnoustrojowego dostarczania witaminy A do wytwarzania niezbędnego światłoczułego chromoforu rodopsyny 11-cis-retinal.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Analiza ilościowa metabolitów witaminy A w diecie metabolitów witaminy A w mysich tkankach ocznych i nieocznych przy użyciu wysokosprawnej chromatografii cieczowej
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Receptory sprzężone z białkiem G (GPCR) to nadrodzina białek transbłonowych, które inicjują kaskady sygnałowe poprzez aktywację białka G po połączeniu z jego ligandem. We wszystkich zmysłach widzenia ssaków rodopsyna jest GPCR odpowiedzialnym za inicjację kaskady fototransdukcji. W fotoreceptorach rodopsyna jest związana ze swoim chromoforem 11-cis-retinalem i jest aktywowana poprzez światłoczułą izomeryzację 11-cis-retinalu do all-trans-siatkówki, co aktywuje białko transducyny G, powodując kaskadę fototransdukcji.
Chociaż fototransdukcja jest dobrze zrozumiana, procesy związane z dostarczaniem w diecie prekursorów witaminy A do generowania 11-cis-siatkówki w oku, jak również choroby powodujące zakłócenie tego dostarczania, nie są jeszcze w pełni zrozumiałe. Po wchłonięciu prekursorów witaminy A do jelita są one przechowywane w wątrobie w postaci estrów retinylu i uwalniane do krwiobiegu jako all-trans-retinol związany z białkiem wiążącym retinol 4 (RBP4). Ten krążący RBP4-retinol zostanie wchłonięty przez narządy ogólnoustrojowe, takie jak wątroba, płuca, nerki i oko. W związku z tym metoda ilościowego oznaczania różnych metabolitów witaminy A w diecie witaminy A w oku i narządach ogólnoustrojowych ma kluczowe znaczenie dla badania prawidłowej funkcji rodopsyny GPCR.
W tej metodzie prezentujemy kompleksową metodę ekstrakcji i analizy witaminy A w tkance mysjej. Dzięki analizie wysokosprawnej chromatografii cieczowej w fazie normalnej wszystkie istotne izomery retinaldehydów, retinoli i estrów retinylu mogą być wykrywane jednocześnie w jednym przebiegu, co pozwala na efektywne wykorzystanie próbek eksperymentalnych i zwiększa wewnętrzną niezawodność dla różnych metabolitów witaminy A w tej samej próbce. Dzięki tej kompleksowej metodzie badacze będą w stanie lepiej ocenić ogólnoustrojową podaż witaminy A w funkcji rodopsyny GPCR.
Wprowadzenie
Receptory sprzężone z białkiem G (GPCRs) są jedną z najlepiej zbadanych i scharakteryzowanych znanych nadrodzin białek. W swojej najbardziej znanej funkcji GPCR służą jako receptor powierzchniowy komórki w transdukcji sygnału, inicjując odpowiedzi wewnątrzkomórkowe po związaniu się ze specyficznym ligandem. GPCR charakteryzują się siedmioma transbłonowymi (TM) domenami spiralnymi i sześcioma całkowitymi domenami pętlowymi. Spośród sześciu pętli, trzy pętle są zorientowane zewnątrzkomórkowo, aby ułatwić wiązanie liganda, podczas gdy pozostałe trzy pętle wewnątrzkomórkowe są sprzężone z heterotrimerycznym białkiem G składającym się z podjednostek Gα, Gβ i Gγ
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
UWAGA: Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) Uniwersytetu Minnesoty (protokół # 2312-41637A) i przeprowadzone zgodnie z Oświadczeniem ARVO dotyczącym wykorzystania zwierząt w badaniach okulistycznych i wzrokowych. Wykonuj wszystkie ekstrakcje w ciemności, w słabym czerwonym świetle dla oświetlenia. Należy zwrócić uwagę na szczątkowe światło emitowane przez wyświetlacze wskaźników i diody LED akcesoriów.
1. Generacja wzorca spektrofotometrycznego retinoidu i zewnętrzna krzywa wzorcowa
UWAGA: Przygotuj pojemn....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
W niniejszej pracy wykorzystaliśmy opisaną powyżej metodę do wykrywania i oznaczania ilościowego retinoidów w tkankach oka oraz tkankach systemowych myszy, a następnie wygenerowaliśmy reprezentatywne chromatogramy. Dodatkowo przedstawimy podsumowanie typowych retinoidów, które można wykryć w tych tkankach.
Myszy w wieku 6 miesięcy uśmiercono poprzez uduszenie CO2. Aby zachować zawartość retinoidów w oku, myszy adaptowano do ciemności przez 2 dni przed uśmierceniem i ekstrakcją. Do e.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
W tej metodzie HPLC w fazie normalnej służy do wykrywania i ilościowego oznaczania odpowiednich retinoidów, w tym estrów retinylu, retinaldehydów i retinoli. Biorąc pod uwagę znaczenie 11-cis-retinalu jako krytycznego chromoforu w aktywacji rodopsyny GPCR, metoda, która może wykryć metabolity związane z produkcją 11-cis-retinalu, ma kluczowe znaczenie dla badania ogólnych funkcji wzrokowych. Główną zaletą tej metody jest to, że wszystkie istotne izomery zarówno retinaldehydów, jak i retinoli mogą być je.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.
Podziękowania
Ta praca była wspierana przez granty NIH-NEI (EY030889 i 3R01EY030889-03S1) oraz częściowo przez fundusze startowe Uniwersytetu Minnesoty dla G.P.L. Chcielibyśmy również podziękować Narodowemu Instytutowi Okulistyki za udostępnienie nam standardu 11-cis-retinal użytego w tym manuskrypcie.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Odczynnik | |||
| 1-Octanol, odpowiedni do HPLC, ≥ 99,5% | Sigma-Aldrich, Millipore Sigma | 203-917-6 | |
| 1,4-dioksan, odpowiedni do HPLC, ≥ 99,5% | Sigma-Aldrich, Millipore Sigma | 204-661-8 | |
| 11-cis-retinol | National Eye Institute | N/A | |
| 11-cis-retinol | Research Chemicals | TRC-R252105 | |
| 13-cis-retinal | Toronto Research Chemicals | TRC-R239900 | |
| 13-cis-retinol | Toronto Research Chemicals | TRC-R252110 | |
| All-trans-Retinal | Toronto Research Chemicals | TRC-R240000 | |
| All-trans-Retinol | Toronto Research Chemicals | TRC-R252002 | |
| Octan etylu, odpowiedni do HPLC, ≥ 99,7% | Sigma-Aldrich, Millipore Sigma | 205-500-4 | |
| Heksan, klasa HPLC | Fisher Scientific, Spectrum Chemical | 18-610-808 | |
| Metanol (HPLC) | Fisher Scienctific | A452SK-4 | |
| Palmitynian retinylu | Toronto Research Chemicals | TRC-R275450 | |
| Chlorek sodu (krystaliczny / certyfikowany ACS) | Fisher Scientific | S271-500 | |
| Instruments | |||
| 1260 Analityczny kolektor frakcji Infinity II | Agilent | G1364F | |
| 1260 Infinity II Pompa | binarna Agilent | G7112B | |
| 1260 Detektor diodowy Infinity II | Agilent | G7115A | |
| Infinity II | Agilent | G7116A | |
| 1260 Infinity II Vialsampler | Agilent | G7129A | |
| ST40R Wirówka z chłodzeniem | Thermo Scientific | TSST40R | |
| Vacufuge Plus Koncentrator wirówek | Eppendorf | 22820168 | |
| Consumables | |||
| 2 mL Bursztynowe fiolki z zakrętką | Agilent | 5188-6535 | |
| Nasadka zaciskana z przegrodą PTFE/czerwona guma, 11 mm | Agilent | 5183-4498 | |
| Jednorazowe szklane stożkowe probówki wirówkowe | Millipore Sigma | CLS9950215 | |
| Probówka z nakrętką, 15 ml | Sarstedt | 62.554.502 | |
| Wkładka do fiolki, 150 &mikro; L, szkło z nóżkami polimerowymi | Agilent | 5183-2088 |
Bibliografia
- Palczewski, K., et al. Crystal structure of rhodopsin: A G protein-coupled receptor. Science. 289 (5480), 739-745 (2000).
- Rosenbaum, D. M., Rasmussen, S. G. F., Kobilka, B. K. The structure and function of G-protein-coupled receptors. Nature. 459 (7245), 356-363 (2009).....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
