Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Fotobiomodulacja pod elektroencefalograficzną kontrolą snu w celu stymulacji limfatycznego usuwania toksyn z mózgu myszy

1.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/67035

⸱

28 czerwca 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biology, Saratov State University, 2Institute of Physics, Department of Optics and Biophotonics, Saratov State University, 3Institute of Biochemistry and Physiology of Plants and Microorganisms, Saratov Scientific Centre of the Russian Academy of Sciences

W tym artykule

Podsumowanie

To badanie przedstawia oryginalną i przenośną technologię tPBM pod elektroencefalograficzną (EEG) kontrolą głębokiego lub nieszybkiego ruchu gałek ocznych (NREM) snu u nieznieczulonych samców myszy C57BL/6 w różnym wieku, aby stymulować klirens limfatyczny Aβ z mózgu do obwodowego układu limfatycznego (głębokie węzły chłonne szyjne, dcLNs).

Streszczenie

Naczynia limfatyczne opon mózgowych (MLV) odgrywają ważną rolę w usuwaniu toksyn z mózgu. Rozwój innowacyjnych technologii stymulacji funkcji MLV jest obiecującym kierunkiem w leczeniu różnych chorób mózgu związanych z nieprawidłowościami MLV, w tym chorób Alzheimera i Parkinsona, guzów mózgu, urazowych urazów mózgu i krwotoków śródczaszkowych. Sen jest naturalnym stanem, w którym procesy drenażowe mózgu są najbardziej aktywne. Dlatego stymulacja drenażu mózgu i MLV podczas snu może mieć najbardziej wyraźne efekty terapeutyczne. Jednak takie komercyjne technologie obecnie nie istnieją.

To badanie przedstawia nową przenośną technologię przezczaszkowej fotobiomodulacji (tPBM) pod elektroencefalograficzną (EEG) kontrolą snu, zaprojektowaną w celu fotostymulacji usuwania toksyn (np. rozpuszczalnego beta-amyloidu (Aβ)) z mózgu starszych myszy BALB/c z możliwością porównania skuteczności terapeutycznej różnych środków optycznych. Technologia może być stosowana w naturalnych warunkach domowej klatki bez znieczulenia, utrzymując aktywność motoryczną myszy. Dane te otwierają nowe perspektywy rozwoju nieinwazyjnych i obiecujących klinicznie technologii fotograficznych do korekcji związanych z wiekiem zmian w funkcjach MLV i procesach drenażu mózgu oraz do skutecznego oczyszczania tkanek mózgowych z metabolitów i toksyn. Technologia ta jest przeznaczona zarówno do badań przedklinicznych nad funkcjami śpiącego mózgu, jak i do opracowywania klinicznie istotnych metod leczenia chorób mózgu związanych ze snem.

Wprowadzenie

Naczynia limfatyczne opon mózgowych (MLV) odgrywają ważną rolę w usuwaniu toksyn i metabolitów z tkanek mózgowych1,2,3. Uszkodzeniu MLV w różnych chorobach mózgu, w tym nowotworach, urazowych urazach mózgu, krwotokach i procesach neurodegeneracyjnych, towarzyszy spadek funkcji MLV, co prowadzi do postępu tych patologii1,2,3,4,5,6. Dlatego rozwój metod stymulacji MLV otwiera nowe horyzonty w powstawaniu skutecznych technologii leczenia chorób mózgu. Niedawno zaproponowano nieinwazyjną technologię skutecznej przezczaszkowej fotobiomodulacji (tPBM) w celu stymulacji MLV i usuwania toksyn, takich jak krew i Aβ z mózgu5,7,8,9,10,11,12. Warto zauważyć, że głęboki sen jest naturalnym czynnikiem aktywacji procesów drenażu limfatycznego w mózgu13,14. Opierając się na tym fakcie, logiczne jest założenie, że tPBM MLV podczas snu może mieć bardziej skuteczne efekty terapeutyczne niż podczas czuwania9,11,12,15. Jednak obecnie nie ma komercyjnych technologii dla tPBM podczas snu16. Ponadto eksperymenty na zwierzętach w celu zbadania efektów terapeutycznych tPBM są przeprowadzane w znieczuleniu, które jest wymagane do dokładnego dostarczania światła do mózgu. Jednak znieczulenie znacząco wpływa na drenaż mózgu, co obniża jakość wyników badań17.

Aβ jest produktem metabolicznym normalnej aktywności neuronalnej18. Jak ustalono w hodowanych neuronach korowych szczurów, Aβ jest z nich uwalniany z dużą szybkością do przestrzeni zewnątrzkomórkowej (2-4 cząsteczki/neuron/s dla Aβ)19. Istnieją dowody na to, że rozpuszczona forma Aβ, znajdująca się w przestrzeniach zewnątrzkomórkowych i okołonaczyniowych, jest najbardziej toksyczna dla neuronów i synaps20. Rozpuszczalny Aβ jest szybko usuwany z ludzkiego mózgu w ciągu 1-2,5 h21. MLV to tunele do usuwania rozpuszczalnego Aβ z mózgu1,7, który zmniejsza się wraz z wiekiem, prowadząc do akumulacji Aβ w starzejącym się mózgu1,22. Istnieją dowody na to, że zewnątrzkomórkowe nieprawidłowości poziomu Aβ w mózgu korelują ze zdolnościami poznawczymi w starzeniu się i są związane z rozwojem choroby Alzheimera (AD)23,24. Dlatego stare i stare gryzonie są uważane za alternatywę dla modeli transgenicznych do badania amyloidozy, w tym AD25,26.

To badanie przedstawia oryginalną i przenośną technologię tPBM pod elektroencefalograficzną (EEG) kontrolą głębokiego lub nieszybkiego ruchu gałek ocznych (NREM) snu u nieznieczulonych samców myszy C57BL/6 w różnym wieku, aby stymulować klirens limfatyczny Aβ z mózgu do obwodowego układu limfatycznego (głębokie węzły chłonne szyjne, dcLNs).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie procedury zostały przeprowadzone zgodnie z "Przewodnikiem opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych", Dyrektywą 2010/63/UE w sprawie ochrony zwierząt wykorzystywanych do celów naukowych oraz wytycznymi Ministerstwa Nauki i Szkolnictwa Wyższego Federacji Rosyjskiej (nr 742 z 13.11.1984), które zostały zatwierdzone przez Komisję Bioetyczną Uniwersytetu Państwowego w Saratowie (Protokół nr 7, 22.09.2022).

1. Montaż sprzętu

  1. Wytnij kawałek folii tekstolitowej o grubości 1,5 mm do wymiarów 1,5 mm x 2 mm. Ta część będzie określana jako płytka drukowana (PCB) z diodą elektroluminescencyjną (LED) ( Rysunek 1C).
  2. diodę LED do płytki drukowanej, jak pokazano na Rysunek 1.
  3. dwa skręcone druty miedziane do pinów diody LED, a następnie przykryj je tuleją.
  4. Wydrukuj model 3D ramy (Rysunek 1A); umieść diodę LED (Rysunek 1B) i magnesy (Rysunek 1D) na ramie; umieść podkładkę (Rysunek 1E) na główce myszy.
  5. Aby zmontować obwód (Rysunek 2), wykonaj następujące kroki.
    1. Najpierw podłącz rezystor (Rysunek 2; R1) między anodą LED a portem 5 V w Arduino.
    2. Następnie podłącz katodę LED do tranzystora polowego (MOSFET) z tlenkiem metalu i półprzewodnika (MOSFET) (Rysunek 2; Q1) drenaż. Następnie podłącz źródło MOSFET do masy.
    3. Podłącz rezystor ściągający (Rysunek 2; R2) między bramką MOSFET a masą. Na koniec podłącz bramkę MOSFET do pinu 3 w Arduino.
  6. Podłącz nakładkę klawiatury wyświetlacza ciekłokrystalicznego (LCD) do Arduino.
  7. Wydrukuj modele 3D obudowy, pokrywy i przycisków. Włóż płytkę Arduino z osłoną klawiatury LCD, tranzystorem MOSFET i złączem LED do obudowy, jak pokazano na Rysunek 3.

2. Przewodnik po oprogramowaniu (Rysunek 4)

  1. Pobierz szkic Arduino (plik .ino) i otwórz go za pomocą zintegrowanego środowiska programistycznego Arduino (IDE) (Supplementary Coding File 1).
  2. Wybierz właściwy port komunikacyjny (COM) i zaktualizuj oprogramowanie układowe.
  3. Interfejs zawiera dwie kolumny. Użyj przycisków w lewo i w prawo, aby nawigować między tymi kolumnami. Wskaźnik zaznaczenia znajduje się po lewej stronie kolumny.
  4. Lewa kolumna na ekranie to pole wyboru cyklu pracy modulacji szerokości impulsu (PWM). Użyj przycisków w górę i w dół, aby dostosować cykl pracy. Osiągnij dawkę 10/20/30 Dj/cm2 PBM przy odpowiednim cyklu pracy 2%/4%/6% PWM w sesji 17-minutowej.
  5. Kolumna po prawej stronie ekranu to pole RUN/Off. Aby zaznaczyć tę kolumnę, naciśnij prawy przycisk na klawiaturze, a następnie naciśnij przycisk Wybierz. Gdy proces jest uruchomiony, wskaźnik aktywności zacznie migać, a tekst na przycisku URUCHOM zmieni się na OFF.
    NUTA. Myszy są przygotowywane do eksperymentów przez okres 10 dni, w tym do implantacji elektrod EEG, implantacji przewlekłego cewnika do prawej komory bocznej w celu wstrzyknięcia fluorescencyjnego Aβ oraz umieszczenia płytki do PBM.

3. Wdrożenie systemu zapisu EEG (Rysunek 5)

  1. Zważyć mysz i znieczulić ją mieszaniną ketaminy i ksylazyny (odpowiednio 100 mg/kg; 10 mg/kg) przez wstrzyknięcie domięśniowe w udo. Ksylazynę należy podawać jako przedoperacyjne środki przeciwbólowe w stężeniu 20 mg/ml w dawce 1,5 ml/kg.
  2. Gdy ustaną odruchy wycofania tylnej stopy i reakcja na uszczypnięcie ogona, umieść mysz w stereotaktycznej ramce nad poduszką grzewczą (Rysunek 5A).
  3. Nałóż maść okulistyczną na powieki, aby zapobiec wysuszeniu gałek ocznych podczas zabiegu. Powtórz tę procedurę, gdy tylko zajdzie taka potrzeba.
  4. Ogol głowę w obszarze od kości nosowych do kości potylicznych za pomocą maszynki do golenia i zdezynfekuj odsłoniętą skórę naprzemiennie po 3 razy chlorheksydyny i alkoholu.
  5. Za pomocą prostych nożyczek preparacyjnych odetnij skórę głowy, przytrzymaj ją mikrokleszkami, oczyść czaszkę z powięzi i osusz wacikami. W razie potrzeby użyj środków hemostatycznych.
  6. Za pomocą wiertła o średnicy 1,3 mm wykonaj 2 otwory w kościach skroniowych z każdej strony wzdłuż współrzędnych: AP = -1 mm dla pierwszej pary i AP = -3 mm dla drugiej pary.
  7. Umieść EEG z przewodami w alkoholu na 15 minut, a następnie umieść EEG w roztworze soli fizjologicznej.
  8. Umieść cztery posrebrzane z elektrodami w otworach na głębokość 1 mm (Rysunek 5B).
  9. Przymocuj do powierzchni czaszki za pomocą akrylu dentystycznego tak, aby wystające z nich elektrody znajdowały się w kierunku nosa zwierzęcia (Rysunek 5C). Pozwól akrylowi dentystycznemu stwardnieć przez 15 minut.
  10. Przymocuj czujnik zapisu EEG do nosa zwierzęcia za pomocą akrylu dentystycznego. Pozwól akrylowi dentystycznemu stwardnieć przez 30 minut (Rysunek 5D).
  11. Umieść elektrody EMG z tyłu mięśnia okrężnego oka za pomocą zakrzywionej pęsety i przymocuj je za pomocą akrylu dentystycznego. Pozwól akrylowi dentystycznemu stwardnieć przez 15 minut (Rysunek 5E).
  12. Podłącz elektrody EEG do posrebrzanego wgłębienia czujnika i je za pomocą stacji lutowniczej. Następnie zamocuj elektrody EEG za pomocą akrylu dentystycznego (Rysunek 5F).
  13. Po operacji umieść mysz na poduszce grzewczej, aby utrzymać temperaturę ciała, dopóki zwierzę w pełni nie wyzdrowieje ze znieczulenia.
  14. Następnie umieść mysz w indywidualnej klatce domowej ze swobodnym dostępem do jedzenia i wody z ibuprofenem (40 mg/kg w 200 ml wody) w celu znieczulenia po operacji przez 10 dni.
    UWAGA: Każde zwierzę było trzymane w indywidualnej klatce, aby myszy nie mogły zdeformować systemu rejestracji EEG. Ibuprofen był dostarczany z wodą, aby zapobiec stresowi u zwierząt.

4. Implantacja płytki do PBM

  1. Zważyć mysz i znieczulić ją mieszaniną ketaminy i ksylazyny (odpowiednio 100 mg/kg; 10 mg/kg) we wstrzyknięciu domięśniowym w udo 7 dni po implantacji systemu rejestracji EEG. Ksylazynę należy podawać jako przedoperacyjne środki przeciwbólowe w stężeniu 20 mg/ml w dawce 1,5 ml/kg.
  2. Gdy ustaną odruchy wycofania tylnej stopy i reakcja na uszczypnięcie ogona, ustaw mysz w systemie stereotaktycznym.
  3. Nałóż maść okulistyczną na powieki, aby zapobiec wysuszeniu gałek ocznych podczas zabiegu. Powtórz tę procedurę, gdy tylko zajdzie taka potrzeba.
  4. Przymocuj metalową płytkę o średnicy 5 mm do kości potylicznej czaszki za pomocą akrylu dentystycznego i kleszczy Dumonta. Pozwól akrylowi dentystycznemu stwardnieć przez 15 minut (Rysunek 6).

5. Przygotowanie przewlekłego cewnika

  1. Zaznacz na igle insulinowej segment 2 cm od boku ściętego końca.
  2. Zamocować igłę insuliny w uchwycie igły od strony ściętej końcówki do zaznaczonego segmentu.
  3. Umieścić cewnik polietylenowy PE-10 o średnicy 2 cm na całej pozostałej długości igły.
  4. Napełnij cewnik roztworem soli fizjologicznej i przykryj go plastikową nasadką, aby go uszczelnić.

6. Implantacja przewlekłego cewnika do prawej bocznej komory

  1. Po implantacji płytki do PBM należy wykonać otwór trepanacyjny o współrzędnych AP = -0,5 mm i ML = 1,2 mm, o średnicy 1,5 mm, za pomocą wiertła.
  2. Umieść cewnik polietylenowy PE-10 w uchwycie stereotaktycznym i włóż go do czaszki myszy (DV = 2 mm). Następnie napraw go za pomocą akrylu dentystycznego. Pozwól akrylowi dentystycznemu stwardnieć przez 15 minut (Rysunek 7).
  3. Po operacji umieść mysz na poduszce grzewczej, aby utrzymać temperaturę ciała, dopóki zwierzę w pełni nie wyzdrowieje ze znieczulenia.
  4. Następnie umieść mysz w indywidualnej klatce domowej ze swobodnym dostępem do jedzenia i wody z ibuprofenem (40 mg/kg w 200 ml wody) w celu znieczulenia po operacji przez 10 dni.
    UWAGA: Każde zwierzę było trzymane w indywidualnej klatce, aby myszy nie mogły zdeformować systemu rejestracji EEG. Ibuprofen był dostarczany z wodą, aby zapobiec stresowi u zwierząt. W okresie rehabilitacji (7 dni) należy nałożyć maść przeciwbakteryjną na odsłonięte obszary czaszki i tkanek miękkich, aby zapobiec ich wysuszeniu.

7. tPBM pod kontrolą EEG snu NREM

  1. Podłącz dowolny komercyjny system rejestracji EEG do złącza na główce myszy i ustaw wymaganą wartość cyklu pracy PWM.
  2. Monitoruj sygnał EEG i poczekaj na aktywność rytmu delta. Jeśli zaobserwujesz sen NREM, zainicjuj proces PBM i zatrzymaj go, jeśli sen NREM przechodzi w sen lub czuwanie z szybkimi ruchami gałek ocznych (REM). Dawka zwiększa się z każdą interakcją, aż osiągnie wymaganą wartość.
  3. Po uzyskaniu wymaganej dawki PBM sesja jest zakończona.

8. Konfokalne obrazowanie limfatycznego usuwania Aβ z mózgu myszy

  1. Podłączyć cewnik o średnicy 10 cm do igły insulinowej.
  2. Za pomocą strzykawki Hamiltona z igłą o sile 29 G przygotować wlew fluorescencyjnego beta-amyloidu (FAβ) w objętości 5 μl do cewnika. Niech cewnik pozostanie na strzykawce Hamiltona.
  3. Zamocuj rękę myszy i podłącz cewnik za pomocą igły do wszczepionego przewlekłego cewnika.
  4. Podłączyć cewnik do mikrowstrzykiwacza. Następnie umieść mysz w indywidualnym pudełku;
  5. Wybierz szybkość wtrysku 0,1 μl/min w menu mikrowtryskiwacza i naciśnij przycisk Start.
  6. Wykonać wstrzyknięcie FAβ do prawej komory bocznej.
  7. Po podaniu FAβ należy wykonać PBM za pomocą diody LED przez 61 minut zgodnie z algorytmem: 17 min - światło i 5 min - przerwa powyżej 61 min.
  8. Po PBM wstrzyknąć dożylnie dowolny znacznik do znakowania naczyń mózgowych przez ogon.
  9. Po wstrzyknięciu należy poddać myszy eutanazji za pomocą komory eutanazyjnej CO2 .
  10. Za pomocą ostrych, prostych nożyczek wykonaj małe poprzeczne nacięcie w skórze wzdłuż tchawicy, przytrzymując skórę prostymi, nieostrymi pęsetami.
  11. Wykonaj podłużne nacięcie na całej długości szyi za pomocą prostych nożyczek.
  12. Za pomocą zakrzywionej pęsety zbierz gruczoły ślinowe i ostrożnie oddziel je od tkanki łącznej. Umieść zwijacz rany na otwartym odcinku nacięcia i zamocuj go w taki sposób, aby odepchnąć otaczające tkanki.
  13. Zbadaj obszar między tchawicą a mięśniem obojczykowo-sutkowym za pomocą dwóch zakrzywionych pęset po obu stronach szyi.
  14. Po wykryciu głębokiego węzła chłonnego szyjnego (dcLN) z każdej strony, usuń dcLN za pomocą prostej pęsety z końcami i odetnij go od tkanki łącznej.
  15. Umieścić dcLN na szalce Petriego z roztworem soli fizjologicznej i przykryć je poziomo ustawionym szkłem nakrywkowym (25 mm × 50 mm × 0,17 mm).
  16. Użyj dowolnego komercyjnego mikroskopu konfokalnego, aby uzyskać obrazy całych dcLN.

9. Analiza Aβ w lizatach tkanek mózgowych

  1. Przygotować próbki do oznaczenia.
    1. Poddaj myszy eutanazji za pomocą komory eutanazyjnej CO2 .
    2. Odetnij głowę myszy, usuń skórę z jej głowy i usuń mięśnie z czaszki.
    3. Wykonaj dwa nacięcia ostrymi, prostymi nożyczkami od wielkiego otworu potylicznego do kanału słuchowego.
    4. Za pomocą prostej pęsety oddziel brzuszną część czaszki, kość potyliczną i kości tworzące jamy ucha środkowego.
    5. Za pomocą pęsety oddziel mózg od kości ciemieniowej i czołowej.
    6. Za pomocą prostych nożyczek usuń górną szczękę i odetnij opuszki węchowe.
    7. Umieść mózg w roztworze fizjologicznym.
    8. Opłucz mózg w zimnym roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami, aby dokładnie usunąć nadmiar krwi i zważyć przed homogenizacją.
    9. Przygotować bufor lizujący o pH 7,2 zawierający 1,5 mm KH2PO4, 8 mm Na2HPO4, 3 mm KCl, 137 mm NaCl i 0,1% Tween20, 10 mM EDTA ze świeżo przygotowanym mieszaniną hamującą proteazę.
    10. Homogenizuj mózg w świeżym buforze do lizy (1 ml buforu do lizy na 200-500 mg próbki tkanki) za pomocą szklanego homogenizatora na lodzie.
    11. Sonikować powstałą zawiesinę za pomocą ultradźwiękowego zakłócacza komórek, aż roztwór zostanie sklarowany.
    12. Odwirować homogenaty w temperaturze 10 000 × g przez 5 minut.
    13. Zebrać supernatant za pomocą jednokanałowej pipety mechanicznej (100–1000 μl) i natychmiast oznaczyć lub podwielokrotność i przechowywać w temperaturze ≤–20 °C.
  2. Przygotuj następujące materiały: czytnik mikropłytek z filtrem 450 nm ± 10 nm; probówki do mikrowirówek; pipety jedno- lub wielokanałowe z bardzo precyzyjnymi i jednorazowymi końcówkami; bibuła chłonna do osuszania mikropłytki; pojemnik na roztwór do mycia; sól fizjologiczna buforowana fosforanem (PBS) o stężeniu 0,01 mol/l (lub 1x) oraz woda dejonizowana lub destylowana.
  3. Przygotować odczynniki.
    1. Przed użyciem doprowadzić elementy zestawu i próbki do temperatury pokojowej (RT; 18-25 °C).
    2. Rozpuść wzorzec w 1,0 ml standardowego rozcieńczalnika, trzymaj przez 10 minut w temperaturze pokojowej i delikatnie wstrząśnij (nie do spienienia). Standardowy roztwór podstawowy to 300 pg/ml. Przygotować 5 probówek zawierających objętość 0,6 ml standardowego rozcieńczalnika i wykonać serię potrójnych rozcieńczeń.
    3. Ustaw 5 punktów (300 pg/ml, 100 pg/ml, 33,33 pg/mL, 11,11 pg/ml i 3,70 pg/ml) rozcieńczonego wzorca i ostatnie probówki z jako ślepą próbą zawierającą tylko standardowy rozcieńczalnik (0 pg/ml).
    4. Przed użyciem szybko odwirować roztwory podstawowe odczynnika do wykrywania A i odczynnika do wykrywania B. Rozcieńczyć je 100-krotnie rozcieńczalnikiem A i B, aby przygotować stężenie robocze.
    5. Rozcieńczyć 20 ml stężonego roztworu do przemywania (30x) w 580 ml wody dejonizowanej lub destylowanej, aby uzyskać 600 ml roztworu do przemywania (1x).
    6. Odessać potrzebną dawkę roztworu za pomocą wysterylizowanych końcówek i nie wlewać ponownie pozostałego roztworu do fiolki.
  4. Wykonaj test.
    1. Określić studzienki dla rozcieńczonego wzorca, próby ślepej i próbki.
    2. Przygotuj 5 studzienek na standardowe punkty i jedną studzienkę na ślepą próbę.
      1. Dodać po 50 μl każdego z rozcieńczeń wzorcowych, ślepych prób i próbek odpowiednio do odpowiednich studzienek. Następnie natychmiast dodaj 50 μl odczynnika wykrywającego A do każdej studzienki.
      2. Delikatnie wstrząśnij płytką (zalecana jest wytrząsarka do mikropłytek) i przykryj ją uszczelniaczem do płytek. Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę. Odczynnik detekcyjne A może wydawać się mętny. Podgrzej roztwór do temperatury pokojowej i delikatnie mieszaj, aż stanie się jednolity.
    3. Odessać roztwór i umyć każdą studzienkę 350 μl 1x roztworu myjącego za pomocą butelki ze spryskiwaczem, pipety wielokanałowej, dozownika kolektora lub myjki automatycznej. Pozostaw talerz w spokoju na 1-2 minuty. Zatrzaśnij płytkę na papierze chłonnym, aby całkowicie usunąć pozostałą ciecz ze wszystkich studzienek. Powtórz tę procedurę 3 razy.
    4. Po ostatnim praniu odessać lub zdekantować pozostały bufor do płukania. Upewnij się, że roztwór myjący zostanie całkowicie usunięty, odwracając płytkę i ocierając ją o papier chłonny.
    5. Dodać 100 μl roztworu roboczego odczynnika B do wykrywania do każdego dołka i inkubować płytkę przez 30 minut w temperaturze 37 °C po pokryciu jej uszczelniaczem do płytek.
    6. Powtarzaj etapy aspiracji/mycia łącznie przez 5 minut.
    7. Dodać 90 μl roztworu podłoża do każdej studzienki i pokryć płytkę nowym uszczelniaczem do płytek. Inkubować przez 10-20 minut w temperaturze 37 °C (nie przekraczać 30 minut) chroniąc przed światłem. Po dodaniu roztworu substratu ciecz zmieni kolor na niebieski.
    8. Dodać 50 μl roztworu zatrzymującego do każdej studzienki, aby zakończyć reakcję. Dodanie roztworu zatrzymującego zmieni kolor cieczy na żółty. Postukaj w talerz na boku, aby wymieszać płyn. Jeśli zmiana koloru jest niespójna, delikatnie postukaj w płytkę, aby zapewnić dokładne wymieszanie.
    9. Upewnij się, że woda i odciski palców na dnie płytki nie tworzą się pęcherzyki na powierzchni cieczy. Następnie natychmiast odczytać płytkę w czytniku mikropłytek przy długości fali 450 nm.
  5. Oblicz wyniki.
    1. Określ średnią z podwójnych odczytów dla każdego wzorca, kontroli i próbki. Wykreślić krzywą wzorcową z logarytmem stężenia Aβ 1-42 na osi y i absorbancji na osi x.
    2. Narysuj krzywą najlepszego dopasowania przez punkty, które można wyznaczyć za pomocą analizy regresji.
    3. Jeżeli użyto próbek rozcieńczonych, należy pomnożyć stężenie otrzymane z krzywej wzorcowej przez współczynnik rozcieńczenia.
      UWAGA: W przypadku testu ELISA w tym badaniu użyto zestawu do oznaczania Aβ 1-42.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

W pierwszym kroku badanie skupiło się na ustaleniu skutecznej dawki światła (diody LED 1050 nm) dla stymulacji limfatycznego usuwania fluorescencyjnego Aβ z mózgu do głębokich szyjnych węzłów chłonnych (dcLNs) u przebudzonych dorosłych (wiek 2–3 miesiące, masa 26–29 g) samców myszy szczepu BALB/c. Dawki światła wybrano losowo jako 10 J/cm²2, 20 J/cm²2, oraz 30 J/cm²2 na podstawie naszych poprzednich badań nad wpływem tPBM na usuwanie różnych barwników oraz erytrocytów z mózgu

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

MLV są ważnym celem dla rozwoju innowacyjnych technologii modulacji drenażu mózgu i usuwania zanieczyszczeń komórkowych i odpadów z mózgu, szczególnie u osób w podeszłym wieku, u których funkcja MLV ulega pogorszeniu 1,22. W stanie homeostatycznym głęboki sen jest związany z naturalną aktywacją oczyszczania tkanki mózgowej13,14. Dlatego oczywiste jest, że oczekiwanie, że stymulacja MLV podczas głębokiego ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Te badania były wspierane przez grant z Rosyjskiej Fundacji Naukowej (nr 23-75-30001).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,1% Tween20Helikon,  RosjaSB-G2009-100ML
CewnikScientific Commodities Inc., USAPE-10, 0,28 mm ID i czasy 0,61 mm OD
Komora CO2Binder, NiemcyCB-S 170
Mikroskop konfokalnyNikon, JaponiaA1R MP
Akryl dentystycznyZermack, Polska-RosjaVillacryl S, V130V4Z05
DrillForedom, RosjaSR W-0016
Kleszcze DumontStoelting, USA52100-07
Evans Blue dyeSigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA206334
HamiltonHamilton Bonaduz AG, Szwajcaria29 G igła
IbuprofenSintez OJSC, RosjaN/A  Lek przeciwbólowy
Igła insulinowaINSUPEN, Włochy31 G, 0,25 mm x 6 mm
Maść przeciwbakteryjna LevomekolNizhpharmD06C Do użytku zewnętrznego w dawce 40 mg/g, 1 raz dziennie
MikrokleszczeStoelting, USA52102-02P
MikrowirówkaGyrozen, Korea PołudniowaGZ-1312
MikroiniektorStoelting, USA53311
Pęseta bez ostrej pozycjiStoelting, USA52108-83P
System PINNACLEPinnacle Technology, USA8400-K3-SLSystem do rejestracji EEG (2 kanały) i EMG (1 kanał) myszy
Maszynka do goleniaBraunSeries 3310s
Pipety jedno- i wielokanałoweEppendorf, AustriaEpp 3120 000.020, Epp 3122 000.019
Chlorek soduKraspharma, RosjaNie dotyczy
Stacja lutowniczaAOYUE, ChinyNie dotyczy
Rama stereotaktycznaStoelting, USA51500
Nożyczki do prostego preparowaniaStoelting, USA52132-10P
TetracyklinaJSC Tatkhimfarmpreparaty, RosjaNie dotyczyMaść do oczu
PęsetaStoelting, Stany Zjednoczone52100-03
Ultradźwiękowy zakłócacz komórekBiobase, ChinyUSD-500
Retraktor ranStoelting, USA52125
XylanitNita-Farm, RosjaNie dotyczyŚrodek zwiotczający mięśnie
Zoletil 100Virbac Sante Animale, FrancjaNie dotyczyZnieczulenie ogólne

Bibliografia

  1. Da Mesquita, S., et al. Functional aspects of meningeal lymphatics in ageing and Alzheimer's disease. Nature. 560 (7717), 185-191 (2018).
  2. Chen, J., et al. Meningeal lymphatics clear erythrocytes that arise from subarachnoid hemorrhage. Nat Commun. 11, 3159(2020).
  3. Zou, W., et al. Blocking meningeal lymphatic drainage aggravates Parkinson's disease-like pathology in mice overexpressing mutated α-synuclein. Transl Neurodegener. 8, 7(2019).
  4. Hu, X., et al. Meningeal lymphatic vessels regulate brain tumor drainage and immunity. Cell Res. 30 (3), 229-243 (2020).
  5. Dong-Yu, L., et al. Photostimulation of brain lymphatics in male newborn and adult rodents for therapy of intraventricular hemorrhage. Nat Comm. 14 (1), 6104(2023).
  6. Bolte, A., et al. Meningeal lymphatic dysfunction exacerbates traumatic brain injury pathogenesis. Nat Commun. 11 (1), 4524(2020).
  7. Semyachkina-Glushkovskaya, O., et al. Mechanisms of phototherapy of Alzheimer's disease during sleep and wakefulness: the role of the meningeal lymphatics. Front Optoelectron. 16, 22(2023).
  8. Dongyu, L., et al. Photostimulation of lymphatic clearance of β- amyloid from mouse brain: new strategy for the therapy of Alzheimer's disease. Front Optoelectron. 16, 45(2023).
  9. Semyachkina-Glushkovskaya, O., et al. Mechanisms of phototherapy of Alzheimer's disease during sleep and wakefulness: the role of the meningeal lymphatics. Front Optoelectron. 16, 22(2023).
  10. Semyachkina-Glushkovskaya, O., et al. Intranasal delivery of liposomes to glioblastoma by photostimulation of the lymphatic system. Pharmaceutics. 15 (1), 36(2023).
  11. Semyachkina-Glushkovskaya, O., et al. Night photostimulation of clearance of beta-amyloid from mouse brain: New strategies in preventing Alzheimer's disease. Cells. 10 (12), 3289(2021).
  12. Semyachkina-Glushkovskaya, O., et al. Technology of the photobiostimulation of the brain's drainage system during sleep for improvement of learning and memory in male mice. Biomed Opt Express. 15 (1), 44-58 (2024).
  13. Fultz, N., et al. Coupled electrophysiological, hemodynamic, and cerebrospinal fluid oscillations in human sleep. Science. 366 (6465), 628-631 (2019).
  14. Xie, L., et al. Sleep drives metabolite clearance from the adult brain. Science. 342 (6156), 373-377 (2013).
  15. Semyachkina-Glushkovskaya, O., et al. Phototherapy of Alzheimer's disease: Photostimulation of brain lymphatics during sleep: A systematic review. Int J Mol Sci. 24 (13), 10946(2023).
  16. Semyachkina-Glushkovskaya, O., et al. Brain waste removal system and sleep: Photobiomodulation as an innovative strategy for night therapy of brain diseases. Int J Mol Sci. 24 (4), 3221(2023).
  17. Hablitz, L. M., et al. Increased glymphatic influx is correlated with high EEG delta power and low heart rate in mice under anesthesia. Sci Adv. 5 (2), 5447(2019).
  18. Fukumoto, H., et al. Primary cultures of neuronal and non-neuronal rat brain cells secrete similar proportions of amyloid beta peptides ending at A beta40 and A beta42. Neuroreport. 10 (14), 2965-2969 (1999).
  19. Moghekar, A., et al. Large quantities of Abeta peptide are constitutively released during amyloid precursor protein metabolism in vivo and in vitro. J Biol Chem. 286 (16), 15989-15997 (2011).
  20. Wells, C., Brennan, S., Keon, M., Ooi, L. The role of amyloid oligomers in neurodegenerative pathologies. Int J Biol Macromol. 181, 582-604 (2021).
  21. Savage, M., et al. Turnover of amyloid beta-protein in mouse brain and acute reduction of its level by phorbol ester. J Neurosci. 18 (5), 1743-1752 (1998).
  22. Ahn, J., et al. Meningeal lymphatic vessels at the skull base drain cerebrospinal fluid. Nature. 572 (7767), 62-66 (2019).
  23. Stevens, D., et al. Regional amyloid correlates of cognitive performance in ageing and mild cognitive impairment. Brain Commun. 4 (1), 016(2022).
  24. Ma, C., Hong, F., Yang, S. Amyloidosis in Alzheimer's disease: Pathogeny, etiology, and related therapeutic directions. Molecules. 27 (4), 1210(2022).
  25. Kobro-Flatmoen, A., Hormann, T., Gouras, G. Intracellular amyloid-β in the normal rat brain and human subjects and its relevance for Alzheimer's disease. J Alzheimers Dis. 95 (2), 719-733 (2023).
  26. Ahlemeyer, B., Halupczok, S., Rodenberg-Frank, E., Valerius, K., Baumgart-Vogt, E. Endogenous murine amyloid-β peptide assembles into aggregates in the aged C57BL/6J mouse suggesting these animals as a model to study pathogenesis of amyloid-β plaque formation. J Alzheimers Dis. 61 (4), 1425-1450 (2018).
  27. Zhinchenko, E., et al. Pilot study of transcranial photobiomodulation of lymphatic clearance of beta-amyloid from the mouse brain: Breakthrough strategies for nonpharmacologic therapy of Alzheimer's disease. Biomed Opt Express. 10 (8), 4003-4017 (2019).
  28. Semyachkina-Glushkovskaya, O., et al. Transcranial photobiomodulation of clearance of beta-amyloid from the mouse brain: Effects on the meningeal lymphatic drainage and blood oxygen saturation of the brain. Adv Exp Med Biol. 1269, 57-61 (2021).
  29. Semyachkina-Glushkovskaya, O., et al. Photobiomodulation of lymphatic drainage and clearance: Perspective strategy for augmentation of meningeal lymphatic functions. Biomed Opt Express. 11 (2), 725-734 (2020).
  30. Zhinchenko, E., et al. Photostimulation of extravasation of beta-amyloid through the model of blood-brain barrier. Electronics. 9 (6), 1056(2020).
  31. Semyachkina-Glushkovskaya, O., et al. Photostimulation of cerebral and peripheral lymphatic functions. Transl Biophotonics. 2 (1-2), e201900036(2020).
  32. Semyachkina-Glushkovskaya, O., et al. Photomodulation of lymphatic delivery of liposomes to the brain bypassing the blood-brain barrier: New perspectives for glioma therapy. Nanophotonics. 10 (12), 3215-3227 (2021).
  33. Semyachkina-Glushkovskaya, O., et al. Photomodulation of lymphatic delivery of Bevacizumab to the brain: The role of singlet oxygen. Adv Exp Med Biol. 1395, 53-57 (2022).
  34. Semyachkina-Glushkovskaya, O., et al. Transcranial photosensitizer-free laser treatment of glioblastoma in rat brain. Int J Mol Sci. 24 (18), 13696(2023).
  35. Blázquez-Castro, A. Direct 1O2 optical excitation: A tool for redox biology. Redox Biol. 13, 39-59 (2017).
  36. Spitler, R., Berns, M. Comparison of laser and diode sources for acceleration of in vitro wound healing by low-level light therapy. J Biomed Opt. 19 (3), 038001(2014).
  37. Sato, K., Watanabe, R., Hanaoka, H., Nakajima, T., Choyke, P., Kobayashi, H. Comparative effectiveness of light emitting diodes (LEDs) and Lasers in near infrared photoimmunotherapy. Oncotarget. 7 (12), 14324-14335 (2016).
  38. Keshri, G., Gupta, A., Yadav, A., Sharma, S., Singh, S. Photobiomodulation with pulsed and continuous wave near-infrared laser (810 nm, Al-Ga-As) augments dermal wound healing in immunosuppressed rats. PLoS One. 11 (11), e0166705(2016).
  39. Kim, H., et al. Pulse frequency dependency of photobiomodulation on the bioenergetic functions of human dental pulp stem cells. Sci Rep. 7 (1), 15927(2017).
  40. Chen, Z., et al. The pulse light mode enhances the effect of photobiomodulation on B16F10 melanoma cells through autophagy pathway. Lasers Med Sci. 38 (1), 71(2023).
  41. Mezey, E., et al. An immunohistochemical study of lymphatic elements in the human brain. Proc Natl Acad Sci U S A. 118 (3), e2002574118(2021).
  42. Chang, J., et al. Characteristic features of deep brain lymphatic vessels and their regulation by chronic stress. Research. 6, 0120(2023).
  43. Prineas, L. W. Multiple sclerosis: Presence of lymphatic capillaries and lymphoid tissue in the brain and spinal cord. Science. 203 (4385), 1123-1125 (1979).
  44. Semyachkina-Glushkovskaya, O., et al. Pilot identification of the Live-1/Prox-1 expressing lymphatic vessels and lymphatic elements in the unaffected and affected human brain. bioRxiv. , 458990(2021).
  45. Semyachkina-Glushkovskaya, O., Postnov, D., Kurths, J. Blood-brainbarrier, lymphatic clearance, and recovery: Ariadne's thread in labyrinths of hypotheses. Int J Mol Sci. 19 (12), 3818(2018).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

Terapia fotobiomodulacyjnanaczynia limfatyczne opon mózgowychmonitorowanie snu EEGdrenaż mózguusuwanie beta-amyloiduprzezczaszkowe PBMmikroskopia konfokalnastymulacja snu NREMtoksyny w mózgu myszynieinwazyjna terapia mózgu
Fotobiomodulacja pod elektroencefalograficzną kontrolą snu w celu stymulacji limfatycznego usuwania toksyn z mózgu myszy
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.