Tutaj opisujemy dwie ilościowe metody badania oddziaływań białko-ligand receptorów błonowych witaminy A i opsyny fotoreceptorów z ich odpowiednimi fizjologicznymi ligandami.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Metodologia badania oddziaływań receptorów błonowych witaminy A i białka opsyny z ich ligandami w wytwarzaniu białka retinylidenu
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Dystrybucja witaminy A/all-trans retinolu (ROL) w organizmie jest kluczowa dla utrzymania funkcji retinoidów w tkankach obwodowych i generowania białka retinylidenu dla funkcji wzrokowych. RBP4-ROL to kompleks ROL z białkiem wiążącym retinol 4 (RBP4), który jest obecny we krwi. Dwa receptory błonowe, Retinol Binding Protein 4 Receptor 2 (RBPR2) w wątrobie i STimulowane przez kwas retinowy 6 Retinol (STRA6) w oku, wiążą krążący RBP4 i ten mechanizm ma kluczowe znaczenie dla internalizacji ROL w komórkach. Ustalenie metod badania kinetyki receptor-ligand jest niezbędne do zrozumienia fizjologicznej funkcji receptorów witaminy A dla homeostazy retinoidów. Za pomocą testów powierzchniowego rezonansu plazmonowego (SPR) możemy analizować powinowactwo wiązania i parametry kinetyczne receptorów błonowych witaminy A z jej fizjologicznym ligandem RBP4.
Te metodologie mogą ujawnić nowe strukturalne i biochemiczne informacje o motywach wiążących RBP4 w RBPR2 i STRA6, które są kluczowe dla zrozumienia patologicznych stanów niedoboru witaminy A. W oku zinternalizowany ROL jest metabolizowany do 11-cis retinal, wizualnego chromoforu, który wiąże się z opsyną w fotoreceptorach, tworząc białko retinylidenu, rodopsynę. Absorbancja światła powoduje izomeryzację cis-to-trans siatkówki 11-cis, indukując zmiany konformacyjne w rodopsyny, a następnie aktywację kaskady fototransdukcji. Zmniejszone stężenie ROL w surowicy i oku może wpływać na tworzenie białka retinylidenu, co z kolei może powodować nieprawidłową lokalizację rodopsyny, akumulację opsyny apoproteinowej, ślepotę nocną i zwyrodnienie zewnętrznego segmentu fotoreceptora, prowadząc do barwnikowego zwyrodnienia siatkówki lub wrodzonej ślepoty Lebera.
Dlatego metodologie spektrofotometryczne do ilościowego oznaczania kompleksu siatkówkowego opsyn-11-cis sprzężonego z białkiem G w siatkówce są kluczowe dla zrozumienia mechanizmów degeneracji komórek siatkówki w wyżej wymienionych stanach patologicznych. Dzięki tym kompleksowym metodologiom badacze będą w stanie lepiej ocenić podaż witaminy A w diecie w utrzymaniu homeostazy retinoidów ogólnoustrojowych i ocznych, co ma kluczowe znaczenie dla generowania i utrzymywania stężeń białka retinylidenu w fotoreceptorach, co ma kluczowe znaczenie dla utrzymania funkcji wzrokowych u ludzi.
Wprowadzenie
Witamina A/all-trans retinol/ROL jest ważnym składnikiem odgrywającym rolę w funkcjonowaniu wzrokowym1,2. Chromofor 11-cis retinal, metabolit witaminy A w diecie, wiąże się z opsyną receptora sprzężonego z białkiem G (GPCR) w celu wytworzenia białka retinylidenu, rodopsyny, w fotoreceptorach. Kiedy światło pada na oko, konfiguracja rodopsyny ulega fundamentalnej zmianie poprzez konwersję jej 11-cis-retinalnego komponentu do all-trans-retinalu. Ta zmiana konfiguracji uruchamia kaskadę fototransdukcji w fotoreceptorach pręcików, przekształcając światło w sygnał elektryczny, kt....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Metodologia powierzchniowego rezonansu plazmonowego (SPR)
- Przygotowanie i oczyszczanie mysiego białka RBP4
- Zaprojektuj startery do generowania cDNA myszy RBP4 (msRBP4) o pełnej długości (sekwencja referencyjna NCBI: NM_001159487.1). Sklonuj cDNA msRBP4 do wektora ekspresyjnego opornego na kanamycynę pET28a His-tag i ulegnij ekspresji w komórkach BL-21 DE3 (tabela materiałów).
- Przekształć kompetentne komórki BL-21 DE3 (zgodnie z protokołem producenta) za pomocą ligowanego wektora msRBP4-pET28a, a następnie płytkę na płytkach agarowych bulionu Luria-Bertani (LB) zawierając....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Opisano metody ilościowe służące do badania oddziaływań białko-ligand receptorów błonowych witaminy A oraz opsyny fotoreceptorów z ich odpowiednimi ligandami fizjologicznymi. Rekombinowane białko RBP4 mysie powinno zostać wyekspresowane w E. coli, a oczyszczone białko powinno być wykorzystane jako ligand sprzężony na chipie SPR. Chemicznie syntetyzowane białka RBPR2, STRA6 oraz mutant S294A RBPR2 „SYL motif RBP4 interacting extracellular site” w postaci peptydów o długości ok. 40 aminokwasów są wykorzystywane ja.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Krytyczne kroki w protokole
Metodologia SPR
Modelowanie in silico i analiza dokowania:Do badania dokowania należy wykorzystać przewidywaną strukturę RBPR2 (https://alphafold.ebi.ac.uk/entry/Q9DBN1) i STRA6 oraz znaną strukturę bazy danych msRBP4 PDB (RSCB PDB ID: 2wqa). Dodatkowo należy zastosować metody in vitro (hodowla komórkowa) w celu potwierdzenia interakcji przypuszczalnych miejsc wią.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy deklarują brak konfliktu interesów. Fundatorzy nie odegrali żadnej roli w projektowaniu badania; w gromadzeniu, analizie lub interpretacji danych; w pisaniu manuskryptu lub w decyzji o publikacji wyników.
Podziękowania
Autorzy dziękują dr Beacie Jastrzębskiej, Ph.D. (Department of Pharmacology, Case Western Reserve University, OH) za jej porady dotyczące protokołu absorpcji rodopsyny. Praca ta była wspierana przez grant NIH-NEI (EY030889 i 3R01EY030889-03S1) oraz, częściowo, przez fundusze startowe University of Minnesota dla G.P.L.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 2-D Quant Kit | Cytiva | 80648356 | |
| Amine Coupling Kit | Cytiva | BR100050 | |
| Oprogramowanie ewaluacyjne Biacore Biacore | S200 | wersja 1.1 | |
| Biacore Układ czujnika CM5 | Cytiva | BR100530 | |
| Bis tris propan | Sigma | B6755-25G | 20 mM |
| BL21 DE3 kompetentne ogniwa | Thermo Naukowy | CD EC0114 | |
| Spektropolarymetr | Jasco | J-815 | |
| Glicyna HCL | Fisher Bioodczynniki | BP381-1 | |
| GraphPad Prism | Dopasowanie modelu, analiza danych | ||
| Bulion LB | Fisher Bioodczynniki | BP1426-500 | |
| n-dodecyl-β-d-maltozyd (DDM) | EMD Milipor | 324355-1GM | 2-20 mM |
| pET28a His-tag Wektor ekspresji odporny na kanamycynę | Addgene | 69864-3 | |
| Zestaw do oczyszczania plazmidu | Qiagen | 27106 | |
| Rho1D4 MagBeads | CubeBiotech | 33299 | |
| Kaseta dializacyjna Slide-A_Lyzer 10K | Thermo Scientific | 66810 | |
| Tween20 | Fisher Bioreagents | BP337-500 | 0,05% |
| UV vis Spektrofotometr | Agilent | Cary 60 UV-Vis | |
| Nazwa peptydu | Sekwencja peptydowa | HPLC-czystość | Mass Spec |
| Mouse Rbpr2 (42) | HVRDKLDMFEDKLESYLTHM NETGTLTPIILQVKELISVTKG | 92.14% | Pasuje do |
| myszy Stra6 (40) | SVVPTVQKVRAGINTDVSYL LAGFGIVLSEDRQEVVELVK | 90.84% | Zgadza się |
| z mutantem myszy Rbpr2 S294A (42) | HVRDKLDMFEDKLEAYLTHM NETGTLTPIILQVKELISVTKG | 0.92% | Zgadza się |
Bibliografia
- Dowling, J. E., Wald, G. Vitamin A deficiency and night blindness. Proc Natl Acad Sci U S A. 44 (7), 648-6618 (1958).
- Dowling, J. E., Wald, G. The biological function of vitamin A acid. Proc Natl Acad Sci U S A. 46 (5), 587-608 (1960).
- Kiser, P. D., Palczewski, K.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
