Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Długoterminowe monitorowanie wskaźników zużycia tlenu w wysoce zróżnicowanych i spolaryzowanych kulturach nabłonka barwnikowego siatkówki

6.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/67038

⸱

16 sierpnia 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Kellogg Eye Center, University of Michigan, Ann Arbor, 2School of Optometry and Vision Science, University of New South Wales, 3Lucid Scientific, 4Schepens Eye Research Institute of Mass. Eye and Ear, Department of Ophthalmology, Harvard Medical School, 5Cellular and Molecular Biology Program, University of Michigan, Ann Arbor

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Wprowadzamy nowatorskie urządzenie do pomiaru wskaźników zużycia tlenu (OCR) w hodowlach nabłonka barwnikowego siatkówki (RPE). Urządzenie może mierzyć OCR przez wiele tygodni na RPE hodowanym na standardowych płytkach do hodowli komórkowych ze standardowymi pożywkami, podczas gdy płytki znajdują się w standardowym inkubatorze do hodowli komórkowych.

Streszczenie

Metabolizm mitochondriów jest krytyczny dla prawidłowego funkcjonowania nabłonka barwnikowego siatkówki (RPE), monowarstwy komórek w siatkówce, ważnej dla przetrwania fotoreceptorów. Dysfunkcja mitochondriów RPE jest cechą charakterystyczną zwyrodnienia plamki żółtej związanego z wiekiem (AMD), głównej przyczyny nieodwracalnej ślepoty w krajach rozwiniętych, oraz proliferacyjnej witreoretinopatii (PVR), oślepiającego powikłania odwarstwienia siatkówki. Stany zwyrodnieniowe RPE zostały dobrze wymodelowane przez systemy hodowli RPE, które są wysoce zróżnicowane i spolaryzowane, aby naśladować RPE in vivo. Jednak monitorowanie wskaźników zużycia tlenu (OCR), wskaźnika funkcji mitochondriów, było trudne w takich systemach hodowli, ponieważ warunki sprzyjające idealnej polaryzacji i różnicowaniu RPE nie pozwalają na łatwe pomiary OCR.

Tutaj wprowadzamy nowatorski system, Resipher, do monitorowania OCR przez wiele tygodni w dobrze zróżnicowanych kulturach RPE, jednocześnie utrzymując RPE na optymalnych podłożach wzrostowych i fizjologicznych podłożach hodowlanych w standardowym inkubatorze do hodowli komórkowych. System ten oblicza OCR, mierząc gradient stężenia tlenu obecnego w pożywkach nad komórkami. Omawiamy zalety tego systemu w porównaniu z innymi metodami wykrywania OCR oraz sposób konfiguracji systemu pomiaru OCR w hodowlach RPE. Omówiono najważniejsze porady i wskazówki dotyczące korzystania z systemu, ostrzeżenia dotyczące interpretowania danych oraz wskazówki dotyczące rozwiązywania problemów z nieoczekiwanymi wynikami.

Udostępniamy również kalkulator online do ekstrapolacji poziomu doświadczenia z hodowlami RPE w hipoksji, normoksji lub hiperoksji na podstawie gradientu tlenu w pożywkach nad komórkami wykrytymi przez system. Na koniec dokonujemy przeglądu dwóch zastosowań systemu, mierząc stan metaboliczny komórek RPE w modelu PVR i rozumiejąc, w jaki sposób RPE metabolicznie dostosowuje się do niedotlenienia. Przewidujemy, że zastosowanie tego systemu w wysoce spolaryzowanych i zróżnicowanych kulturach RPE poprawi naszą wiedzę na temat metabolizmu mitochondrialnego RPE zarówno w stanach fizjologicznych, jak i chorobowych.

Wprowadzenie

Nabłonek barwnikowy siatkówki (RPE) to monowarstwa funkcjonalnie postmitotycznych, wysoce spolaryzowanych komórek nabłonkowych, które tworzą barierę między światłoczułymi fotoreceptorami w siatkówce a ich krążeniem krwi, łożyskiem włosowatym zwanym naczyniówką włosowatą. Podobnie jak neurony wspierające glej, RPE pełni niezliczone funkcje wspierające fotoreceptory, w tym fagocytozę zewnętrznych segmentów fotoreceptorów, transport składników odżywczych i wsparcie metaboliczne dla fotoreceptorów oraz wydzielanie niezbędnych czynników wzrostu, z których wszystkie mają kluczowe znaczenie dla utrzymania funkcji wzrokowych.

Zwyrodnienie RPE leży u podstaw kilku powszechnych zaburzeń zwyrodnieniowych wzroku. W zwyrodnieniu plamki żółtej związanym z wiekiem (AMD), jednej z najczęstszych przyczyn nieuleczalnej utraty wzroku na świecie, RPE umiera, a zatem leżące nad nim fotoreceptory cierpią na wtórne zwyrodnienie. W proliferacyjnej witreoretinopatii (PVR) RPE zamiast tego wychodzi ze swojego normalnie spokojnego stanu postmitotycznego, proliferując i odróżnicowując się w stan mezenchymalny (tak zwane przejście nabłonkowe do mezenchymalnego [EMT]) ze zmianami w jego metabolizmie. Dedyferencjacja RPE powoduje utratę wsparcia RPE dla fotoreceptorów, jednocześnie wywołując stan bardziej zwłóknienia. Powoduje to zarówno zwyrodnienie fotoreceptorów, jak i bliznowacenie wywołane przez RPE, które powodują utratę wzroku1,2.

Główna część wsparcia RPE dla fotoreceptorów ma charakter metaboliczny, a dysregulacja metaboliczna jest krytycznym czynnikiem w wielu chorobach siatkówki, w tym AMD i PVR. RPE służy jako bariera regulacyjna między fotoreceptorami a ich źródłem tlenu i składników odżywczych, naczyniówką włosowatą. Tak więc to, co RPE wybiera do metabolizowania, w porównaniu z tym, co RPE decyduje się przejść z naczynia włosowatego do fotoreceptorów, silnie reguluje metabolizm i przeżycie fotoreceptorów. Liczne badania wykazały, że RPE jest silnie zależny od metabolizmu mitochondrialnego dla swojego normalnego zdrowia, a fotoreceptory zamiast tego w dużym stopniu polegają na glikolizie3. W ten sposób wprowadzono koncepcję komplementarnych, splecionych stanów metabolicznych między fotoreceptorami a RPE. W szczególności RPE zmniejsza metabolizm preferowanych substratów metabolicznych fotoreceptorów i zamiast tego wykorzystuje produkty uboczne metabolizmu fotoreceptorów w połączeniu z metabolitami, których fotoreceptory nie zużywają. W chorobach takich jak PVR i AMD dowody silnie sugerują, że RPE staje się bardziej glikolityczny i mniej zależny od metabolizmu mitochondrialnego; to przesunięcie w kierunku glikolizy RPE może pozbawić fotoreceptory potrzebnych im metabolitów, wywołując degenerację4,5,6. Biorąc pod uwagę, jak współzależny jest metabolizm RPE i fotoreceptorów oraz jak bardzo zmieniony metabolizm leży u podstaw choroby siatkówki, istnieje duże zainteresowanie modelowaniem i manipulowaniem metabolizmem RPE w celach terapeutycznych.

Podczas gdy badanie metabolizmu mitochondriów RPE in vivo jest idealne, wiele aspektów metabolizmu mitochondriów RPE można praktycznie zbadać tylko w systemie hodowli in vitro. W ciągu ostatnich kilku dekad poczyniono znaczący postęp w kierunku kultur RPE o wysokiej wierności, do tego stopnia, że najbardziej starannie przygotowane kultury RPE są obecnie wykorzystywane do terapii zastępczej komórek w badaniach klinicznych na ludziach7. Aby utrzymać tak wierne hodowle, RPE musi być uprawiany na określonych podłożach w określonych podłożach przez wiele miesięcy przed eksperymentami. W tych warunkach kultury RPE są maksymalnie zróżnicowane i spolaryzowane, zbliżając się do RPE in vivo. Niestety, obecnie nie ma dostępnego sprzętu, który mógłby mierzyć metabolizm mitochondrialny konkretnie z RPE in vivo. Chociaż monitorowanie tlenu w sieci kapilarnej siatkówki zostało osiągnięte in vivo za pomocą oksymetrii elektronowego rezonansu paramagnetycznego (EPR) 8, nie jest to możliwe w przypadku analizy RPE. Różnice między metabolizmem RPE in vivo i in vitro nie są dobrze opisane, ale wykazano, że hodowle RPE mają wysoką aktywność mitochondrialną, podobną do RPE in vivo3,9, co sugeruje, że istotny wgląd w metabolizm mitochondriów RPE można uzyskać przy użyciu kultur RPE o wysokiej wierności.

Ponieważ cały metabolizm mitochondriów prowadzi do zużycia tlenu, pomiar wskaźników zużycia tlenu RPE (OCR) jest wiernym wskaźnikiem metabolizmu mitochondriów. Pomiar OCR w kulturach RPE był trudny, ponieważ warunki, które sprzyjają maksymalnej polaryzacji i różnicowaniu RPE, często uniemożliwiają długoterminowe dokładne pomiary OCR przy użyciu obecnie dostępnych technik, takich jak Seahorse Analyzer. W tym artykule przedstawiono nowatorskie urządzenie, nazwane Resipher (zwane dalej "systemem"), które umożliwia ciągły pomiar OCR przez tygodnie w RPE hodowanym w warunkach, które maksymalnie promują polaryzację i różnicowanie. Łatwość, z jaką OCR może być mierzony przez ten system w warunkach hodowli RPE, które maksymalnie promują różnicowanie i polaryzację RPE, jest wyjątkowa wśród istniejących urządzeń do pomiaru OCR.

Ten artykuł zawiera porady i wskazówki dotyczące korzystania z systemu z kulturami RPE, a następnie demonstrację dwóch konkretnych zastosowań. Po pierwsze, RPE EMT, naśladując PVR, jest wyzwalany przez ekspozycję na transformujący czynnik wzrostu-beta (TGFβ)1,10,11,12. System służy do monitorowania ewolucji metabolizmu RPE podczas procesu EMT. Po drugie, za pomocą tego systemu bada się rolę hipoksji w metabolizmie RPE. Niedotlenienie jest ważnym czynnikiem przyczyniającym się do patogenezy AMD, ponieważ naczyniówka włosowata rozrzedza się z wiekiem13,14. Połączenie tego systemu z komorami hipoksyjnymi pozwala na modelowanie zmienionego metabolizmu mitochondrialnego RPE z subtelnym niedotlenieniem, które towarzyszy starzeniu się. Na koniec wprowadzono kalkulator online wykorzystujący dane Resipher, który pozwala określić, czy hodowle RPE znajdują się w warunkach hipoksyjnych, normoksycznych czy hiperoksycznych. Takie informacje mają kluczowe znaczenie dla wyciągnięcia jakichkolwiek wniosków na temat metabolizmu RPE na podstawie badań in vitro hodowli RPE.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Protokoły ustanawiające ludzkie kultury pierwotne lub iPSC-RPE można znaleźć w następujących odniesieniach15,16,17,18. Pozyskiwanie i wykorzystywanie tkanek ludzkich do tych protokołów zostało zweryfikowane i zatwierdzone przez Instytucjonalną Komisję Rewizyjną Uniwersytetu Michigan (HUM00105486).

1. Ogólne zastosowanie systemu do kultury RPE

  1. Płytki z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) pochodzących z RPE lub pierwotnych ludzkich komórek RPE w kompatybilnych z systemem płytkach 96-dołkowych.
    1. Zakładając już istniejące dojrzałe kultury wyhodowane na 24-dołkowych płytkach do hodowli komórkowych, należy raz przemyć komórki solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS), a następnie dodać 500 μl 0,25% trypsyny-EDTA (tabela materiałów). Inkubować przez 10-40 minut w inkubatorze do hodowli komórkowych, sprawdzając co 5-10 minut, aż komórki będą zaokrąglone i prawie gotowe do odłączenia.
    2. Delikatnie naniec pipety na komórki, aby odłączyć je od plastiku hodowli komórkowej, a następnie przenieś do 3 razy większej objętości pożywki do hodowli komórkowych (1 500 μl na 24 dołki), wirując w wirówce o stężeniu 250 × g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
      UWAGA: Przepis na pożywki do hodowli komórek RPE jest szczegółowo opisany w Tabeli 1 i dostępny we wcześniej opublikowanych źródłach9,15,16,17,18.
    3. Ponownie zawiesić komórki w pożywce do hodowli komórek RPE za pomocą 15% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) i policzyć komórki za pomocą hemocytometru.
    4. Wysiewaj 74 000 komórek na każdą studzienkę 96-dołkowej płytki (zwykle 225-300 × 105 komórek/cm2), po pokryciu wysoce wyspecjalizowanymi substratami do powlekania macierzy zewnątrzkomórkowej (Tabela materiałów) zgodnie z instrukcjami producenta.
      UWAGA: Komórki nasienne należy umieszczać tylko na płytce kompatybilnej z Resipher (Tabela materiałów) i tylko w studzienkach odpowiadających układowi sond na pokrywie czujnika (kolumny 3, 4, 9 i 10 dla pokrywy 32-kanałowej; patrz Tabela materiałów). Pokrywa czujnika systemu jest dostępna z czujnikami 4-, 32- lub 96-kanałowymi (patrz lokalizacje czujników w Rysunek 1A-D), a szereg standardowych płytek do hodowli komórkowych jest kompatybilnych.
    5. Ponieważ studzienki brzegowe są podatne na parowanie, co dramatycznie wpływa na dostępność tlenu, a tym samym na odczyty OCR, należy unikać wysiewania komórek we wszystkich dołkach krawędziowych (rzędy A i H płytki 96-dołkowej). Ponadto dodaj 200 μl sterylnej wody do każdej z pustych studzienek 96-dołkowej płytki, aby zmniejszyć efekt parowania.
    6. Trzymaj płytkę na stabilnej powierzchni stołu przez 10 minut, aby komórki mogły się uspokoić, a następnie włóż ją z powrotem do inkubatora. Zmień pożywkę po 24-72 godzinach, zastępując standardową pożywkę hodowlaną RPE o 5% FBS. Hodowla przez co najmniej 4 tygodnie, zmiana podłoża 2 razy w tygodniu.
      UWAGA: Komórki są gotowe do eksperymentów, gdy są pigmentowane, brukowe i bardzo zwarte (Rysunek 1E).
  2. Konfiguracja i pobieranie danych za pomocą systemu
    1. Umieść pokrywę czujnika na pustej 96-dołkowej płytce odbiorczej, a następnie umieść ją z powrotem w inkubatorze do hodowli komórkowych. Wyrównaj i zamontuj urządzenie na pokrywie czujnika i podłącz je do koncentratora za pomocą dostarczonego USB. W ten sposób powstaje "kanapka" Resiphera. (Rysunek 2A).
    2. Przejdź do aplikacji internetowej Lucid lab (https://lab.lucidsci.com/) i kliknij przycisk Nowy eksperyment w prawym górnym rogu, aby utworzyć nowy eksperyment.
    3. Nazwij tytuł eksperymentu i wprowadź wszelkie istotne notatki eksperymentalne dotyczące konkretnego badania (np. numer przejścia używanego iPSC-RPE).
    4. Stwórz dobre warunki i grupy zabiegowe. Na przykład, jeśli testujesz wpływ różnych stężeń surowicy w pożywce na OCR, wybierz Surowicę w nazwie grupy, a następnie wprowadź stężenia pożywek w surowicy, które mają być używane, dodając więcej wartości procentowych surowicy, klikając przycisk +. Przypisz, które studzienki otrzymają określony procent surowicy i wybierz wzór kolorów dla tych studzienek. W razie potrzeby dodaj więcej grup (np. inną zmienną eksperymentalną do przetestowania), klikając przycisk Dodaj grupę.
    5. Zdefiniuj konfigurację blachy i wybierz odpowiedni styl urządzenia i blachy. Kliknij przycisk dodaj tablicę i wybierz Urządzenie; Wybierz Typ blachy. Wybierz zabieg i kliknij odpowiednią studnię.
    6. Kliknij przycisk Rozpocznij teraz, aby rozpocząć eksperyment. Sprawdź, czy wskaźnik na stronie internetowej i dioda LED na koncentratorze świecą na zielono.
    7. Pozwól systemowi działać przez 15-60 minut, aby upewnić się, że każdy czujnik jest prawidłowo skalibrowany i dokładnie wykrywa tlen atmosferyczny, który powinien mieć stężenie ~ 200 μM w całkowicie nawilżonym inkubatorze do hodowli komórkowych z 5% CO2 ( Rysunek 2Bi).
      UWAGA: Jeśli którykolwiek z czujników różni się o więcej niż 20% od średniej innych czujników w standardowej konfiguracji inkubatora do hodowli komórkowych, rozważ wykluczenie tego dobrze w analizie danych, ponieważ czujnik jest uszkodzony (Rysunek 2Bii).
      UWAGA: Jeśli wszystkie czujniki różnią się o więcej niż 20% od średniej innych czujników i od oczekiwanego atmosferycznegoO2 zgłoszonego jako 200 μM w standardowej konfiguracji inkubatora do hodowli komórkowych, oznacza to, że pokrywa czujnika była używana zbyt wiele razy; wymień go na nową pokrywę czujnikową (Rysunek 2Biii).
      UWAGA: Uzyskanie odczytów O2 w powietrzu przed rozpoczęciem eksperymentu znacznie poprawia późniejsze rozwiązywanie problemów. Jeśli po przeprowadzeniu eksperymentu dana studnia wydaje się odstająca i ma ona czujnik, który nie był skalibrowany, problem może dotyczyć czujnika, a nie repliki biologicznej.
    8. Zdejmij urządzenie z pokrywy czujnika (ale nie odłączaj USB od urządzenia). Umieść urządzenie do góry nogami w inkubatorze, aby umożliwić zresetowanie silnika urządzenia. Nie używaj ponownie urządzenia, dopóki wszystkie dźwięki silnika nie ustaną (około 20-30 s).
      UWAGA: Ważne jest, aby urządzenie było podłączone do koncentratora za pomocą USB przez cały czas trwania eksperymentu, nawet gdy urządzenie jest zdjęte z pokrywy czujnika. Dzięki temu urządzenie może stale monitorować i raportować środowisko inkubatora kultur komórkowych.
    9. Umieść płytkę z pokrywką czujnikową z powrotem w kapturze do hodowli komórkowych wraz z 96-dołkową płytką zawierającą kultury RPE. Zmień pożywkę na płytce z kulturami RPE z tą samą pożywką i tą samą objętością dla wszystkich studzienek, aby uzyskać podstawowe wartości OCR dla każdej studzienki. Pamiętaj, aby napełnić wszystkie studzienki bez RPE sterylną wodą, aby zapobiec parowaniu.
      UWAGA: Ogólnie rzecz biorąc, zalecamy 60-100 μl pożywki hodowlanej RPE na 96 dołków, w oparciu o dane pokazujące, że mniejsze objętości pożywki prowadzą do szybkiego wyczerpania składników odżywczych, ale większe objętości pożywki prowadzą do niezamierzonego niedotlenienia9.
    10. Przenieść pokrywkę czujnikową na płytkę zawierającą kultury komórkowe, a standardową (inną niż Resipher) pokrywkę na płytkę zawierającą kultury komórkowe na pustą 96-dołkową płytkę odbiorczą w celu utrzymania sterylności pokrywki wzorcowej, która będzie potrzebna w różnych momentach podczas eksperymentowania.
    11. Umieścić płytkę z kulturami komórkowymi i pokrywką czujnikową z powrotem w inkubatorze do hodowli komórkowych. Ponownie wyrównaj i zamontuj urządzenie na pokrywie czujnika i podłącz je do koncentratora za pomocą dostarczonego USB (montaż "kanapki"). Sprawdź, czy wskaźniki w interfejsie witryny i Hubie świecą na zielono.
      UWAGA: Dane o stężeniuO2 pojawią się od razu, podczas gdy dane OCR pojawią się dopiero po zebraniu wystarczającej ilości danychO2, czyli po około 1 godzinie.
    12. Pozwól urządzeniu mierzyć OCR na każdym dołku przez co najmniej 12-24 godziny, aby uchwycić podstawowy OCR.
      UWAGA: Podstawowy OCR będzie się różnić w zależności od wielu czynników, w tym od rodzaju podłoża stosowanego do komórek. W Rysunek 2C, standardowe podłoża hodowlane RPE z różnymi ilościami FBS (0%, 5%, 15%) mają nieco inne wartości OCR. Co więcej, kultury z większą liczbą FBS mogą utrzymywać aktywność mitochondriów przez dłuższy czas po nałożeniu pożywki na komórki, zanim OCR spadnie z powodu wyczerpania metabolitów mitochondrialnych (prawa strona krzywej).
    13. Po uzyskaniu wyjściowego OCR powtórz kroki 1.2.8-1.2.12, ale zmień pożywkę na płytce z kulturami RPE do własnych warunków eksperymentalnych (zazwyczaj ± leku lub porównania różnych warunków pożywki).
      UWAGA: Rutynowe zmiany nośników można również obsługiwać w ten sam sposób. Za każdym razem, gdy inkubator do hodowli komórkowych jest otwierany, należy spodziewać się znacznych zakłóceń w odczytach OCR, ponieważ są one zależne od temperatury, wilgotności, stężenia CO2 i innych czynników, które są tymczasowo zakłócane przez otwarcie drzwi inkubatora. Podczas wyjmowania urządzenia z pokrywy czujnika nie ma potrzeby przerywania eksperymentu w trybie online. Po otwarciu drzwi inkubatora do hodowli komórkowych lub wymianie pożywki na sondowanej płytce, przywrócenie gradientu tlenu i rozpoczęcie dokładnego pomiaru OCR zajmuje zwykle 2-4 godziny.
    14. Po uzyskaniu danych odejmij podstawowy OCR dla każdego dołka od OCR po zastosowaniu warunków eksperymentalnych, aby określić OCR Delta wyzwalany przez zabieg.
    15. Po zakończeniu eksperymentu wysterylizuj i ponownie użyj pokrywy czujnika (która może być ponownie użyta 3-5 razy, chociaż wydajność pogarsza się przy wielokrotnym użyciu). Aby wysterylizować pokrywę czujnika, zanurz całą pokrywkę w 70% etanolu na 10 minut w kapturze do hodowli komórkowych, a następnie wyjmij z zanurzenia i spoczywaj w głowicy do góry (unikaj dotykania delikatnych końcówek sondy) i pozwól, aby etanol i woda całkowicie odparowały przed umieszczeniem pokrywy czujnika na nowej 96-dołkowej płytce odbiorczej.
  3. Wykonaj zdjęcia w jasnym polu, aby znormalizować wartości OCR do numeru komórki.
    UWAGA: Akumulacja melaniny w RPE ułatwia normalizację OCR na podstawie prostego liczenia liczby komórek w żywych kulturach przy użyciu mikroskopu jasnego pola.
    1. Wyjmij urządzenie i umieść je do góry nogami, jak w kroku 1.2.8. W kapturze do hodowli komórkowej zamień pokrywę czujnika na płytce do hodowli RPE na standardową pokrywę z 96 dołkami.
    2. Używając standardowego mikroskopu odwróconego, wykonaj zdjęcia w jasnym polu każdej studzienki.
      UWAGA: Utrzymuj spójność obrazów obszaru pierwszego między studzienkami (względne położenie w studni i powiększenie obiektywu).
    3. W kapturze do hodowli komórkowej zastąp standardową 96-dołkową pokrywę płytki do hodowli RPE pokrywką czujnikową i umieść ją z powrotem w inkubatorze w celu dalszego monitorowania.
    4. Policz numer komórki w każdym dołku za pomocą ImageJ lub innego oprogramowania.
    5. Znormalizuj OCR do liczby komórek w różnych grupach eksperymentalnych. System raportuje OCR w jednostkach fmol∙(mm2)-1∙s-1-zużycie na jednostkę powierzchni przekroju. Dlatego, aby znormalizować OCR na komórkę, podziel OCR przez liczbę komórek na mm2 (a nie liczbę komórek na studzienkę). Równoważnie, pomnóż OCR zgłoszony przez system przez pole przekroju poprzecznego studni (około 31mm2 dla standardowej płytki 96-dołkowej), aby uzyskać OCR w jednostkach fmol∙s-1∙studiń-1.
  4. Kontrole do określania parametrów bioenergetycznych RPE.
    UWAGA: Aby upewnić się, że system i hodowle RPE reagują na manipulacje mitochondrialne w przewidywalny sposób, można przetestować pewne małe cząsteczki, które są dobrze ugruntowane pod kątem określonych etapów mitochondrialnej fosforylacji oksydacyjnej. Testy te są analogiczne do etapów wykonywanych w Mitochondrialnym Teście Stresu przy użyciu Seahorse Analyzer10 i zapewniają profil bioenergetyczny dla kultur RPE.
    1. Hoduj komórki RPE w 65 μl standardowej pożywki hodowlanej RPE z 5% FBS i mierz OCR przez 24 godziny, aby ustalić punkt odniesienia.
    2. Odessać pożywki hodowlane i dodać 65 μl standardowych pożywek hodowlanych RPE z 5% FBS i z rozprzęgaczami mitochondrialnymi (3 μM cyjanek karbonylu-p-trifluorometoksyfenylohydrazon [FCCP] lub 500 nM Bam15, tabela materiałów). Inkubować przez noc.
      UWAGA: Rozprzęgacze mitochondrialne powinny znacznie zwiększyć OCR. Upewnij się, że zwiększony OCR nie jest równy ani bliski teoretycznego maksymalnego OCR ograniczonego dyfuzją wynoszącego około 275 fmol∙(mm2)-1∙s-1 dla 65 μl pożywki w standardowych warunkach hodowli. Maksymalny OCR dla różnych powszechnie używanych woluminów multimediów jest dostępny w sekcji Dyskusja.
    3. Po całonocnej inkubacji odessać pożywkę za pomocą rozłączaczy mitochondrialnych i zastąpić 65 μl standardowych pożywek hodowlanych RPE z 5% FBS. Obserwować tabliczkę przez kolejne 24 godziny, aby określić regenerację OCR RPE po usunięciu leków.
    4. Oblicz wpływ rozsprzęgaczy na OCR, odejmując OCR uzyskany po leczeniu od OCR uzyskanego przed leczeniem (Rysunek 3).
      UWAGA: Wzrost OCR z dodatkiem rozprzęgaczy mitochondrialnych oznacza rezerwową mitochondrialną pojemność oddechową komórki19.
    5. Aby zmierzyć inne parametry mitochondrialne zwykle wychwytywane podczas testu stresu mitochondrialnego za pomocą analizatora konika morskiego, wykonaj te same kroki powyżej z następującymi związkami (Rysunek 4).
      1. Użyj oligomycyny w stężeniu 1 μM, aby ocenić oddychanie sprzężone z ATP.
      2. Użyj antymycyny A i rotenonu w stężeniu 1 μM, aby ocenić oddychanie niemitochondrialne.
        UWAGA: FCCP, oligomycyna, antymycyna A i rotenon mogą być toksyczne dla RPE. Jeśli wywołują znaczną śmierć komórki, pomiary OCR nie będą dokładne. W związku z tym pomiary OCR powinny być wykonywane tylko w momencie, w którym nie ma oczywistej śmierci komórki, zazwyczaj w ciągu pierwszych kilku godzin po dodaniu leków (Rysunek 4).

2. Pomiar zmian w metabolizmie mitochondrialnym u RPE poddawanego EMT

  1. Postępuj zgodnie z tym samym protokołem, jak opisano w sekcji 1.2.
  2. Aby wywołać EMT po uzyskaniu wyjściowych pomiarów OCR, dodaj TGF-β2 (10 ng / ml) do kultur RPE i monitoruj OCR przez 3 tygodnie. Odświeżaj nośnik za pomocą nowego TGFβ2 co 2-3 dni (Rysunek 5).
  3. Co najmniej 2 razy w tygodniu uzyskuj obrazy w jasnym polu, jak w sekcji 1.3, aby upewnić się, że liczba komórek się nie zmienia. Jeśli liczba się zmieni, znormalizuj wartości OCR do numeru komórki w każdym dołku.
    UWAGA: Ten sam protokół można zastosować w przypadku innych induktorów EMT do monitorowania długoterminowych zmian OCR przez cały okres hodowli, gdy komórki znajdują się w inkubatorze.

3. Pomiar zmian w metabolizmie mitochondriów w niedotlenionym RPE

UWAGA: Zastosowanie systemu w warunkach hipoksyjnych, normoksycznych lub hiperoksycznych jest takie samo jak w sekcji 1.2, z wyjątkiem trzymania "kanapki" w komorze hipoksyjnej (Tabela Materiałów) umieszczonej w standardowym inkubatorze do hodowli komórkowych.

  1. Wywierć otwór w pokrywie komory hipoksji, aby zamontować USB typu c i uszczelnić go silikonem lub kitem (Rysunek 6A).
  2. Zamontuj pokrywę czujnikową z płytką do hodowli komórkowej w kapturze i przenieś je do komory hipoksji.
  3. Ustaw "kanapkę" (płytkę, pokrywę czujnika, urządzenie) w komorze hipoksji. Umieść również w komorze hipoksji szalkę Petriego ze sterylną wodą, aby pomóc utrzymać wilgotność. Na koniec umieść przenośny czujnikO2 w komorze hipoksji (tabela materiałów). Konfiguracja jest wyświetlana w Rysunek 6A.
  4. Uszczelnić komorę i podłączyć ją do butli gazowej o stężeniu hipoksyjnym O2 i standardowym stężeniu CO2 w hodowli komórkowej (np. 1%O2 i 5% CO2 ).
  5. Powoli wymieniaj powietrze w komorze hipoksji na 1% O2/5% CO2 powietrze w butli, aż czujnik tlenu pokaże pożądane stężenie O2 , zwykle gdzieś między 1% a 10%.
    UWAGA: Przenośny czujnikO2 potrzebuje czasu na zrównoważenie, dlatego gaz z butli należy powoli dodawać do komory hipoksji.
  6. Zamknij zawory wlotowe i wylotowe komory hipoksji i przenieś całą komorę do inkubatora.
  7. Ustaw i rozpocznij eksperyment jak w sekcji 1.2.
    UWAGA: Wstępne równoważenie pożywki w komorze hipoksji przed dodaniem do komórek może skrócić czas potrzebny monowarstwie komórki na prawdziwe niedotlenienie (Rysunek 6B).

4. Obliczanie stężenia O2 w monowarstwie RPE w celu określenia, czy komórki znajdują się w warunkach niedotlenienia, normoksyki czy hiperoksyki

UWAGA: System domyślnie mierzy stężenie O2 na wysokości około 1 do 1,5 mm nad dnem studzienki, zakładając, że używana jest standardowa płytka z odpowiednią zalecaną pokrywą czujnikową do hodowli jednowarstwowej (patrz https://lucidsci.com/docs/LucidScientific_Sensing_Lid_Selection_Guide.pdf). Chociaż stężenieO2 w monowarstwie ogniwa nie jest mierzone bezpośrednio, dane z systemu można wykorzystać do oszacowania stężeniaO2 na poziomie RPE. W szczególności, wiedząc, że gradient tlenu istnieje między górną częścią kolumny pożywki, gdzie dostępny jestO2, a dolną częścią kolumny pożywki, gdzie O2 jest zużywane, prawa dyfuzji Ficka można połączyć ze zmierzoną szybkością OCR w celu ekstrapolacji poziomów O2 w monowarstwie komórki. Kalkulator do tego oszacowania jest dostępny online: https://lucidsci.com/notes?entry=oxygen_diffusion (oraz w formie interaktywnego notatnika o otwartym kodzie źródłowym na https://observablehq.com/@lucid/oxygen-diffusion-and-flux-in-cell-culture, kod źródłowy tego kalkulatora można znaleźć pod adresem https://github.com/lucidsci/oxygen-diffusion-calculator).

  1. Po uzyskaniu dostępu do kalkulatora wprowadź objętość nośnika w mikrolitrach (np. 100 μL).
  2. Wprowadź stężenie nasyconego tlenu na granicy faz powietrze-ciecz (górna część kolumny pożywki nad komórkami). Wartość ta wynosi ~185 μM przy standardowym ciśnieniu atmosferycznym przy 5% O2 i wilgotności 95%.
    UWAGA: Można to również określić na podstawie pomiarówO2 za pomocą sond systemowych w studzienkach zawierających tylko media (bez komórek na dnie studzienki).
  3. W polu Flux input (Strumień wejściowy) wprowadź Flux/OCR zgłoszony przez system.
  4. Na podstawie tych wartości obliczane jest stężenie tlenu w stanie ustalonym na każdej wysokości w kolumnie pożywki i pokazane na wykresie (Rysunek 7). Oś x działki to wysokość w mm nad dnem studni. Oś y to obliczone stężenieO2 na tej wysokości (w μM).
  5. StężenieO2 na dnie studzienki (gdzie znajdują się komórki) podaje się w wierszu poniżej wykresu.
    UWAGA: Ogólnie rzecz biorąc, szacuje się, że RPE in vivo widzi stężenie O2 na poziomie 4-9%. Każde 10 μMO2 w normalnych warunkach atmosferycznych odpowiada około 1%O2. Zatem normoksja na poziomie komórek wynosi około 40-90 μMO2. Im wyższa kolumna nośnika, tym niższy będzie O2 na poziomie RPE monolayer9. Tak więc, jeśli komórki wydają się być w warunkach niedotlenienia, objętość pożywki może zostać zmniejszona. Jeśli komórki wydają się być w warunkach hiperoksycznych, objętość pożywki może zostać zwiększona.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Konfiguracja typu „kanapka” dla eksperymentu Resipher została przedstawiona na Rysunku 2A. Pokrywy pomiarowe z 32 sondami, odpowiadające kolumnom 3, 4, 9 i 10 na płytce 96-dołkowej, znajdują się pomiędzy płytką z komórkami a Urządzeniem. Po podłączeniu do Hubu Urządzenie uruchamia silniki, które poruszają pokrywą pomiarową w górę i w dół, mierząc stężenie O2 w kolumnie medium na różnych wysokościach nad monowarstwą komórek (zazwyczaj 1-1,5 mm). Gradient O2 jest zatem mi...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Mitochondrialny metabolizm RPE odgrywa kluczową rolę w patogenezie powszechnych chorób siatkówki powodujących ślepotę, w tym AMD i PVR. Modelowanie metabolizmu mitochondrialnego RPE in vitro pozwala na odizolowanie jego stanu metabolicznego od stanu metabolicznego otaczających tkanek, a także poddanie tkanki różnym obrażeniom symulującym chorobę w kontrolowany sposób. Takie modelowanie in vitro metabolizmu mitochondrialnego RPE zostało ułatwione dzięki pojawieniu się kultur pierwotnych i iPSC-RPE o wyso...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Richard A. Bryan i Kin Lo są pracownikami firmy Lucid Scientific, która produkuje system Resipher.

Podziękowania

Dziękujemy doktorom Danielowi Hassowi i Jimowi Hurleyowi za pomysł przetestowania rozpuszczalności O2 w nowych pożywkach w porównaniu z kondycjonowanymi jako kontrolą. Dziękujemy dr Magali Saint-Geniez za wkład redakcyjny w powstanie manuskryptu. Dziękujemy Scottowi Szalayowi z Instrument and Electronic Services Core, Kellogg Eye Center, za doposażenie komory hipoksyjnej w USB Resipher. Na badania nad HFT nie wykorzystano żadnych funduszy federalnych. Rdzeń usług elektronicznych jest wspierany przez P30 EY007003 z National Eye Institute. Praca ta jest wspierana przez nieograniczony grant wydziałowy z Research to Prevent Blindness (RPB). J.M.L.M. jest wspierany przez James Grosfeld Initiative for Dry Age-Related Macular Degeneration, Fundację E. Matildy Ziegler dla Niewidomych, grant Eversight-eye-bank, grant na K08EY033420 z National Eye Institute oraz wsparcie od Dee i Dickson Brown, a także David and Lisa Drews Discovering Hope Foundation. D.Y.S. jest wspierany przez UNSW Scientia Program. L.A.K. jest wspierany przez Iraty Award, Monte J. Wallace, Michel Plantevin, grant R01EY027739 z National Eye Institute oraz Departament Obrony Army Medical Research Acquisition Activity VR220059.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,25% Trypsyna-EDTAGibco#25-200-056
3,3',5-trijodo-L-tyronina sól sodowaSigmaT5516
32-kanałowa pokrywka ResipherLucid ScientificNS32-101A dla Falcon
Antimycin A ze streptomyces sp.SigmaA8674-25MGInhibitor kompleksu III łańcucha transportu elektronów
BAM15SigmaSML1760-5MGŚrodek rozprzęgający zwiększający oddychanie mitochondrialne
DMSO, klasa hodowli komórkowejSigma-aldrichD4540-100MLNośnik do odtwarzania leków mitochondrialnych
Podłoża powlekające macierz zewnątrzkomórkową:
Synthemax II-SC		Corning#3535Macierz zewnątrzkomórkowa dla hfRPE
Substraty powlekające macierz zewnątrzkomórkową: VitronectinGibcoA14700Macierz zewnątrzkomórkowa do iPSC-RPE
FCCPSigmaC2920-10MGŚrodek rozprzęgający zwiększający oddychanie mitochondrialne
Surowica bydlęca płodu (Bio-Techne S11550H)Bio-TechneS11550H
Hydrokortyzon-cyklodekstrynaSigmaH0396
Komora do hipoksyjiEmbrient Inc.MIC-101
N1 Suplement mediówSigmaN6530
Roztwór aminokwasów endogennychGibco11140050
Czujnik O2Technologia Sensit lub detektory kryminalistyczneP100 lub FD-90A-O2
Penicylina-StreptomycynaGibco15140-122
Rekombinowany ludzki TGF i beta; 2Peprotech100-35BTransformujący czynnik wzrostu beta-2 w celu indukowania przejścia nabłonkowo-mezenchymalnego
RotenonSigmaR8875-1GInhibitor kompleksu I łańcucha transportu elektronów
Płytka kompatybilna z systememCorning#353072
TaurineSigmaT8691
α MEM (Modyfikacja Alfa Pożywki Orła)Corning15-012-CV

Bibliografia

  1. Shu, D. Y., Butcher, E., Saint-Geniez, M. EMT and EndMT: emerging roles in age-related macular degeneration. Int J Mol Sci. 21 (12), 4271(2020).
  2. Shu, D. Y., Lovicu, F. J. Myofibroblast transdifferentiation: the dark force in ocular wound healing and fibrosis. Prog Retin Eye Res. 60, 44-65 (2017).
  3. Hurley, J. B. Retina metabolism and metabolism in the pigmented epithelium: a busy intersection. Annu Rev Vis Sci. 7, 665-692 (2021).
  4. Wu, W., et al. Deficient RPE mitochondria energetics leads to subretinal fibrosis in age-related macular degeneration. Invest Ophthalmol Vis Sci. 64 (8), 2420(2023).
  5. Hansman, D. S., et al. Metabolic reprogramming of the retinal pigment epithelium by cytokines associated with age-related macular degeneration. Biosci Rep. 44 (4), BSR20231904BSR20231904(2024).
  6. Li, K. X., et al. Modulation of pyruvate kinase M2 activity as a therapy in a primary RPE cell culture model of proliferative vitreoretinopathy. Invest Ophthalmol Vis Sci. 62 (8), 2213(2021).
  7. Gupta, S., et al. Progress in stem cells-based replacement therapy for retinal pigment epithelium: in vitro differentiation to in vivo delivery. Stem Cells Transl Med. 12 (8), 536-552 (2023).
  8. Wilson, D. F., et al. Oxygen distribution and vascular injury in the mouse eye measured by phosphorescence-lifetime imaging. Appl Opt. 44 (25), 5239-5248 (2005).
  9. Hass, D. T., et al. Medium depth influences O2 availability and metabolism in human RPE cultures. Invest Ophthalmol Vis Sci. 64 (14), 4(2023).
  10. Shu, D. Y., Butcher, E. R., Saint-Geniez, M. Suppression of PGC-1α drives metabolic dysfunction in TGFβ2-Induced EMT of retinal pigment epithelial cells. Int J Mol Sci. 22 (9), 4701(2021).
  11. Shu, D. Y., et al. Dimethyl fumarate blocks tumor necrosis factor-alpha-driven inflammation and metabolic rewiring in the retinal pigment epithelium. Front Mol Neurosci. 15, 896786(2022).
  12. Ng, P. Q., Saint-Geniez, M., Kim, L. A., Shu, D. Y. Divergent metabolomic signatures of TGFβ2 and TNFα in the induction of retinal epithelial-mesenchymal transition. Metabolites. 13 (2), 213(2023).
  13. Kar, D., et al. Choriocapillaris impairment is associated with delayed rod-mediated dark adaptation in age-related macular degeneration. Invest Ophthalmol Vis Sci. 64 (12), 41(2023).
  14. Curcio, C. A., Kar, D., Owsley, C., Sloan, K. R., Ach, T. Age-related macular degeneration, a mathematically tractable disease. Invest Ophthalmol Vis Sci. 65 (3), 4(2024).
  15. Maminishkis, A., et al. Confluent monolayers of cultured human fetal retinal pigment epithelium exhibit morphology and physiology of native tissue. Invest Ophthalmol Vis Sci. 47 (8), 3612-3624 (2006).
  16. Maminishkis, A., Miller, S. S. Experimental models for study of retinal pigment epithelial physiology and pathophysiology. J Vis Exp: JoVE. (45), e2032(2010).
  17. Zhang, Q., et al. A platform for assessing outer segment fate in primary human fetal RPE cultures. Exp Eye Res. 178, 212-222 (2019).
  18. Sharma, R., Bose, D., Montford, J., Ortolan, D., Bharti, K. Triphasic developmentally guided protocol to generate retinal pigment epithelium from induced pluripotent stem cells. STAR Protoc. 3 (3), 101582(2022).
  19. Marchetti, P., Fovez, Q., Germain, N., Khamari, R., Kluza, J. Mitochondrial spare respiratory capacity: Mechanisms, regulation, and significance in non-transformed and cancer cells. FASEB J. 34 (10), 13106-13124 (2020).
  20. Rosenfeld, P. J., Trivizki, O., Gregori, G., Wang, R. K. An update on the hemodynamic model of age-related macular degeneration. Am J Ophthalmol. 235, 291-299 (2022).
  21. Fitch, T. C., et al. Real-time analysis of bioenergetics in primary human retinal pigment epithelial cells using high-resolution respirometry. J Vis Exp: JoVE. (192), (2023).
  22. Calton, M. A., Beaulieu, M. O., Benchorin, G., Vollrath, D. Method for measuring extracellular flux from intact polarized epithelial monolayers. Mol Vis. 24, 425-433 (2018).
  23. Grumbine, M. K., et al. Maintaining and assessing various tissue and cell types of the eye using a novel pumpless fluidics system. J Vis Exp: JoVE. (197), (2023).
  24. Mu, C., Shearer, J. Protocol for measuring respiratory function of mitochondria in frozen colon tissue from rats. STAR Protoc. 4 (4), 102560(2023).
  25. Rocha, D. S., Manucci, A. C., Bruni-Cardoso, A., Kowaltowski, A. J., Vilas-Boas, E. A. A practical and robust method to evaluate metabolic fluxes in primary pancreatic islets. Mol Metab. 83, 101922(2024).
  26. Kanaan, M. N., et al. Cystine/glutamate antiporter xCT controls skeletal muscle glutathione redox, bioenergetics and differentiation. Redox Biol. 73, 103213(2024).
  27. da Veiga Moreira, J., et al. Methylene blue metabolic therapy restrains in vivo ovarian tumor growth. Cancers. 16 (2), 355(2024).
  28. McNally, L. A., Altamimi, T. R., Fulghum, K., Hill, B. G. Considerations for using isolated cell systems to understand cardiac metabolism and biology. J Mol Cell Cardiol. 153, 26-41 (2021).
  29. Misare, K. R., et al. The consequences of tetraploidy on Caenorhabditis elegans physiology and sensitivity to chemotherapeutics. Sci Rep. 13 (1), 18125(2023).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

nabłonek pigmentowy siatkówkifunkcja mitochondriówhodowle RPEinkubator do hodowli komórkowychkomora hipoksycznaprofilowanie bioenergetycznepolaryzacja RPEpomiar gradientu tlenowego
Długoterminowe monitorowanie wskaźników zużycia tlenu w wysoce zróżnicowanych i spolaryzowanych kulturach nabłonka barwnikowego siatkówki
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.