Artykuł metodologiczny

Charakterystyka płytek krwi prokoagulantu poprzez pomiar ekspozycji na fosfatydyloserynę i uwalniania mikropęcherzyków z oczyszczonych płytek krwi u ludzi

1.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/67042

⸱

29 listopada 2024

 ,  , 
1French Reference Centre for Inherited Platelet Disorders, University Hospital of Bordeaux, 2Department of Haematology, University Hospital of Bordeaux, 3Inserm U1034, Biology of Cardiovascular Disease

W tym artykule

Podsumowanie

Tworzenie się płytek krwi z prokoagulantem jest skorelowane ze zwiększonym ryzykiem zakrzepicy. Przedstawiono dokładny protokół izolacji przemytych płytek krwi od krwi ludzkiej, mający na celu ilościowe określenie ekspozycji na fosfatydyloserynę i uwalnianie mikropęcherzyków, które są charakterystycznymi cechami płytek krwi prokoagulantu.

Streszczenie

Aktywowane płytki krwi sprzyjają krzepnięciu głównie poprzez eksponowanie proagulantu fosfolipidowego fosfatydyloseryny (PS) na ich zewnętrznej powierzchni błony i uwalnianie mikropęcherzyków wyrażających PS, które zachowują oryginalną architekturę błony i cytoplazmatyczne składniki ich macierzystych komórek. Dostępność fosfatydyloseryny ułatwia wiązanie głównych czynników krzepnięcia, znacznie zwiększając skuteczność katalityczną enzymów krzepnięcia, podczas gdy uwalnianie mikropęcherzyków działa jako kluczowy mediator sygnalizacji międzykomórkowej. Prokoagulanty odgrywają kluczową rolę w stabilizacji skrzepów podczas hemostazy, a ich zwiększony udział w krwiobiegu koreluje ze zwiększonym ryzykiem zakrzepicy. Wykazano również, że mikropęcherzyki płytkowe są bogate w czynniki wzrostu, które wspomagają gojenie się ran i modulację stanu zapalnego. Analiza ekspozycji na fosfatydyloserynę i uwalniania mikropęcherzyków za pomocą cytometrii przepływowej stanowi poważne wyzwanie ze względu na ich niewielki rozmiar i ograniczoną liczbę pozytywnych zdarzeń dla markerów będących przedmiotem zainteresowania. Pomimo znacznych postępów poczynionych w ciągu ostatniej dekady, metody oceny ekspozycji na fosfatydyloserynę i uwalniania mikropęcherzyków pozostają w toku. Niestety, nie istnieje jeden powszechnie stosowany protokół i należy ocenić kilka czynników, aby określić najbardziej odpowiednią metodologię dla każdego konkretnego zastosowania. W tym miejscu opisujemy szczegółowy protokół izolowania przemytych płytek krwi od ludzkiej krwi, a następnie aktywacji kolagenu i / lub trombiny, w celu zmierzenia ekspozycji na fosfatydyloserynę i uwalnianie mikropęcherzyków, które charakteryzują płytki krwi prokoagulantu. Protokół ten ma na celu ułatwienie wstępnego przygotowania osocza bogatopłytkowego i izolacji przemytych płytek krwi. Wreszcie, ekspozycja na fosfatydyloserynę i uwalnianie mikropęcherzyków są określane ilościowo za pomocą cytometrii przepływowej, co umożliwia identyfikację płytek krwi prokoagulantów.

Wprowadzenie

Tworzenie prokoagulantu płytek krwi jest kluczowe dla utrzymania hemostazy1,2,3. Proces ten obejmuje indukowaną przez agonistów ekspresję fosfolipidów na błonie płytek krwi, która jest niezbędna do składania kompleksów tenazy i protrombinazy1,3,4. Po aktywacji płytek krwi, mikropęcherzyki płytkowe są również w sposób ciągły uwalniane5,6. Mikropęcherzyki (o średnicy od 50 nm do ponad 1 μm) otaczają zarówno strukturę błony, jak i składniki cytoplazmatyczne komórek źródłowych7,8. Mikropęcherzyki są ważnymi mediatorami sygnalizacji międzykomórkowej9,10, a także repozytoria czynników wzrostu, które wspomagają gojenie się ran i modulację stanu zapalnego11,12. Sugeruje się również, że mikropęcherzyki są od 50 do 100 razy bardziej prokoagulacyjne niż aktywowane płytki krwi13. Warto zauważyć, że najnowsze dowody sugerują, że zmagazynowane płytki krwi ulegają aktywacji, co prowadzi do produkcji mikropęcherzyków - ma to potencjalne konsekwencje dla praktyki terapii transfuzji płytek krwi. Wydłużony czas przechowywania mikropęcherzyków i zwiększona aktywność prokoagulantu sprawiają, że są one obiecującym substytutem płytek krwi w zastosowaniach transfuzjologicznych14.

Wprowadzono innowacje metodologiczne, aby bezpośrednio i pośrednio ocenić powstawanie prokoagulantów płytek krwi zarówno w warunkach zdrowotnych, jak i chorobowych4,14,15. Oceny ekspozycji na fosfatydyloserynę i uwalniania mikropęcherzyków przy użyciu oczyszczonych płytek krwi dostarczyły nowych danych na temat tego, jak zaburzone są reakcje prokoagulantów płytek krwi w różnych chorobach człowieka1,4. Ta rozwijająca się dziedzina badań otwiera również możliwości interwencji terapeutycznych1,4. Jednak izolacja i analiza oczyszczonych płytek krwi z krwi jest czasochłonna, wymaga specjalistycznego sprzętu laboratoryjnego, a zatem nie można ich obecnie dostosować do rutynowej diagnostyki klinicznej16,17. Analiza ekspozycji na fosfatydyloserynę i uwalniania mikropęcherzyków jest również trudna ze względu na ich mały rozmiar i liczbę pozytywnych zdarzeń dla markerów będących przedmiotem zainteresowania18,19.

Cytometria przepływowa, wykorzystująca fluorescencyjne wiązanie Aneksyny-V, była kamieniem węgielnym w ocenie ekspresji PS na płytkach krwi i mikropęcherzykach od momentu jej powstania dwie dekady temu20. Zyskał powszechną akceptację w badaniu prokoagulacyjnych płytek krwi i mikropęcherzyków21,22. W związku z tym przedstawiono tutaj zoptymalizowany protokół, który można wykorzystać do izolacji oczyszczonych płytek krwi z próbek krwi przy użyciu techniki opracowanej przez grupę Cazenave'a23, a następnie charakterystyki ekspozycji na fosfatydyloserynę i uwalniania mikropęcherzyków za pomocą cytometrii przepływowej po aktywacji płytek krwi24. Protokół ten ułatwi dalsze badania i dogłębną charakterystykę prokoagulacyjnych płytek krwi w populacjach klinicznych będących przedmiotem zainteresowania.

Protokół

Protokół jest zgodny z wytycznymi i został zatwierdzony przez Komitet Etyki Badań Naukowych Szpitala Uniwersyteckiego w Bordeaux. Próbki krwi pobrano od zdrowych ochotników, którzy wyrazili świadomą zgodę, a próbki te zostały przetworzone zgodnie z protokołami instytucjonalnymi. Dawcy, którzy przyjmowali jakiekolwiek substancje mogące wpływać na czynność płytek krwi, byli wykluczani, jeśli takie substancje zostały przyjęte w ciągu 10 dni poprzedzających eksperymenty. Uzyskano świadomą zgodę od zdrowych ochotników na pobranie krwi i opublikowanie danych. Szczegółowe informacje na temat odczynników i używanego sprzętu są wymienione w Tabeli materiałów.

1. Pobieranie krwi i przygotowanie umytych płytek krwi

  1. Krew z żył obwodowych należy pobrać do probówek zbiorczych zawierających aktywny antykoagulant cytrynian trójsodowy z kwasem cytrynowym i dekstrozą (ACD) po odrzuceniu pierwszych 3 ml.
  2. Po pobraniu delikatnie odwróć probówkę, aby wymieszać krew z ACD i pozostaw mieszaninę w temperaturze pokojowej na 15 minut przed odwirowaniem.
  3. Policz płytki krwi za pomocą automatycznego licznika komórek przed odwirowaniem, aby określić prawidłową prędkość wirowania (Tabela 1). Przygotować osocze bogatopłytkowe (PRP) przez odwirowanie przy 250 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej (RT) bez stosowania hamulca, aby zoptymalizować regenerację płytek krwi.
    UWAGA: Ten krok spowoduje wytworzenie trzech warstw w próbce: górna warstwa zawierająca osocze, płytki krwi i niewielką frakcję białych krwinek; środkowa warstwa wzbogacona białymi krwinkami; i dolna warstwa składająca się z czerwonych krwinek. Ostrożnie przenieś PRP z górnej warstwy do nowej stożkowej probówki o pojemności 50 ml, aby uniknąć zanieczyszczenia czerwonymi i białymi krwinkami.
  4. Do PRP dodać 1 ml ACD-A (patrz Tabela 2) i 6,25 μl apyrazy na 9 ml.
    UWAGA: Apyraza, w stężeniu 0,02 U/ml, rozkłada śladowe ilości ATP lub ADP wydzielane przez płytki krwi, zapobiegając w ten sposób odczuleniu receptorów ADP płytek krwi i utrzymując kształt płytek krwi25. Inhibitor prostacykliny PGI2 (0,5 μM) może być również dołączony do apyrazy, aby zapobiec aktywacji płytek krwi.
  5. Przygotować osad płytek krwi przez odwirowanie w temperaturze pokojowej przy 1100 x g przez 10 minut. Odessać supernatant zawierający osocze ubogie w płytki krwi (PPP) delikatną metodą, taką jak pipeta Pasteura, i ponownie zawiesić osad w 1 ml buforu płuczącego (patrz Tabela 3 i Tabela 4). Delikatnie homogenizować pipetą, a następnie dodać dodatkowe 3-4 ml buforu do mycia.
    UWAGA: Poziom wapnia jest obniżony, aby zapobiec krzepnięciu czynnikami skrzepowymi obecnymi w osoczu. Na tym etapie osocze ubogie w płytki krwi zostało całkowicie usunięte, co zapobiega tworzeniu się skrzepów i aktywacji płytek krwi przez produkcję trombiny.
  6. Ponownie odwirować w temperaturze pokojowej przy 1100 x g przez 10 minut. Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad w 1 ml buforu do mycia. Przenieść 150 μl zawiesiny płytek krwi do probówki o pojemności 1,5 ml w celu zliczenia komórek za pomocą automatycznego licznika komórek. Następnie ponownie zawiesić osad za pomocą 3-4 ml buforu do mycia.
  7. Przeprowadzić końcowe wirowanie przy 1100 x g przez 10 minut (w temperaturze pokojowej). Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad płytek krwi w objętości buforu reakcyjnego (patrz tabela 5 i tabela 6) do uzyskania końcowego stężenia 5 x 1011 płytek krwi/l.
  8. Pozwól umytym płytkom krwi odpocząć przez co najmniej 30 minut przed eksperymentami, aby umożliwić zużycie pozostałych inhibitorów i aklimatyzację płytek krwi do buforu.

2. Przygotowanie testu

  1. Przygotować wszystkich agonistów i fluorochromy w buforze reakcyjnym. Dodać 5 μl trombiny do 45 μl buforu (rozcieńczenie 1:10) i 5 μl jonoforu do 495 μl buforu (rozcieńczenie 1:500).
    1. W przypadku testów wewnętrznych należy porównać nieaktywowane płytki krwi z płytkami krwi leczonymi pojedynczymi i podwójnymi agonistami. Dodać, w różnych podwielokrotnościach, 100 μl przemytych płytek krwi w proporcjach 50 x 109 płytek krwi/l do: (i) 10 μl buforu reakcyjnego, (ii) 3 μl nierozcieńczonego kolagenu (końcowe stężenie 30 μg/ml), (iii) 10 μl wstępnie rozcieńczonej trombiny (0,5 j.m./ml), (iv) 3 μl nierozcieńczonego kolagenu + 10 μl wstępnie rozcieńczonej trombiny, oraz (v) 10 μl wstępnie rozcieńczonego jonoforu (końcowe stężenie 2 μM), o którym wiadomo, że bezpośrednio zwiększa wewnątrzkomórkowy poziom wapnia, jak wcześniej wspomniano26.
      UWAGA: Leczenie jonoforem wapnia, takim jak A23187 lub jonomycyna, ma kluczowe znaczenie, ponieważ indukuje rozległe mieszanie błony fosfolipidowej i zwiększoną eksternalizację PS.
    2. Delikatnie wstrząsnąć ręką i inkubować w temperaturze 37 °C przez 5 min.
      UWAGA: Dłuższa inkubacja agonistów (30 min) może pozwolić na lepsze różnicowanie populacji płytek krwi podczas procesu analizy cytometrii przepływowej.
  2. Dodać 5 μl nierozcieńczonego Annexin-V FITC do każdej mikroprobówki i inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 minut w ciemności.
    UWAGA: W celu lepszej identyfikacji komórek płytkowych można również włączyć przeciwciało monoklonalne przeciwko jednemu z receptorów swoistych dla płytek krwi, GPIX (CD42b) lub integrynie αIIb (CD41, GPIIb).
  3. Dodać 500 μl buforu reakcyjnego, aby zatrzymać proces i kontynuować analizę próbki za pomocą cytometru przepływowego.

3. Charakterystyka prokoagulacyjnych płytek krwi i mikropęcherzyków za pomocą cytometrii przepływowej (FC)

UWAGA: Do wiarygodnej analizy funkcji płytek krwi użyj przyrządu do cytometrii przepływowej (FC) skonfigurowanego zgodnie z ustalonymi standardami27. Przyrząd musi być zdolny do wykrywania rozproszenia do przodu (FSC) i co najmniej jednego sygnału fluorescencyjnego. Ustaw detektory rozproszenia światła i fluorescencji na wzmocnienie logarytmiczne. Rozcieńczyć próbki odpowiednio do FC, aby upewnić się, że tylko pojedyncze płytki krwi są zliczane ze zmniejszoną prędkością pozyskiwania danych.

  1. Ustaw cytometr przepływowy na "wolne" natężenie przepływu z progiem co najmniej 10 000 zdarzeń płytkowych. Monitoruj emisję fluorescencji za pomocą filtra przepustowego dla FITC.
  2. Bramka populacji płytek krwi za pomocą rozproszenia do przodu (FSC). Zbadaj płytki krwi i uwolnione mikropęcherzyki zgodnie z ich wielkością. Użyj wykresów gęstości, aby zidentyfikować płytki krwi i uwolnione mikropęcherzyki zarówno dla płytek krwi spoczynkowych, jak i stymulowanych; Analizuj każdą populację bramkowaną niezależnie.
  3. Rozróżnij płytki krwi prokoagulacyjne zgodnie z osią FL1. Umieścić ujemną granicę odcięcia po prawej stronie populacji płytek krwi w stanie spoczynku (tj. w obecności buforu reakcyjnego). Po aktywacji płytek krwi należy sklasyfikować wszystkie zdarzenia zlokalizowane po prawej stronie tego punktu odcięcia jako płytki krwi eksponujące fosfatydyloserynę.
  4. Rozróżniaj mikropęcherzyki, które są mniejsze niż płytki krwi, dzięki ich unikalnym właściwościom rozpraszania światła. Ustawić punkt odcięcia na najniższą wartość FSC obserwowaną w spoczynkowej populacji płytek krwi. Po aktywacji należy sklasyfikować wszelkie zdarzenia fosfatydyloseryny dodatnie poniżej tego progu jako mikropęcherzyki.
    UWAGA: Należy uwzględnić indywidualne różnice w wielkości płytek krwi, dostosowując w razie potrzeby wartość odcięcia. Upewnij się, że mniej niż 1% mikropęcherzyków jest obecnych w stanie spoczynku.

Wyniki

Kwantyfikacja płytek krwi i mikropęcherzyków prokoagulantu jest osiągana za pomocą barwienia Aneksyną-V, z co najmniej 50 000 zarejestrowanych zdarzeń na próbkę. Jak stwierdzono w kroku 2.2, podstawowe pomiary płytek krwi wykonano z próbek inkubowanych z buforem reakcyjnym, jak pokazano na rysunku Rysunek 1A. Wielkość płytek krwi mierzono za pomocą mediany wartości rozproszenia do przodu (FSC). Chociaż na FSC wpływają różne czynniki, pozostaje on powszechnym wskaźnikiem zastępczym do szacowania wielkości komórek, w tym płytek krwi. Wykresy gęstości obszaru (Rysunek 1A) zostały wykorzystane do identyfikacji i wykluczenia spoczynkowych płytek krwi i uwolnionych mikropęcherzyków.

W przypadku nieaktywowanych płytek krwi, mniej niż 2,9% wykazywało fosfatydyloserynę (PS), jak określono za pomocą barwienia Aneksyną-V. Po aktywacji przemytych płytek krwi samym kolagenem lub w połączeniu z trombiną lub jonoforem wapnia obserwowano wzrost ekspozycji na PS. Sam kolagen spowodował 26,7% wzrost liczby płytek krwi PS-dodatnich. Trombina miała minimalny wpływ na ekspozycję na PS (9,1%), ale w połączeniu z kolagenem zwiększała odsetek płytek krwi eksponujących PS do 36,2%. Dla porównania, leczenie jonoforem 2 μM spowodowało, że 49,6% płytek krwi stało się prokoagulantami.

Rysunek 1 pokazuje, że wyjściowy odsetek mikropęcherzyków z przemytych płytek krwi u zdrowej osoby był minimalny (0,3%). Podczas gdy trombina i kolagen minimalnie zwiększały tworzenie mikropęcherzyków, dopiero połączenie kolagenu i trombiny znacznie zwiększyło tworzenie mikropęcherzyków (Rysunek 1D; 11,4%). Dodanie jonoforu 2 μM spowodowało, że 44,0% mikropęcherzyków utworzonych przez płytki krwi z grupy kontrolnej było narażonych na PS.

Rysunek 2 dostarcza informacji dotyczących zmienności, powtarzalności i odtwarzalności, których można oczekiwać od tego procesu.

figure-results-1
Rysunek 1: Ekspozycja PS i tworzenie mikropęcherzyków w spoczynkowych i aktywowanych płytkach krwi. Płytki krwi były aktywowane lub nieaktywowane (spoczynkowe) (A), z 30 μg/ml kolagenu (B), z 0,5 U/ml trombiny (C), z kombinacjami kolagenu i trombiny (D) z jonoforem 2 μM. Reprezentatywne wykresy punktowe wyświetlają rozmiar płytek krwi (rozrzut do przodu (log FSC)) w porównaniu z wiązaniem Annexin-V. Linie poziome i pionowe (E) wyznaczają populację ujemną pod względem płytek krwi. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Powtarzalność i odtwarzalność ekspozycji na PS i tworzenia mikropęcherzyków po inkubacji z jonoforem. Analiza ekspozycji na PS i tworzenia mikropęcherzyków po inkubacji z jonoforem 2 μM lub 5 μM w przemytych płytkach krwi, poddanych lub niepoddanych działaniu cytrynianu (chelatora wapnia): (A) z 4 różnych zdrowych grup kontrolnych; (B) z jednej zdrowej grupy kontrolnej powtórzonej 5 razy; oraz (C) z dwóch zdrowych próbek kontrolnych przygotowanych przez dwóch różnych techników. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rozdział szt. szt. szt. szt. szt. szt. szt. szt. szt. szt. szt.
Liczba płytek krwi we krwi pełnej (10,9 / ml)Względne siły odśrodkowe (g)
<3070
30-50100
51-100130
101-150200
151-300Z kolei 250
301-600290
>600340

Tabela 1: Względne siły odśrodkowe dla przygotowania osocza bogatopłytkowego w stosunku do liczby płytek krwi pełnej.

Odczynnikkwota
Kwas cytrynowy jednowodny (C, 6, H, 8,O7. H2O, 38 mM)8 gramów
Cytrynian trisodowy dwuwodny (Na3C6H5O7,2 H2O, 61 mM)180 gr
Glukoza (C6H12O6, 136 mM)24,6 gr
pH roztworu nie powinno być regulowane. Roztwór należy przechowywać w temperaturze 4 °C.

Tabela 2: Przygotowanie 1 l wodnego roztworu kwasu cytrynianu i dekstrozy (ACD).

powiedział:
Odczynnikkwota
Kwas cytrynowy jednowodny (C6H8O7. H2O, 36 mM)7,56 gr
NaCl (103 mM)6 gramów
NaOH4 gramów
MgCl2,6H 2O (1 mM) 0,203 gr
Dostosuj pH na 6,5. Roztwór należy przechowywać w temperaturze 4 °C.

Tabela 3: Przygotowanie roztworu podstawowego buforu myjącego.

Odczynnikkwota
30% albumina surowicy bydlęcej (BSA)583 μL
CaCl2, 0,25 m400 μL
glukoza40 mg tabletki powlekania
Apyrase (Apyrase)31,5 μL

Tabela 4: Przygotowanie 50 ml roztworu dożylnego buforu do przemywania z roztworu podstawowego.

Odczynnikkwota
NaCl (137 mM)8 gramów
KCl (2,7 mM)0,2 grama
MgCl2,6H 2O (1 mM)0,203 gr
FILTR ELEKTROMAGNETYCZNY (5 mM) 1,19 gr
NaHCO3 (12 mM) 1 gramów
NaH2PO4,2 H2O; 0,3 mM0,05 gr
Dostosuj pH na 7.4. Roztwór należy przechowywać w temperaturze 4 °C.

Tabela 5: Przygotowanie podstawowego roztworu buforu reakcyjnego.

Odczynnikkwota
30% albumina surowicy bydlęcej (BSA)167 μL
CaCl2, 0,25 m400 μL
glukoza50 mg tabletki powlekania

Tabela 6: Przygotowanie 50 ml roztworu doraźnego buforu reakcyjnego z roztworu podstawowego.

Dyskusja

Ostatnie badania nad prokoagulacyjnymi płytkami krwi podkreśliły ich zmiany podczas kilku chorób 1,28,29, podkreślając znaczenie ich szczegółowej analizy i charakterystyki 30,31,32. Chociaż obecne testy kliniczne oceniające tworzenie prokoagulantów płytek krwi są ograniczone, w ciągu ostatnich dwóch dekad nastąpił znaczny wzrost zainteresowania klinicznego. Na przykład zależny od wapnia scramblase TMEM16F (ANO6) bierze udział w ekspozycji na prokoagulanta fosfatydyloserynę (PS)33. Warianty TMEM16F są związane z zespołem Scotta 33,34,35, rzadkim zaburzeniem krzepnięcia charakteryzującym się upośledzonym mieszaniem fosfolipidów i zmniejszonym wytwarzaniem trombiny w aktywowanych płytkach krwi 36. Co więcej, podwyższony poziom prokoagulantów płytek krwi jest związany z udarami zakrzepowymi i chorobą wieńcową, co wzbudza zainteresowanie terapiami mającymi na celu ograniczenie aktywności prokoagulantu płytek krwi37. Spośród obecnie dostępnych metod oceny tworzenia się proagulantów płytek krwi, ocena ekspozycji na PS poprzez wiązanie Aneksyny-V i uwalnianie mikropęcherzyków jest jedną z najczęściej stosowanych38,39.

Przedstawiony tutaj protokół umożliwia izolację oczyszczonych przez człowieka płytek krwi i scharakteryzowanie płytek krwi prokoagulantów poprzez pomiar ekspozycji na PS i uwalniania mikropęcherzyków za pomocą cytometrii przepływowej. Bardzo ważne jest, aby zalecić zdrowym ochotnikom, aby powstrzymali się od leków, które mogą wpływać na czynność płytek krwi przez co najmniej 10 dni przed pobraniem krwi. Pobieranie krwi wymaga ostrożności, aby uniknąć urazu żyły lub zbyt powolnego przepływu, ponieważ mogą one indukować wytwarzanie trombiny i aktywację płytek krwi. Krew antykoagulowana cytrynianem sodu nie jest zalecana do przygotowania przemytych płytek krwi, ponieważ resztkowy wapń może umożliwiać wytwarzanie trombiny i aktywację płytek krwi podczas wirowania17. Krew z antykoagulacją ACD ma pH 6,5 i wyższe stężenie cytrynianu 22 mmol/L w porównaniu z pH krwi z antykoagulacją cytrynianową wynoszącą 7,5 i stężenie cytrynianu 13 mmol/l17. Kwaśne pH i obniżone zewnątrzkomórkowe stężenie wapnia we krwi z antykoagulacją ACD zapobiegają agregacji płytek krwi24. Niezbędne jest zminimalizowanie wytwarzania trombiny podczas procesu zbierania. Zaleca się nieurazowe nakłucie żyły przy użyciu igły o wadze co najmniej 21 G, aby zapobiec zastojowi żylnemu lub nadmiernemu ciśnieniu. Dodatkowo pierwsze kilka mililitrów krwi należy wyrzucić, aby uniknąć zanieczyszczenia czynnikami tkankowymi i śladowymi ilościami trombiny17. Niezbędne jest również zminimalizowanie czasu między nakłuciem żyły a przetworzeniem próbki, ponieważ długotrwałe przechowywanie krwi może prowadzić do aktywacji płytek krwi, zwiększając w ten sposób ekspozycję na PS i uwalnianie mikropęcherzyków40. Podczas całej procedury przygotowania płytek krwi należy zwrócić szczególną uwagę, aby zapobiec spontanicznej preaktywacji płytek krwi, która może wystąpić podczas samego procesu przygotowania41,17. Co więcej, wyizolowanie oczyszczonych płytek krwi wymaga ostrożnego unikania zanieczyszczenia innymi komórkami krwi17. Polega to na dokładnym zasysaniu supernatantu po odwirowaniu płytek krwi w celu zapewnienia czystego preparatu. Ponieważ osad jest zazwyczaj widoczny i mocno przylega do ścianki probówki, supernatant można łatwo zassać za pomocą końcówki pipety.

Podczas etapów płukania wirowania płytki krwi są ponownie zawieszane w buforze, który symuluje warunki fizjologiczne. Użycie przemytych płytek krwi w buforze fizjologicznym izoluje je od antykoagulantów i osocza, zapobiegając w ten sposób artefaktom za pośrednictwem trombiny. Podczas gdy osocze bogatopłytkowe (PRP) jest szybką metodą uzyskiwania wysokich stężeń płytek krwi, jej zastosowanie w badaniach funkcjonalnych jest ograniczone przez zmiany pH wywołane antykoagulantami oraz zewnątrzkomórkową zawartość wapnia i białka w osoczu, które mogą wpływać na aktywację płytek krwi17. Co więcej, wysokie poziomy PS generowane podczas aktywacji płytek krwi byłyby wystarczające, aby sprzyjać tworzeniu się kompleksów krzepnięcia osocza, następnemu wybuchowi trombiny i tworzeniu się skrzepów w PRP, co uniemożliwiłoby interpretację wyników eksperymentalnych. Natomiast ponowne zawieszenie w buforze zawierającym apirazę jest zalecane w celu utrzymania funkcjonalności płytek krwi poprzez zapobieganie odczulaniu receptorów purynergicznych poprzez degradację ATP i ADP42,43. Chociaż wielokrotne etapy wirowania i płukania wymagają więcej czasu, zawiesiny przemytych płytek krwi przygotowane tą metodą mają tę zaletę w postaci większej stabilności (5-8 godzin) w porównaniu z preparatami cytrynianowymi PRP, które są stabilne nie dłużej niż 1-3 h23.

Badanie to pokazuje wykonalność i prostotę ilościowego oznaczania mikropęcherzyków za pomocą cytometrii przepływowej. Jednak produkcja mikropęcherzyków może zostać zagubiona w gruzach i hałasie maszyny. Dlatego bardzo ważne jest, aby upewnić się, że cytometr przepływowy został poddany gruntownemu czyszczeniu i że stosowane nie zawierają żadnych cząstek zanieczyszczających, które mogłyby prowadzić do wysokiego tła podczas analizy cytometrii przepływowej. Alternatywnie, do identyfikacji powstawania mikropęcherzyków można użyć specjalistycznych cytometrów przepływowych z możliwością wykrywania małych cząstek. Badano również wiązanie znakowanej fluoresceiną Aneksyny-V w funkcji zawartości PS w błonie, podkreślając krytyczną rolę wystarczających stężeń wapnia w buforze dla wiązania Aneksyny-V i prokoagulacyjnej odpowiedzi płytek krwi44.

Dane potwierdzające stabilność próbek płytek krwi w czasie są obecnie nieliczne. Kilka laboratoriów rozwiązało ten problem, stabilizując próbki poprzez dodanie roztworu utrwalającego, takiego jak bufor zawierający formaldehyd. Dodanie utrwalacza do świeżo pobranych próbek płytek krwi ma tę zaletę, że pozwala zachować próbki do późniejszej analizy. Niemniej jednak wiązanie formaldehydu może powodować sztucznie zwiększone wiązanie Aneksyny-V. Rochat i wsp. wykazali, że wiązanie płytek krwi roztworem formaldehydu o niskim stężeniu, wolnym od wapnia, nie zmienia proporcji dodatnich płytek krwi Aneksyny-V45. Jednak badacze, którzy wymagają fiksacji, powinni zoptymalizować swój specyficzny protokół, aby upewnić się, że nie powoduje on sztucznie zmienionych wyników. W przeciwnym razie próbki należy natychmiast przetworzyć.

Innym szlakiem, który może również prowadzić do ekspozycji na PS, jest apoptoza wewnętrzna, proces, o którym wiadomo, że reguluje żywotność płytek krwi w krążeniu46. Aktywacja proapoptotycznych białek BAK i BAX powoduje aktywację kaspazy, która sprzyja eksternalizacji PS, prowadząc do klirensu płytek krwi in vivo . Ostatnio zasugerowano, że inny marker powierzchni płytek krwi, selektyna P/CD62P, oprócz Aneksyny-V, może być stosowany do odróżniania prokoagulantów od apoptotycznych płytek krwi47. Oczekuje się, że płytki krwi prokoagulantów będą dodatnie zarówno dla markerów PS, jak i selektyny P, podczas gdy płytki apoptozy są dodatnie dla aneksyny-V, ale ujemne dla selektyny P. Jednak czas jest również czynnikiem różnicującym płytki krwi prokoagulacyjne i apoptotyczne47. Wytwarzanie prokoagulacyjnych płytek krwi in vitro jest szybkim procesem, podczas gdy apoptoza wewnętrzna jest procesem wolniejszym itrwa wiele godzin. W tym kontekście stosowanie dodatkowych markerów do oceny prokoagulacyjnych płytek krwi nie jest konieczne, co upraszcza metodę. Utrzymujący się wzrost wewnątrzkomórkowego Ca2+ i prokoagulacyjnego tworzenia płytek krwi następuje w ciągu kilku minut z bardzo silnymi agonistami, takimi jak jonofor lub połączona aktywacja z kolagenem i trombiną, podczas gdy inhibitor BCL-XL (lub mimetyk BH3) wyzwala tworzenie apoptotycznych płytek krwi poprzez aktywację proapoptotycznych BAK i BAX, powodując przepuszczalność błony zewnętrznej mitochondriów, uwalnianie cytochromu C, i aktywacja kaspazy49.

Podsumowując, opisany tutaj protokół ułatwia izolację oczyszczonych płytek krwi i ich późniejszą charakterystykę pod kątem aktywności prokoagulacyjnej przy użyciu standardowego sprzętu laboratoryjnego i cytometrii przepływowej. Procedura ta toruje drogę do przyszłych badań nad prokoagulantami płytek krwi w próbkach krwi pacjentów, z potencjalnymi zastosowaniami w praktyce klinicznej, takimi jak diagnoza rzadkiego zespołu Scotta50.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
(CD42b, GPIX) APCBeckman CoulterB13980
Probówki do pobierania krwi ACD-ABD Vacutainer366645
Annexin-V FITCBD Pharmingen560931
Apyrase Grade VIISigma-AldrichA6410
Albumina surowicy bydlęcej 30%Sigma-AldrichA9576
CaCl2, 0,25MSigma-AldrichC3881
Monohydrat kwasu cytrynowegoMerck5949-29-1
Kolagen Stago86924
Glukoza Sigma-AldrichG8270
Hepes jonofor Sigma-AldrichH3375
 Calbiochem/VWR100105
KCl Merck7447-40-7
MgCl2Sigma-AldrichM0250
NaCl VWR27810.295
NaOH Merck1.06498
Wodorowęglan soduMerck6329NaHCO3
Trombina Łącznik BiomedEZ 006 A
Cytrynian trisodowy dwuwodny Sigma-AldrichG8270Na3C6H5O7*2H2O
α Integryna IIb (CD41, GPIIb) PC7Beckman Coulter6607115

Bibliografia

  1. Chu, Y., Guo, H., Zhang, Y., Qiao, R. Procoagulant platelets: Generation, characteristics, and therapeutic target. J Clin Lab Anal. 35 (5), e23750(2021).
  2. Agbani, E. O., Hers, I., Poole, A. W. Platelet procoagulant membrane dynamics: A key distinction between thrombosis and hemostasis. Blood Adv. 7 (8), 1615-1619 (2022).
  3. Veuthey, L., Aliotta, A., Bertaggia Calderara, D., Pereira Portela, C., Alberio, L. Mechanisms underlying dichotomous procoagulant COAT platelet generation-A conceptual review summarizing current knowledge. Int J Mol Sci. 23 (5), 2536(2022).
  4. Bourguignon, A., Tasneem, S., Hayward, C. P. M. Update on platelet procoagulant mechanisms in health and in bleeding disorders. Int J Lab Hematol. 44 Suppl 1, 89-100 (2022).
  5. Suades, R., Padró, T., Vilahur, G., Badimon, L. Platelet-released extracellular vesicles: The effects of thrombin activation. Cel lMo lLife Sci. 79 (3), 190(2022).
  6. Dai, Z., et al. Platelets and platelet extracellular vesicles in drug delivery therapy: A review of the current status and future prospects. Front Pharmacol. 13, 1026386(2022).
  7. Kalluri, R., LeBleu, V. S. The biology, function, and biomedical applications of exosomes. Science (New York, N.Y.). 367 (6478), eaau6977(2020).
  8. Doyle, L. M., Wang, M. Z. Overview of extracellular vesicles, their origin, composition, purpose, and methods for exosome isolation and analysis. Cells. 8 (7), 727(2019).
  9. Berumen Sánchez, G., Bunn, K. E., Pua, H. H., Rafat, M. Extracellular vesicles: Mediators of intercellular communication in tissue injury and disease. Cell communsignal. 19 (1), 104(2021).
  10. Arraud, N., et al. Extracellular vesicles from blood plasma: determination of their morphology, size, phenotype and concentration. J Thromb Haemost. 12 (5), 614-627 (2014).
  11. Eustes, A. S., Dayal, S. The role of platelet-derived extracellular vesicles in immune-mediated thrombosis. Int J Mol Sci. 23 (14), 7837(2022).
  12. Chaudhary, P. K., Kim, S., Kim, S. Shedding light on the cell biology of platelet-derived extracellular vesicles and their biomedical applications. Life. 13 (6), 1403(2023).
  13. Sinauridze, E. I., et al. Platelet microparticle membranes have 50- to 100-fold higher specific procoagulant activity than activated platelets. Thromb Haemost. 97 (3), 425-434 (2007).
  14. Cai, Z., et al. Platelet-derived extracellular vesicles play an important role in platelet transfusion therapy. Platelets. 34 (1), 2242708(2023).
  15. Chaudhary, P. K., Kim, S., Kim, S. An insight into recent advances on platelet function in health and disease. Int J Mol Sci. 23 (11), 6022(2022).
  16. Tyagi, T., et al. A guide to molecular and functional investigations of platelets to bridge basic and clinical sciences. Nat Cardiovasc Res. 1 (3), 223-237 (2022).
  17. Hechler, B., Dupuis, A., Mangin, P. H., Gachet, C. Platelet preparation for function testing in the laboratory and clinic: Historical and practical aspects. Res Pract Thromb Haemost. 3 (4), 615-625 (2019).
  18. Perez, G. I., et al. Phosphatidylserine-exposing Annexin A1-positive extracellular vesicles: Potential cancer biomarkers. Vaccines. 11 (3), 639(2023).
  19. Inglis, H., Norris, P., Danesh, A. Techniques for the analysis of extracellular vesicles using flow cytometry. J Vis Exp. (97), e52484(2015).
  20. Dachary-Prigent, J., Freyssinet, J. M., Pasquet, J. M., Carron, J. C., Nurden, A. T. Annexin V as a probe of aminophospholipid exposure and platelet membrane vesiculation: A flow cytometry study showing a role for free sulfhydryl groups. Blood. 81 (10), 2554-2565 (1993).
  21. Abaeva, A. A., et al. Procoagulant platelets form an α-granule protein-covered "cap" on their surface that promotes their attachment to aggregates. J Biol Chem. 288 (41), 29621-29632 (2013).
  22. Fager, A. M., Wood, J. P., Bouchard, B. A., Feng, P., Tracy, P. B. Properties of procoagulant platelets: defining and characterizing the subpopulation binding a functional prothrombinase. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 30 (12), 2400-2407 (2010).
  23. Cazenave, J. P., Hemmendinger, S., Beretz, A., Sutter-Bay, A., Launay, J. Platelet aggregation: A tool for clinical investigation and pharmacological study. Methodology. Ann Biol Clin. 41 (3), 167-179 (1983).
  24. Han, P., Ardlie, N. G. The influence of pH, temperature, and calcium on platelet aggregation: Maintenance of environmental pH and platelet function for in vitro studies in plasma stored at 37 degrees C. Br J Haematol. 26 (3), 373-389 (1974).
  25. Ardlie, N. G., Perry, D. W., Packham, M. A., Mustard, J. F. Influence of apyrase on stability of suspensions of washed rabbit platelets. Proc Soc Exp Biol Med. 136 (4), 1021-1023 (1971).
  26. Kang, J. K., et al. Increased intracellular Ca2+ concentrations prevent membrane localization of PH domains through the formation of Ca2+-phosphoinositides. Proc Natl Acad Sci USA. 114 (45), 11926-11931 (2017).
  27. Frelinger, A. L., et al. Consensus recommendations on flow cytometry for the assessment of inherited and acquired disorders of platelet number and function: Communication from the ISTH SSC Subcommittee on Platelet Physiology. J Thromb Haemost. 19 (12), 3193-3202 (2021).
  28. Khattab, M. H., et al. Increased procoagulant platelet levels are predictive of death in COVID-19. GeroScience. 43 (4), 2055-2065 (2021).
  29. Denorme, F., Campbell, R. A. Procoagulant platelets: Novel players in thromboinflammation. Am J Physiol Cell Physiol. 323 (4), C951-C958 (2022).
  30. Gianazza, E., et al. Platelets in healthy and disease states: From biomarkers discovery to drug targets identification by proteomics. Int J Mol Sci. 21 (12), 4541(2020).
  31. Menck, K., Bleckmann, A., Schulz, M., Ries, L., Binder, C. Isolation and characterization of microvesicles from peripheral blood. J VisExp. (119), (2017).
  32. Alberca, R. W., et al. Platelet-based biomarkers for diagnosis and prognosis in COVID-19 Patients. Life. 11 (10), 1005(2021).
  33. Suzuki, J., Umeda, M., Sims, P. J., Nagata, S. Calcium-dependent phospholipid scrambling by TMEM16F. Nature. 468 (7325), 834-838 (2010).
  34. Boisseau, P., et al. A new mutation of ANO6 in two familial cases of Scott syndrome. Br J Haematol. 180 (5), 750-752 (2018).
  35. Castoldi, E., Collins, P. W., Williamson, P. L., Bevers, E. M. Compound heterozygosity for 2 novel TMEM16F mutations in a patient with Scott syndrome. Blood. 117 (16), 4399-4400 (2011).
  36. Zwaal, R. F. A., Comfurius, P., Bevers, E. M. Scott syndrome, a bleeding disorder caused by defective scrambling of membrane phospholipids. Biochim Biophys Acta Mol Cell Biol Lipids. 1636 (2), 119-128 (2004).
  37. Agbani, E. O., Poole, A. W. Procoagulant platelets: Generation, function, and therapeutic targeting in thrombosis. Blood. 130 (20), 2171-2179 (2017).
  38. Reddy, E. C., Rand, M. L. Procoagulant phosphatidylserine-exposing platelets in vitro and in vivo. Front Cardiovasc Med. 7, 15(2020).
  39. Reddy, E. C., et al. Analysis of procoagulant phosphatidylserine-exposing platelets by imaging flow cytometry. Res Pract Thromb Haemost. 2 (4), 736-750 (2018).
  40. Magnette, A., Chatelain, M., Chatelain, B., Ten Cate, H., Mullier, F. Pre-analytical issues in the haemostasis laboratory: Guidance for the clinical laboratories. Thromb J. 14, 49(2016).
  41. Schoenfeld, H., Muhm, M., Doepfmer, U., Exadaktylos, A., Radtke, H. Platelet activity in washed platelet concentrates. Anesth Analg. 99 (1), 17-20 (2004).
  42. Koessler, J., et al. Role of purinergic receptor expression and function for reduced responsiveness to adenosine diphosphate in washed human platelets. PLoS ONE. 11 (1), e0147370(2016).
  43. Baurand, A., et al. Desensitization of the platelet aggregation response to ADP: Differential down-regulation of the P2Y1 and P2cyc receptors. Thromb Haemost. 84 (3), 484-491 (2000).
  44. Alberio, L., et al. Delayed-onset of procoagulant signalling revealed by kinetic analysis of COAT platelet formation. Thromb Haemost. 117 (06), 1101-1114 (2017).
  45. van Kruchten, R., et al. Both TMEM16F-dependent and TMEM16F-independent pathways contribute to phosphatidylserine exposure in platelet apoptosis and platelet activation. Blood. 121 (10), 1850-1857 (2013).
  46. Rochat, S., Alberio, L. Formaldehyde-fixation of platelets for flow cytometric measurement of phosphatidylserine exposure is feasible. Cytometry A. 87 (1), 32-36 (2015).
  47. Josefsson, E. C., Ramström, S., Thaler, J., Lordkipanidzé, M. COAGAPO study group Consensus report on markers to distinguish procoagulant platelets from apoptotic platelets: communication from the Scientific and Standardization Committee of the ISTH. J Thromb Haemost. 21 (8), 2291-2299 (2023).
  48. Choo, H. J., Kholmukhamedov, A., ChengZing, Z., Shawn, J. Inner mitochondrial membrane disruption links apoptotic and agonist-initiated phosphatidylserine externalization in platelets. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 37 (8), 1503-1512 (2017).
  49. Johnson, L., Pearl Lei, P., Waters, L., Padula, M. P., Marks, D. C. Identification of platelet subpopulations in cryopreserved platelet components using multi-colour imaging flow cytometry. Sci Rep. 13 (1), 1221(2023).
  50. Montague, S. J. Comprehensive functional characterization of a novel ANO6 variant in a new patient with Scott syndrome. J Thromb Haemost. S1538 - 7836 (24), 00127-00132 (2024).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

p ytki prokoagulacyjneaktywacja p ytek krwicytometria przep ywowap ukane p ytki krwiosocze bogate w p ytki krwiizolacja p ytek krwiaktywacja kolagenemaktywacja trombin

Powiązane artykuły