Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Charakterystyka płytek krwi prokoagulantu poprzez pomiar ekspozycji na fosfatydyloserynę i uwalniania mikropęcherzyków z oczyszczonych płytek krwi u ludzi

1.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/67042

⸱

29 listopada 2024

 ,  , 
1French Reference Centre for Inherited Platelet Disorders, University Hospital of Bordeaux, 2Department of Haematology, University Hospital of Bordeaux, 3Inserm U1034, Biology of Cardiovascular Disease

W tym artykule

Podsumowanie

Tworzenie się płytek krwi z prokoagulantem jest skorelowane ze zwiększonym ryzykiem zakrzepicy. Przedstawiono dokładny protokół izolacji przemytych płytek krwi od krwi ludzkiej, mający na celu ilościowe określenie ekspozycji na fosfatydyloserynę i uwalnianie mikropęcherzyków, które są charakterystycznymi cechami płytek krwi prokoagulantu.

Streszczenie

Aktywowane płytki krwi sprzyjają krzepnięciu głównie poprzez eksponowanie proagulantu fosfolipidowego fosfatydyloseryny (PS) na ich zewnętrznej powierzchni błony i uwalnianie mikropęcherzyków wyrażających PS, które zachowują oryginalną architekturę błony i cytoplazmatyczne składniki ich macierzystych komórek. Dostępność fosfatydyloseryny ułatwia wiązanie głównych czynników krzepnięcia, znacznie zwiększając skuteczność katalityczną enzymów krzepnięcia, podczas gdy uwalnianie mikropęcherzyków działa jako kluczowy mediator sygnalizacji międzykomórkowej. Prokoagulanty odgrywają kluczową rolę w stabilizacji skrzepów podczas hemostazy, a ich zwiększony udział w krwiobiegu koreluje ze zwiększonym ryzykiem zakrzepicy. Wykazano również, że mikropęcherzyki płytkowe są bogate w czynniki wzrostu, które wspomagają gojenie się ran i modulację stanu zapalnego. Analiza ekspozycji na fosfatydyloserynę i uwalniania mikropęcherzyków za pomocą cytometrii przepływowej stanowi poważne wyzwanie ze względu na ich niewielki rozmiar i ograniczoną liczbę pozytywnych zdarzeń dla markerów będących przedmiotem zainteresowania. Pomimo znacznych postępów poczynionych w ciągu ostatniej dekady, metody oceny ekspozycji na fosfatydyloserynę i uwalniania mikropęcherzyków pozostają w toku. Niestety, nie istnieje jeden powszechnie stosowany protokół i należy ocenić kilka czynników, aby określić najbardziej odpowiednią metodologię dla każdego konkretnego zastosowania. W tym miejscu opisujemy szczegółowy protokół izolowania przemytych płytek krwi od ludzkiej krwi, a następnie aktywacji kolagenu i / lub trombiny, w celu zmierzenia ekspozycji na fosfatydyloserynę i uwalnianie mikropęcherzyków, które charakteryzują płytki krwi prokoagulantu. Protokół ten ma na celu ułatwienie wstępnego przygotowania osocza bogatopłytkowego i izolacji przemytych płytek krwi. Wreszcie, ekspozycja na fosfatydyloserynę i uwalnianie mikropęcherzyków są określane ilościowo za pomocą cytometrii przepływowej, co umożliwia identyfikację płytek krwi prokoagulantów.

Wprowadzenie

Tworzenie prokoagulantu płytek krwi jest kluczowe dla utrzymania hemostazy1,2,3. Proces ten obejmuje indukowaną przez agonistów ekspresję fosfolipidów na błonie płytek krwi, która jest niezbędna do składania kompleksów tenazy i protrombinazy1,3,4. Po aktywacji płytek krwi, mikropęcherzyki płytkowe są również w sposób ciągły uwalniane5,6. Mikropęcherzyki (o średnicy od 50 nm do ponad 1 μm) otaczają zarówno strukturę błony, jak i składniki cytoplazmatyczne komórek źródłowych7,8. Mikropęcherzyki są ważnymi mediatorami sygnalizacji międzykomórkowej9,10, a także repozytoria czynników wzrostu, które wspomagają gojenie się ran i modulację stanu zapalnego11,12. Sugeruje się również, że mikropęcherzyki są od 50 do 100 razy bardziej prokoagulacyjne niż aktywowane płytki krwi13. Warto zauważyć, że najnowsze dowody sugerują, że zmagazynowane płytki krwi ulegają aktywacji, co prowadzi do produkcji mikropęcherzyków - ma to potencjalne konsekwencje dla praktyki terapii transfuzji płytek krwi. Wydłużony czas przechowywania mikropęcherzyków i zwiększona aktywność prokoagulantu sprawiają, że są one obiecującym substytutem płytek krwi w zastosowaniach transfuzjologicznych14.

Wprowadzono innowacje metodologiczne, aby bezpośrednio i pośrednio ocenić powstawanie prokoagulantów płytek krwi zarówno w warunkach zdrowotnych, jak i chorobowych4,14,15. Oceny ekspozycji na fosfatydyloserynę i uwalniania mikropęcherzyków przy użyciu oczyszczonych płytek krwi dostarczyły nowych danych na temat tego, jak zaburzone są reakcje prokoagulantów płytek krwi w różnych chorobach człowieka1,4. Ta rozwijająca się dziedzina badań otwiera również możliwości interwencji terapeutycznych1,4. Jednak izolacja i analiza oczyszczonych płytek krwi z krwi jest czasochłonna, wymaga specjalistycznego sprzętu laboratoryjnego, a zatem nie można ich obecnie dostosować do rutynowej diagnostyki klinicznej16,17. Analiza ekspozycji na fosfatydyloserynę i uwalniania mikropęcherzyków jest również trudna ze względu na ich mały rozmiar i liczbę pozytywnych zdarzeń dla markerów będących przedmiotem zainteresowania18,19.

Cytometria przepływowa, wykorzystująca fluorescencyjne wiązanie Aneksyny-V, była kamieniem węgielnym w ocenie ekspresji PS na płytkach krwi i mikropęcherzykach od momentu jej powstania dwie dekady temu20. Zyskał powszechną akceptację w badaniu prokoagulacyjnych płytek krwi i mikropęcherzyków21,22. W związku z tym przedstawiono tutaj zoptymalizowany protokół, który można wykorzystać do izolacji oczyszczonych płytek krwi z próbek krwi przy użyciu techniki opracowanej przez grupę Cazenave'a23, a następnie charakterystyki ekspozycji na fosfatydyloserynę i uwalniania mikropęcherzyków za pomocą cytometrii przepływowej po aktywacji płytek krwi24. Protokół ten ułatwi dalsze badania i dogłębną charakterystykę prokoagulacyjnych płytek krwi w populacjach klinicznych będących przedmiotem zainteresowania.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Protokół jest zgodny z wytycznymi i został zatwierdzony przez Komitet Etyki Badań Naukowych Szpitala Uniwersyteckiego w Bordeaux. Próbki krwi pobrano od zdrowych ochotników, którzy wyrazili świadomą zgodę, a próbki te zostały przetworzone zgodnie z protokołami instytucjonalnymi. Dawcy, którzy przyjmowali jakiekolwiek substancje mogące wpływać na czynność płytek krwi, byli wykluczani, jeśli takie substancje zostały przyjęte w ciągu 10 dni poprzedzających eksperymenty. Uzyskano świadomą zgodę od zdrowych ochotników na pobranie krwi i opublikowanie danych. Szczegółowe informacje na temat odczynników i używanego sprzętu są wymienione w Tabeli materiałów.

1. Pobieranie krwi i przygotowanie umytych płytek krwi

  1. Krew z żył obwodowych należy pobrać do probówek zbiorczych zawierających aktywny antykoagulant cytrynian trójsodowy z kwasem cytrynowym i dekstrozą (ACD) po odrzuceniu pierwszych 3 ml.
  2. Po pobraniu delikatnie odwróć probówkę, aby wymieszać krew z ACD i pozostaw mieszaninę w temperaturze pokojowej na 15 minut przed odwirowaniem.
  3. Policz płytki krwi za pomocą automatycznego licznika komórek przed odwirowaniem, aby określić prawidłową prędkość wirowania (Tabela 1). Przygotować osocze bogatopłytkowe (PRP) przez odwirowanie przy 250 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej (RT) bez stosowania hamulca, aby zoptymalizować regenerację płytek krwi.
    UWAGA: Ten krok spowoduje wytworzenie trzech warstw w próbce: górna warstwa zawierająca osocze, płytki krwi i niewielką frakcję białych krwinek; środkowa warstwa wzbogacona białymi krwinkami; i dolna warstwa składająca się z czerwonych krwinek. Ostrożnie przenieś PRP z górnej warstwy do nowej stożkowej probówki o pojemności 50 ml, aby uniknąć zanieczyszczenia czerwonymi i białymi krwinkami.
  4. Do PRP dodać 1 ml ACD-A (patrz Tabela 2) i 6,25 μl apyrazy na 9 ml.
    UWAGA: Apyraza, w stężeniu 0,02 U/ml, rozkłada śladowe ilości ATP lub ADP wydzielane przez płytki krwi, zapobiegając w ten sposób odczuleniu receptorów ADP płytek krwi i utrzymując kształt płytek krwi25. Inhibitor prostacykliny PGI2 (0,5 μM) może być również dołączony do apyrazy, aby zapobiec aktywacji płytek krwi.
  5. Przygotować osad płytek krwi przez odwirowanie w temperaturze pokojowej przy 1100 x g przez 10 minut. Odessać supernatant zawierający osocze ubogie w płytki krwi (PPP) delikatną metodą, taką jak pipeta Pasteura, i ponownie zawiesić osad w 1 ml buforu płuczącego (patrz Tabela 3 i Tabela 4). Delikatnie homogenizować pipetą, a następnie dodać dodatkowe 3-4 ml buforu do mycia.
    UWAGA: Poziom wapnia jest obniżony, aby zapobiec krzepnięciu czynnikami skrzepowymi obecnymi w osoczu. Na tym etapie osocze ubogie w płytki krwi zostało całkowicie usunięte, co zapobiega tworzeniu się skrzepów i aktywacji płytek krwi przez produkcję trombiny.
  6. Ponownie odwirować w temperaturze pokojowej przy 1100 x g przez 10 minut. Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad w 1 ml buforu do mycia. Przenieść 150 μl zawiesiny płytek krwi do probówki o pojemności 1,5 ml w celu zliczenia komórek za pomocą automatycznego licznika komórek. Następnie ponownie zawiesić osad za pomocą 3-4 ml buforu do mycia.
  7. Przeprowadzić końcowe wirowanie przy 1100 x g przez 10 minut (w temperaturze pokojowej). Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad płytek krwi w objętości buforu reakcyjnego (patrz tabela 5 i tabela 6) do uzyskania końcowego stężenia 5 x 1011 płytek krwi/l.
  8. Pozwól umytym płytkom krwi odpocząć przez co najmniej 30 minut przed eksperymentami, aby umożliwić zużycie pozostałych inhibitorów i aklimatyzację płytek krwi do buforu.

2. Przygotowanie testu

  1. Przygotować wszystkich agonistów i fluorochromy w buforze reakcyjnym. Dodać 5 μl trombiny do 45 μl buforu (rozcieńczenie 1:10) i 5 μl jonoforu do 495 μl buforu (rozcieńczenie 1:500).
    1. W przypadku testów wewnętrznych należy porównać nieaktywowane płytki krwi z płytkami krwi leczonymi pojedynczymi i podwójnymi agonistami. Dodać, w różnych podwielokrotnościach, 100 μl przemytych płytek krwi w proporcjach 50 x 109 płytek krwi/l do: (i) 10 μl buforu reakcyjnego, (ii) 3 μl nierozcieńczonego kolagenu (końcowe stężenie 30 μg/ml), (iii) 10 μl wstępnie rozcieńczonej trombiny (0,5 j.m./ml), (iv) 3 μl nierozcieńczonego kolagenu + 10 μl wstępnie rozcieńczonej trombiny, oraz (v) 10 μl wstępnie rozcieńczonego jonoforu (końcowe stężenie 2 μM), o którym wiadomo, że bezpośrednio zwiększa wewnątrzkomórkowy poziom wapnia, jak wcześniej wspomniano26.
      UWAGA: Leczenie jonoforem wapnia, takim jak A23187 lub jonomycyna, ma kluczowe znaczenie, ponieważ indukuje rozległe mieszanie błony fosfolipidowej i zwiększoną eksternalizację PS.
    2. Delikatnie wstrząsnąć ręką i inkubować w temperaturze 37 °C przez 5 min.
      UWAGA: Dłuższa inkubacja agonistów (30 min) może pozwolić na lepsze różnicowanie populacji płytek krwi podczas procesu analizy cytometrii przepływowej.
  2. Dodać 5 μl nierozcieńczonego Annexin-V FITC do każdej mikroprobówki i inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 minut w ciemności.
    UWAGA: W celu lepszej identyfikacji komórek płytkowych można również włączyć przeciwciało monoklonalne przeciwko jednemu z receptorów swoistych dla płytek krwi, GPIX (CD42b) lub integrynie αIIb (CD41, GPIIb).
  3. Dodać 500 μl buforu reakcyjnego, aby zatrzymać proces i kontynuować analizę próbki za pomocą cytometru przepływowego.

3. Charakterystyka prokoagulacyjnych płytek krwi i mikropęcherzyków za pomocą cytometrii przepływowej (FC)

UWAGA: Do wiarygodnej analizy funkcji płytek krwi użyj przyrządu do cytometrii przepływowej (FC) skonfigurowanego zgodnie z ustalonymi standardami27. Przyrząd musi być zdolny do wykrywania rozproszenia do przodu (FSC) i co najmniej jednego sygnału fluorescencyjnego. Ustaw detektory rozproszenia światła i fluorescencji na wzmocnienie logarytmiczne. Rozcieńczyć próbki odpowiednio do FC, aby upewnić się, że tylko pojedyncze płytki krwi są zliczane ze zmniejszoną prędkością pozyskiwania danych.

  1. Ustaw cytometr przepływowy na "wolne" natężenie przepływu z progiem co najmniej 10 000 zdarzeń płytkowych. Monitoruj emisję fluorescencji za pomocą filtra przepustowego dla FITC.
  2. Bramka populacji płytek krwi za pomocą rozproszenia do przodu (FSC). Zbadaj płytki krwi i uwolnione mikropęcherzyki zgodnie z ich wielkością. Użyj wykresów gęstości, aby zidentyfikować płytki krwi i uwolnione mikropęcherzyki zarówno dla płytek krwi spoczynkowych, jak i stymulowanych; Analizuj każdą populację bramkowaną niezależnie.
  3. Rozróżnij płytki krwi prokoagulacyjne zgodnie z osią FL1. Umieścić ujemną granicę odcięcia po prawej stronie populacji płytek krwi w stanie spoczynku (tj. w obecności buforu reakcyjnego). Po aktywacji płytek krwi należy sklasyfikować wszystkie zdarzenia zlokalizowane po prawej stronie tego punktu odcięcia jako płytki krwi eksponujące fosfatydyloserynę.
  4. Rozróżniaj mikropęcherzyki, które są mniejsze niż płytki krwi, dzięki ich unikalnym właściwościom rozpraszania światła. Ustawić punkt odcięcia na najniższą wartość FSC obserwowaną w spoczynkowej populacji płytek krwi. Po aktywacji należy sklasyfikować wszelkie zdarzenia fosfatydyloseryny dodatnie poniżej tego progu jako mikropęcherzyki.
    UWAGA: Należy uwzględnić indywidualne różnice w wielkości płytek krwi, dostosowując w razie potrzeby wartość odcięcia. Upewnij się, że mniej niż 1% mikropęcherzyków jest obecnych w stanie spoczynku.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Ilościowe oznaczenie płytek prokoagulacyjnych i mikropęcherzyków przeprowadzono z wykorzystaniem barwienia aneksyną V, rejestrując co najmniej 50 000 zdarzeń na próbkę. Zgodnie z opisem w kroku 2.2, pomiary płytek wyjściowych wykonano na próbkach inkubowanych z buforem reakcyjnym, co przedstawiono na Rysunku 1A. Wielkość płytek oceniano na podstawie mediany wartości rozproszenia w przód (FSC). Choć FSC zależy od wielu czynników, pozostaje ono powszechnie stosowanym wskaźnikiem szacowania wie...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Ostatnie badania nad prokoagulacyjnymi płytkami krwi podkreśliły ich zmiany podczas kilku chorób 1,28,29, podkreślając znaczenie ich szczegółowej analizy i charakterystyki 30,31,32. Chociaż obecne testy kliniczne oceniające tworzenie prokoagulantów płytek krwi są ograniczone, w ciągu ostatnich dwóch dekad nastąpił znaczny wzrost zainter...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
(CD42b, GPIX) APCBeckman CoulterB13980
Probówki do pobierania krwi ACD-ABD Vacutainer366645
Annexin-V FITCBD Pharmingen560931
Apyrase Grade VIISigma-AldrichA6410
Albumina surowicy bydlęcej 30%Sigma-AldrichA9576
CaCl2, 0,25MSigma-AldrichC3881
Monohydrat kwasu cytrynowegoMerck5949-29-1
Kolagen Stago86924
Glukoza Sigma-AldrichG8270
Hepes jonofor Sigma-AldrichH3375
 Calbiochem/VWR100105
KCl Merck7447-40-7
MgCl2Sigma-AldrichM0250
NaCl VWR27810.295
NaOH Merck1.06498
Wodorowęglan soduMerck6329NaHCO3
Trombina Łącznik BiomedEZ 006 A
Cytrynian trisodowy dwuwodny Sigma-AldrichG8270Na3C6H5O7*2H2O
α Integryna IIb (CD41, GPIIb) PC7Beckman Coulter6607115

Bibliografia

  1. Chu, Y., Guo, H., Zhang, Y., Qiao, R. Procoagulant platelets: Generation, characteristics, and therapeutic target. J Clin Lab Anal. 35 (5), e23750(2021).
  2. Agbani, E. O., Hers, I., Poole, A. W. Platelet procoagulant membrane dynamics: A key distinction between thrombosis and hemostasis. Blood Adv. 7 (8), 1615-1619 (2022).
  3. Veuthey, L., Aliotta, A., Bertaggia Calderara, D., Pereira Portela, C., Alberio, L. Mechanisms underlying dichotomous procoagulant COAT platelet generation-A conceptual review summarizing current knowledge. Int J Mol Sci. 23 (5), 2536(2022).
  4. Bourguignon, A., Tasneem, S., Hayward, C. P. M. Update on platelet procoagulant mechanisms in health and in bleeding disorders. Int J Lab Hematol. 44 Suppl 1, 89-100 (2022).
  5. Suades, R., Padró, T., Vilahur, G., Badimon, L. Platelet-released extracellular vesicles: The effects of thrombin activation. Cel lMo lLife Sci. 79 (3), 190(2022).
  6. Dai, Z., et al. Platelets and platelet extracellular vesicles in drug delivery therapy: A review of the current status and future prospects. Front Pharmacol. 13, 1026386(2022).
  7. Kalluri, R., LeBleu, V. S. The biology, function, and biomedical applications of exosomes. Science (New York, N.Y.). 367 (6478), eaau6977(2020).
  8. Doyle, L. M., Wang, M. Z. Overview of extracellular vesicles, their origin, composition, purpose, and methods for exosome isolation and analysis. Cells. 8 (7), 727(2019).
  9. Berumen Sánchez, G., Bunn, K. E., Pua, H. H., Rafat, M. Extracellular vesicles: Mediators of intercellular communication in tissue injury and disease. Cell communsignal. 19 (1), 104(2021).
  10. Arraud, N., et al. Extracellular vesicles from blood plasma: determination of their morphology, size, phenotype and concentration. J Thromb Haemost. 12 (5), 614-627 (2014).
  11. Eustes, A. S., Dayal, S. The role of platelet-derived extracellular vesicles in immune-mediated thrombosis. Int J Mol Sci. 23 (14), 7837(2022).
  12. Chaudhary, P. K., Kim, S., Kim, S. Shedding light on the cell biology of platelet-derived extracellular vesicles and their biomedical applications. Life. 13 (6), 1403(2023).
  13. Sinauridze, E. I., et al. Platelet microparticle membranes have 50- to 100-fold higher specific procoagulant activity than activated platelets. Thromb Haemost. 97 (3), 425-434 (2007).
  14. Cai, Z., et al. Platelet-derived extracellular vesicles play an important role in platelet transfusion therapy. Platelets. 34 (1), 2242708(2023).
  15. Chaudhary, P. K., Kim, S., Kim, S. An insight into recent advances on platelet function in health and disease. Int J Mol Sci. 23 (11), 6022(2022).
  16. Tyagi, T., et al. A guide to molecular and functional investigations of platelets to bridge basic and clinical sciences. Nat Cardiovasc Res. 1 (3), 223-237 (2022).
  17. Hechler, B., Dupuis, A., Mangin, P. H., Gachet, C. Platelet preparation for function testing in the laboratory and clinic: Historical and practical aspects. Res Pract Thromb Haemost. 3 (4), 615-625 (2019).
  18. Perez, G. I., et al. Phosphatidylserine-exposing Annexin A1-positive extracellular vesicles: Potential cancer biomarkers. Vaccines. 11 (3), 639(2023).
  19. Inglis, H., Norris, P., Danesh, A. Techniques for the analysis of extracellular vesicles using flow cytometry. J Vis Exp. (97), e52484(2015).
  20. Dachary-Prigent, J., Freyssinet, J. M., Pasquet, J. M., Carron, J. C., Nurden, A. T. Annexin V as a probe of aminophospholipid exposure and platelet membrane vesiculation: A flow cytometry study showing a role for free sulfhydryl groups. Blood. 81 (10), 2554-2565 (1993).
  21. Abaeva, A. A., et al. Procoagulant platelets form an α-granule protein-covered "cap" on their surface that promotes their attachment to aggregates. J Biol Chem. 288 (41), 29621-29632 (2013).
  22. Fager, A. M., Wood, J. P., Bouchard, B. A., Feng, P., Tracy, P. B. Properties of procoagulant platelets: defining and characterizing the subpopulation binding a functional prothrombinase. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 30 (12), 2400-2407 (2010).
  23. Cazenave, J. P., Hemmendinger, S., Beretz, A., Sutter-Bay, A., Launay, J. Platelet aggregation: A tool for clinical investigation and pharmacological study. Methodology. Ann Biol Clin. 41 (3), 167-179 (1983).
  24. Han, P., Ardlie, N. G. The influence of pH, temperature, and calcium on platelet aggregation: Maintenance of environmental pH and platelet function for in vitro studies in plasma stored at 37 degrees C. Br J Haematol. 26 (3), 373-389 (1974).
  25. Ardlie, N. G., Perry, D. W., Packham, M. A., Mustard, J. F. Influence of apyrase on stability of suspensions of washed rabbit platelets. Proc Soc Exp Biol Med. 136 (4), 1021-1023 (1971).
  26. Kang, J. K., et al. Increased intracellular Ca2+ concentrations prevent membrane localization of PH domains through the formation of Ca2+-phosphoinositides. Proc Natl Acad Sci USA. 114 (45), 11926-11931 (2017).
  27. Frelinger, A. L., et al. Consensus recommendations on flow cytometry for the assessment of inherited and acquired disorders of platelet number and function: Communication from the ISTH SSC Subcommittee on Platelet Physiology. J Thromb Haemost. 19 (12), 3193-3202 (2021).
  28. Khattab, M. H., et al. Increased procoagulant platelet levels are predictive of death in COVID-19. GeroScience. 43 (4), 2055-2065 (2021).
  29. Denorme, F., Campbell, R. A. Procoagulant platelets: Novel players in thromboinflammation. Am J Physiol Cell Physiol. 323 (4), C951-C958 (2022).
  30. Gianazza, E., et al. Platelets in healthy and disease states: From biomarkers discovery to drug targets identification by proteomics. Int J Mol Sci. 21 (12), 4541(2020).
  31. Menck, K., Bleckmann, A., Schulz, M., Ries, L., Binder, C. Isolation and characterization of microvesicles from peripheral blood. J VisExp. (119), (2017).
  32. Alberca, R. W., et al. Platelet-based biomarkers for diagnosis and prognosis in COVID-19 Patients. Life. 11 (10), 1005(2021).
  33. Suzuki, J., Umeda, M., Sims, P. J., Nagata, S. Calcium-dependent phospholipid scrambling by TMEM16F. Nature. 468 (7325), 834-838 (2010).
  34. Boisseau, P., et al. A new mutation of ANO6 in two familial cases of Scott syndrome. Br J Haematol. 180 (5), 750-752 (2018).
  35. Castoldi, E., Collins, P. W., Williamson, P. L., Bevers, E. M. Compound heterozygosity for 2 novel TMEM16F mutations in a patient with Scott syndrome. Blood. 117 (16), 4399-4400 (2011).
  36. Zwaal, R. F. A., Comfurius, P., Bevers, E. M. Scott syndrome, a bleeding disorder caused by defective scrambling of membrane phospholipids. Biochim Biophys Acta Mol Cell Biol Lipids. 1636 (2), 119-128 (2004).
  37. Agbani, E. O., Poole, A. W. Procoagulant platelets: Generation, function, and therapeutic targeting in thrombosis. Blood. 130 (20), 2171-2179 (2017).
  38. Reddy, E. C., Rand, M. L. Procoagulant phosphatidylserine-exposing platelets in vitro and in vivo. Front Cardiovasc Med. 7, 15(2020).
  39. Reddy, E. C., et al. Analysis of procoagulant phosphatidylserine-exposing platelets by imaging flow cytometry. Res Pract Thromb Haemost. 2 (4), 736-750 (2018).
  40. Magnette, A., Chatelain, M., Chatelain, B., Ten Cate, H., Mullier, F. Pre-analytical issues in the haemostasis laboratory: Guidance for the clinical laboratories. Thromb J. 14, 49(2016).
  41. Schoenfeld, H., Muhm, M., Doepfmer, U., Exadaktylos, A., Radtke, H. Platelet activity in washed platelet concentrates. Anesth Analg. 99 (1), 17-20 (2004).
  42. Koessler, J., et al. Role of purinergic receptor expression and function for reduced responsiveness to adenosine diphosphate in washed human platelets. PLoS ONE. 11 (1), e0147370(2016).
  43. Baurand, A., et al. Desensitization of the platelet aggregation response to ADP: Differential down-regulation of the P2Y1 and P2cyc receptors. Thromb Haemost. 84 (3), 484-491 (2000).
  44. Alberio, L., et al. Delayed-onset of procoagulant signalling revealed by kinetic analysis of COAT platelet formation. Thromb Haemost. 117 (06), 1101-1114 (2017).
  45. van Kruchten, R., et al. Both TMEM16F-dependent and TMEM16F-independent pathways contribute to phosphatidylserine exposure in platelet apoptosis and platelet activation. Blood. 121 (10), 1850-1857 (2013).
  46. Rochat, S., Alberio, L. Formaldehyde-fixation of platelets for flow cytometric measurement of phosphatidylserine exposure is feasible. Cytometry A. 87 (1), 32-36 (2015).
  47. Josefsson, E. C., Ramström, S., Thaler, J., Lordkipanidzé, M. COAGAPO study group Consensus report on markers to distinguish procoagulant platelets from apoptotic platelets: communication from the Scientific and Standardization Committee of the ISTH. J Thromb Haemost. 21 (8), 2291-2299 (2023).
  48. Choo, H. J., Kholmukhamedov, A., ChengZing, Z., Shawn, J. Inner mitochondrial membrane disruption links apoptotic and agonist-initiated phosphatidylserine externalization in platelets. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 37 (8), 1503-1512 (2017).
  49. Johnson, L., Pearl Lei, P., Waters, L., Padula, M. P., Marks, D. C. Identification of platelet subpopulations in cryopreserved platelet components using multi-colour imaging flow cytometry. Sci Rep. 13 (1), 1221(2023).
  50. Montague, S. J. Comprehensive functional characterization of a novel ANO6 variant in a new patient with Scott syndrome. J Thromb Haemost. S1538 - 7836 (24), 00127-00132 (2024).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

płytki prokoagulacyjneaktywacja płytek krwicytometria przepływowapłukane płytki krwiosocze bogate w płytki krwiizolacja płytek krwiaktywacja kolagenemaktywacja trombiną
Charakterystyka płytek krwi prokoagulantu poprzez pomiar ekspozycji na fosfatydyloserynę i uwalniania mikropęcherzyków z oczyszczonych płytek krwi u ludzi
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.