Synteza nanocząstek lipidowych przez przepływ turbulentny w ograniczonych mieszalnikach strumieniowych z uderzeniem

Sai Nikhil Subraveti; Brian K. Wilson; Navid Bizmark; Jason Liu; Robert  K. Prud'homme

doi:10.3791/67047

Artykuł metodologiczny

Synteza nanocząstek lipidowych przez przepływ turbulentny w ograniczonych mieszalnikach strumieniowych z uderzeniem

7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/67047

⸱

23 sierpnia 2024

Sai Nikhil Subraveti¹ , Brian K. Wilson¹ , Navid Bizmark¹ , Jason Liu¹ , Robert K. Prud'homme¹

¹Department of Chemical and Biological Engineering, Princeton University

W tym artykule

Podsumowanie

Szczegółowy protokół syntezy nanocząsteczek lipidowych (LNP) przy użyciu technologii mieszalnika CIJ (Limited Impinging Jet), w tym dwustrumieniowego CIJ i czterostrumieniowego mieszalnika wirowego z wieloma wlotami (μMIVM), jest zademonstrowany. Mieszalniki CIJ generują powtarzalne, turbulentne środowiska mikromieszania, co skutkuje produkcją monodyspersyjnych LNP.

Streszczenie

Nanocząsteczki lipidowe (LNP) wykazały swój ogromny potencjał jako środki terapeutyczne, czego dowodem jest zatwierdzenie i globalne zastosowanie dwóch szczepionek COVID-19 z informacyjnym RNA (mRNA). Na małą skalę LNP są często wytwarzane przy użyciu mikrofluidyki; Jednak ograniczenia tych urządzeń wykluczają ich wykorzystanie na dużą skalę. Szczepionki przeciwko COVID-19 są produkowane w dużych ilościach przy użyciu mieszalników turbulentnych z ograniczonym strumieniem uderzeniowym (CIJ). Technologia CIJ umożliwia produkcję na skalę laboratoryjną z pewnością, że można ją skalować do wielkości produkcji. Kluczowymi koncepcjami w mieszaniu CIJ są to, że długość i skala czasu mieszania są określane przez intensywność turbulencji w komorze mieszania oraz że tworzenie się nanocząstek odbywa się z dala od ścian, co eliminuje problem osadzania się na powierzchniach i zanieczyszczenia. Praca ta przedstawia proces wytwarzania LNP przy użyciu technologii mieszalnika z ograniczonym strumieniem uderzeniowym o dwóch geometriach: dwustrumieniowym CIJ i czterostrumieniowym mieszalniku wirowym z wieloma wlotami (MIVM). Omówiono zalety i wady każdej geometrii mieszania. W tych geometriach LNP powstają w wyniku szybkiego mieszania strumienia rozpuszczalnika organicznego (zwykle etanolu zawierającego jonizowalne lipidy, kolipidy i stabilizujące lipidy PEG) z wodnym strumieniem antyrozpuszczalnikowym (wodny bufor zawierający RNA lub DNA). Przedstawiono parametry pracy mieszalników CIJ i MIVM w celu przygotowania powtarzalnych LNP o kontrolowanej wielkości, potencjale zeta, stabilności i skuteczności transfekcji. Przedstawiono również różnice między LNP wytwarzanymi przy niewłaściwym mieszaniu (roztwory pipetujące) w porównaniu z mieszaniem CIJ.

Wprowadzenie

terapia oparta na mRNA ma ogromny potencjał w leczeniu i zapobieganiu szerokiej gamie chorób, w tym chorobom zakaźnym, zaburzeniom genetycznym i nowotworom¹. W przeciwieństwie do małocząsteczkowych środków terapeutycznych, które mogą pasywnie dyfundować przez błonę komórkową, kwasy nukleinowe muszą być zamknięte w kapsułkach w celu dostarczania wewnątrzkomórkowego². Enkapsulacja zapewnia zarówno strukturę, jak i stabilność mRNA, ułatwiając ich wewnątrzkomórkowe dostarczanie przez szlaki endocytarne, a także zapobiegając degradacji przez składniki wewnątrz- i zewnątrzkomórkowe, takie jak nukleazy³. Opracowano szereg materiałów i nanonośników do enkapsulacji i dostarczania mRNA, w tym nanocząstki nieorganiczne, polimery, lipidy i materiały podobne do lipidów¹. Wśród nich LNP stały się najbardziej znaną platformą dostarczania terapii opartych na mRNA⁴.

LNP składają się z czterech składników lipidowych: lipidów jonizowalnych, cholesterolu, lipidów jonowych i stabilizatora lipidów PEG⁵. Jonizowalne lipidy nadające się do dostarczania mRNA wykazują staranną równowagę między hydrofobowością lipidów a stałą dysocjacji (pKa) trójskładnikowej grupy aminowej⁶. Jonizowalny lipid pKa ma zazwyczaj pH między 6,0 a 6,7, takie jak KC-2 (DLin-KC2-DMA), MC-3 (DLin-MC3-DMA) i ALC-0315⁷. To ograniczenie pKa na jonizowalnym lipidie umożliwia zarówno enkapsulację polimerów kwasów nukleinowych jako hydrofobowych soli lipidowych, jak i dostarczanie wewnątrzkomórkowe w procesie "ucieczki endosomu". LNP dostają się do komórki docelowej przez (różne) szlaki endocytozy, z których wszystkie obejmują zakwaszenie endosomu z pH 7,4 do pH ~5⁸. Jonizowalny lipid pKa zapewnia, że LNP mają prawie neutralne powierzchnie w warunkach fizjologicznych, ale stają się kationowe w zakwaszającym endosomie⁹. Ta reakcja pH umożliwia selektywne rozerwanie tylko błony endosomalnej, uwolnienie zamkniętego w kapsułkach polimeru kwasu nukleinowego i zachowanie żywotności komórek, w przeciwieństwie do trwale kationowych lipidów stosowanych w systemach transfekcji, takich jak lipofekcamina. Cholesterol jest hydrofobową, śródmiąższową cząsteczką w strukturze LNP, która poprawia płynność lipidów. Lipid oobojnojonowy odgrywa rolę strukturalną i tworzy dwuwarstwę na powierzchni LNP. Poli(glikol etylenowy)-lipid (PEG-lipid) jest stabilizatorem koloidalnym, który zwiększa stabilność LNP poprzez nadanie polimerowego stabilizatora sterycznego na powierzchnię LNP, który jest odporny na agregację LNP. To stabilizuje LNP, szczególnie podczas zmian pH, które regenerują wolną formę zasadową jonizowalnego lipidu, który zachowuje się jak olej hydrofobowy. Receptura Onpattro (patisiran) (zwana dalej preparatem LNP) jest często używana jako punkt wyjścia dla formulacji LNP z jonizowalnym lipidem MC3, cholesterolem, distearoilofosfatydylocholiną (DSPC) i PEG2000-DMG rozpuszczonymi w etanolu zmieszanym z wodnym roztworem RNA¹⁰.

Do produkcji LNP kapsułkujących polimery kwasów nukleinowych można użyć kilku technik, przy czym większość z nich opiera się na wspólnym motywie szybkiego mieszania strumienia etanolu zawierającego lipidy ze strumieniem wodnym zawierającym interesujący nas kwas nukleinowy (siRNA, mRNA lub DNA)⁹^,¹¹^,^12,¹³^,¹⁴. W związku z tym procesy mieszania masowego, takie jak mieszanie pipetami i mieszanie wirowe, oferują prostą strategię tworzenia LNP, która eliminuje potrzebę stosowania zaawansowanych urządzeń¹². Jednak mieszanie zbiorcze nie zapewnia jednorodnego rozkładu składników, co prowadzi do nieoptymalnego rozkładu wielkości LNP wraz ze znaczną zmiennością między partiami¹⁵.

Laboratoria rutynowo stosują techniki mieszania mikroprzepływowego, aby uzyskać powtarzalne LNP poprzez bardziej precyzyjną kontrolę nad warunkami mieszania¹²^,¹³^,¹⁶. Jednak warunki przepływu laminarnego w urządzeniach mikroprzepływowych, które są nieodłączne ze względu na małe skale długości i niskie prędkości w komorze mikroprzepływowej, skutkują stosunkowo powolnym mieszaniem rozpuszczalnika/antyrozpuszczalnika¹⁷. Małe wymiary komory poważnie ograniczają przepustowość i skalowalność potrzebną do produkcji LNP GMP, ale naukowcy przeprowadzili równoległe komory mikroprzepływowe, aby spróbować zwiększyć wielkość produkcji¹⁵. Równoległa geometria mikrofluidyki nie eliminuje problemu adsorpcji lipidów na powierzchniach podczas przetwarzania dużych objętości, problemu powszechnie określanego jako "zanieczyszczenie" urządzenia mieszającego, a także występują problemy z jednorodnością i stabilnością przepływów, które sprawiają, że skalowanie mikrofluidyki jest wyzwaniem dla produkcji na skalę przemysłową¹⁸^,¹⁹. Nic dziwnego, że firmy farmaceutyczne używały turbulentnych mieszalników strumieniowych do produkcji mRNA-LNPs²⁰.

Proces produkcji LNP załadowanych RNA polega na mieszaniu wodnego strumienia buforowego zawierającego ładunek RNA ze strumieniem etanolu zawierającym cztery odrębne składniki lipidowe. Preparaty te wykorzystują kwaśny bufor o pH 4,0 lub niższym, który ładuje jonizowalny lipid podczas mieszania strumieni wodnych i etanolowych. Dodatnio naładowane lipidy jonizowalne oddziałują elektrostatycznie z ujemnie naładowanymi RNA, tworząc hydrofobową sól lipidową RNA. Hydrofobowe formy lipidów, w tym sól RNA-lipid, wytrącają się w zmieszanych rozpuszczalnikach i tworzą jądra hydrofobowe. Jądra te rosną poprzez wytrącanie się obojgotliwych lipidów i cholesterolu, aż do osiągnięcia punktu krytycznego, w którym wystarczająca ilość pegylowanego lipidu adsorbuje się na powierzchni LNPs, zatrzymując dalszy wzrost -zarodkowanie i mechanizm wzrostu²¹^,²²^,²³. Dodanie buforu wodnego do roztworu lipidowego, w zakresie, w jakim lipidy wytrącają się i tworzą LNP, zależy od dwóch odrębnych skal czasowych: okresu mieszania rozpuszczalnika i antyrozpuszczalnika,_mieszaniny τ i okresu wzrostu jąder, τ_agg. Bezwymiarowa liczba Damköhlera, zdefiniowana jako Da = τ_mix/τ_agg, oddaje wzajemne oddziaływanie między tymi skalami czasu²⁴. W przypadku powolnego mieszania (Da > 1) ostateczna wielkość LNP jest kontrolowana przez transport i zmienia się w zależności od czasu mieszania. I odwrotnie, podczas szybkiego mieszania (Da < 1), płyn jest rozdrobniony na prążki lub warstwy o długości Kołmogrowa, przy czym tworzenie LNP jest regulowane wyłącznie przez dyfuzję molekularną każdego składnika, co skutkuje jednorodną kinetyką tworzenia LNP. Osiągnięcie tego drugiego scenariusza wymaga, aby stężenie lipidów przekroczyło próg krytyczny, ustanawiając stan przesycenia sprzyjający równomiernemu jednorodnemu zarodkowaniu.

Szacuje się, że τ_agg waha się od kilkudziesięciu do kilkuset milisekund²⁵. W najbardziej podstawowej konfiguracji dwa strumienie, jeden zawierający etanol z lipidami, a drugi zawierający wodny bufor z ładunkiem RNA, są wstrzykiwane do komory znanej jako "zamknięty mieszalnik uderzający" (CIJ). Wiry turbulentne wytwarzają skale długości prążków rozpuszczalnika/antyrozpuszczalnika wynoszące 1 μm w ciągu 1,5 m, gdy działają z odpowiednimi prędkościami. Prędkości strumienia i geometria mieszania określają przekształcenie pędu liniowego w wiry turbulentne, które mieszają strumienie. Jest to parametryzowane przez liczbę bezwymiarową, liczbę Reynoldsa (Re), która jest liniowo proporcjonalna do prędkości przepływu. Re oblicza się ze wzoru Re = Σ (V_iD_i/v_i), gdzie V_i jest prędkością przepływu każdej pary, v_i jest lepkością kinematyczną każdego strumienia, a D_i jest średnicą wlotu strumienia w 2-strumieniowych urządzeniach CIJ²⁶ lub średnicą komory w 4-strumieniowych MIVMs²⁷. Uwaga: Niektóre odniesienia do CIJ używają tylko jednej średnicy i prędkości strumienia do zdefiniowania Re²⁸. Re mieści się w zakresie 1-100 w urządzeniu mikrofluidycznym, podczas gdy w urządzeniach CIJ można osiągnąć Re na poziomie 125 000. W mieszalniku CIJ strumienie o równym pędzie zderzają się, rozpraszając swój pęd po uderzeniu jako mieszanie turbulentne, co prowadzi do wydajnego mikromieszania dzięki małym mikroskalom Kołmogorowa i małej liczbie Damköhlera. Innym typem mieszalnika jest "mieszalnik wirowy z wieloma wlotami" (MIVM), w którym cztery strumienie są kierowane do centralnej komory. W tej konfiguracji ciągłe przepływy do zamkniętej komory mieszania zapewniają dobrze zdefiniowaną skalę czasu mieszania. Wszystkie elementy płynne przechodzą przez wysokoenergetyczną strefę mieszania w obu typach mieszalników. W przeciwieństwie do tego, proste urządzenia mieszające, takie jak skrzyżowania T, nie zawierają komory, która zapewnia strefę mieszania, co skutkuje mniejszym mieszaniem dwóch strumieni ze względu na to, że pęd strumienia przychodzącego jest w dużej mierze odchylany w kierunku wylotu, a nie w kierunku turbulentnego generowania wirów. Zarówno mieszalniki CIJ, jak i MIVM mogą pracować w trybie wsadowym lub ciągłym, co zapewnia elastyczność w produkcji LNP na różnych skalach.

Ten protokół opisuje, jak optymalne formuły LNP są tworzone dzięki zastosowaniu dwóch technologii ograniczonego strumienia uderzeniowego: 2-strumieniowych CIJ i 4-strumieniowych mieszalników MIVM. Działanie mieszalników CIJ i MIVM zostało już wcześniej zademonstrowane w celu przygotowania nanocząsteczek z hydrofobowymi materiałami rdzeniowymi²⁹. Ten artykuł i film powinny być konsultowane jako dodatkowe źródło informacji na temat tworzenia się nanocząsteczek w tych mieszalnikach. Ta aktualizacja koncentruje się na tworzeniu NP na podstawie lipidów. Zademonstrowano możliwość dostrojenia wielkości LNP poprzez zmianę warunków mikromieszania. Ponadto wykazano przydatność technologii CIJ w tworzeniu stabilnych, monodyspersyjnych LNP o ulepszonej wydajności transfekcji in vitro w komórkach HeLa w porównaniu z LNP wytwarzanymi przy użyciu słabego mieszania pipetowego. Ponadto omówiono zalety i wady każdej geometrii mieszania CIJ, wraz z odpowiednimi warunkami potrzebnymi do skalowania tych mieszalników.

Protokół

Szczegółowe informacje dotyczące odczynników i sprzętu wykorzystanego w niniejszym badaniu zostały przedstawione w Tabeli materiałów.

1. Przygotowanie buforów, strumieni rozpuszczalnika i antirozpuszczalnika

Rozpuścić wszystkie składniki lipidowe w etanolu w podanych stężeniach masowych, zgodnie z Tabelą 1, aby przygotować formulację patisiran LNP¹⁰. Przed użyciem podgrzać roztwory do 37 °C przy delikatnej sonikacji, aby ponownie rozpuścić wszelkie wytrącone ciała stałe.
UWAGA: Można przygotować większe roztwory zapasowe o objętości kilku mililitrów i przechowywać je w temperaturze 4 °C.
Przygotować roztwór zapasowy buforu octanowego o stężeniu 100 mM i pH 4, łącząc 186 mg octanu sodu i 464 mg kwasu octowego w 80 mL wody wolnej od nukleaz. Dostosować pH za pomocą stężonego HCl lub NaOH w razie potrzeby i uzupełnić objętość końcową do 100 mL.
Przygotować roztwór zapasowy buforu HEPES o stężeniu 1 M i pH 7,5, rozpuszczając 23,82 g soli HEPES w 80 mL wody wolnej od nukleaz. Dostosować pH za pomocą stężonego HCl lub NaOH w razie potrzeby i uzupełnić objętość końcową do 100 mL.
Rozcieńczyć wybrany polimer kwasu nukleinowego oraz 100 mM zapasowy bufor octanowy wodą wolną od nukleaz, aby otrzymać roztwór RNA o stężeniu 300 µg/mL w 30 mM buforze octanowym. Przygotować odpowiednią objętość roztworu roboczego dla zaplanowanych eksperymentów; niniejszy protokół wymaga łącznie 1500 µL dla obu mikserów CIJ i MIVM.
UWAGA: RNA otrzymane od dostawcy będzie już znajdować się w odpowiednim buforze, zazwyczaj w stężeniu 10 mg/mL (RNA drożdżowe) lub 1 mg/mL (mRNA kodujące lucyferazę, LucRNA, lub mRNA kodujące GFP, GFP-RNA). RNA drożdżowe może być stosowane jako tani model RNA do wytrącania.

2. Formułowanie LNP przy użyciu dwustrumieniowego mieszalnika CIJ

Przygotowanie i czyszczenie sprzętu
1. Wyczyść mieszalniki CIJ bezpośrednio przed użyciem, przepłukując mieszalnik etanolem. Napełnij dwie strzykawki o pojemności 5 mL etanolem i zablokuj każdą z nich w porcie wlotowym CIJ. Szybko naciśnij tłoki strzykawek i zbierz odpływ z mieszalnika jako odpad.
  UWAGA: Mieszalniki CIJ mogą być konstruowane i obsługiwane zgodnie z wcześniejszym opisem²⁹. Do utrzymania mieszalnika CIJ można użyć różnych statywów, w tym statywu z obręczą, uchwytu do probówek wirówkowych lub kolby Erlenmeyera. Dostawcy CIJ są wymienieni w Tabeli materiałów oraz w Pliku uzupełniającym 1.
2. Zdejmij strzykawki do płukania etanolem z CIJ. Strzykawki te można przechowywać i wykorzystywać ponownie do dodatkowych płukań CIJ etanolem.
3. Osusz kanały wewnętrzne CIJ, przedmuchując adaptery wlotowe strumieniem suchego azotu. Jeśli azot jest niedostępny, należy użyć wyłącznie suchego, filtrowanego powietrza, które nie jest zanieczyszczone mgłą oleju pompowego ani aerozolami.
Przygotowanie strumieni rozpuszczalnika i antysolwentu
1. Wymieszaj roztwory zapasowe lipidów i rozcieńcz je dodatkowym etanolem, aby otrzymać 500 µL roztworu lipidów o stężeniu 6 mg/mL wymienionego w Tabeli 1, w probówce do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 mL.
  UWAGA: Formulacja ta jest powszechnie stosowanym składem Onpattro zawierającym 50 mole% MC3, 10 mole% DSPC, 38,5 mole% cholesterolu oraz 1,5 mole% DMG-PEG2000.
2. Rozcieńcz roztwór zapasowy buforu octanowego 100 mM o pH 4 do stężenia 10 mM w całkowitej objętości 4 mL, aby służył jako kąpiel wygaszająca dla odpływu z mieszalnika CIJ.
  UWAGA: Do kąpieli wygaszającej można również dodać magnetyczny mieszadełko.
3. Pobierz 500 µL roztworu RNA przygotowanego w kroku 1.4 do strzykawki 1 mL. Odwróć strzykawkę i usuń wszelkie pęcherzyki powietrza z tego wodnego strumienia antysolwentu zawierającego polimer kwasu nukleinowego.
4. Pobierz 500 µL roztworu lipidów przygotowanego w kroku 2.2.1 do strzykawki 1 mL. Odwróć strzykawkę i usuń wszelkie pęcherzyki powietrza z tego etanolowego strumienia rozpuszczalnika zawierającego lipidy.
Produkcja LNP w mieszalniku CIJ
1. Ustaw czysty mieszalnik CIJ nad fiolką z kąpielą wygaszającą.
  UWAGA: Zacisk statywu z obręczą lub statyw na probówki stanowią wygodne podparcie dla mieszalnika CIJ. Typowy układ CIJ przedstawiono na Rysunku 1A.
2. Podłącz dwie strzykawki napełnione w kroku 2.2.3 i 2.2.4 do portów wlotowych mieszalnika CIJ.
3. Szybko naciśnij tłoki obu strzykawek, aby wymieszać strumienie rozpuszczalnika i antysolwentu i zebrać nanocząsteczki lipidowe w kąpieli wygaszającej.
  UWAGA: Strzykawki muszą być przesuwane szybko (w czasie krótszym niż 1 s), ale płynnie i jednostajnie. Asymetryczny lub powolny przepływ spowoduje powstanie polidyspersyjnych, dużych LNP.
4. Zdejmij mieszalnik CIJ znad kąpieli wygaszającej, pozostawiając podłączone strzykawki.
  UWAGA: Nie zdejmuj strzykawek i nie dopuszczaj do spłynięcia objętości martwej do kąpieli wygaszającej, ponieważ materiał ten jest słabo wymieszany i w przypadku dostania się do kąpieli wygaszającej negatywnie wpłynie na właściwości dyspersji produktu.
5. Przytrzymaj CIJ nad pojemnikiem na odpady i zdejmij strzykawki, pozwalając, aby pozostała objętość martwa spłynęła do pojemnika na odpady. Utylizuj te strzykawki i powtórz proces czyszczenia opisany w sekcji 2.1.
6. Przeanalizuj LNP wytworzone za pomocą CIJ zgodnie z opisem w poniższej sekcji 5.

3. Formułowanie LNP przy użyciu czterostrumieniowego miksera MIVM

Montaż mieszalnika MIVM, nazywanego mikro-MIVM (µMIVM), aby odróżnić go od większych modeli stosowanych w produkcji na większą skalę
1. Przygotować wszystkie poszczególne elementy niezbędne do montażu mieszalnika MIVM: dolny odbiornik, dysk z geometrią mieszania, górny dysk, o-ring oraz klucz płaski.
  UWAGA: Konstrukcja, montaż i obsługa MIVM zostały wcześniej zademonstrowane w celu enkapsulacji substancji hydrofobowych, a dostawcy są wymienieni w Pliku uzupełniającym 1 oraz w Tabeli materiałów²⁹. Schemat komponentów i terminologię stojaka mieszalnika przedstawiono na Rysunku 2.
2. Osadzić o-ring w rowku w dysku mieszającym.
3. Dopasować otwory w dysku mieszającym do wypustek w górnym dysku i docisnąć je do siebie, uważając, aby nie przesunąć o-ringu.
4. Luźno wkręcić zestaw złożony z dysku mieszającego, o-ringu i górnego dysku do dolnego odbiornika.
  UWAGA: Przed tym krokiem należy odłączyć przewód wylotowy z dolnego odbiornika.
5. Dokręcić górny dysk w dolnym odbiorniku za pomocą klucza płaskiego.
  UWAGA: Jeśli zauważalne jest zacieranie się gwintów, na gwinty górnego dysku można nanieść środek przeciwzacierowy klasy spożywczej lub farmaceutycznej.
6. Włożyć i dokręcić złączkę przewodu wylotowego w dolnym odbiorniku, aby ukończyć montaż MIVM.
7. Zamontować złożony MIVM w stojaku mieszalnika tak, aby przewód wylotowy wychodził przez płytę wsporczą.
  UWAGA: Procedurę regulacji stojaka mieszalnika MIVM należy przeprowadzać okresowo, aby upewnić się, że ograniczniki mechaniczne w stojaku są poprawnie skonfigurowane²⁹.
Przygotowanie strumieni rozpuszczalnika i antyrozpuszczalnika
1. Wymieszać dwa roztwory strumieni rozpuszczalnika lipidowego w etanolu w probówce do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 mL, zgodnie z Tabelą 2, rozcieńczając roztwory stokowe lipidów i dodając dodatkowy etanol w razie potrzeby, aby uzyskać końcowe stężenie lipidów 6 mg/mL.
  UWAGA: Jest to ten sam skład roztworu lipidów, co w punkcie 2.2.1, ale przy całkowitej objętości 1000 µL.
2. Rozcieńczyć roztwór stokowy buforu octanowego 100 mM o pH 4 do stężenia 10 mM w całkowitej objętości 8 mL, aby uzyskać kąpiel hartującą dla odpływu z MIVM.
  UWAGA: Do kąpieli hartującej można dodać magnetyczny mieszadełko.
Formułowanie LNP przy użyciu mieszalnika MIVM
1. Umieścić 8 mL kąpieli hartującej pod stojakiem mieszalnika tak, aby przewód wylotowy odprowadzał ciecz do kąpieli hartującej.
2. Nabrać strumienie rozpuszczalnika i antyrozpuszczalnika do szczelnych strzykawek 1 mL za pomocą igły tępokątnej. Usunąć wszystkie pęcherzyki powietrza i wyrzucić igłę. Odpowietrzyć każdą strzykawkę, odwracając ją i wypychając powietrze.
3. Zamontować cztery strzykawki w mieszalniku zgodnie z ruchem wskazówek zegara (strzykawki 1-4, Tabela 2), umieszczając te same strumienie po przeciwnych stronach. Schemat końcowego wyglądu przedstawiono na Rysunku 1B.
4. Trzymać obudowę łożyska po obu stronach płyty ruchomej. Unikać kładzenia palców na dolnej ściance obudowy, ponieważ istnieje ryzyko przytrzaśnięcia ze względu na ograniczniki mechaniczne. Ostrożnie opuścić płytę ruchomą, aż równomiernie spocznie ona na strzykawkach.
  UWAGA: Przed rozpoczęciem pracy wszystkie tłoki strzykawek muszą znajdować się na tej samej wysokości.
5. Stabilnie i płynnie docisnąć płytę, dążąc do wykonania operacji w czasie od około 0,5 s do 1 s dla tych objętości strumieni.
6. Zakryć kąpiel hartującą zawierającą dyspersję LNP.
7. Przeprowadzić czyszczenie MIVM po użyciu, zgodnie z instrukcjami w kroku 3.5 poniżej.
Formułowanie LNP przy użyciu mieszalnika MIVM napędzanego pompą strzykawkową
1. Zmontować MIVM zgodnie z opisem w kroku 3.1.
2. Przygotować roztwory rozpuszczalnika i antyrozpuszczalnika o pożądanym składzie i w objętości wystarczającej dla wymaganej wielkości formulacji (Tabela 3).
  UWAGA: Są to te same składy co w przypadku strumieni wodnego antyrozpuszczalnika (krok 1.4) i etanolowego rozpuszczalnika (krok 3.2.1), ale przeskalowane do użycia z większymi objętościami strzykawek podanymi w Tabeli 3.
3. Napełnić szczelne strzykawki o objętości 20 mL roztworami i podłączyć przewody PTFE z zamontowanym na końcu adapterem Luera. Odpowietrzyć strzykawki i przewody, odwracając je i wypychając powietrze.
4. Zamontować strzykawki w pompie strzykawkowej i podłączyć je do wlotów mieszalnika w MIVM, jak pokazano na Rysunku 3A.
  UWAGA: Urządzenie CIJ można również obsługiwać za pomocą pomp w ten sam sposób, ale używając tylko jednej strzykawki z antyrozpuszczalnikiem i jednej z rozpuszczalnikiem.
5. Rozcieńczyć roztwór stokowy buforu octanowego 100 mM o pH 4 do stężenia 10 mM w całkowitej objętości 320 mL, aby uzyskać kąpiel hartującą dla odpływu z MIVM.
6. Umieścić kąpiel hartującą pod wylotem MIVM.
7. Ustawić objętościowy przepływ w pompie strzykawkowej na 20 mL/min.
  UWAGA: Przepływy objętościowe można zmieniać w zakresie od 2 mL/min do 40 mL/min, ręcznie ustawiając wartości w pompie strzykawkowej, aby formować LNP w różnych warunkach mikromieszania.
8. Uruchomić pompę strzykawkową, pozwalając, aby pierwsze 10 s odpływu spłynęło do zlewki z odpadami. Po tym 10-sekundowym okresie rozruchu zbierać odpływ z MIVM w kąpieli hartującej.
9. Wyjąć i zakryć kąpiel hartującą zawierającą dyspersję LNP otrzymaną przy wybranym przepływie objętościowym (20 mL/min).
  UWAGA: Procedurę tę można powtórzyć w celu syntezy LNP przy różnych przepływach, dobierając odpowiednie objętości kąpieli hartującej.
10. Czyścić MIVM między każdym eksperymentem (przy zmianie przepływu), przepłukując go objętością odpowiadającą co najmniej dwukrotności objętości przewodu wylotowego, aby zapobiec gromadzeniu się LNP wytworzonych przy poprzednim przepływie przed rozpoczęciem kolejnej syntezy LNP.
Czyszczenie sprzętu po użyciu
1. Odłączyć mieszalnik od stojaka, pozostawiając podłączone strzykawki, i trzymać go nad pojemnikiem na odpady. Wyjąć strzykawki, pozwalając objętości zalegającej spłynąć do pojemnika. Następnie trzymać zestaw mieszalnika do góry nogami i użyć klucza płaskiego do rozmontowania mieszalnika.
2. Przepłukać przewód wylotowy rozpuszczalnikiem (np. etanolem) i wysuszyć powietrzem lub azotem.
3. Przepłukać geometrię mieszania odpowiednim rozpuszczalnikiem, takim jak woda dejonizowana lub etanol, a następnie przepłukać etanolem. Wysuszyć elementy strumieniem powietrza lub azotu.
4. Przepłukać o-ring wodą dejonizowaną i osuszyć.
  UWAGA: Jeśli o-ring wygląda na rozciągnięty lub odkształcony, pozostawić go do wyschnięcia na powietrzu przez noc przed użyciem. Należy utrzymywać duży zapas o-ringów, ponieważ są to części eksploatacyjne. Jeśli kształt nie powróci do normy następnego dnia, o-ring należy wyrzucić.
5. Dokładnie przepłukać górny dysk rozpuszczalnikiem, używając strumienia powietrza lub azotu do wysuszenia powierzchni i złączek strzykawek.
6. Przepłukać każdą strzykawkę dobrym rozpuszczalnikiem (np. wodą dejonizowaną lub etanolem). Przepłukać końcowo etanolem i wysuszyć na powietrzu przed następnym użyciem.

4. Przetwarzanie końcowe LNP

Wymiana buforu i usuwanie etanolu
1. Przeprowadzić dializę dyspersji LNP przeciwko buforowi HEPES 10 mM o pH 7.4, wykorzystując odpowiednio dobraną kasetę dializacyjną z wkładem o progu odcięcia masy cząsteczkowej (MWCO) 20 kDa.
  UWAGA: Krok ten pozwala zarówno na usunięcie pozostałych 10% etanolu, jak i na zwiększenie pH dyspersji poprzez zastąpienie buforu octanowego buforem HEPES.
2. Rozcieńczyć roztwór stokowy buforu HEPES 1 M do stężenia 10 mM w całkowitej objętości 1 L.
3. Przenieść dyspersję LNP do kasety dializacyjnej o pojemności 12 mL za pomocą strzykawki i igły.
4. Zanurzyć wkład dializacyjny w 1 L buforu HEPES i mieszać zewnętrzny bufor magnetycznie. Wymienić zewnętrzny bufor HEPES po 3 h, a następnie wyjąć wkład dializacyjny po kolejnych 3 h, tak aby całkowity czas dializy wyniósł 6 h.
5. Pobrać zdializowaną dyspersję LNP z wkładu dializacyjnego, a zużyty wkład zutylizować.
Koncentracja zawiesiny LNP poprzez ultrawirowanie
1. Przenieść zawiesinę pipetą do odpowiednio dobranej kolumny filtrującej do wirowania o MWCO 100kDa³⁰.
  UWAGA: Filtry wirówkowe są dostępne w różnych rozmiarach, zazwyczaj od 0,5 mL do 12 mL.
2. Wirować dyspersję przy 2000 x g przez 10-20 min (w temperaturze pokojowej), aby zwiększyć stężenie około 5-20-krotnie.
  UWAGA: Podczas wirowania sprawdzać próbkę co 5 min, aby upewnić się, że pozostała odpowiednia ilość cieczy.

5. Charakterystyka LNP

Pomiary średnicy hydrodynamicznej metodą dynamicznego rozpraszania światła (DLS)
1. Odmierz odpowiednio 750 µL lub 900 µL przygotowanej dyspersji LNP (bez rozcieńczania) do plastikowej kuwety mikro lub kwadratowej.
  UWAGA: W odpowiednich kuwetach można stosować mniejsze objętości.
2. Ustaw odpowiednią lepkość rozpuszczalnika, w którym rozproszone są LNP (np. 1,26 cP dla mieszaniny z 10 vol% etanolu).
3. Zbierz światło rozproszone wstecznie pod kątem 173° w temperaturze 25 °C, a następnie wyznacz rozmiar LNP, korzystając z modelu Stokesa-Einsteina oraz pierwszego cumulantu rozwinięcia w szereg funkcji korelacji rozpraszania światła, zgodnie z definicją w normie ISO 13321:1996 E.
4. Powtórz pomiary co najmniej trzy razy.
Pomiary potencjału zeta
1. Wprowadź ok. 800 µL świeżo przygotowanej dyspersji LNP do zgiętych kapilarnych cel zeta-sizer.
  UWAGA: Aby uniknąć uwięzienia pęcherzyków powietrza w kanale kapilarnym, połowę cieczy należy wprowadzić do cel, odwrócić je do góry dnem, a następnie obrócić.
2. Powtórz pomiary co najmniej trzy razy.
  UWAGA: Dla uzyskania najlepszych wyników przewodność buforu powinna wynosić od 0,2 do 2 mS/cm.
Pomiary wydajności enkapsulacji (EE) za pomocą komercyjnie dostępnego zestawu do ilościowego oznaczania RNA
1. Rozcieńcz odpowiednią ilość dołączonego do zestawu buforu 20x Tris-EDTA (TE) o pH 7,5 do stężenia 1x, używając wody wolnej od nukleaz.
2. Przygotuj roztwór Triton X-100 o stężeniu 2 wt%.
3. Rozcieńcz odpowiednią ilość dyspersji LNP w buforze 1x TE, aby uzyskać całkowite stężenie masowe RNA wynoszące około 0,6 µg/mL, przy zawartości etanolu poniżej 0,2 vol%.
4. Przygotuj próbki analogiczne do tych z poprzedniego kroku, ale zawierające 0,5 wt.% Triton X-100, który skutecznie rozpuszcza LNP, co umożliwia odróżnienie stężeń RNA „wolnego” oraz całkowitego odpowiednio w obecności i w nieobecności Triton X-100.
5. Przygotuj odpowiednie ilości kontrolnych roztworów RNA o stężeniach 0 µg/mL, 0,1 µg/mL, 0,2 µg/mL, 0,4 µg/mL, 0,6 µg/mL, 0,8 µg/mL i 1,0 µg/mL w buforze 1x TE.
  UWAGA: Zestaw RNA może początkowo wymagać rozcieńczenia.
6. Powtórz poprzedni krok, stosując 0,5 wt.% Triton X-100.
7. Rozcieńcz barwnik Ribogreen (zawarty w zestawie) 200-krotnie w buforze 1x TE.
8. Dodaj odpowiednie objętości rozcieńczonego barwnika Ribogreen do wszystkich przygotowanych roztworów kontrolnych RNA i próbek, zarówno z Triton X-100, jak i bez niego. Barwnik powinien zostać rozcieńczony tak samo w roztworach kontrolnych i próbkach, w stosunku dwa do jednego. W rezultacie całkowite rozcieńczenie barwnika wynosi 400 razy w stosunku do jego pierwotnego stężenia w zestawie analitycznym.
9. Wymieszaj naczynia za pomocą wstrząsarki vortex.
10. Przygotuj niepowlekaną, nieprzezroczystą płytkę 96-dołkową z płaskim dnem do analizy w czytniku płytek.
11. Wprowadź objętości 100 µL próbek i kontroli RNA do oddzielnych dołków płytki.
  UWAGA: Zwróć uwagę na powstawanie pęcherzyków w roztworach zawierających Triton X-100. Dla każdej próbki wykonuje się co najmniej trzy powtórzenia, co wymaga co najmniej 350 µL próbek.
12. Zarejestruj natężenie fluorescencji za pomocą czytnika płytek przy długości fali wzbudzenia 485 nm i długości fali emisji 528 nm, z czasem naświetlania około 10 s na odczyt. Wstrząsanie nie jest wymagane.
  UWAGA: Wydajność EE jest wyznaczana na podstawie , gdzie I_{with Triton} i I_{without Triton} reprezentują uśrednione natężenie fluorescencji trzech powtórzeń próbek odpowiednio z Triton X-100 i bez Triton X-100, a a_{with Triton} i a_{without Triton} oznaczają nachylenie dopasowania liniowego do dwóch uśrednionych krzywych kalibracyjnych odpowiednio z Triton X-100 i bez Triton X-100³¹.

Wyniki

Przesiewanie optymalnych formulacji LNP można szybko przeprowadzić przy użyciu stosunkowo niewielkich ilości materiału, wykorzystując dwustrumieniowe turbulentne mieszalniki CIJ, pod warunkiem ich pracy przy odpowiednich prędkościach. Mieszalnik µMIVM napędzany programowalną pompą strzykawkową, przedstawiony na Rysunku 3A, jest wykorzystywany do podkreślenia znaczenia osiągnięcia wystarczającego mikromieszania, powyżej krytycznej liczby Reynoldsa, w celu utworzenia małych, monodyspersyjnych LNP. Tabela 3 zawiera podsumowanie formulacji użytych do produkcji LNP, a konfiguracja mieszalnika przebiega zgodnie z protokołem opisanym w kroku 3.4. Wielkości LNP scharakteryzowano za pomocą dynamicznego rozpraszania światła (DLS) w funkcji liczby Reynoldsa. Jak pokazano na Rysunku 3B, powyżej krytycznej wartości Re wynoszącej 5000 obserwuje się małe i monodyspersyjne LNP. Co więcej, wysokie liczby Reynoldsa (~10⁴-10⁵) można osiągnąć, gdy strzykawki są dociskane równomiernie ręcznie lub przy użyciu statywu do mieszania (najbardziej prawy punkt danych na Rysunku 3B). Statyw do mieszania, pokazany na Rysunku 2A, równomiernie dociska wszystkie strzykawki jednocześnie²⁷. W rezultacie takie LNP mają również optymalne rozmiary. Przy niewystarczającym mieszaniu (tj. zbyt małej wartości Re) tworzą się większe LNP. Zdjęcia reprezentatywne dla LNP powstałych przy niskim (Zdjęcie 1) i wysokim Re (Zdjęcie 2) przedstawiono na Rysunku 3B. Próbki przygotowane przy niskim Re są mętne, co wskazuje na obecność dużych koloidalnych struktur rozpraszających światło (efekt Tyndalla), natomiast LNP powstałe przy wysokim Re wydają się przejrzyste ze względu na słabsze, przesunięte w stronę niebieską rozpraszanie z mniejszych koloidów.

Lipidy jonizowalne posiadają różne właściwości fizykochemiczne, co wpływa na cechy fizykochemiczne LNP wytwarzanych z w przeciwnym razie identycznych formulacji lipidowych. W celu przetestowania tego zjawiska wykorzystuje się mieszalnik CIJ (Rycina 1A). W Tabeli 4 wymieniono formulacje przygotowane z użyciem dwóch zatwierdzonych przez FDA lipidów jonizowalnych: ALC-0315 oraz MC3. Rycina 4A pokazuje, że LNP wytworzone z ALC-0315 przy pH 5 mają rozmiar ~80 nm, podczas gdy LNP wytworzone z użyciem MC3 mają rozmiar ~60 nm. Co więcej, przy pH 5, MC3-LNP wykazują dodatni potencjał zeta (~28 mV), podczas gdy ALC-LNP mają neutralny potencjał zeta (<10 mV). Ta różnica w ładunku powierzchniowym, jak i w ogólnym rozmiarze LNP, wynika z pKa obu lipidów. MC3 ma wyższe pKa (6,44) w porównaniu do ALC0315 (6,09)³²; w związku z tym przy pH 5 większa frakcja lipidów MC3 jest naładowana. Obie formulacje zawierają 1,5 mol% stabilizatora PEG-lipid; jednakże MC3-LNP stabilizują się przy mniejszym rozmiarze ze względu na silniejsze odpychanie elektrostatyczne podczas montażu LNP w trakcie agregacji ograniczonej dyfuzyjnie, co zatrzymuje wzrost przy mniejszym rozmiarze. Obie formulacje wykazują wysoką wydajność enkapsulacji (>90%), co przedstawiono na Rycini 4B. Budowa chemiczna lipidów jest kluczowa dla określenia ogólnych właściwości, jak i wydajności LNP, dlatego muszą być one starannie dobrane w zależności od zamierzonego zastosowania.

LNP wytworzone przy użyciu obu geometrii mieszalników turbulentnych (krok 2.3 i krok 3.3) wykazują podobne właściwości fizykochemiczne. Porównanie to zostało rozszerzone o LNP otrzymane za pomocą technik słabego mieszania, takich jak mieszanie pipetą w objętości, aby dodatkowo zilustrować różnicę między mieszalnikami turbulentnymi a technikami mieszania niejednorodnego (Rysunek 1C). Tabela 5 zawiera podsumowanie formulacji użytych do wytwarzania LNP, co przedstawiono na Rysunku 5. W przypadku techniki mieszania pipetą, równe objętości strumieni etanolowych i wodnych są szybko mieszane poprzez pipetowanie w górę i w dół przez 15-20 s, a następnie mieszanina jest przenoszona pipetą do kąpieli z buforem octanowym o pH 4. Rysunek 5A pokazuje, że rozmiary LNP w kąpieli z 10 mM buforem octanowym (pH 4, 10 vol% etanolu) są uderzająco podobne i małe (~50 nm), niezależnie od zastosowanej geometrii mieszalnika (CIJ lub MIVM). Jednak LNP wytworzone za pomocą mieszania pipetą są dwukrotnie większe od LNP otrzymanych przy użyciu mieszalników turbulentnych. Dowodzi to, że LNP wytworzone z różnych geometrii CIJ wykazują podobne właściwości, gdy są produkowane przy wystarczająco wysokich prędkościach (reżim turbulentny powyżej krytycznej liczby Reynoldsa), podczas gdy słabe mieszanie skutkuje powstaniem większych, polidyspersyjnych LNP.

Następnie LNP poddawano dializie przeciwko buforowi HEPES 10 mM o pH 7,4 (100-krotna objętość), aby usunąć etanol i zmienić pH na 7,4. W trakcie tego procesu dochodzi do częściowej fuzji i wzrostu LNP do nieco większego rozmiaru, co pokazano na Rysunku 5A, co jest zgodne z dobrze opisanym w literaturze mechanizmem fuzji³³. Ogólnie LNP przygotowane przy użyciu mieszalników CIJ i MIVM mają rozmiar poniżej 100 nm, podczas gdy LNP przygotowane poprzez mieszanie pipetą mają rozmiar około 140 nm. Jak pokazano na Rysunku 5B, potencjały zeta dla tych formulacji wynoszą mniej niż 10 mV, co wskazuje, że wszystkie są obojętne przy pH 7,4. Ponadto wszystkie wykazują wysoką wydajność enkapsulacji >95% (Rysunek 5C). Zatem LNP o optymalnych właściwościach fizykochemicznych można łatwo wytworzyć przy użyciu technologii mieszalników turbulentnych. Wydajność tych LNP ocenia się poprzez przeprowadzenie transfekcji in vitro w komórkach HeLa.

oparty na lucyferazie in vitro protokół testu transfekcji został zaadaptowany z wcześniejszej publikacji³⁴. Rycina 6A wykreślono luminescencję (RLU) na 1000 komórek dla trzech sformułowań podsumowanych w Tabela 5W качестве kontroli pozytywnej zastosowano Lipofectamine 3000. Należy zauważyć, że Lipofectamine 3000 jest zazwyczaj stosowany w formulacjach DNA, jednak w niniejszych eksperymentach sprawdził się jako odpowiednia kontrola. LNP przygotowane przy użyciu mieszalników 2-jet CIJ oraz 4-jet MIVM wykazują znacznie wyższą efektywność transfekcji niż LNP przygotowane metodą mieszania pipetą. Mimo że oczekiwałoby się, iż większe cząstki będą transfekować lepiej niż cząstki małe ze względu na większy ładunek w pojedynczym LNP, LNP przygotowane tutaj poprzez mieszanie pipetą transfekują mniej efektywnie. Sugeruje to jednoznacznie, że istnieje istotna różnica w strukturze LNP wytworzonych za pomocą technologii CIJ w porównaniu do LNP przygotowanych metodą mieszania pipetą. Efektywność transfekcji LNP wytworzonych za pomocą mieszalników CIJ i MIVM jest w zasadzie identyczna. Lipofectamine 3000 wykazuje najniższą efektywność transfekcji. Rysunek 6B ocenia toksyczność LNP in vitro na komórkach HeLa z wykorzystaniem testu żywotności komórek opartego na soli sodowej rezazuryny³⁵Wszystkie formulacje wykazują niską cytotoksyczność, o czym świadczy wysoki poziom żywotności komórek po przedstawieniu danych jako procentu żywych komórek w stosunku do kontroli niepoddanej działaniu nanocząstek.

Układy mikserów strumieniowych: (A) dwustrumieniowy CIJ, (B) czterostrumieniowy μMIVM, (C) mieszanie pipetą. Schemat dynamiki płynów.
Rysunek 1: Metody mieszania stosowane do produkcji LNP. (A) Dwustrumieniowy mikser z ograniczonymi zderzającymi się strumieniami (CIJ) – zdjęcie przezroczystego miksera oraz zmontowanego układu miksera z Delrinu, regularnie używanego w laboratorium. (B) Czterostrumieniowy mikro-wirujący mikser z wieloma wlotami (µMIVM) – zdjęcie przezroczystego miksera oraz zmontowanego układu miksera ze stali nierdzewnej i Delrinu. Strumienie wlotowe w przezroczystym mikserze zostały przesunięte na boki urządzenia w celu lepszej wizualizacji geometrii mieszania, natomiast w mikserze praktycznym strumienie wlotowe wprowadzane są od góry. Zarówno CIJ, jak i µMIVM pracują z wystarczającą prędkością cieczy, aby przepływy znajdowały się w reżimie turbulentnym, a mieszanie generowało mikroskale Kołmogorowa mniejsze niż 1 µm, co umożliwia osiągnięcie stanu przesycenia w czasie ~1.5 ms. (C) Układ mieszania pipetą, powszechnie stosowany do przygotowywania małych objętości dyspersji LNP poprzez mieszanie roztworów wodnych i etanolowych. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Schemat układu reometrycznego pokazujący płytkę ruchomą, ogranicznik mechaniczny, płytkę wspierającą oraz elementy mieszające.
Rycina 2: Powiększony widok µMIVM i stojaka do mieszania. (A) Zmontowany µMIVM z szklanymi strzykawkami, umieszczony pod stojakiem do mieszania, który umożliwia równomierne i szybkie wysuwanie tłoków strzykawek. Rycina została powielona z Markwalter et al.²⁹. (B) Rozmontowany µMIVM z widocznymi komponentami wewnętrznymi. Ta geometria mieszania jest identyczna z przezroczystym mieszaczem na Rycini 1B, z wyjątkiem tego, że strumienie wlotowe wprowadzane są przez górną tarczę, a nie przez boczną powierzchnię cylindryczną. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Schemat pompy strzykawkowej µMIVM, wykres wielkości LNP w zależności od liczby Reynoldsa; analiza średnicy hydrodynamicznej.
Rysunek 3: Zwiększenie liczby Reynoldsa w mieszalniku turbulentnym zmniejsza hydrodynamiczną średnicę LNP aż do osiągnięcia plateau dla krytycznej liczby Reynoldsa. (A) Schematyczna prezentacja układu pompy strzykawkowej i µMIVM wykorzystanego do kontrolowania liczby Reynoldsa w mieszalniku turbulentnym poprzez ustawienie objętościowych natężeń przepływu strumieni. (B) Hydrodynamiczna średnica LNP w zależności od liczby Reynoldsa w MIVM. Zwiększenie liczby Reynoldsa i turbulentnej dyssypacji energii poprawia mieszanie i prowadzi do bardziej homogenicznego mieszania, przesycenia i wzrostu cząstek. Powyżej krytycznej liczby Reynoldsa wielkości LNP pozostają stałe przy zwiększających się natężeniach przepływu ze względu na warunek Da<<1, tzn. czas dyfuzji rozpuszczalnika/antyrozpuszczalnika jest krótszy niż czas montażu NP. Podane natężenia przepływu stanowią całkowite natężenia przepływu wszystkich czterech strumieni. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Wykresy wielkości, potencjału ζ i wydajności enkapsulacji; ALC vs MC3; wyniki analizy nanomateriałów.
Rycina 4: Właściwości koloidalne LNP wytworzonych z użyciem różnych lipidów jonizowalnych. (A) Średnice hydrodynamiczne i potencjały zeta LNP wytworzonych z dwóch różnych lipidów jonizowalnych: ALC-0315 oraz MC3. Pomiary wykonano przy pH 5 w kąpieli hartującej po formowaniu LNP. Różnice w pozornej pKa lipidów jonizowalnych wpływają na właściwości koloidalne LNP. (B) Pomiary wydajności enkapsulacji obu rodzajów LNP (n = 3, słupki błędów reprezentują jedno odchylenie standardowe). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Charakterystyka LNP: średnica hydrodynamiczna, potencjał zeta, wydajność enkapsulacji; wykresy słupkowe.
Rycina 5: Właściwości koloidalne LNP wytworzonych za pomocą różnych mieszalników, enkapsulujących mRNA lucyferazy z wykorzystaniem jonizowalnego lipidu MC3. (A) Średnice hydrodynamiczne LNP wytworzonych za pomocą mieszalników 2-dyszowych, 4-dyszowych oraz pipetowych. Pomiary przeprowadzono zarówno w kwaśnych warunkach kąpieli gaszącej po formowaniu LNP (lewa strona), jak i po dializie do neutralnego buforu HEPES (prawa strona). Rozmiar LNP zwiększa się podczas neutralizacji pH z powodu dejonizacji jonizowalnego lipidu, co prowadzi do fuzji i wzrostu LNP. Stabilizator lipid-PEG hamuje ten wzrost koalescencji cząstek przed powstaniem precypitatów o rozmiarach mikrometrycznych. (B) Pomiary ładunku powierzchniowego (jako potencjał ζ) zdializowanych LNP w warunkach 10 mM HEPES, pH 7.4. Wszystkie LNP mieszczą się w przedziale 2 mV od 0 mV, co wskazuje, że powierzchnie tych cząstek są neutralne i posiadają jedynie prawie niewykrywalną ilość ładunku kationowego. (C) Pomiary wydajności enkapsulacji po dializie LNP (n = 3, słupki błędu reprezentują jedno odchylenie standardowe). Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Wykresy porównawcze transfekcji i żywotności komórek HeLa; dane dotyczące luminescencji i procentowej żywotności komórek.
Rysunek 6: Transfekcja komórek HeLa przygotowanymi LNP. (A) Luminescencja wyrażonego enzymu lucyferazy po traktowaniu lucyferyną. (B) Żywotność komórek HeLa po inkubacji z LNP. Komórki nie wykazują statystycznie istotnych zmian w żywotności, co wskazano w teście metabolicznym z rezazuryną (n = 4, słupki błędu reprezentują jedno odchylenie standardowe). Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

Strumień(e) / Kąpiel hartująca	Składnik	Skład	Roztwór stokowy	Objętość
Strzykawka 1 - Strumień etanolowy (6 mg/mL całkowitej zawartości lipidów)	Lipid jonizowalny (MC3)	50 mol%	50 mg/mL	0.5 mL
	Lipid zwiterionowy (DSPC)	10 mol%	5 mg/mL
	Cholesterol	38.5 mol%	5 mg/mL
	Lipid pegylowany (DMG-PEG2000)	1.5 mol%	4 mg/mL
Strzykawka 2 - Strumień wodny (0.3 mg/mL RNA)	RNA drożdżowe	N/P 6	10 mg/mL	0.5 mL
Strzykawka 2 - Strumień wodny (0.3 mg/mL RNA)	Bufor octanowy	20 mM, pH 4	100 mM, pH 4	0.5 mL
Kąpiel hartująca	Bufor octanowy	10 mM, pH 4	100 mM, pH 4	4 mL

Tabela 1: Standardowa formulacja LNP patisiranu przygotowana za pomocą miksera CIJ. W niniejszym protokole jako modelowe RNA zastosowano RNA drożdżowe. Wszystkie roztwory zostały rozpuszczone na poziomie molekularnym i dokładnie wymieszane przed pobraniem ich do strzykawek.

Strumień(cie) / Kąpiel hartownicza	Komponent	Sformułowanie	Roztwór stokowy	Objętość
Strzykawka 1 - Strumień etanolu (6 mg/mL całkowitej zawartości lipidów)	Lipid jonizowalny (MC3)	50 mol%	50 mg/ml	0,5 ml
	Lipid zwiterionowy (DSPC)	10% mol	5 mg/ml
	Cholesterol	38,5 mol%	5 mg/ml
	Lipid pegylowany (DMG-PEG2000)	1,5 mol%	4 mg/ml
Strzykawka 2 - Strumień wodny (0,3 mg/ml RNA)	RNA drożdży	N/P 6	10 mg/ml	0,5 ml
Strzykawka 2 - Strumień wodny (0,3 mg/ml RNA)	Bufor octanowy	20 mM, pH 4	100 mM, pH 4	0,5 ml
Strzykawka 3 - Strumień etanolu (6 mg/ml całkowitej zawartości lipidów)	Lipid jonizowalny (MC3)	50 mol%	50 mg/ml	0,5 mL
	Lipid zwitterionowy (DSPC)	10 mol%	5 mg/ml
	Cholesterol	38,5 mol%	5 mg/ml
	Lipid pegylowany (DMG-PEG2000)	1,5 mol%	4 mg/ml
Strzykawka 4 - Strumień wodny (0,3 mg/ml RNA)	RNA drożdży	N/P 6	10 mg/mL	0,5 mL
Strzykawka 4 - Strumień wodny (0,3 mg/ml RNA)	Bufor octanowy	20 mM, pH 4	100 mM, pH 4	0,5 mL
Kąpiel hartownicza	Bufor octanowy	10 mM, pH 4	100 mM, pH 4	8 mL

Tabela 2: Standardowa formulacja LNP patisiranu przygotowana za pomocą miksera MIVM.Mikser MIVM wykorzystuje cztery strumienie – dwa rozpuszczalniki i dwa antyrozpuszczalniki. Można stosować strumienie o różnych pędach; jednak w niniejszym protokole wybrano strumienie o pędach równych.

Strumień (strumienie) / Kąpiel gasząca	Składnik	Formulacja	Stężenie zapasu	Objętość
Strzykawka 1 - Strumień etanolowy (6 mg/mL całkowitego lipidu)	Lipid jonizowalny (MC3)	50 mol%	50 mg/mL	20 mL
	Lipid zwitterionowy (DSPC)	10 mol%	5 mg/mL
	Cholesterol	38.5 mol%	5 mg/mL
	Lipid pegylowany (DMG-PEG2000)	1.5 mol%	4 mg/mL
Strzykawka 2 - Strumień wodny (0.3 mg/mL RNA)	RNA drożdżowe	N/P 6	10 mg/mL	20 mL
Strzykawka 2 - Strumień wodny (0.3 mg/mL RNA)	Bufor octanowy	20 mM, pH 4	100 mM, pH 4	20 mL
Strzykawka 3 - Strumień etanolowy (6 mg/mL całkowitego lipidu)	Lipid jonizowalny (MC3)	50 mol%	50 mg/mL	20 mL
	Lipid zwitterionowy (DSPC)	10 mol%	5 mg/mL
	Cholesterol	38.5 mol%	5 mg/mL
	Lipid pegylowany (DMG-PEG2000)	1.5 mol%	4 mg/mL
Strzykawka 4 - Strumień wodny (0.3 mg/mL RNA)	RNA drożdżowe	N/P 6	10 mg/mL	20 mL
Strzykawka 4 - Strumień wodny (0.3 mg/mL RNA)	Bufor octanowy	20 mM, pH 4	100 mM, pH 4	20 mL
Kąpiel gasząca (Czas zbierania = 30 s)	Bufor HEPES	10 mM, pH 7.5	1 M, pH 7.5	320 mL

Tabela 3: Formuła LNP wytworzona za pomocą mieszalnika MIVM napędzanego pompą strzykawkową. DODMA jest stosowany jako lipid jonizowalny, a RNA drożdżowe jako modelowe RNA. Dla tego protokołu wybrano przykładowy przebieg procesu przy przepływie 40 mL/min.

Strumień(strumienie) / Kąpiel hartownicza	Komponent	Formulacja	Roztwór stokowy	Objętość
Strzykawka 1 - Strumień etanolu (12 mg/ml całkowitej zawartości lipidów)	Lipid jonizowalny (MC3 lub ALC0315)	50 mol%	50 mg/ml	0,5 ml
	Lipid zwitterionowy (DSPC)	10 mol%	5 mg/mL
	Cholesterol	38,5 mol%	5 mg/ml
	Lipid pegylowany (DMG-PEG2000)	1,5 mol%	4 mg/ml
Strzykawka 2 - Strumień wodny (0,6 mg/ml RNA)	RNA drożdży	N/P 6	10 mg/ml	0,5 ml
Strzykawka 2 - Strumień wodny (0,6 mg/ml RNA)	Bufor octanowy	20 mM, pH 5	100 mM, pH 5	0,5 ml
Kąpiel hartownicza	Bufor octanowy	10 mM, pH 5	100 mM, pH 5	9 ml

Tabela 4: Formuły LNP z dwóch różnych lipidów jonizowalnych wytworzone za pomocą mieszalnika CIJ. Formuły przygotowano z zastosowaniem ALC-0315 lub MC3, podczas gdy pozostałe składniki pozostały niezmienione.

Strumień(strumienie) / Kąpiel hartownicza	Komponent	Formulacja	Roztwór zapasowy	Objętość
Strzykawka 1 - Strumień etanolu (6 mg/ml całkowitych lipidów)	Lipid jonizowalny (MC3)	50 mol%	50 mg/ml	0,5 mL
	Lipid zwitterionowy (DSPC)	10 mol%	5 mg/ml
	Cholesterol	38,5 mol%	5 mg/ml
	Lipid pegylowany (DMG-PEG2000)	1,5 mol%	4 mg/ml
Strzykawka 2 - Strumień wodny (0,3 mg/ml RNA)	mRNA FLuc	N/P 6	1 mg/ml	0,5 ml
Strzykawka 2 - Strumień wodny (0,3 mg/ml RNA)	Bufor octanowy	20 mM, pH 4	100 mM, pH 4	0,5 ml
Kąpiel hartownicza	Bufor octanowy	10 mM, pH 4	100 mM, pH 4	4 mL

Tabela 5: Standardowa formulacja LNP patisiranu wytworzona za pomocą mieszalnika CIJ. Do pomiaru ekspresji genów za pomocą testu bioluminescencyjnego wykorzystuje się mRNA FLuc, które koduje białko lucyferazy.

Plik uzupełniający 1: Dostawcy mikserów CIJ i MIVM. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

Przedstawiono syntezę LNP zawierających polimery kwasów nukleinowych przy użyciu dwóch ograniczonych mieszalników turbulentnych z uderzeniem strumieniowym. Mieszalniki turbulentne CIJ, prowadzone z odpowiednimi prędkościami, zapewniają, że skala czasowa mieszania jest krótsza niż czas montażu LNP, wytwarzając jednorodne warunki przesycenia do tworzenia małych LNP o wąskich rozkładach wielkości²¹. W związku z tym LNP wykonane tą samą chemią przy użyciu różnych geometrii mieszalników turbulentnych (2-strumieniowy CIJ i 4-strumieniowy mieszalnik MIVM) wykazują podobne właściwości fizykochemiczne i wykazują dobrą wydajność transfekcji (Rysunek 5 i Rysunek 6). W przeciwieństwie do tego, LNP wykonane przy użyciu pipetowania, które powoduje gorsze mieszanie, skutkuje większymi i bardziej polidyspersyjnymi LNP (Rysunek 5A) o niższej wydajności transfekcji. Od dawna wiadomo, że kinetyka mieszania i montażu odgrywa znaczącą rolę w przetwarzaniu LNP; Cullis i wsp. zauważyli, że szybkie mieszanie konwwekcyjno-dyfuzyjne etanolu i buforu prowadzi do powstawania małych cząstek o wąskim rozkładzie wielkości, podczas gdy powolne mieszanie dyfuzyjne prowadzi do większych cząstek o szerokim rozkładzie wielkości⁹. Skala czasowa mieszania w mieszalnikach turbulentnych CIJ zmniejsza się proporcjonalnie do natężeń przepływu strumieni na wlocie do mieszalnika²⁷. Jest to określane ilościowo za pomocą bezwymiarowej liczby Reynoldsa (Re), która mierzy stosunek sił bezwładności i lepkości. Turbulencje wewnątrz komór mieszania CIJ i MIVM występują przy wystarczająco wysokim Re, tak że turbulentne rozciąganie wiru powoduje powstawanie małych skali długości, które powodują szybkie mieszanie rozpuszczalnika i antyrozpuszczalnika przez dyfuzję. Skala długości turbulentnej zależy od Re, a nie od konkretnej geometrii urządzenia mieszającego. Z tego powodu zarówno CIJ, jak i MIVM wytwarzają te same cząstki LNP i dlatego różne rozmiary mieszalników MIVM wytwarzają te same rozmiary NP²⁷. Przy wysokim Re, odpowiadającym wysokim prędkościom wlotowym, LNP mogą być wytwarzane w sposób powtarzalny bez zmian między partiami (rysunek 3B).

Protokół ten umożliwia formułowanie różnych LNP mRNA, DNA lub siRNA o różnych właściwościach fizykochemicznych przy użyciu turbulentnych mieszalników CIJ. Oprócz zapewnienia wszechstronności pod względem składu i stężeń, technika ta zapewnia jasną ścieżkę do szybkiego przesiewania preparatów w sprzedaży laboratoryjnej (kilka miligramów) i skalowania preparatów ołowiu do większych przemysłowych wielkości partii przy szybkości produkcji 5 l/min³⁶. Było to główną przeszkodą dla kilku innych technik, w tym mieszania luzem i mikrofluidyki. Na przykład techniki przetwarzania masowego nie są w stanie konsekwentnie wytwarzać LNP w sposób powtarzalny, nawet w skali kilku mililitrów. Techniki mikroprzepływowe zapewniają znaczną poprawę w porównaniu z technikami mieszania luzem, umożliwiając wytwarzanie jednorodnych i powtarzalnych LNP; Jednak, są one tylko w zakresie miligramów²⁹. Jak szczegółowo opisano we wprowadzeniu, zrównoleglenie urządzeń mikroprzepływowych stanowi próbę skalowania do wag produkcyjnych, ale nie eliminuje problemu zanieczyszczenia i nie może być skalowane tak skutecznie, jak mieszalniki oparte na technologii ograniczonego strumienia uderzeniowego.

Oprócz tych zalet, mieszalniki CIJ odegrają kluczową rolę w produkcji LNP nowej generacji, które wykazują zdolności celowania lub przeprowadzają edycję genów. Obecne preparaty LNP zawierają lipidy i kwasy nukleinowe o podobnej dyfuzyjności, a zatem można je wytwarzać nawet przy nieco słabym mieszaniu na skali laboratoryjnej. Jednak podejścia do edycji genów mogą wymagać enkapsulacji gatunków kwasów nukleinowych o bardzo różnych masach cząsteczkowych, takich jak małe cząsteczki przewodnika RNA i duże transkrypty mRNA, w celu zakodowania białka CAS9³⁷. Bardzo różne skale czasu dyfuzji tych różnych gatunków sprawiają, że jednolita enkapsulacja w proporcjach stechiometrycznych jest wyzwaniem. Ten problem jednolitej enkapsulacji staje się coraz bardziej wyraźny wraz ze spadkiem wydajności mieszania. Podobnie, celowanie w komórki niewątrobowe może wymagać włączenia silnie związanych stabilizatorów wolno dyfuzyjnych (takich jak kopolimery blokowe o dużej masie cząsteczkowej z docelowymi ligandami). Ukierunkowane ligandy o wielkości do 14 kDa mogą być sprzężone z kopolimerami blokowymi przed złożeniem nanocząstek, co umożliwia ich równomierne włączenie do nanocząsteczek za pomocą mieszania CIJ³⁸. Mieszalniki turbulentne CIJ są przydatnymi narzędziami do produkcji LNP wykonanych z komponentów o różnych dyfuzyjnościach.

Chociaż mieszalniki turbulentne CIJ wykazują kilka zalet w porównaniu z innymi mieszalnikami w zakresie formułowania LNP, ważne jest, aby zwrócić uwagę na ograniczenia związane z każdą geometrią. Mieszalnik 2-strumieniowy CIJ wymaga, aby oba strumienie wlotowe (etanol i woda) miały równe momenty (w granicach 10%-30%), aby uzyskać równomierne turbulentne mikromieszanie w komorze. Fakt, że strumień wyjściowy składa się w proporcji 50:50 rozpuszczalnik/antyrozpuszczalnik, ogranicza poziom przesycenia w komorze mieszania, w której występuje wytrącanie się²⁹. Ta wada została rozwiązana przez 4-strumieniowy mieszalnik MIVM, ponieważ może on wykorzystywać cztery dysze o nierównym momencie, aby osiągnąć warunki wysokiego przesycenia w komorze mieszania. Ponadto oba mieszalniki muszą być rzędu miligramów masy całkowitej, co czyni je nieidealnym wyborem do wysokoprzepustowych badań przesiewowych wielu różnych preparatów LNP. W przypadku prostych preparatów LNP badania przesiewowe najlepiej przeprowadzić za pomocą mikrofluidyki lub strategii pipetowania w skali mikrogramowej, a następnie przenieść do technologii ograniczonego strumienia uderzeniowego po zidentyfikowaniu kilku preparatów ołowianych. Istotne jest również, aby wziąć pod uwagę martwe objętości w mieszalnikach. W CIJ, dwóch mieszalnikach strumieniowych, objętości podtrzymania wynoszą 50-100 mikrolitrów. Tę ilość materiału należy odjąć od ilości wychwyconej w kąpieli hartowniczej przy obliczaniu odzysku z procesu. Straty te są nieznaczne w przypadku pracy na dużą skalę, ale wynoszą 10% strat, gdy produkowane są całkowite objętości 5 ml, jak pokazano tutaj. Mieszalniki turbulentne z uderzającym strumieniem są cennym narzędziem do produkcji LNP w skali GMP, czego dowodem są dwie szczepionki COVID-19 zatwierdzone przez FDA.

Oświadczenia

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

Stypendium NSF dla BKW (DGA1148900), wsparcie od Tessera Therapeutics Inc., Fundacji Billa i Melindy Gatesów (BMGF, numery umów OPP1150755 i INV-041182) oraz FDA w ramach 75F40122C00186.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
18:0 PC (DSPC)	Avanti Polar Lipids	850365P	Pomocniczy lipid
21 G x 1-1/2 cala. Igła BD PrecisionGlide	BD	305167
96-dołkowa ścianka płyta dolna	Fisher Scientific	07-000-135
96 Well biała/przezroczysta płyta dolna, powierzchnia TC	Thermo Fisher Scientific	165306
Kwas octowy, lodowaty	Fisher Scientific	A38-212
ALC-0315	Avanti Polar Lipids	890900	Jonizowalny lipid
Filtr odśrodkowy Amicon Ultra, 100 kDa MWCO, 15 ml	Millipore Sigma	UFC910024
Filtr odśrodkowy Amicon Ultra, 100 kDa MWCO, 4 mL	Millipore Sigma	UFC810096
Bright-Glo Lucyferazy System testowy	Promega	E2620
Cholesterol	Millipore Sigma	C8667
CleanCap FLuc mRNA (5 miesięcy)	Trilink Biotechnologies	L-7202
Mieszalnik z ograniczonymi strumieniami uderzeniowymi	Holland Applied Technologies, Helix Biotech, Diamond Tool and Die (DTD)	/A Skontaktuj	się z Holland lub DTD w sprawie niestandardowych zamówień, a system Helix Biotech to Nova BT. Zapoznaj się z tekstem do walidacji nowego miksera
D-Lin-MC3-DMA	MedChemExpress	HY-112251	Jonizowalny lipid
DMEM, wysoka zawartość glukozy, pirogronian	Thermo Fisher Scientific	11995065
DMG-PEG 2000	Avanti Polar Lipids	880151P	PEG-lipid
DODMA	Avanti Polar Lipids	890899P	Jonizowalny etanol lipidowy
200 Proof	Decon Labs, Inc.	2701
Stożkowe probówki wirówkowe Falcon 15 ml	Fisher Scientific	14-959-70C
Stożkowe probówki wirówkowe Falcon 50 ml o wysokiej czystości	Fisher Scientific	14-959-49A
Surowica bydlęca, certyfikowana, Stany Zjednoczone	Thermo Fisher Scientific	16000044
HeLa	ATCC	CCL-2
HEPES, wolny kwas	IBI Scientific	IB01130
HSW HENKE-JECT dwuczęściowy 1 ml Luer	Henke Sass Wolf	4010.200V0
HSW HENKE-JECT dwuskładnikowy 5 ml (6 mL) Luer Lock	Henke Sass Wolf	4050.X00V0
Idex 1648 ETFE rurka ” OD 0,093" ID	Idex Zdrowie & Nauka	1648
Idex P-678 ¼ "-28 do Luer dopasowanie	Idex Health & Tuleja Science	P-678
Idex P-940 do przewodów ETFE	Idex Health & Science	P-940
Lipofectamine 3000 Odczynnik do transfekcji	Thermo Fisher Scientific	L3000001
Złączka Luer	Idex Health & Science	P-604	Zamontuj na wlocie mieszalnika CIJ lub MIVM z odpowiednimi gwintami. Części Idex są również dostępne za pośrednictwem VWR i wielu innych dostawców
Stoisko mikserów	Holland Applied Technologies	N/A	Zobacz Markwalter & Prud'homme for design.²⁶ Skontaktuj się z Hollandią, aby kupić
mieszalnik wirowy z wieloma wlotami	Holland Applied Technologies i Diamond Tool and Die (DTD)	/A	Skontaktuj się z Holland lub DTD w sprawie niestandardowych zamówień. Zapoznaj się z tekstem nowego o-ringu walidacyjnego mieszalnika
(MIVM)	C.E. Conover	MM1.5 35.50 V75	Zamów luzem - część eksploatacyjna. Upewnij się, że rozpuszczalnik jest kompatybilny, jeśli używasz alternatywnego źródła.
Tuleja odpływowa - CIJ	Idex Health & Science	P-200	Montaż ze złączką wylotową (duży koniec zlicowany z rurką)
Złączka wylotowa - CIJ	Idex Health & Science	P-205	Montaż z tuleją i rurką na wylocie komory CIJ
Złączka wylotowa - MIVM	Idex Health & Science	P-942	Połączenie z tuleją
Rurka wylotowa - CIJ	Idex Health & Science	1517	Użyj obcinaka do rurek do czystych końcówek. Upewnij się, że dodatkowe rurki nie wystają do komory mieszania
Rurka wylotowa - MIVM	N/A	N/A	Pasuje do identyfikatora tulejki.
PBS - sól fizjologiczna buforowana fosforanami (10x) pH 7,4, bez RNaz	Thermo Fisher Scientific	AM9624
Penicylina-Streptomycyna (10 000 U/mL)	Thermo Fisher Scientific	15140122
PHD 2000 Programowalna pompa strzykawkowa	Apparatus	N/A
Plastikowa dwuczęściowa strzykawka 1 ml	Thermo Fisher Scientific	S7510-1
Złączka	wtykowaIdex Zdrowie & Science	P-309	Montaż po bokach mieszalnika CIJ (punkt dostępu do uszczelki po wierceniu)
Quant-it Zestaw do oznaczania RNA RiboGreen i odczynnik RiboGreen RNA, RediPlate 96 Zestaw do oznaczania ilościowego RNA RiboGreen	Invitrogen firmy Thermo Fisher Scientific	R11491
Resazurin, sól sodowa	Thermo Fisher Scientific	R12204
RNase AWAY Odkażacz powierzchniowy	Thermo Fisher Scientific	7000TS1
Fiolka scyntylacyjna	DWK Lifesciences	74504-20
SGE Gazoszczelne strzykawki, Luer Lock, 100 ml	SGE	100MR-LL-GT
SGE Gazoszczelne strzykawki, Luer Lock, 50 ml	SGE	50MR-LL-GT
Slide-A-Lyzer, 20 K MWCO	Thermo Fisher Scientific	66012
Octan sodu	Millipore Sigma	32319-500G-R
Wodorotlenek sodu	Fisher Scientific	S320-500
Milipore sacharozy	Sigma	S7903-1KG
Filtry strzykawkowe, sterylne	Genesse Scientific	25-243
Triton X-100	Millipore Sigma	9036-19-5
Trypsyna-EDTA (0,25%), czerwień fenolowa	Thermo Fisher Scientific	25200056
Woda, jakość wolna od endotoksyn	Biologiczne	RNA 118-325-131	RNA wolne od RNAzy i DNAz
(10 mg / ml)	Thermo Fisher Scientific	AM7118

NN Harvard Kasety dializacyjne Drożdżowe

Bibliografia

Hou, X., Zaks, T., Langer, R., Dong, Y. Lipid nanoparticles for mRNA delivery. Nat Rev Mater. 6 (12), 1078-1094 (2021).
Dowdy, S. F., Setten, R. L., Cui, X. -S., Jadhav, S. G. Delivery of RNA therapeutics: The great endosomal escape. Nucleic Acid Ther. 32 (5), 361-368 (2022).
Eygeris, Y., Patel, S., Jozic, A., Sahay, G. Deconvoluting lipid nanoparticle structure for messenger RNA delivery. Nano Lett. 20 (6), 4543-4549 (2020).
Tenchov, R., Bird, R., Curtze, A. E., Zhou, Q. Lipid nanoparticles─from liposomes to mRNA vaccine delivery, a landscape of research diversity and advancement. ACS Nano. 15 (11), 16982-17015 (2021).
Buck, J., Grossen, P., Cullis, P. R., Huwyler, J., Witzigmann, D. Lipid-based DNA therapeutics: Hallmarks of non-viral gene delivery. ACS Nano. 13 (4), 3754-3782 (2019).
Semple, S. C., et al. Rational design of cationic lipids for siRNA delivery. Nat Biotechnol. 28 (2), 172-176 (2010).
Lam, K., et al. trialkyl ionizable lipids are versatile lipid-nanoparticle components for therapeutic and vaccine applications. Adv Mater. 35 (15), 2209624(2023).
Gilleron, J., et al. Image-based analysis of lipid nanoparticle-mediated siRNA delivery, intracellular trafficking and endosomal escape. Nat Biotechnol. 31 (7), 638-646 (2013).
Evers, M. J. W., et al. State-of-the-art design and rapid-mixing production techniques of lipid nanoparticles for nucleic acid delivery. Small Methods. 2 (9), 1700375(2018).
Kulkarni, J. A., Cullis, P. R., Van Der Meel, R. Lipid nanoparticles enabling gene therapies: From concepts to clinical utility. Nucleic Acid Ther. 28 (3), 146-157 (2018).
Jürgens, D. C., et al. Lab-scale siRNA and mRNA LNP manufacturing by various microfluidic mixing techniques - an evaluation of particle properties and efficiency. OpenNano. 12, 100161(2023).
Wang, X., et al. Preparation of selective organ-targeting (sort) lipid nanoparticles (LNPs) using multiple technical methods for tissue-specific mRNA delivery. Nat Protoc. 18 (1), 265-291 (2023).
Yanez Arteta, M., et al. Successful reprogramming of cellular protein production through mRNA delivered by functionalized lipid nanoparticles. Proc Natl Acad Sci. 115 (15), E3351-E3360 (2018).
Eygeris, Y., Gupta, M., Kim, J., Sahay, G. Chemistry of lipid nanoparticles for RNA delivery. Acc Chem Res. 55 (1), 2-12 (2022).
Shepherd, S. J., et al. Scalable mRNA and siRNA lipid nanoparticle production using a parallelized microfluidic device. Nano Lett. 21 (13), 5671-5680 (2021).
Leung, A. K. K., Tam, Y. Y. C., Chen, S., Hafez, I. M., Cullis, P. R. Microfluidic mixing: A general method for encapsulating macromolecules in lipid nanoparticle systems. J Phys Chem B. 119 (28), 8698-8706 (2015).
Prakash, G., et al. Microfluidic fabrication of lipid nanoparticles for the delivery of nucleic acids. Adv Drug Deliv Rev. 184, 114197(2022).
Carvalho, B. G., Ceccato, B. T., Michelon, M., Han, S. W., De La Torre, L. G. Advanced microfluidic technologies for lipid nano-microsystems from synthesis to biological application. Pharmaceutics. 14 (1), 141(2022).
Webb, C., et al. Using microfluidics for scalable manufacturing of nanomedicines from bench to GMP: A case study using protein-loaded liposomes. Int J Pharm. 582, 119266(2020).
Warne, N., et al. Delivering 3 billion doses of comirnaty in 2021. Nat Biotechnol. 41 (2), 183-188 (2023).
Johnson, B. K., Prud'homme, R. K. Flash nanoprecipitation of organic actives and block copolymers using a confined impinging jets mixer. Aust J Chem. 56 (10), 1021-1024 (2003).
Hogarth, C., et al. Evaluating the impact of systematic hydrophobic modification of model drugs on the control, stability and loading of lipid-based nanoparticles. J Mater Chem B. 9 (48), 9874-9884 (2021).
Belliveau, N. M., et al. Microfluidic synthesis of highly potent limit-size lipid nanoparticles for in vivo delivery of siRNA. Mol Ther Nucleic Acids. 1, e37(2012).
D'addio, S. M., Prud'homme, R. K. Controlling drug nanoparticle formation by rapid precipitation. Adv Drug Deliv Rev. 63 (6), 417-426 (2011).
Johnson, B. K., Prud'homme, R. K. Mechanism for rapid self-assembly of block copolymer nanoparticles. Phys Rev Lett. 91 (11), 118302(2003).
Han, J., et al. A simple confined impingement jets mixer for flash nanoprecipitation. J Pharm Sci. 101 (10), 4018-4023 (2012).
Markwalter, C. E., Prud'homme, R. K. Design of a small-scale multi-inlet vortex mixer for scalable nanoparticle production and application to the encapsulation of biologics by inverse flash nanoprecipitation. J Pharm Sci. 107 (9), 2465-2471 (2018).
Johnson, B. K., Prud'homme, R. K. Chemical processing and micromixing in confined impinging jets. AIChE. 49, 2264-2282 (2003).
Markwalter, C. E., Pagels, R. F., Wilson, B. K., Ristroph, K. D., Prud'homme, R. K. Flash nanoprecipitation for the encapsulation of hydrophobic and hydrophilic compounds in polymeric nanoparticles. J Vis Exp. (143), e58757(2019).
Bailey-Hytholt, C. M., Ghosh, P., Dugas, J., Zarraga, I. E., Bandekar, A. Formulating and characterizing lipid nanoparticles for gene delivery using a microfluidic mixing platform. J Vis Exp. (168), e62226(2021).
Bizmark, N., et al. Ribogreen fluorescent assay kinetics to measure ribonucleic acid loading into lipid nanoparticle carriers. Adv Mater Interfaces. 11 (17), 2301083(2024).
Zhang, C., et al. Modification of lipid-based nanoparticles: An efficient delivery system for nucleic acid-based immunotherapy. Molecules. 27 (6), 1943(2022).
Kulkarni, J. A., et al. Fusion-dependent formation of lipid nanoparticles containing macromolecular payloads. Nanoscale. 11 (18), 9023-9031 (2019).
El-Mayta, R., Padilla, M. S., Billingsley, M. M., Han, X., Mitchell, M. J. Testing the in vitro and in vivo efficiency of mRNA-lipid nanoparticles formulated by microfluidic mixing. J Vis Exp. (191), e64810(2023).
Scalzo, S., et al. Ionizable lipid nanoparticle-mediated delivery of plasmid DNA in cardiomyocytes. Int J Nanomed. 17, 2865-2881 (2022).
Feng, J., Markwalter, C. E., Tian, C., Armstrong, M., Prud'homme, R. K. Translational formulation of nanoparticle therapeutics from laboratory discovery to clinical scale. J Transl Med. 17 (1), 200(2019).
Kazemian, P., et al. Lipid-nanoparticle-based delivery of CRISPR/cas9 genome-editing components. Mol Pharm. 19 (6), 1669-1686 (2022).
Pinkerton, N. M. Polymeric drug delivery vehicles and imaging agents. Princeton University. , PhD thesis, http://arks.princeton.edu/ark:/88435/dsp01h128nd846 (2014).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Mieszanie turbulentne mieszad o wirowiryczne formowanie nanocz steczek urz dzenia mikroprzep ywowe pompa strzykawkowa rozpuszczalnik etanolowy wodny antirozpuszczalnik skalowalno produkcji nanocz steczek

Synteza nanocząstek lipidowych przez przepływ turbulentny w ograniczonych mieszalnikach strumieniowych z uderzeniem