Radiosynteza, kontrola jakości i obrazowanie pozytonowej tomografii emisyjnej małych zwierząt 68nanocząsteczek znakowanych Ga

Podsumowanie

Ten artykuł opisuje radiosyntezę, formułowanie, kontrolę jakości nowej sondy znakowanej radioaktywnie (tj. nanoniki NM-02 znakowanej ⁶⁸Ga) oraz jej zastosowanie do obrazowania PET/CT małych zwierząt w modelu ksenoprzeszczepu.

Streszczenie

Techniki obrazowania pozytonowej tomografii emisyjnej (PET) i tomografii komputerowej emisji pojedynczych fotonów (SPECT) są kluczowe w przedklinicznych badaniach nad rakiem, wymagając skrupulatnej uwagi przy syntezie radioznaczników, zapewnieniu jakości i protokołach iniekcji in vivo. Badanie to przedstawia kompleksowy przebieg pracy dostosowany do zwiększenia odporności i odtwarzalności eksperymentów PET na małych zwierzętach. Proces syntezy w laboratorium radiochemicznym przy użyciu ⁶⁸Ga jest szczegółowy, z naciskiem na rygorystyczne protokoły kontroli jakości i zapewnienia dla każdej produkcji radioznacznika. Parametry takie jak stężenie, aktywność molowa, pH i czystość są rygorystycznie monitorowane, zgodnie ze standardami mającymi zastosowanie w badaniach na ludziach. Metodologia ta wprowadza usprawnione przygotowanie strzykawki i specjalnie zaprojektowaną kaniulę 30G do precyzyjnych wstrzyknięć dożylnych myszom. Monitorowanie stanu zdrowia zwierząt podczas skanowania, w tym temperatury i tętna, zapewnia ich dobre samopoczucie przez cały czas trwania zabiegu. Dawki dla skanów PET i SPECT są z góry określone, aby zrównoważyć pozyskiwanie danych z minimalizacją narażenia na promieniowanie zwierząt i badaczy. Podobnie, tomografia komputerowa wykorzystuje wstępnie zaprogramowane ustawienia w celu ograniczenia narażenia na promieniowanie, co jest szczególnie istotne w długoterminowych badaniach oceniających efekty leczenia. Optymalizując te etapy, przepływ pracy ma na celu standaryzację procedur, zmniejszenie zmienności i poprawę jakości obrazowania PET/SPECT/CT małych zwierząt. Zasób ten dostarcza cennych informacji dla badaczy dążących do poprawy dokładności i wiarygodności badań przedklinicznych w obrazowaniu molekularnym, co ostatecznie przyczyni się do postępu w tej dziedzinie.

Wprowadzenie

Jednym z tematów, który ma ogromne znaczenie, są badania w dziedzinie raka piersi. Rak piersi pozostaje często występującym nowotworem, stanowiąc około 1/³ wszystkich nowotworów u kobiet. Leczenie jest dostosowane do biologicznej i histologicznej charakterystyki guza oraz do stadium choroby. Szansa na przeżycie jest na ogół duża, chyba że guz ma już przerzuty, w którym to przypadku 5-letnie przeżycie wynosi tylko około 30%¹. Podobny los spotyka inne nowotwory ginekologiczne, na przykład rak jajnika wykazuje > 95% 5-letniego przeżycia w przypadku guzów w stadium 1, ale tylko 15% w przypadku guzów w stadium 4 z przerzutami^2,3.

Nieinwazyjne obrazowanie, w szczególności pozytonowa tomografia emisyjna (PET), przekształca badania nad rakiem, oferując niezrównany wgląd w aspekty molekularne guza, takie jak metabolizm, ekspresja receptorów i odpowiedź terapeutyczna^4,5,6. Pozwala zarówno na wizualizację, jak i kwantyfikację określonych obszarów metabolicznych - pozwalając nie tylko na trafną diagnozę, ale także na monitorowanie efektu (nowych) terapii w bardzo krótkich punktach czasowych. Rzeczywiście, PET umożliwia ocenę odpowiedzi w porównaniu z brakiem odpowiedzi po 1-3 cyklach terapii i robi to lepiej i szybciej w porównaniu ze zmianami morfologicznymi obserwowanymi przez klasyczną tomografię komputerową (CT)⁷. Nieinwazyjny charakter PET umożliwia również badania podłużne.

Każdy model zwierzęcy wymaga maksymalnej standaryzacji w celu dokładnej oceny zdolności terapeutycznej nowych (radioaktywnych) farmaceutyków, więc należy położyć na to nacisk - zarówno w generowaniu modelu nowotworu, jak i w obrazowaniu/analizie danych PET dla małych zwierząt. Można by dyskutować o najlepszym modelu guza u zwierząt (inokulacja podskórna lub implantacja ortotopowa, nowotwory mysie, ludzkie lub syngeniczne, którym towarzyszy rutynowa opieka kliniczna lub nie), ale byłoby to poza celem tej publikacji. Do badań nad nowotworami wykorzystujemy kilka modeli, a ten opisany tutaj jest stosunkowo prostym modelem podskórnym.

Kontrola jakości w radiochemii jest najważniejsza dla bezpieczeństwa zwierząt i skuteczności leczenia. Ma to wpływ nie tylko na sam radiofarmaceutyk, ale także na postać produktu. Istnieje obszerne prawodawstwo dotyczące produkcji radiofarmaceutyków do zastosowań klinicznych^8,9 (zobacz ¹⁰ w celu uzyskania obszernego przeglądu obowiązujących przepisów i wytycznych) oraz kilka wytycznych dotyczących właściwości radiofarmaceutyków do badań przedklinicznych (zobacz ¹¹ w celu uzyskania obszernego przeglądu). Produkujemy radiofarmaceutyki zarówno do zastosowań klinicznych, jak i przedklinicznych, upraszczając przejście od wysokiej klasy kontroli jakości, jaką można znaleźć w syntezach do zastosowań klinicznych, na te do zastosowań przedklinicznych.

Nasze badania koncentrują się na teranostyce ukierunkowanej, szczególnie na nowotworach ludzkiego naskórkowego czynnika wzrostu 2 (HER2)-dodatnich. W związku z tym opracowujemy nowe radiofarmaceutyki do diagnozowania i monitorowania nowotworów w trakcie leczenia. Skuteczne radiofarmaceutyki diagnostyczne są również oceniane jako związki terapeutyczne wykorzystujące różne izotopy promieniowania. Ocena tych radiofarmaceutyków jest przeprowadzana początkowo na modelach zwierzęcych, dążąc do przełożenia klinicznego po obiecujących wynikach przedklinicznych. W tym artykule przedstawimy stosowane protokoły, na przykładzie jednego radiofarmaceutyku, w celu zapewnienia kontroli i zapewnienia jakości, a także standardową praktykę w zakresie wstrzykiwań dożylnych u myszy i skanowania PET/CT, w celu poprawy dokładności i wiarygodności badań przedklinicznych w obrazowaniu molekularnym. Protokół jest podzielony na trzy różne sekcje: radiochemia (synteza znaczników i kontrola jakości), generowanie modelu zwierzęcego (podskórny model guza) i obrazowanie.

Protokół

Protokół badawczy przestrzega najwyższych standardów dobrostanu zwierząt i jest ściśle zgodny z Wytycznymi Opieki nad Zwierzętami Szpitala Uniwersyteckiego RWTH Aachen. Dokładamy wszelkich starań, aby zapewnić etyczne i humanitarne traktowanie wszystkich zwierząt biorących udział w badaniach, a procedury są sprawdzane i zatwierdzane przez lokalną komisję etyczną ds. zwierząt. Wszystkie doświadczenia na zwierzętach zostały zatwierdzone przez właściwy organ niemiecki (Landesamt für Natur, Umwelt und Verbraucherschutz Nordrhein-Westfalen, LANUV) pod kątem zgodności z ustawą o ochronie zwierząt w połączeniu z rozporządzeniem o ochronie zwierząt wykorzystywanych do celów doświadczalnych i innych celów naukowych.

UWAGA: Pełna lista sprzętu, materiałów i odczynników używanych podczas tego badania znajduje się w Tabeli Materiałów. Ważne jest, aby pamiętać, że obchodzenie się z ⁶⁸Ga powinno odbywać się za pomocą pipety, gdy tylko jest to możliwe, a na pewno należy unikać metalu, ponieważ żelazko może znacznie zmniejszyć wydajność etykietowania. Oznacza to, że należy unikać igieł do czasu zakończenia procedur radiochemicznych

.

1. Radiochemia

1. Znakowanie radioaktywne NM-02-DOTA-GA za pomocą ⁶⁸Ga
   UWAGA: Protokół obejmuje obchodzenie się z materiałami radioaktywnymi i manipulowanie nimi. Naukowcy muszą przestrzegać lokalnych przepisów dotyczących obchodzenia się z materiałami radioaktywnymi, praktyk ALARA (tak niskich, jak to jest osiągalne), pracować z osłonami ołowianymi, minimalizować czas bezpośredniego kontaktu i utrzymywać maksymalną odległość na każdym etapie narażenia na promieniowanie. Procedury doświadczalne muszą być monitorowane za pomocą urządzeń do wykrywania promieniotwórczości.
   1. Eluuj ^{generator 68}Ge/⁶⁸Ga ręcznie lub automatycznie w 10 ml 0,6 M HCL (1,2 GBq/10 ml). Uwięzić ⁶⁸Ga na kartridżu PS-H⁺ (rozmiar M - 0,8 ml), przepuszczając eluat przez wkład. Stopniowo i powoli eluować wkład PS-H⁺ SPE o łącznej zawartości 1 ml 4 M NaCl do probówki mikrowirówkowej.
   2. Wyrzucić pierwsze 0,3 ml eluatu, a resztę 0,7 ml zebrać w innej probówce do mikrowirówki.
   3. Weź nową probówkę do mikrowirówki i przystąp do znakowania radioizotopowego NM-02-DOTA-GA zgodnie z protokołem producenta.
      UWAGA: Koniugat nanociało-chelator (NM-02-DOTA-GA) został wcześniej przygotowany zgodnie z protokołem dostawcy. Koniugat może być przechowywany w podwielokrotnościach w temperaturze -80 °C przez kilka miesięcy.
   4. Dostosuj pH produktu do około 7 za pomocą do 5 μl 3 M NH₄OAc.
2. Kontrola jakości
   1. Zmierzyć aktywność zagęszczonej próbki w probówce mikrowirówki za pomocą miernika aktywności przy odpowiednim ustawieniu (⁶⁸Ga jako izotop; 1 ml strzykawka, 0,1 ml dla geometrii). Wydajność radiochemiczna (skorygowana o rozpad) powinna wynosić co najmniej 40%.
   2. Określ pH za pomocą paska testowego pH (0-14), umieszczając wystarczającą ilość na pasku testowym pH (10-15 μl).
   3. Chromatografia cienkowarstwowa (TLC)
      1. Umieścić 1 μl mieszaniny reakcyjnej znakowanej radioizotopem na pasku TLC nasączonym krzemionką. Pozostaw porcję do wyschnięcia na około 1 minutę. Uruchom TLC przy użyciu kwasu cytrynowego jako fazy ruchomej, wstępnie napełnionej na około 2-3 mm, w zamkniętej komorze TLC. Wyjmij pasek TLC z komory, gdy płyn dotrze do górnej części paska.
      2. Umieść pasek TLC na skanerze radiowym TLC i zmierz go zgodnie z protokołem producenta. Produkt powinien pojawić się w miejscu początkowym (R_f < 0,2), podczas gdy wolne ⁶⁸Ga kationy będą wymywane z czołem rozpuszczalnika (R_f > 0,9).
      3. Obliczyć wydajność znakowania promieniotwórczego reakcji za pomocą radiochromatogramu, dzieląc obszar zintegrowany pod krzywą (AUC) od R_f 0,0-0,2 przez całkowitą AUC (R_f 0,0-1,0) i mnożąc przez 100.
   4. Wysokosprawna chromatografia cieczowa (HPLC)
      1. Upewnij się, że HPLC pracowała przez co najmniej 10 minut przy użyciu odpowiedniego rozpuszczalnika, aby wszystkie linie zostały zalane i dostosuj ustawienie pomiaru. Zastosować izokratyczny przepływ mieszaniny acetonitrylu (rozpuszczalnik A) i mieszaniny 0,9% roztworu NaCl (980 ml) w stosunku 50:50 w połączeniu z kwasem trifluoroctowym (1 ml) i roztworem cytrynianu (20 ml) jako rozpuszczalnikiem B. Zmierzyć absorbancję promieniowania UV przy 280 nm.
      2. Pobrać 5 μl produktu i rozcieńczyć go 15 μl 0,9% NaCl. Wstrzyknąć 15 μl mieszaniny do analitycznego radio-HPLC (kolumna 5 μm SEC-s2000 154 A; natężenie przepływu: 2 ml/min).
      3. Zastosować izokratyczny przepływ mieszaniny acetonitrylu (rozpuszczalnik A) i mieszaniny 0,9% roztworu NaCl (980 ml) w stosunku 50:50 w połączeniu z kwasem trifluoroctowym (1 ml) i roztworem cytrynianu (20 ml) jako rozpuszczalnikiem B. Zmierzyć absorbancję promieniowania UV przy 280 nm. Występuje niewielkie przesunięcie w czasach retencji między kanałami UV i gamma; wynika to z konstrukcji HPLC (sygnał gamma jest instalowany szeregowo za detektorem UV).
      4. Określić czystość radiochemiczną, całkując piki w kanale gamma. Produkt powinien znajdować się w zakresie integracji, który został wcześniej określony przez pomiar nieznakowanego radioaktywnie nanociała. Ponadto należy zintegrować wszystkie inne piki w kanale gamma i ocenić je jako zanieczyszczenia. Czystość powinna wynosić >95%.
   5. Endotoksyna
      1. Przygotować rozcieńczenie produktu w stosunku 1:20 o całkowitej objętości 150 μl, używając (certyfikowanej) wody wolnej od endotoksyn do rozcieńczenia.
      2. Włóż jednorazowy wkład z endotoksyną, który jest fabrycznie napełniony wszystkimi niezbędnymi odczynnikami, do czytnika testów na endotoksyny i załaduj 25 μl rozcieńczonego produktu do każdej komory wkładu.
      3. Naciśnij przycisk Odtwórz. PTS posiada wewnętrzne kontrole dodatnie i ujemne i zostanie uwzględniony w raporcie końcowym. Test trwa około 15 minut. Produkt uznaje się za wolny od endotoksyn, jeśli zawartość endotoksyny wynosi < 8,7 EU/ml przy V_max = 20 ml.
   6. Sterylność retrospektywna
      1. Po wstrzyknięciu i pobraniu wysokiej jakości próbki należy przechowywać radiofarmaceutyk w sterylnej fiolce w lodówce w temperaturze 4 °C.
      2. Przekaż próbkę do certyfikowanego instytutu w celu analizy sterylności (własnego lub zewnętrznego przedsiębiorstwa), jeśli limit zwolnienia wynoszący 10,⁵ Bq lub 10 Bq/g nie jest przekroczony, w celu przeprowadzenia testu sterylności zgodnie z¹².
3. Przygotowanie strzykawki (jedna na zwierzę)
   1. Zmierz aktywność produktu za pomocą miernika aktywności przy odpowiednim ustawieniu (⁶⁸Ga jako izotop; 1 ml strzykawka, 0,1 ml dla geometrii).
   2. Pobrać 15 MBq produktu (około 25 μl) do probówki mikrowirówkowej i napełnić objętość 0,9% NaCl do 75 μl.
   3. Dodać 50 μl do strzykawki i zmierzyć za pomocą miernika aktywności przy odpowiednim ustawieniu (⁶⁸Ga jako izotop; 1 ml strzykawka, 0,1 ml dla geometrii). Strzykawka powinna zawierać 10 MBq produktu.
      UWAGA: Gdy tylko uformuje się nanonik NM-02 z oznaczeniem ⁶⁸Ga, plastikowe końcówki do pipet nie są już potrzebne podczas obsługi ⁶⁸Ga. Od tego momentu, gdy w protokole jest mowa o obchodzeniu się z płynem, należy użyć odpowiedniej strzykawki (1 ml) i igły (27-30 g).

2. Generowanie modeli zwierzęcych

1. Pomieszczenia dla zwierząt
   1. Użyj samic myszy z niedoborem odporności Rj: ATHYM-Foxn1^{nu / nu} w wieku 6-8 tygodni (od komercyjnego dostawcy) do rozwoju guzów podskórnych. Po przyjeździe umieść wszystkie myszy bezpośrednio w pomieszczeniu dla zwierząt i daj im co najmniej 1 tydzień po transporcie na aklimatyzację.
   2. Trzymanie zwierząt w cyklu 12 godzin światła/12 godzin ciemności i zapewnienie swobodnego dostępu do jedzenia i wody. Utrzymuj temperaturę w pomieszczeniu i wilgotność względną odpowiednio w zakresie 20-25 °C i 45%-65%.
2. Przygotowanie komórek do implantacji
   1. Rozpocznij hodowlę komórkową od 1 x 10⁶ komórek SKOV-3 i dodaj 25 ml wstępnie podgrzanej pożywki DMEM/F12 wzbogaconej o 10% FBS i 1% penicyliny/streptomycyny w kolbie do hodowli komórkowej T175.
   2. Hodować komórki w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ i wymieniać całe podłoże co najmniej 2 razy w tygodniu.
   3. Po 1 tygodniu lub najpóźniej 1 dzień przed implantacją komórek należy pobrać 20 μl pożywki z kolby do hodowli komórkowej w celu zbadania na obecność mykoplazmy¹³. Do wstrzykiwania komórek należy używać wyłącznie komórek mykoplazmoujemnych.
   4. W dniu wstrzyknięcia komórek należy odessać całe podłoże i odpipetować 5 ml PBS do butelki. Zakręć butelką kilka razy w przód iw tył, aby zmyć pozostałe podłoże.
   5. Dodać 3 ml trypsyny do kolby i inkubować ją przez 4 minuty w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO_{2 w} celu dysocjacji komórek. Sprawdź pod mikroskopem z 40-krotnym powiększeniem, czy komórki odłączyły się od kolby do hodowli komórkowych.
   6. Dodać 7 ml pożywki, aby zneutralizować aktywność trypsyny i przenieść zawiesinę komórek do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml.
   7. Odwirować komórki przy 150 x g przez 5 minut (w temperaturze pokojowej), aby uzyskać osad komórkowy. Usunąć supernatant i dodać 1 ml pożywki w celu ponownego zawieszenia komórek.
   8. Pobrać 12 μl zawiesiny komórkowej do probówki mikrowirówkowej i dodać równą ilość błękitu trypanowego. Napełnić komorę hemocytometru 10 μl starannie wymieszanej zawiesiny komórek.
   9. Policz niebarwione, żywotne komórki w określonym obszarze i oblicz liczbę komórek. Dostosuj stężenie komórek do 5 x 10 7 komórek/ml pożywki i ostrożnie wymieszaj zawiesinę komórek z 1 ml macierzy błony podstawnej.
   10. Weź 5 x 10⁶ komórek w 0,2 ml pożywki komórkowej z 50% macierzą błony podstawnej w strzykawce insulinowej o pojemności 1 ml dla każdej myszy. Trzymać strzykawkę na lodzie do momentu wstrzyknięcia, aby zapobiec zestaleniu się macierzy błony podstawnej.
       UWAGA: Jeśli mysz waży mniej niż 20 g, wstrzyknij tylko 150 μl (dla 15-20 g) lub 100 μL (dla 10-15 g) mieszanki. W przypadku podawania podskórnego należy zwrócić uwagę, aby nie została przekroczona maksymalna objętość 10 ml/kg masy ciała zalecana przez GV-SOLAS¹⁴.
3. Szczepienie i działania następcze
   1. Zawiesinę komórkową wstrzyknąć podskórnie w bok obudzonego zwierzęcia, mocując jedną ręką szyję i ogon. Zazwyczaj preferujemy iniekcje w lewą flankę.
   2. Odczekaj 10-15 s, aż matryca błony podstawnej stwardnieje, a następnie wyjmij igłę.
   3. Monitoruj wzrost guza codziennie po implantacji za pomocą suwmiarki cyfrowej do pomiaru dwóch prostopadłych osi guza.
   4. Korzystając z tych pomiarów, oceń wzrost guza za pomocą objętości guza obliczonej według wzoru:
      V_T = L × B² × π / 6
      gdzie V_T to objętość guza w mm³, L to długość guza w mm (tj. większa z dwóch prostopadłych osi), a B to szerokość guza w mm (tj. mniejsza z dwóch prostopadłych osi¹⁵). Ta technika ma tendencję do przeszacowywania objętości guza, ponieważ obejmuje również skórę.
   5. Masa guza wpływa na wagę myszy mierzoną na wadze elektronicznej. Aby obliczyć masę zwierzęcia skorygowaną o masę guza, użyj następującego wzoru:
      m_mouse-T = m_mouse - 0,82 × V_T
      gdzie m_mouse-T to waga myszy z wyłączeniem masy guza w g, m_mysz to waga myszy zgodnie ze skalą elektroniczną w g, a V_T to obliczona objętość guza w mm³. Liczba 0,82 g/^mm3 wynika ze średniej wartości serii guzów wyizolowanych z poprzednich doświadczeń na zwierzętach, zważonych i określonych ich objętością za pomocą podanego wzoru. Reprezentuje średnią gęstość guza.
   6. Dodatkowo określ, jak duży jest guz w porównaniu z myszą i monitoruj obciążenie guzem za pomocą następującego wzoru:
      Obciążenie guzem [%] = (0,82 × V_T) / m_myszy × 100
      gdzie masa guza jest wyrażona w procentach, 0,82 × V_T odpowiada masie guza w g (tj. V_T, obliczona objętość guza w mm³, razy średnia gęstość guza), a m_mysz to waga myszy według skali w g.
   7. Gdy zwierzęta osiągną objętość guza większą niż 200 mm³, należy zaplanować je na nieinwazyjne PET/CT lub SPECT/CT, w zależności od eksperymentu.

3. Obrazowanie

1. Przygotowanie strzykawki (system na zamówienie)
   UWAGA: Ogon myszy jest mały; dlatego wymagane jest użycie kaniuli 27G lub mniejszej (większa liczba odpowiada mniejszym igłom). W przypadku samic myszy jedynymi dostępnymi żyłami do wstrzyknięć w bolusie są trzy żyły ogonowe. Anatomicznie żyła ogonowa grzbietowa jest bliżej kręgosłupa w porównaniu z dwiema żyłami bocznymi; Nie należy wstrzykiwać w tę żyłę, aby uniknąć jatrogennego drapania kości. Z doświadczenia wynika, że najlepsze efekty daje użycie kaniuli 30G, ponieważ można również uzyskać dostęp do mniejszych żył. Ponieważ cewniki 30G nie są dostępne w sprzedaży, ten typ musi być wykonany z należytą starannością przez badacza.
   1. Należy przygotować strzykawkę ze znacznikiem radioaktywnym w zależności od planowanej drogi podania. W przypadku wstrzyknięć dożylnych należy upewnić się, że na mysz o masie 25 g podawana jest maksymalna objętość 5 ml/kg masy ciała; Oznacza to maksymalną wstrzykiwaną objętość 125 μl.
   2. Aby przygotować cewnik 30G, najpierw użyj dowolnej igły 30G i usuń metalowy trzon igły, albo metalowymi nożyczkami, albo odginając go od plastiku.
   3. Ręcznie włóż rurkę PE10 o średnicy 0,3 mm do części wału, która została wyjęta z piasty. Należy uważać, aby nie przebić rury.
      UWAGA: Można również stosować inne rodzaje tworzyw sztucznych; jednak PE10 oferuje najlepszą równowagę między sztywnością ścian a elastycznością.
2. Wstrzyknięcie dożylne
   UWAGA: Wstrzyknięcia dożylne można również wykonywać u zwierząt obudzonych; Jednakże, jeśli nie jest to wymagane, zwierzętom należy wstrzyknąć w sedacji izofluranem w celu zmniejszenia obciążenia zwierzęcia prowadzącego badania.
   1. Napełnij cewnik 30G 0,9% buforem NaCl lub innym żądanym buforem.
   2. Umieść mysz w komorze indukcyjnej i stale napełniaj ją mieszaniną tlenu (lub sprężonego powietrza klasy medycznej) i gazowego izofluranu, aż zwierzę straci odruch prostowania. Do indukcji użyj 3,5%-5% izofluranu o przepływie tlenu lub powietrza 0,8 l/min.
   3. Natychmiast umieść uspokojoną mysz w początkowej pozycji brzusznej na macie grzewczej (37-38 °C), nadal utrzymując sedację izofluranem przez stożek nosowy. Często sprawdzaj myszy pod kątem oznak przegrzania (np. nadmiernego rozciągania, szybkiego oddechu, zaczerwienienia skóry). Do podtrzymania znieczulenia należy stosować 1,8%-2,5% izofluranu o przepływie tlenu lub powietrza 0,8 l/min.
   4. Nałóż maść okulistyczną na oczy zwierzęcia, aby zapobiec wysuszeniu podczas sedacji. Sprawdź obie boczne żyły ogonowe i wybierz najlepszą do wstrzyknięcia. Należy wziąć pod uwagę widoczność i średnicę żyły. Aby uzyskać najlepsze rezultaty, lekko obróć ogon tak, aby wybrana żyła zetknęła się z matą grzewczą i pozwól żyle rozszerzyć się na 1 minutę.
   5. Obróć całą mysz do pozycji bocznej tak, aby wybrana żyła skierowała się ku górze. Przymocuj końcówkę i podstawę ogona taśmą.
   6. Weź cewnik 30G ręką dominującą i delikatnie umieść palec wskazujący ręki niedominującej na wybranej żyle, aby utworzyć kopię zapasową krwi wewnątrz. W miejscu kopii zapasowej żyła rozszerzy się, tworząc mały garb.
   7. Ręką dominującą umieść cewnik 30G równolegle do ogona, skierowany w stronę garbu żyły. Przesuń rękę dominującą do przodu. W większości przypadków technika ta zapewnia bezpośrednie nakłucie żyły.
   8. Po wejściu do żyły refluks krwi staje się widoczny w plastikowej rurce. Zamocować plastikową rurkę, aby upewnić się, że igła nie będzie się przemieszczać wewnątrz żyły podczas wstrzykiwania. Na wolnym końcu probówki włożyć strzykawkę znacznikową podłączoną do igły 30G.
      UWAGA: W przypadku gdy konieczne jest oszacowanie dynamicznego rozkładu znacznika, po umieszczeniu zwierzęcia na łóżku skanera PET i zainicjowaniu PET należy wykonać następujące punkty.
   9. Powoli wstrzykiwać zawartość strzykawki znacznikowej przez co najmniej 10 sekund. Trzymając igłę 30G nadal podłączoną do systemu cewnika 30G, wyjmij tylko strzykawkę znacznikową i podłącz strzykawkę z 0,9% buforem NaCl (lub innym pożądanym buforem), aby przepłukać cewnik. Podczas procedury wstrzykiwania należy stale monitorować oddech i dostosować stężenie izofluranu tak, aby utrzymywało się na poziomie około 1 oddechu na sekundę.
   10. Usuń cewnik 30G z żyły ogonowej i użyj sterylnego bawełnianego kompresu, aby zatrzymać krwawienie.
   11. Aby zmierzyć pozostałą aktywność, zmierz cewnik 30G, strzykawkę z buforem, pustą strzykawkę znacznikową i bawełniany kompres, ponieważ wszystkie z nich zawierają niewielkie ilości znacznika, który nie dotarł do zwierzęcia.
3. Akwizycja PET/CT
   UWAGA: W przypadku nanokieli NM-02 znakowanej ⁶⁸Ga wszystkie zwierzęta są obrazowane za pomocą systemu PET / CT dla małych zwierząt.
   1. Akwizycja PET
      1. Umieść uspokojoną mysz w pozycji brzusznej na łóżku dla zwierząt i przymocuj ją do skanera PET. Przełącz przepływ izofluranu na stożek nosowy w PET i utrzymuj go na poziomie 1,5%-2,5% izofluranu w powietrzu medycznym na poziomie 0,8 l/min, tak aby częstość oddechów zwierzęcia podczas skanowania wynosiła od 75 do 50 oddechów na minutę.
      2. Przymocuj mysz za szyją do legowiska dla zwierząt za pomocą taśmy medycznej. W razie potrzeby ponownie nałóż maść okulistyczną na oczy myszy, aby zapobiec wysuszeniu podczas sedacji.
      3. Włącz poduszkę grzewczą w legowisku dla zwierząt na około 80% mocy, co odpowiada około 30 °C.
      4. Ustaw czas akwizycji na 45 minut i wybierz obszar zainteresowania, który będzie skanowany. Wybierz ⁶⁸Ga jako izotop badania i rozpocznij skanowanie. Wprowadzić ilość wstrzykniętej aktywności, czas wstrzyknięcia i czas pomiaru pustej strzykawki. Jedna pozycja łóżka PET wynosi 160 mm, co jest wystarczająco długie, aby można było wykonać skan całego ciała za pomocą myszy.
      5. Gdy konieczna jest ocena dynamicznego rozkładu znacznika, najpierw rozpocznij skanowanie PET, poczekaj 30 sekund na akwizycję, a dopiero potem przejdź do kroków 3.2.9-3.2.10. Pozostawić cewnik w myszy z dołączoną strzykawką z buforem, aby uniknąć dalszej utraty krwi. Cewnik może zostać odłączony na końcu PET, przed akwizycją TK, aby uniknąć artefaktów.
   2. Akwizycja tomografii komputerowej
      1. Odłącz legowisko zwierzęcia od skanera PET i natychmiast podłącz je do tomografu komputerowego. W razie potrzeby należy również odłączyć kaniulę od żyły ogonowej. Po co najmniej 30 minutach od wkłucia żyły miejsce wstrzyknięcia jest już skrzepnięte, więc nie wystąpi już krwawienie.
      2. Przełączyć przepływ izofluranu na stożek nosowy w tomografie komputerowym.
      3. Wybierz ten sam obszar zainteresowania, który ma zostać zeskanowany w celu obrazowania PET. Wybierz standardowy protokół akwizycji: 440 μA, 50 kVp, czas naświetlania 32 ms i obrót o 1080° w trybie spiralnym z 960 ekspozycjami/360°; czas trwania tomografii komputerowej wynosi około 7 minut w przypadku skanu całego ciała myszy.
      4. Kontroluj częstość oddechów i włącz poduszkę grzewczą w legowisku dla zwierząt. Monitoruj oddech w sposób ciągły podczas skanowania i dostosuj stężenie izofluranu, aby utrzymać częstość oddechów między 75 a 50 oddechów na minutę.

4. Opieka nad zwierzętami po obrazowaniu

1. Pod koniec skanów zwierzę potrzebuje co najmniej 15 minut, aby się obudzić. Aby uniknąć agresji ze strony rodzeństwa, należy trzymać zwierzę w klatce samodzielnie przez około 15 minut lub do momentu, gdy będzie w stanie samodzielnie chodzić, aż do umieszczenia go z powrotem w pierwotnej klatce. W tym czasie używaj światła podczerwonego, aby uniknąć hipotermii.
2. Początkowo ułóż zwierzę na lewym boku (pozycja bezpieczna), aby uniknąć wstrząsu hemodynamicznego. Niech maść okulistyczna pozostanie, ponieważ zostanie usunięta przez samo zwierzę, gdy się obudzi.

5. Rekonstrukcja PET/CT

1. Wykonaj rekonstrukcję PET przy użyciu trójwymiarowej maksymalizacji oczekiwań uporządkowanego podzbioru (tj. OSEM-3D z 30 iteracjami) z oknem energetycznym ± 15% od szczytu 511 keV do izometrycznej wielkości woksela 0,4 mm w matrycy 192 × 192 × 384. Zastosuj poprawki oparte na tomografii komputerowej (tj. korekcję tłumienia, korekcję rozproszenia, czas martwy i zdarzenia losowe) do rekonstrukcji PET.
2. W przypadku, gdy konieczne jest oszacowanie dynamicznego rozkładu znacznika, należy zastosować rekonstrukcję wieloklatkową. Na przykład do skanowania 45-minutowego można użyć następujących klatek: 4 x 30 s, 3 x 1 min, 5 x 2 min, 2 x 5 min i 2 x 10 min.
3. Rekonstrukcja standardowych protokołów akwizycji CT przy użyciu procesu rekonstrukcji algorytmu rekonstrukcji iteracyjnej (tj. ISRA) do izometrycznego rozmiaru woksela 0,2 mm w matrycy 200 × 200 × 425. Korzystając z oprogramowania dostawcy, przelicz wartości CT na jednostki Hounsfielda (HU) za pomocą wzoru:
   
   gdzie_{μ W} jest liniowym współczynnikiem tłumienia wody, μ_a jest liniowym współczynnikiem tłumienia powietrza, a μ_T jest liniowym współczynnikiem tłumienia tkanki.
4. Obrazy PET i CT zostały automatycznie wyrównane po rekonstrukcji za pomocą matrycy wygenerowanej z fantomowego skanu kapilarnego. Zarchiwizuj wszystkie zrekonstruowane dane, a także przenieś je na serwer bazy danych za pomocą oprogramowania do analizy obrazu, jeśli to konieczne.

6. Przetwarzanie i analiza obrazu

UWAGA: Współzarejestrowane obrazy PET/CT są dalej wykorzystywane do kwantyfikacji na serwerze bazy danych oprogramowania do analizy obrazu, gdzie każdy skan hybrydowy jest zapisywany jako temat.

1. Zidentyfikuj guz na podstawie tomografii komputerowej i wybierz go jako obszar zainteresowania. Ręcznie zamaskuj podstawę guza na CT.
2. Aby uzyskać segmentację niezależną od użytkownika, należy określić próg nowo utworzonej maski nowotworowej na PET lub SPECT. W przypadku PET należy stosować minimalny próg 1,0 znormalizowanej wartości absorpcji (SUV). W przypadku SPECT należy zastosować minimalny próg wyższy niż średni pobór z puli krwi mierzony w sercu lub końcowej aorcie brzusznej.
3. Należy zapisać średnią, maksimum, średnią z 10 najgorętszych wokseli (tj. średnią gorącą 10) oraz całkowite wykorzystanie nowo wygenerowanych woluminów będących przedmiotem zainteresowania.
Wartości te służą
4. do generowania wartości SUV i TBR (target-to-background), które będą dalej wykorzystywane do analizy statystycznej.

Wyniki

Jednym z najważniejszych aspektów kontroli jakości radiofarmaceutyku jest HPLC, ponieważ pokazuje to nie tylko czystość chemiczną i radiochemiczną (98,2% w tym przypadku), ale także pozwala udowodnić tożsamość radiofarmaceutyku poprzez porównanie czasu elucji i kształtu piku z nieradioaktywnym związkiem odniesienia. Ten związek referencyjny jest w tym przypadku nieznakowanym nanociałem, którego klasyczne techniki, takie jak spektrometria mas lub magnetyczny rezonans jądrowy, okazały się właściwym związkiem. Techniki te nie mogą być stosowane bezpośrednio do związku promieniotwórczego (nie ma wystarczającej masy, aby wygenerować sygnał), ale porównując związek radioaktywny z jego odniesieniem, uzyskuje się wystarczające dowody na to, że właściwy związek został rzeczywiście znakowany i nie został zmieniony podczas syntezy. Zwróć uwagę na niewielką różnicę w czasie retencji między produktem radioaktywnym a odniesieniem w Rysunek 1, odpowiadający szeregowemu pomiarowi przepływu HPLC (najpierw mierzy się UV; przepływ potrzebuje około 0,2 minuty, aby dotrzeć do detektora radioaktywności w typowej konfiguracji).

Rysunek 1: Typowy analityczny chromatogram HPLC do kontroli jakości nanonika znakowanego ⁶⁸Ga NM-02 (GLNM-02). Absorpcja promieniowania UV zimnego związku (tj. górnego panelu) jest mierzona przy 280 nm i wykazuje szczyt po 4,18 minuty, z przesunięciem o 0,22 minuty. Szczyt produktu znakowanego ⁶⁸Ga można zobaczyć w detektorze gamma (tj. w dolnym panelu). Wydajność radiochemiczna wynosi 98,2%. mAU = mili jednostki absorbancji, NM-02 = nasz produkt, UV = kanał światła ultrafioletowego, nm = nanometr, min = minuta, CPS = liczba na sekundę, GLMN-02 = ⁶⁸Nanobody znakowany Ga NM-02, ⁶⁸Ga-DOTA-GA = [⁶⁸Ga]Ga-DOTA-GA, γ ChA = kanał gamma. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

W przypadku braku HPLC lub w jego uzupełnieniu, TLC może być użyte do określenia wydajności etykietowania i czystości produktu końcowego (ale nie tożsamości, i nie tak szczegółowej jak HPLC). Ze względu na niską złożoność, TLC jest idealny, gdy szlak radiosyntezy jest nadal optymalizowany. Rysunek 2 przedstawia chromatogram TLC ^nanonikaNM-02 znakowanego 68 Ga (pozorna czystość radiochemiczna 99,9%).

Rysunek 2: Typowy chromatogram analityczny TLC do kontroli jakości nanonika znakowanego ⁶⁸Ga NM-02 (GLNM-02). Liczbę powierzchni wykreśla się w stosunku do odległości przebytej przez rozpuszczalnik (cytrynian) na płytce TLC. R_f wynosi 0,2, a czystość radiochemiczna 99,9%. C = zliczenia, mm = milimetr, GLNM-02 = ⁶⁸Nanobody znakowany Ga NM-02, TLC = chromatografia cienkowarstwowa. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

W procesie przygotowywania danych obrazowych do publikacji, standardową praktyką jest pokazanie przynajmniej jednego samodzielnego obrazu CT i PET. Takie podejście umożliwia kompleksową ocenę biodystrybucji znaczników. Standardowe skalowanie CT wynosi od -1000 HU do 1000 HU, co pozwala na wizualizację wszystkich tkanek miękkich w jednym oknie. Jak pokazano w Rysunek 3A, metoda ta umożliwia wyraźne rozgraniczenie nerek myszy, jednocześnie umożliwiając ocenę kości.

Dla skali PET ustaw dolny próg na poziomie SUV 0,0, zachowując minimalny górny próg 1,0 (Rysunek 3B), najlepiej używając normalizacji masy ciała podczas obliczania SUV (np._{SUV bw}). Dodatkowo, do oceny ilościowej, SUVmean jest preferowany w porównaniu z SUVmax; jeśli używany jest SUVmax, użyj średniej z 10 najgorętszych wokseli zamiast wartości najgorętszego pojedynczego woksela w obliczeniach_BW SUV. Przygotuj fuzje cech obrazów PET/CT, łącząc warstwy CT i PET (Rysunek 3C).

Aby umożliwić czytelnikom niezależną ocenę biodystrybucji znacznika całego ciała, projekcja maksymalnej intensywności tego samego skanu PET może być przedstawiona przy użyciu tej samej skali co wycinek PET (Rysunek 3D).

Rysunek 3: Obrazy in vivo PET/CT podskórnej myszy z guzem SKOV-3. Obraz uzyskano 3 godziny po dożylnym wstrzyknięciu 5 MBq ⁶⁸Ga znakowanego nanobody NM-02 (GLNM-02). (A) Obraz CT jest skalowany w zakresie od -1000 HU do 1000 HU, podczas gdy (B) obraz PET mieści się w zakresie od SUV od 0,0 do 5,0. (C) Fuzja PET/CT wykorzystuje tę samą skalę. (D) Obraz PET z projekcją maksymalnej intensywności (MIP) jest również skalowany przy użyciu SUV 0,0 i 5,0. Wszystkie obrazy PET wykazują dobry wychwyt guza GLNM-02, a klirens nerkowy jest wyraźnie widoczny. CT = tomografia komputerowa, PET = pozytonowa tomografia emisyjna, MIP = projekcja maksymalnej intensywności, HU = jednostka Hounsfielda, SUV = znormalizowana wartość wychwytu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

W konkretnym przypadku nanobody NM-02 znakowanego ⁶⁸Ga, zauważalny wychwyt guza można zaobserwować na lewym boku myszy. Dodatkowo widoczny jest również klirens nerkowy znacznika. Prezentując projekcję maksymalnej intensywności PET, widoczna staje się również aktywność pęcherza moczowego, co wzmacnia klirens nerkowy znacznika. W tym konkretnym przypadku warto wspomnieć, że nerka, guz i pęcherz moczowy nie mogą być pokazane w tym samym wycinku 2D. Dzięki uwzględnieniu projekcji maksymalnej intensywności w publikacjach, cała biodystrybucja znacznika jest przedstawiona na tym samym obrazie.

Dyskusja

Radiosynteza
Opisana tutaj radiosynteza jest typowa dla nowego związku znakowanego ⁶⁸Ga - krótki czas syntezy, z naciskiem na odpowiednie pH i unikanie metali, gdy tylko jest to możliwe. W tym celu ważne jest, aby ściśle przestrzegać kolejności dodawania składników. W każdym przypadku wartość pH roztworu ⁶⁸Ga musi być najpierw dostosowana do pH 4 przy 3 M NH₄OAc; w przeciwnym razie nanocząsteczka może ulec degradacji, jeśli pH jest zbyt kwaśne. Ogólne koncepcje syntezy ⁶⁸Ga zostały opisane wcześniej¹⁶, więc nie będziemy tutaj wchodzić w szczegóły. Moduł automatycznej syntezy wymaga dalszej optymalizacji pod kątem redukcji dawki promieniowania. Wymaga to znacznego wysiłku, który wykracza poza zakres badań eksploracyjnych w typowym eksperymencie przedklinicznym, jak opisano tutaj. Co więcej, jest mało prawdopodobne, aby zautomatyzowana synteza dała tak małe objętości, jakie możemy wyprodukować obecną metodą (< 1 ml), co pozwala na uzyskanie wyższych stężeń ⁶⁸Ga i wyższej aktywności właściwej.

Kontrola jakości powinna być nadal przeprowadzana i rejestrowana w bardzo szczegółowy sposób. Jedynym wyjątkiem od tej zasady jest pH: podczas gdy pomiary pH do syntez klinicznych są często wykonywane bardzo dokładnie przy użyciu pH-metrów, w tym przypadku wystarczy zmierzyć pH za pomocą prostego paska pH, ponieważ pozwalają na to wymagania dotyczące wstrzyknięć dożylnych (dopuszczalne jest dowolne pH między 6 a 8¹⁴). Ta prosta technika zmniejsza koszty i ryzyko skażenia sprzętu materiałem radioaktywnym.

Preparaty dla modeli zwierzęcych
Ostateczna formuła znacznika jest kluczowym aspektem znacznika, aspektem, który często jest słabo opisywany w badaniach przedklinicznych. Chociaż istnieją jasne przepisy dotyczące formułowania farmaceutyków do badań klinicznych na ludziach, w tym radiofarmaceutyków, istnieją jedynie wytyczne^17,18, które nie omawiają konkretnie rozpuszczalników ani postaci użytkowych. Wytyczne te są często wykorzystywane przy sporządzaniu lub ocenie wymaganych prawem protokołów do zatwierdzenia przez komisje etyczne (dotyczące zwierząt) (w Niemczech: LANUV¹⁹), ale dokumenty te niewystarczająco podkreślają znaczenie formuły. Jest prawdopodobne, że złe formuły mogą prowadzić do fałszywych (negatywnych) wyników, ale takie twierdzenie jest trudne do zweryfikowania, biorąc pod uwagę utrzymującą się stronniczość publikacji, która nadal istnieje, również w dziedzinie onkologii²⁰.

Oprócz wytycznych ARRIVE zdecydowaliśmy się w jak największym stopniu przestrzegać przepisów przeznaczonych do stosowania u ludzi, zakładając, że preparaty odpowiednie dla ludzi są zasadniczo odpowiednie również dla gryzoni. Główną różnicą jest wielkość przedmiotu, a co za tym idzie, ilość objętości, którą można bezpiecznie wstrzyknąć. W tym celu zdecydowaliśmy się na oczyszczanie związku, gdy tylko jest to możliwe, za pomocą filtrów odcięcia masy cząsteczkowej (MWCO), ponieważ udowodniono, że są one skuteczne w oczyszczaniu dużych związków²¹. Pozwalają one na ostateczne rozpuszczenie typowego znacznika znakowanego 68Ga w wybranym roztworze i w małej objętości odpowiedniej dla myszy (typowe maksymalne wstrzyknięcie dożylne 100 - 150 μL).

W Niemczech GV-SOLAS (Gesellschaft für Versuchstierkunde, pol. Stowarzyszenie na rzecz zwierząt laboratoryjnych) służy jako pośrednik między ochroną zwierząt a badaniami, przynosząc korzyści zarówno ludziom, jak i zwierzętom. W związku z tym stowarzyszenie to opracowało zalecenia dotyczące wielu aspektów badań na zwierzętach, zwłaszcza w dziedzinie onkologii i anestezjologii, w celu standaryzacji opieki nad zwierzętami na poziomie krajowym¹⁴. Od tego czasu większość kompetentnych organów i krajowych komitetów etycznych egzekwuje przestrzeganie tych zaleceń zgodnie z protokołami dotyczącymi zwierząt. GV-SOLAS zawiera zalecenia dotyczące maksymalnych objętości większości ścieżek aplikacji. W przypadku wstrzyknięcia dożylnego zaleca się maksymalnie 5 ml/kg masy ciała; w przypadku myszy o wadze 25 g odpowiada to 150 μl. Z tego powodu wszystkie produkcje znaczników promieniotwórczych są ustawione na maksymalną objętość wstrzyknięć wynoszącą 150 μl na zwierzę. Przekroczenie tego progu podczas wstrzykiwania dożylnego zwiększa ryzyko ostrej niewydolności serca spowodowanej hiperwolemią. Wielokrotne wstrzyknięcia dożylne przekraczające ten próg prowadzą do zwiększonego ryzyka zwłóknienia płuc, ponieważ każde wstrzyknięcie, w zależności od prędkości przepływu, powoduje niewielki obrzęk płuc. Ludzkim odpowiednikiem mysiego dożylnego dożylnego przedstawionego w tej pracy byłoby wstrzyknięcie dożylnie w bolusie (w ciągu 10 s) całkowitej objętości 375 ml dla człowieka o wadze 75 kg. W standardowej opiece klinicznej podaje się 500 ml 0,9% roztworu NaCl w ciągu 1 godziny; Oznacza to, że 375 ml należy podać w ciągu 45 minut, aby uniknąć powikłań.

GV-SOLAS zaleca, aby obciążenie guzem nie przekraczało 5%; W przypadku, gdy zwierzę jest w trakcie leczenia, obciążenie może zostać zwiększone do 10%²². Ta różnica między grupami leczonymi i nieleczonymi może potencjalnie powodować błąd systematyczny w badaniach, szczególnie w przypadku przeżycia, ponieważ leczone myszy nowotworowe mogą osiągnąć wyższe obciążenie guzem niż grupa kontrolna otrzymująca aferent. Aby uniknąć takich przypadków, należy również ustalić 5% obciążenie guzem dla zwierząt leczonych; Może to jednak prowadzić do dylematów etycznych związanych z zabijaniem zwierząt badawczych przed osiągnięciem tzw. humanitarnego punktu końcowego lub (najlepiej) argumentować, że wzrost do 10% w przypadku aferentnych grup kontrolnych jest etycznie uzasadniony w celu uniknięcia stronniczości.

Ponieważ masa guza musi być obliczana codziennie w sposób nieinwazyjny, stosujemy współczynnik korekcyjny (tj. 0,82), aby przeliczyć codziennie obliczaną objętość guza na masę guza. Obliczyliśmy ten czynnik, mierząc średnicę guza za pomocą suwmiarki cyfrowej przed zabiciem zwierząt zgodnie z protokołem, a następnie rzeczywistą masę guza za pomocą wagi. Ten współczynnik korekcyjny różni się od gęstości tkanki nowotworowej, ponieważ zmierzona objętość guza obejmuje również skórę. Dlatego czynnik ten wynosi prawdopodobnie < 1,0, ponieważ zmierzona objętość guza jest większa niż rzeczywista objętość guza. Ponieważ guzy, które zważyliśmy, były stosunkowo duże, ponieważ ocena została przeprowadzona w ostatnim dniu eksperymentu, czynnik ten rzeczywiście zawyża wagę małych guzów. Powinien być stosowany wyłącznie w ocenie obciążenia guza.

Innym aspektem zaleceń GV-SOLAS jest to, że dla myszy stała średnica guza wynosząca 15 mm jest ustalana jako humanitarny punkt końcowy¹⁷. Często guz ma tendencję do szybkiego wzrostu wzdłuż kanału igły wykonanego przez wstrzyknięcie podskórne, jeśli po roztworze zawierającym komórki nowotworowe nie zostanie wstrzyknięte powietrze ani czopek. W związku z tym 15 mm są osiągane szybciej przy niektórych drogach aplikacji. Ponieważ, biorąc pod uwagę doświadczenie, niektóre guzy rosną w kształcie elipty, dostosowaliśmy i wykorzystaliśmy wyżej wspomnianą formułę objętości guza, aby dokonać bezstronnych porównań między różnymi drogami aplikacji.

Używane przez nas modele zwierzęce są projektowane zgodnie z wytycznymi ARRIVE¹⁷ i PREPARE¹⁸ , co pozwala na łatwą reprodukcję eksperymentalną. Model podlega pewnym zmianom, ponieważ tempo wzrostu guza różni się u różnych myszy, co utrudnia standaryzację i interpretację. Jednak różnice te odzwierciedlają heterogeniczność wewnątrz- i międzyguzową występującą u pacjentów z rakiem²³.

Protokół ten nie jest pozbawiony ograniczeń. Zwierzęta muszą być uspokojone podczas wstrzyknięcia, zwłaszcza podczas badania PET/CT. Sedacja, szczególnie izofluranem, wpływa na przepływ krwi, a zwierzęta mogą stać się hipotermiczne, co wymaga użycia maty grzewczej i monitorowania głębokości sedacji. Tego problemu można uniknąć, skanując obudzone zwierzęta; Wymaga to jednak specjalistycznego oprogramowania i wiedzy specjalistycznej, które często nie są dostępne.

Kolejnym ograniczeniem jest dawka promieniowania. Chociaż dawka otrzymana przez zwierzęta jest znikoma dla pojedynczego skanowania, wykonanie wielu skanów (tj. zwłaszcza jeśli jest ich więcej niż 10) może skutkować znaczną dawką skumulowaną, potencjalnie wpływając na wzrost guza. Gdy wzrost guza jest parametrem odczytu, ważne jest, aby wszystkie zwierzęta otrzymały taką samą liczbę skanów i dawek, aby zapewnić porównywalne grupy, co zwiększa obciążenie całego projektu. Stosowanie systemu PET/MRI zamiast systemu PET/CT może zmniejszyć narażenie na promieniowanie. Takie podejście wiąże się jednak z dłuższym czasem skanowania, dodatkowymi kosztami i inną metodą pozyskiwania informacji anatomicznych.

Stosując się do zaleceń organizacji zajmujących się dobrostanem, takich jak GV-SOLAS w Niemczech, i postępując zgodnie z ustalonymi wytycznymi, takimi jak ARRIVE i PREPARE, dążymy do standaryzacji modeli zwierzęcych i minimalizacji zmienności w protokołach eksperymentalnych. Wysiłki te mają zasadnicze znaczenie dla zapewnienia wiarygodności i odtwarzalności badań przedklinicznych, co ostatecznie ułatwi translację obiecujących radiofarmaceutyków z laboratorium do łóżka pacjenta.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Equipment
Miernik aktywności ISOMED 2010	Nuviatech Healthcare	-
Wirówka MIKRO 185	Andreas Hettich GmbH & Co. KG	1203
Badanie endotoksyn Endosafe nexgen-PTS	Charles	River-Blok
grzewczy NANOCOLOR VARIO C2	Macherey-Nagel	919350
System HPLC, w tym detektor radiowy	Knauer & Oprogramowanie do	Raytest-Pmod
4.4	PMOD Technologies LLC	-
System PET/CT dla małych zwierząt β-CUBE i X-CUBE	Molecubes NV-TLC
MiniGITA*	Elysia-Raytest	-
Materiały
Średnica 0,3 mm Rurka PE10	fisher scientific	22-204008
Igła 30G	B|Braun	4656300
Filtr odśrodkowy; 10 kDa MWCO, 0,5 ml	miliporów	UFC501008
Pasek bibuły chromatograficznej iTLC-SG	Agilent Technologies	SGI0001
Endotoxin Cartridge, czułość 0,05 EU/ml	Charles River	PTS-2005
Kolumna HPLC Biosep SEC-s2000	Phenomenex
(1,5 ml)	Eppendorf	0030125150
pasek pH 0,0 - 6,0	Merck KGaA	109531
pasek pH 0-14	Merck KGaA	109535
PS-H+ wkład SPE	Macherey Nagel GmbH &; Co. KG	731861
Sterylna fiolka 10 ml	ALK Life Science Solutions	SEV100
odczynniki
68Ge/68Ga-Generator	NRF-iThembaLABS-Amonamacetate
	Merck KGaA	101116
Kwas cytrynowy	Merck KGaA
Kwas solny	Merck KGaA	320331
NaCl	Merck KGaA	S9888
Nanobody NM-02	Radiopharm Theranostics-P-SCN-Bz-DOTA-GA
	CheMatech	C115
Kwas trifluorooctowy	Merck KGaA	T6508
Woda ultraczysta	Merck KGaA