Artykuł metodologiczny

Radiosynteza, kontrola jakości i obrazowanie pozytonowej tomografii emisyjnej małych zwierząt 68nanocząsteczek znakowanych Ga

1.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/67048

⸱

4 października 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Nuclear Medicine, University Hospital RWTH Aachen, 2Department of Radiology and Nuclear Medicine, Maastricht University Medical Center, 3School of Nutrition and Translational Research in Metabolism (NUTRIM), Maastricht University, 4School for Cardiovascular Diseases (CARIM), Maastricht University

W tym artykule

Podsumowanie

Ten artykuł opisuje radiosyntezę, formułowanie, kontrolę jakości nowej sondy znakowanej radioaktywnie (tj. nanoniki NM-02 znakowanej 68Ga) oraz jej zastosowanie do obrazowania PET/CT małych zwierząt w modelu ksenoprzeszczepu.

Streszczenie

Techniki obrazowania pozytonowej tomografii emisyjnej (PET) i tomografii komputerowej emisji pojedynczych fotonów (SPECT) są kluczowe w przedklinicznych badaniach nad rakiem, wymagając skrupulatnej uwagi przy syntezie radioznaczników, zapewnieniu jakości i protokołach iniekcji in vivo. Badanie to przedstawia kompleksowy przebieg pracy dostosowany do zwiększenia odporności i odtwarzalności eksperymentów PET na małych zwierzętach. Proces syntezy w laboratorium radiochemicznym przy użyciu 68Ga jest szczegółowy, z naciskiem na rygorystyczne protokoły kontroli jakości i zapewnienia dla każdej produkcji radioznacznika. Parametry takie jak stężenie, aktywność molowa, pH i czystość są rygorystycznie monitorowane, zgodnie ze standardami mającymi zastosowanie w badaniach na ludziach. Metodologia ta wprowadza usprawnione przygotowanie strzykawki i specjalnie zaprojektowaną kaniulę 30G do precyzyjnych wstrzyknięć dożylnych myszom. Monitorowanie stanu zdrowia zwierząt podczas skanowania, w tym temperatury i tętna, zapewnia ich dobre samopoczucie przez cały czas trwania zabiegu. Dawki dla skanów PET i SPECT są z góry określone, aby zrównoważyć pozyskiwanie danych z minimalizacją narażenia na promieniowanie zwierząt i badaczy. Podobnie, tomografia komputerowa wykorzystuje wstępnie zaprogramowane ustawienia w celu ograniczenia narażenia na promieniowanie, co jest szczególnie istotne w długoterminowych badaniach oceniających efekty leczenia. Optymalizując te etapy, przepływ pracy ma na celu standaryzację procedur, zmniejszenie zmienności i poprawę jakości obrazowania PET/SPECT/CT małych zwierząt. Zasób ten dostarcza cennych informacji dla badaczy dążących do poprawy dokładności i wiarygodności badań przedklinicznych w obrazowaniu molekularnym, co ostatecznie przyczyni się do postępu w tej dziedzinie.

Wprowadzenie

Jednym z tematów, który ma ogromne znaczenie, są badania w dziedzinie raka piersi. Rak piersi pozostaje często występującym nowotworem, stanowiąc około 1/3 wszystkich nowotworów u kobiet. Leczenie jest dostosowane do biologicznej i histologicznej charakterystyki guza oraz do stadium choroby. Szansa na przeżycie jest na ogół duża, chyba że guz ma już przerzuty, w którym to przypadku 5-letnie przeżycie wynosi tylko około 30%1. Podobny los spotyka inne nowotwory ginekologiczne, na przykład rak jajnika wykazuje > 95% 5-letniego przeżycia w przypadku guzów w stadium 1, ale tylko 15% w przypadku guzów w stadium 4 z przerzutami2,3.

Nieinwazyjne obrazowanie, w szczególności pozytonowa tomografia emisyjna (PET), przekształca badania nad rakiem, oferując niezrównany wgląd w aspekty molekularne guza, takie jak metabolizm, ekspresja receptorów i odpowiedź terapeutyczna4,5,6. Pozwala zarówno na wizualizację, jak i kwantyfikację określonych obszarów metabolicznych - pozwalając nie tylko na trafną diagnozę, ale także na monitorowanie efektu (nowych) terapii w bardzo krótkich punktach czasowych. Rzeczywiście, PET umożliwia ocenę odpowiedzi w porównaniu z brakiem odpowiedzi po 1-3 cyklach terapii i robi to lepiej i szybciej w porównaniu ze zmianami morfologicznymi obserwowanymi przez klasyczną tomografię komputerową (CT)7. Nieinwazyjny charakter PET umożliwia również badania podłużne.

Każdy model zwierzęcy wymaga maksymalnej standaryzacji w celu dokładnej oceny zdolności terapeutycznej nowych (radioaktywnych) farmaceutyków, więc należy położyć na to nacisk - zarówno w generowaniu modelu nowotworu, jak i w obrazowaniu/analizie danych PET dla małych zwierząt. Można by dyskutować o najlepszym modelu guza u zwierząt (inokulacja podskórna lub implantacja ortotopowa, nowotwory mysie, ludzkie lub syngeniczne, którym towarzyszy rutynowa opieka kliniczna lub nie), ale byłoby to poza celem tej publikacji. Do badań nad nowotworami wykorzystujemy kilka modeli, a ten opisany tutaj jest stosunkowo prostym modelem podskórnym.

Kontrola jakości w radiochemii jest najważniejsza dla bezpieczeństwa zwierząt i skuteczności leczenia. Ma to wpływ nie tylko na sam radiofarmaceutyk, ale także na postać produktu. Istnieje obszerne prawodawstwo dotyczące produkcji radiofarmaceutyków do zastosowań klinicznych8,9 (zobacz 10 w celu uzyskania obszernego przeglądu obowiązujących przepisów i wytycznych) oraz kilka wytycznych dotyczących właściwości radiofarmaceutyków do badań przedklinicznych (zobacz 11 w celu uzyskania obszernego przeglądu). Produkujemy radiofarmaceutyki zarówno do zastosowań klinicznych, jak i przedklinicznych, upraszczając przejście od wysokiej klasy kontroli jakości, jaką można znaleźć w syntezach do zastosowań klinicznych, na te do zastosowań przedklinicznych.

Nasze badania koncentrują się na teranostyce ukierunkowanej, szczególnie na nowotworach ludzkiego naskórkowego czynnika wzrostu 2 (HER2)-dodatnich. W związku z tym opracowujemy nowe radiofarmaceutyki do diagnozowania i monitorowania nowotworów w trakcie leczenia. Skuteczne radiofarmaceutyki diagnostyczne są również oceniane jako związki terapeutyczne wykorzystujące różne izotopy promieniowania. Ocena tych radiofarmaceutyków jest przeprowadzana początkowo na modelach zwierzęcych, dążąc do przełożenia klinicznego po obiecujących wynikach przedklinicznych. W tym artykule przedstawimy stosowane protokoły, na przykładzie jednego radiofarmaceutyku, w celu zapewnienia kontroli i zapewnienia jakości, a także standardową praktykę w zakresie wstrzykiwań dożylnych u myszy i skanowania PET/CT, w celu poprawy dokładności i wiarygodności badań przedklinicznych w obrazowaniu molekularnym. Protokół jest podzielony na trzy różne sekcje: radiochemia (synteza znaczników i kontrola jakości), generowanie modelu zwierzęcego (podskórny model guza) i obrazowanie.

Protokół

Protokół badawczy jest zgodny z najwyższymi standardami dobrostanu zwierząt i ściśle przestrzega Wytycznych dotyczących opieki nad zwierzętami Szpitala Uniwersyteckiego RWTH Aachen. Zobowiązujemy się do zapewnienia etycznego i humanitarnego traktowania wszystkich zwierząt biorących udział w badaniach, a procedury są przeglądane i zatwierdzane przez lokalną komisję etyki ds. zwierząt. Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały zatwierdzone przez niemiecki organ kompetentny (Landesamt für Natur, Umwelt und Verbraucherschutz Nordrhein-Westfalen, LANUV) pod kątem zgodności z ustawą o ochronie zwierząt, w połączeniu z rozporządzeniem dotyczącym ochrony zwierząt wykorzystywanych do celów eksperymentalnych i innych celów naukowych.

UWAGA: Pełna lista sprzętu, materiałów i odczynników wykorzystanych w całym badaniu znajduje się w Tabeli materiałów. Należy pamiętać, że operacje z 68Ga powinny być wykonywane za pomocą pipety zawsze, gdy jest to możliwe; należy bezwzględnie unikać kontaktu z metalem, ponieważ żelazo może znacznie obniżyć wydajność znakowania. Oznacza to, że należy unikać stosowania igieł do momentu zakończenia procedur radiochemicznych.

1. Radiochemia

  1. Radiomarkowanie NM-02-DOTA-GA z użyciem 68Ga
    UWAGA: Protokół obejmuje obchodzenie się z materiałami radioaktywnymi i ich manipulację. Badacze muszą przestrzegać lokalnych przepisów dotyczących postępowania z materiałami radioaktywnymi, zasad ALARA (tak nisko, jak jest to rozsądnie osiągalne), pracować z osłonami ołowianymi, minimalizować czas bezpośredniego kontaktu i zachowywać maksymalną odległość na każdym etapie ekspozycji na promieniowanie. Procedury eksperymentalne muszą być monitorowane za pomocą urządzeń do detekcji promieniotwórczości.
    1. Eluuj generator 68Ge/68Ga ręcznie lub automatycznie w 10 mL 0,6 M HCl (1,2 GBq/10 mL). Wyłap 68Ga na kartridżu PS-H+ (rozmiar M – 0,8 mL), przepuszczając eluat przez kartridż. Eluuj kartridż SPE PS-H+ łącznie 1 mL 4 M NaCl, etapami i powoli, do probówki do mikrocentryfugi.
    2. Odrzuć pierwsze 0,3 mL eluatu i zbierz pozostałe 0,7 mL do drugiej probówki do mikrocentryfugi.
    3. Pobierz nową probówkę do mikrocentryfugi i przeprowadź radiomarkowanie NM-02-DOTA-GA zgodnie z protokołem producenta.
      UWAGA: Konjugat nanociało-chelator (NM-02-DOTA-GA) został przygotowany wcześniej zgodnie z protokołem dostawcy. Konjugat można przechowywać w aliquotach w temperaturze -80 °C przez kilka miesięcy.
    4. Dostosuj pH produktu do około 7, używając do 5 µL 3 M NH4OAc.
  2. Kontrola jakości
    1. Zmierz aktywność skoncentrowanej próbki w probówce do mikrocentryfugi za pomocą miernika aktywności przy odpowiednich ustawieniach (68Ga jako izotop; strzykawka 1 mL, geometria 0,1 mL). Wydajność radiochemiczna (skorygowana o rozpad) powinna wynosić co najmniej 40%.
    2. Wyznacz pH za pomocą paska testowego pH (0-14), nanosząc odpowiednią ilość (10-15 µL) na pasek.
    3. Chromatografia cienkowarstwowa (TLC)
      1. Nanieś 1 µL mieszaniny z reakcji radiomarkowania na pasek TLC impregnowany krzemionką. Pozostaw aliquot do wyschnięcia przez około 1 min. Przeprowadź TLC, używając kwasu cytrynowego jako fazy ruchomej, nasycając komorę TLC przez około 2-3 mm w zamkniętym naczyniu. Wyjmij pasek TLC z komory, gdy ciecz dotrze do górnej krawędzi paska.
      2. Umieść pasek TLC w skanerze radio-TLC i dokonaj pomiaru zgodnie z protokołem producenta. Produkt powinien pojawić się w miejscu naniesienia (Rf < 0,2), natomiast wolne kationy 68Ga eluują z czołem rozpuszczalnika (Rf > 0,9).
      3. Oblicz wydajność radiomarkowania reakcji na podstawie radiogramu, dzieląc zintegrowaną powierzchnię pod krzywą (AUC) dla Rf 0,0-0,2 przez całkowitą AUC (Rf 0,0-1,0) i mnożąc wynik przez 100.
    4. Wysokosprawna chromatografia cieczowa (HPLC)
      1. Upewnij się, że HPLC pracuje przez co najmniej 10 min z użyciem odpowiedniego rozpuszczalnika, aby wszystkie linie były wypełnione, i dostosuj ustawienia do pomiaru. Zastosuj przepływ izokratyczny mieszaniny 50:50 acetonitrylu (rozpuszczalnik A) oraz mieszaniny 0,9% NaCl (980 mL) połączonej z kwasem trifluorooctowym (1 mL) i roztworem cytrynianu (20 mL) jako rozpuszczalnika B. Zmierz absorbancję UV przy 280 nm.
      2. Pobierz 5 µL produktu i rozcieńcz go 15 µL 0,9% NaCl. Wstrzyknij 15 µL mieszaniny do analitycznego radio-HPLC (kolumna 5 µm SEC-s2000 154 Å; przepływ: 2 mL/min).
      3. Zastosuj przepływ izokratyczny mieszaniny 50:50 acetonitrylu (rozpuszczalnik A) oraz mieszaniny 0,9% NaCl (980 mL) połączonej z kwasem trifluorooctowym (1 mL) i roztworem cytrynianu (20 mL) jako rozpuszczalnika B. Zmierz absorbancję UV przy 280 nm. Występuje niewielkie przesunięcie czasów retencji między kanałem UV a gamma; wynika to z konstrukcji HPLC (detektor gamma jest zainstalowany szeregowo za detektorem UV).
      4. Wyznacz czystość radiochemiczną poprzez całkowanie pików w kanale gamma. Produkt powinien znajdować się w zakresie całkowania wyznaczonym wcześniej poprzez pomiar nanociała nieoznaczonego radioaktywnie. Dodatkowo całkowuj wszystkie pozostałe piki w kanale gamma i oceń je jako zanieczyszczenia. Czystość powinna wynosić >95%.
    5. Endotoksyny
      1. Przygotuj rozcieńczenie produktu 1:20 o łącznej objętości 150 µL, używając do rozcieńczenia (certyfikowanej) wody wolnej od endotoksyn.
      2. Włóż jednorazowy kartridż do badania endotoksyn, który jest komercyjnie napełniony wszystkimi niezbędnymi odczynnikami, do czytnika endotoksyn i załaduj 25 µL rozcieńczonego produktu do każdej komory kartridża.
      3. Naciśnij Play. System PTS posiada wewnętrzne kontrole pozytywne i negatywne, które zostaną zawarte w raporcie końcowym. Test trwa około 15 min. Produkt uznaje się za wolny od endotoksyn, jeśli zawartość endotoksyn wynosi < 8,7 EU/mL przy Vmax = 20 mL.
    6. Rytrospektywna sterylność
      1. Po wstrzyknięciu i pobraniu próbki do kontroli jakości, przechowuj radiofarmaceutyk w sterylnej fiolce w lodówce w temperaturze 4 °C.
      2. Przekaż próbkę do certyfikowanego instytutu w celu analizy sterylności (wewnątrz zakładowego lub zewnętrznego), jeśli granica zwolnienia 105 Bq lub 10 Bq/g nie została przekroczona, aby przeprowadzić test sterylności zgodnie z12.
  3. Przygotowanie strzykawek (jedna na zwierzę)
    1. Zmierz aktywność produktu za pomocą miernika aktywności przy odpowiednich ustawieniach (68Ga jako izotop; strzykawka 1 mL, geometria 0,1 mL).
    2. Pobierz 15 MBq produktu (około 25 µL) do probówki do mikrocentryfugi i uzupełnij objętość 0,9% NaCl do 75 µL.
    3. Nabierz 50 µL do strzykawki i zmierz za pomocą miernika aktywności przy odpowiednich ustawieniach (68Ga jako izotop; strzykawka 1 mL, geometria 0,1 mL). Strzykawka powinna zawierać 10 MBq produktu.
      UWAGA: Po utworzeniu nanociała NM-02 znakowanego 68Ga, plastikowe końcówki do pipet nie są już wymagane przy obchodzeniu się z 68Ga. Od tego momentu, wszędzie tam, gdzie protokół wspomina o obchodzeniu się z cieczą, należy używać odpowiedniej strzykawki (1 mL) i igły (27-30G).

2. Tworzenie modelu zwierzęcego

  1. Zakwaterowanie zwierząt
    1. Użyj samic myszy immunodeficyjnych szczepu: ATHYM-Foxn1nu/nu myszy w wieku 6–8 tygodni (z dostawy komercyjnej) do rozwoju guzów podskórnych. Po przyjeździe wszystkie myszy należy umieścić bezpośrednio w pomieszczeniu dla zwierząt i zapewnić im co najmniej 1 tydzień aklimatyzacji po transporcie.
    2. Zwierzęta należy utrzymywać w 12-godzinnym cyklu światła i ciemności (12 h światła/12 h ciemności), zapewniając im swobodny dostęp do pokarmu i wody. Temperaturę pokojową oraz wilgotność względną należy utrzymywać w przedziale 20-25 °C i odpowiednio 45%–65%.
  2. Przygotowanie komórek do implantacji
    1. Rozpocząć hodowlę komórkową z 1 x 106 komórki SKOV-3 i dodać 25 ml podgrzanej pożywki DMEM/F12 wzbogaconej o 10% FBS oraz 1% penicyliny/streptomycyny do kolby hodowlanej T175.
    2. Hodować komórki w inkubatorze w temperaturze 37 °C oraz 5% CO22 oraz wymieniać pełną pożywkę co najmniej 2 razy w tygodniu.
    3. Na 1 tydzień lub najpóźniej na 1 dzień przed implantacją komórek pobrać 20 µL pożywki z kolby do hodowli komórkowej w celu przeprowadzenia testu na obecność mykoplazm13Do iniekcji komórkowej należy używać wyłącznie komórek wolnych od mykoplazm.
    4. W dniu wstrzykiwania komórek odessać pożywkę kompletną i pipetować do butelki 5 ml PBS. Kilkukrotnie delikatnie potrząsać butelką w przód i w tył, aby wypłukać pozostałości pożywki.
    5. Do kolby należy dodać 3 ml trypsyny i inkubować przez 4 min w inkubatorze w temperaturze 37 °C oraz 5% CO22 w celu dysocjacji komórek. Sprawdzić pod mikroskopem przy powiększeniu 40x, czy komórki oddzieliły się od kolby do hodowli komórkowej.
    6. Dodać 7 ml pożywki w celu zneutralizowania aktywności trypsyny, a następnie przenieść zawiesinę komórkową do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml.
    7. Wiruj komórki z prędkością 150 x g przez 5 min (w temperaturze pokojowej), aby uzyskać osad komórkowy. Odpiąć nadsącz i dodać 1 ml pożywki w celu resuspensji komórek.
    8. Pobierz 12 µL zawiesiny komórkowej do probówki do mikrocentryfugi i dodać taką samą ilość błękitu trypanu. Napełnić komorę hemocytometru 10 µL starannie wymieszanej zawiesiny komórkowej.
    9. Należy policzyć niebarwione, żywe komórki w wyznaczonym obszarze i obliczyć ich liczbę. Następnie należy dostosować stężenie komórek do poziomu 5 x 107 komórek/ml medium i ostrożnie wymieszać zawiesinę komórek z 1 ml macierzy błony podstawnej.
    10. Pobrać 5 x 106 komórki w 0,2 ml pożywki komórkowej z 50% macierzą błony podstawnej w strzykawce insulinowej o pojemności 1 ml dla każdej myszy. Strzykawkę należy przechowywać w lodzie do momentu iniekcji, aby zapobiec zestaleniu się macierzy błony podstawnej.
      UWAGA: Jeśli mysz waży mniej niż 20 g, należy wstrzyknąć jedynie 150 µL (dla 15–20 g) lub 100 µL (dla 10–15 g) mieszaniny. W przypadku podania podskórnego należy zadbać o to, aby nie przekroczyć maksymalnej objętości 10 ml/kg masy ciała zalecanej przez GV-SOLAS14.
  3. Inokulacja i obserwacja
    1. Wstrzyknij zawiesinę komórkową podskórnie w bok ciała przebudzonego zwierzęcia, unieruchamiając jedną ręką szyję i ogon. Zazwyczaj preferujemy iniekcje w lewy bok.
    2. Odczekać 10–15 s do stwardnienia macierzy błony podstawnej, a następnie wyjąć igłę.
    3. Monitoruj codziennie wzrost guza po implantacji, wykorzystując suwmiarkę cyfrową do pomiaru dwóch prostopadłych osi guza.
    4. Na podstawie tych pomiarów należy ocenić wzrost guza, wykorzystując objętość guza obliczoną według wzoru:
      VT = L × B2 × π / 6
      gdzie VT czy objętość guza jest podana w mm³3, L jest długością guza w mm (tj. większą z dwóch osi prostopadłych), a B czy szerokość guza w mm (tj. mniejsza z dwóch osi prostopadłych15). Technika ta wykazuje tendencję do zawyżania objętości guza, ponieważ obejmuje ona również skórę.
    5. Masa guza wpływa na wagę myszy podczas pomiaru na wadze elektronicznej. Aby obliczyć wagę zwierzęcia skorygowaną o masę guza, należy zastosować następujący wzór:
      mmysz-T = mmysz - 0,82 × VT
      gdzie mmysz-T czy masa myszy z wyłączeniem masy guza jest podana w g, mmysz czy masa myszy według wagi elektronicznej jest podana w g i VT czy obliczona objętość guza jest podana w mm³3Liczba 0,82 g/mm3 wyniki pochodzące z wartości średniej serii guzów wyizolowanych z wcześniejszych eksperymentów na zwierzętach, zważonych i z określoną objętością obliczoną według podanego wzoru. Reprezentują one średnią gęstość guza.
    6. Ponadto należy określić wielkość guza w stosunku do wielkości myszy i monitorować obciążenie nowotworowe, korzystając z następującego wzoru:
      Obciążenie nowotworem [%] = (0,82 × VT) / mmysz × 100
      gdzie obciążenie nowotworowe wyrażone jest w procentach, 0,82 × VT odpowiada masie guza w g (t. j., VT, obliczona objętość guza w mm³3, razy średnią gęstość guza), i mmysz Masa myszy zgodnie ze wskazaniem wagi jest podana w g.
    7. Gdy objętość guza u zwierząt przekroczy 200 mm³3zaplanuj ich nieinwazyjne badanie PET/CT lub SPECT/CT, w zależności od przebiegu eksperymentu.

3. Obrazowanie

  1. Przygotowanie strzykawki (system wykonany na zamówienie)
    UWAGA: Ogon myszy jest mały, dlatego wymagane jest użycie kaniuli 27G lub mniejszej (większe liczby odpowiadają cieńszym igłom). W przypadku myszy żeńskich jedynymi dostępnymi żyłami do iniekcji bolusowych są trzy żyły ogonowe. Anatomicznie żyła grzbietowa ogona znajduje się bliżej kręgosłupa niż dwie żyły boczne; nie należy wstrzykiwać preparatu do tej żyły, aby uniknąć jatrogennego uszkodzenia kości. Z doświadczenia wynika, że najlepsze rezultaty daje zastosowanie kaniuli 30G, gdyż umożliwia ona dostęp również do mniejszych żył. Ponieważ cewniki 30G nie są dostępne w sprzedaży, tego typu narzędzie musi zostać starannie wykonane przez badacza.
    1. Przygotować strzykawkę z radioznacznikiem, zależnie od planowanej drogi podania. W przypadku iniekcji dożylnych należy upewnić się, że dla myszy o masie 25 g podawana jest objętość maksymalna wynosząca 5 ml/kg masy ciała; oznacza to, że maksymalna objętość iniekcji wynosi 125 µL.
    2. Aby przygotować cewnik 30G, należy najpierw użyć dowolnej igły 30G i usunąć metalowy trzpień igły, używając nożyczek metalowych lub wyginając go w kierunku przeciwnym do tworzywa sztucznego.
    3. Ręcznie wprowadź rurkę PE10 o średnicy 0,3 mm do części wału, która została usunięta z piasty. Należy zachować ostrożność, aby nie przebić rurki.
      UWAGA: Można stosować również inne rodzaje tworzyw sztucznych, jednakże PE10 zapewnia najlepszy balans pomiędzy sztywnością a elastycznością ścianek.
  2. Wstrzyknięcie dożylne
    UWAGA: Iniekcje dożylne można przeprowadzać również u zwierząt w stanie czuwania; jednakże, jeśli nie jest to wymagane, iniekcje muszą być wykonywane w sedacji izofluranem, aby zminimalizować obciążenie zwierzęcia badawczego.
    1. Napełnić cewnik 30G buforem 0,9% NaCl lub innym wybranym buforem.
    2. Umieść mysz w komorze indukcyjnej i napełniaj ją stale mieszaniną tlenu (lub medycznego powietrza sprężonego) i izofluranu w fazie gazowej, aż zwierzę straci odruch prostowania. Do indukcji należy użyć stężenia izofluranu wynoszącego 3,5%–5% przy przepływie tlenu lub powietrza rzędu 0,8 L/min.
    3. Natychmiast umieść uśpioną mysz w pozycji początkowej na brzuchu na macie grzewczej (37-38 °C), utrzymując jednocześnie sedację izofluranem za pomocą maski nosowej. Często sprawdzać, czy u myszy nie występują objawy przegrzania (np. nadmierne przeciąganie się, przyspieszony oddech, zaczerwienienie skóry). W celu podtrzymania znieczulenia stosować izofluran w stężeniu 1,8%–2,5% przy przepływie tlenu lub powietrza wynoszącym 0,8 l/min.
    4. Nanieść maść oftalmiczną do oczu zwierzęcia, aby zapobiec ich wysychaniu podczas sedacji. Obejrzeć obie żyły boczne ogona i wybrać tę najlepiej nadającą się do iniekcji. Należy wziąć pod uwagę widoczność oraz średnicę żyły. Aby uzyskać najlepsze rezultaty, należy lekko obrócić ogon tak, aby wybrana żyła stykała się z matą grzewczą, i odczekać 1 minutę do czasu rozszerzenia się naczynia.
    5. Ułóż mysz w pozycji bocznej w taki sposób, aby wybrana żyła znajdowała się u góry. Przymocuj końcówkę oraz nasadę ogona za pomocą taśmy.
    6. Chwyć cewnik 30G dominującą ręką i delikatnie oprzyj palec wskazujący niedominującej ręki na wybranej żyle, aby spowodować zastój krwi w jej wnętrzu. W miejscu zastoju żyła rozszerzy się, tworząc niewielkie uwypuklenie.
    7. Dominującą ręką należy umieścić kaniulę 30G równolegle do ogona, skierowaną w stronę wybrzuszenia żyły. Następnie przesuń dominującą rękę do przodu. W większości przypadków technika ta zapewnia bezpośrednią wenipunkcję.
    8. Po wprowadzeniu do żyły w plastikowej rurce widoczny staje się refluks krwi. Unieruchom plastikową rurkę, aby igła nie przemieściła się wewnątrz żyły podczas iniekcji. Do wolnego końca rurki wsuń strzykawkę z substancją znakującą połączoną z igłą 30G.
      UWAGA: W przypadku konieczności oceny dynamicznego rozkładu znacznika, po umieszczeniu zwierzęcia na stole skanera PET i uruchomieniu badania PET należy wykonać następujące czynności.
    9. Powoli wstrzyknij zawartość strzykawki z markerem przez co najmniej 10 s. Pozostawiając igłę 30G podłączoną do systemu kaniuli 30G, odłącz samą strzykawkę z markerem i podłącz strzykawkę z buforem 0,9% NaCl (lub innym wybranym buforem), aby przepłukać kaniulę. Przez cały czas trwania procedury wstrzykiwania monitoruj oddychanie i dostosowuj stężenie izofluranu tak, aby utrzymać tempo około jednego oddechu na sekundę.
    10. Usuń cewnik 30G z żyły ogonowej i użyj sterylnego kompresu bawełnianego, aby zatamować krwawienie.
    11. Aby zmierzyć pozostałą aktywność, należy zmierzyć cewnik 30G, strzykawkę z buforem, pustą strzykawkę z izotopem oraz kompres bawełniany, ponieważ wszystkie te elementy zawierają niewielkie ilości izotopu, które nie dotarły do zwierzęcia.
  3. Akwizycja PET/CT
    UWAGA: Dla 68W przypadku nanociała NM-02 znakowanego galem, wszystkie zwierzęta są obrazowane przy użyciu systemu PET/CT dla małych zwierząt.
    1. Akwizycja PET
      1. Umieść uśpioną mysz w pozycji brzusznej na podkładce dla zwierząt i przymocuj ją do skanera PET. Przekieruj przepływ izofluranu do maski nosowej w skanerze PET i utrzymuj stężenie izofluranu w powietrzu medycznym na poziomie 1,5%–2,5% przy przepływie 0,8 l/min, tak aby częstość oddechów zwierzęcia podczas skanowania wynosiła od 50 do 75 oddechów na minutę.
      2. Przymocuj mysz do podłoża za pomocą taśmy medycznej w okolicy karku. W razie potrzeby ponownie nałóż maść oftalmiczną do oczu myszy, aby zapobiec ich wysychaniu podczas sedacji.
      3. Włącz mata grzewcza w legowisku dla zwierząt, ustawiając moc na około 80%, co odpowiada wartości około 30 °C.
      4. Ustaw czas akwizycji na 45 min i wybierz Obszar zainteresowania które zostaną zeskanowane. Wybierz 68Ga jako izotop badawczy i rozpocznij skanowanie. Wprowadź wartość podanej aktywności, czas podania oraz czas pomiaru pustej strzykawki. Jedna pozycja łoża PET wynosi 160 mm, co jest odległością wystarczającą do pełnego skanowania ciała myszy.
      5. W przypadku konieczności oceny dynamicznego rozkładu znacznika, należy najpierw rozpocząć skanowanie PET, odczekać 30 s w celu akwizycji danych, a dopiero potem przejść do kroków 3.2.9–3.2.10. Pozostawić cewnik w organizmie myszy z podłączoną strzykawką z buforem, aby zapobiec dalszej utracie krwi. Cewnik można odłączyć po zakończeniu badania PET, przed akwizycją CT, aby uniknąć powstania artefaktów.
    2. Akwizycja obrazów TK
      1. Odłącz stół dla zwierząt od skanera PET i natychmiast podłącz go do skanera CT. W razie potrzeby odłącz również kaniulę z żyły ogonowej. Po upływie co najmniej 30 min od nakłucia żyły miejsce wstrzyknięcia jest już ścięte, zatem nie wystąpi dalsze krwawienie.
      2. Przełącz przepływ izofluranu na stożek nosowy w skanerze CT.
      3. Wybierz ten sam obszar zainteresowania (ROI) do skanowania w obrazowaniu PET. Wybierz standardowy protokół akwizycji: 440 µA, 50 kVp, czas ekspozycji 32 ms oraz 1080° obrót w trybie spiralnym z 960 ekspozycjami360°czas trwania tomografii komputerowej (CT) wynosi około 7 min w przypadku pełnego skanu ciała myszy.
      4. Kontroluj częstotliwość oddychania i włącz podkładkę grzewczą w kojcu dla zwierzęcia. stale monitoruj oddech podczas skanowania i dostosowuj stężenie izofluranu w celu utrzymania częstotliwości oddychania w zakresie od 50 do 75 oddechów na minutę.

4. Opieka nad zwierzętami po obrazowaniu

  1. Po zakończeniu skanowania zwierzę potrzebuje co najmniej 15 minut na wybudzenie. Aby uniknąć agresji między współlokatorami, należy umieścić zwierzę w oddzielnej klatce na około 15 min lub do momentu, gdy będzie w stanie samodzielnie chodzić, przed powrotem do oryginalnej klatki. W tym czasie należy stosować światło podczerwone, aby zapobiec hipotermii.
  2. Na początku należy położyć zwierzę na lewym boku (pozycja bezpieczna), aby uniknąć wstrząsu hemodynamicznego. Maść oftalmiczna powinna pozostać w oku, ponieważ zwierzę usunie ją samodzielnie po przebudzeniu.

5. Rekonstrukcja PET/CT

  1. Przeprowadź rekonstrukcję PET z wykorzystaniem trójwymiarowego algorytmu maksymalizacji wiarygodności z uporządkowanymi podzbiorami (tj. OSEM-3D z 30 iteracjami), przy oknie energetycznym ± 15% od szczytu 511 keV, do izometrycznej wielkości woksela 0.4 mm w macierzy 192 × 192 × 384. Zastosuj korekcje oparte na CT (tj. korekcję tłumienia, korekcję rozproszenia, czas martwy i zdarzenia przypadkowe) do rekonstrukcji PET.
  2. W przypadku konieczności oceny dynamicznego rozkładu znacznika, zastosuj rekonstrukcję wieloklatkową. Przykładowo, dla skanu trwającego 45 min można zastosować następujące klatki: 4 x 30 s, 3 x 1 min, 5 x 2 min, 2 x 5 min oraz 2 x 10 min.
  3. Zrekonstruuj standardowe protokoły akwizycji CT, stosując iteracyjny algorytm rekonstrukcji (tj. ISRA), do izometrycznej wielkości woksela 0.2 mm w macierzy 200 × 200 × 425. Używając oprogramowania producenta, przekonwertuj wartości CT na jednostki Hounsfielda (HU) zgodnie z wzorem:
    Wzór na jednostkę Hounsfielda, zmienne μt, μw, μa, równanie analizy obrazowania medycznego.
    gdzie µw to liniowy współczynnik tłumienia wody, µa to liniowy współczynnik tłumienia powietrza, a µt to liniowy współczynnik tłumienia tkanki.
  4. Obrazy PET i CT zostały automatycznie wyrównane po rekonstrukcji przy użyciu macierzy wygenerowanej ze skanu fantoma kapilarnego. Zarchiwizuj wszystkie zrekonstruowane dane oraz przekaż je na serwer bazy danych, korzystając w razie potrzeby z oprogramowania do analizy obrazów.

6. Przetwarzanie i analiza obrazów

UWAGA: Współrejestrowane obrazy PET/CT są następnie wykorzystywane do kwantyfikacji w serwerze bazy danych oprogramowania do analizy obrazów, gdzie każdy skan hybrydowy jest zapisywany jako osobny podmiot.

  1. Zidentyfikuj guz na podstawie obrazu TK i wybierz go jako obszar zainteresowania. Ręcznie wyznacz maskę guza na obrazie TK.
  2. Aby uzyskać segmentację niezależną od użytkownika, zastosuj progowanie nowo utworzonej maski guza na obrazie PET lub SPECT. W przypadku PET przyjmij minimalny próg 1,0 standardized uptake value (SUV). W przypadku SPECT zastosuj minimalny próg wyższy niż średni wychwyt w puli krwi, zmierzony w sercu lub w końcowym odcinku aorty brzusznej.
  3. Zapisz średnią, maksymalną, średnią z 10 najintensywniejszych wokseli (tj. hot average 10) oraz całkowity wychwyt w nowo wygenerowanych wolumenach zainteresowania.
  4. Wykorzystaj te wartości do wyznaczenia wartości SUV oraz stosunku sygnału z celu do tła (TBR), które zostaną następnie użyte do analizy statystycznej.

Wyniki

Jednym z najważniejszych aspektów kontroli jakości radiofarmaceutyku jest analiza za pomocą HPLC, ponieważ pozwala ona nie tylko określić czystość chemiczną i radiochemiczną (w tym przypadku 98,2%), ale także potwierdzić tożsamość radiofarmaceutyku poprzez porównanie czasu elucji i kształtu piku z tymi dla niepromienistego związku referencyjnego. Związkiem referencyjnym jest w tym przypadku nieznakowane nanociało, którego tożsamość została potwierdzona klasycznymi metodami, takimi jak spektrometria mas lub magnetyczny rezonans jądrowy. Metod tych nie można zastosować bezpośrednio do związku radioaktywnego (masa jest zbyt mała, aby wygenerować sygnał), jednak poprzez porównanie związku radioaktywnego z jego wzorcem gromadzi się wystarczające dowody na to, że oznakowano właściwy związek i nie uległ on zmianie podczas syntezy. Należy zwrócić uwagę na niewielką różnicę w czasie retencji między produktem radioaktywnym a wzorcem na Rysunku 1, co wynika z szeregowego pomiaru przepływu w układzie HPLC (najpierw mierzona jest absorpcja UV, a następnie przepływ potrzebuje około 0,2 min, aby dotrzeć do detektora promieniowania w typowej konfiguracji).

Schemat wyników chromatografii; rozdział peptydów za pomocą HPLC; detekcja UV przy 280 nm; dane CPS.
Rycina 1: Typowy chromatogram analityczny HPLC dla kontroli jakości nanociała NM-02 znakowanego 68Ga (GLNM-02). Absorbancja UV związku nieznakowanego (tj. górny panel) jest mierzona przy 280 nm i wykazuje pik w 4,18 min, z przesunięciem o 0,22 min. Pik produktu znakowanego 68Ga jest widoczny w detektorze gamma (tj. dolny panel). Wydajność radiochemiczna wynosi 98,2%. mAU = mili jednostek absorbancji, NM-02 = nasz produkt, UV = kanał światła ultrafioletowego, nm = nanometr, min = minuta, CPS = zliczenia na sekundę, GLMN-02 = nanociało NM-02 znakowane 68Ga, 68Ga-DOTA-GA = [68Ga]Ga-DOTA-GA, γ ChA = kanał gamma. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

W przypadku braku HPLC lub jako metoda uzupełniająca, TLC może być wykorzystana do określenia wydajności znakowania i czystości produktu końcowego (jednak nie do potwierdzenia jego tożsamości i z mniejszą szczegółowością niż HPLC). Ze względu na niską złożoność, TLC jest idealna w sytuacjach, gdy ścieżka radiosyntezy jest jeszcze optymalizowana. Rycina 2 przedstawia chromatogram TLC nanociała NM-02 znakowanego 68Ga (pozorna czystość radiochemiczna 99,9%).

Wykres chromatograficzny, wynik TLC, stężenie w funkcji odległości, analiza piku, wizualizacja czoła rozpuszczalnika.
Rycina 2: Typowy analityczny chromatogram TLC dla kontroli jakości nanociała NM-02 znakowanego 68Ga (GLNM-02). Liczba zliczeń powierzchniowych została naniesiona w funkcji odległości przebytej przez rozpuszczalnik (cytrynian) na płytce TLC. Wartość Rf wynosi 0.2, a czystość radiochemiczna 99,9%. C = zliczenia, mm = milimetr, GLNM-02 = nanociało NM-02 znakowane 68Ga, TLC = chromatografia cienkowarstwowa. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.

W procesie przygotowywania danych obrazowych do publikacji standardową praktyką jest przedstawienie przynajmniej jednego samodzielnego obrazu CT i PET. Takie podejście umożliwia kompleksową ocenę biodystrybucji znacznika. Standardowe skalowanie CT mieści się w zakresie od -1000 HU do 1000 HU, co pozwala na wizualizację wszystkich tkanek miękkich w ramach jednego okna. Jak pokazano na Rysunku 3A, metoda ta umożliwia wyraźne wyznaczenie granic nerek myszy, pozwalając jednocześnie na ocenę kości.

W przypadku skali PET należy ustawić dolny próg na poziomie SUV 0,0, zachowując minimalny próg górny wynoszący 1,0 (Rycina 3B), najlepiej stosując normalizację do masy ciała podczas obliczania SUV (tj. SUVbw). Ponadto do kwantyfikacji preferowany jest SUVmean w porównaniu do SUVmax; w przypadku zastosowania SUVmax należy użyć średniej z 10 najgorętszych wokseli zamiast wartości pojedynczego najgorętszego woksela w obliczeniach SUVbw. Należy przygotować fuzje cech obrazów PET/CT poprzez scalenie przekrojów CT i PET (Rycina 3C).

Aby umożliwić czytelnikom niezależną ocenę biodystrybucji znacznika w całym organizmie, maksymalną projekcję intensywności tego samego skanu PET można przedstawić przy użyciu tej samej skali co w przypadku przekroju PET (Rysunek 3D).

Schemat porównawczy obrazowania CT, PET, PET/CT; ujawnia dane anatomiczne i funkcjonalne w badaniu.
Rycina 3: Obrazy PET/CT in vivo myszy z podskórnym guzami SKOV-3. Obraz uzyskano 3 h po dożylnym wstrzyknięciu 5 MBq nanociała NM-02 (GLNM-02) znakowanego 68Ga. (A) Obraz CT jest przeskalowany w zakresie od -1000 HU do 1000 HU, natomiast (B) obraz PET znajduje się w zakresie SUV od 0,0 do 5,0. (C) Fuzja PET/CT wykorzystuje tę samą skalę. (D) Obraz PET z maksymalną projekcją intensywności (MIP) jest również przeskalowany przy użyciu SUV od 0,0 do 5,0. Wszystkie obrazy PET wykazują dobry wychwyt GLNM-02 przez guz, a klirens nerkowy jest wyraźnie widoczny. CT = tomografia komputerowa, PET = pozytonowa tomografia emisyjna, MIP = maksymalna projekcja intensywności, HU = jednostka Hounsfielda, SUV = standaryzowana wartość wychwytu. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

W konkretnym przypadku nanociała NM-02 znakowanego 68Ga można zaobserwować wyraźne wychwycenie znacznika przez guz w lewym boku myszy. Dodatkowo widoczne jest wydalanie znacznika przez nerki. Dzięki przedstawieniu maksymalnej projekcji intensywności (MIP) obrazowania PET widoczna staje się również aktywność w pęcherzu moczowym, co potwierdza nerkowy klirens znacznika. W tym konkretnym przypadku warto wspomnieć, że nerki, guz i pęcherz nie mogą być wyświetlone na tym samym przekroju 2D. Uwzględnienie maksymalnej projekcji intensywności w publikacjach pozwala na przedstawienie pełnej biodystrybucji znacznika na jednym obrazie.

Dyskusja

Radiosynteza
Opisana tutaj radiosynteza jest typowa dla nowego związku znakowanego 68Ga - krótki czas syntezy, z naciskiem na odpowiednie pH i unikanie metali, gdy tylko jest to możliwe. W tym celu ważne jest, aby ściśle przestrzegać kolejności dodawania składników. W każdym przypadku wartość pH roztworu 68Ga musi być najpierw dostosowana do pH 4 przy 3 M NH4OAc; w przeciwnym razie nanocząsteczka może ulec degradacji, jeśli pH jest zbyt kwaśne. Ogólne koncepcje syntezy 68Ga zostały opisane wcześniej16, więc nie będziemy tutaj wchodzić w szczegóły. Moduł automatycznej syntezy wymaga dalszej optymalizacji pod kątem redukcji dawki promieniowania. Wymaga to znacznego wysiłku, który wykracza poza zakres badań eksploracyjnych w typowym eksperymencie przedklinicznym, jak opisano tutaj. Co więcej, jest mało prawdopodobne, aby zautomatyzowana synteza dała tak małe objętości, jakie możemy wyprodukować obecną metodą (< 1 ml), co pozwala na uzyskanie wyższych stężeń 68Ga i wyższej aktywności właściwej.

Kontrola jakości powinna być nadal przeprowadzana i rejestrowana w bardzo szczegółowy sposób. Jedynym wyjątkiem od tej zasady jest pH: podczas gdy pomiary pH do syntez klinicznych są często wykonywane bardzo dokładnie przy użyciu pH-metrów, w tym przypadku wystarczy zmierzyć pH za pomocą prostego paska pH, ponieważ pozwalają na to wymagania dotyczące wstrzyknięć dożylnych (dopuszczalne jest dowolne pH między 6 a 814). Ta prosta technika zmniejsza koszty i ryzyko skażenia sprzętu materiałem radioaktywnym.

Preparaty dla modeli zwierzęcych
Ostateczna formuła znacznika jest kluczowym aspektem znacznika, aspektem, który często jest słabo opisywany w badaniach przedklinicznych. Chociaż istnieją jasne przepisy dotyczące formułowania farmaceutyków do badań klinicznych na ludziach, w tym radiofarmaceutyków, istnieją jedynie wytyczne17,18, które nie omawiają konkretnie rozpuszczalników ani postaci użytkowych. Wytyczne te są często wykorzystywane przy sporządzaniu lub ocenie wymaganych prawem protokołów do zatwierdzenia przez komisje etyczne (dotyczące zwierząt) (w Niemczech: LANUV19), ale dokumenty te niewystarczająco podkreślają znaczenie formuły. Jest prawdopodobne, że złe formuły mogą prowadzić do fałszywych (negatywnych) wyników, ale takie twierdzenie jest trudne do zweryfikowania, biorąc pod uwagę utrzymującą się stronniczość publikacji, która nadal istnieje, również w dziedzinie onkologii20.

Oprócz wytycznych ARRIVE zdecydowaliśmy się w jak największym stopniu przestrzegać przepisów przeznaczonych do stosowania u ludzi, zakładając, że preparaty odpowiednie dla ludzi są zasadniczo odpowiednie również dla gryzoni. Główną różnicą jest wielkość przedmiotu, a co za tym idzie, ilość objętości, którą można bezpiecznie wstrzyknąć. W tym celu zdecydowaliśmy się na oczyszczanie związku, gdy tylko jest to możliwe, za pomocą filtrów odcięcia masy cząsteczkowej (MWCO), ponieważ udowodniono, że są one skuteczne w oczyszczaniu dużych związków21. Pozwalają one na ostateczne rozpuszczenie typowego znacznika znakowanego 68Ga w wybranym roztworze i w małej objętości odpowiedniej dla myszy (typowe maksymalne wstrzyknięcie dożylne 100 - 150 μL).

W Niemczech GV-SOLAS (Gesellschaft für Versuchstierkunde, pol. Stowarzyszenie na rzecz zwierząt laboratoryjnych) służy jako pośrednik między ochroną zwierząt a badaniami, przynosząc korzyści zarówno ludziom, jak i zwierzętom. W związku z tym stowarzyszenie to opracowało zalecenia dotyczące wielu aspektów badań na zwierzętach, zwłaszcza w dziedzinie onkologii i anestezjologii, w celu standaryzacji opieki nad zwierzętami na poziomie krajowym14. Od tego czasu większość kompetentnych organów i krajowych komitetów etycznych egzekwuje przestrzeganie tych zaleceń zgodnie z protokołami dotyczącymi zwierząt. GV-SOLAS zawiera zalecenia dotyczące maksymalnych objętości większości ścieżek aplikacji. W przypadku wstrzyknięcia dożylnego zaleca się maksymalnie 5 ml/kg masy ciała; w przypadku myszy o wadze 25 g odpowiada to 150 μl. Z tego powodu wszystkie produkcje znaczników promieniotwórczych są ustawione na maksymalną objętość wstrzyknięć wynoszącą 150 μl na zwierzę. Przekroczenie tego progu podczas wstrzykiwania dożylnego zwiększa ryzyko ostrej niewydolności serca spowodowanej hiperwolemią. Wielokrotne wstrzyknięcia dożylne przekraczające ten próg prowadzą do zwiększonego ryzyka zwłóknienia płuc, ponieważ każde wstrzyknięcie, w zależności od prędkości przepływu, powoduje niewielki obrzęk płuc. Ludzkim odpowiednikiem mysiego dożylnego dożylnego przedstawionego w tej pracy byłoby wstrzyknięcie dożylnie w bolusie (w ciągu 10 s) całkowitej objętości 375 ml dla człowieka o wadze 75 kg. W standardowej opiece klinicznej podaje się 500 ml 0,9% roztworu NaCl w ciągu 1 godziny; Oznacza to, że 375 ml należy podać w ciągu 45 minut, aby uniknąć powikłań.

GV-SOLAS zaleca, aby obciążenie guzem nie przekraczało 5%; W przypadku, gdy zwierzę jest w trakcie leczenia, obciążenie może zostać zwiększone do 10%22. Ta różnica między grupami leczonymi i nieleczonymi może potencjalnie powodować błąd systematyczny w badaniach, szczególnie w przypadku przeżycia, ponieważ leczone myszy nowotworowe mogą osiągnąć wyższe obciążenie guzem niż grupa kontrolna otrzymująca aferent. Aby uniknąć takich przypadków, należy również ustalić 5% obciążenie guzem dla zwierząt leczonych; Może to jednak prowadzić do dylematów etycznych związanych z zabijaniem zwierząt badawczych przed osiągnięciem tzw. humanitarnego punktu końcowego lub (najlepiej) argumentować, że wzrost do 10% w przypadku aferentnych grup kontrolnych jest etycznie uzasadniony w celu uniknięcia stronniczości.

Ponieważ masa guza musi być obliczana codziennie w sposób nieinwazyjny, stosujemy współczynnik korekcyjny (tj. 0,82), aby przeliczyć codziennie obliczaną objętość guza na masę guza. Obliczyliśmy ten czynnik, mierząc średnicę guza za pomocą suwmiarki cyfrowej przed zabiciem zwierząt zgodnie z protokołem, a następnie rzeczywistą masę guza za pomocą wagi. Ten współczynnik korekcyjny różni się od gęstości tkanki nowotworowej, ponieważ zmierzona objętość guza obejmuje również skórę. Dlatego czynnik ten wynosi prawdopodobnie < 1,0, ponieważ zmierzona objętość guza jest większa niż rzeczywista objętość guza. Ponieważ guzy, które zważyliśmy, były stosunkowo duże, ponieważ ocena została przeprowadzona w ostatnim dniu eksperymentu, czynnik ten rzeczywiście zawyża wagę małych guzów. Powinien być stosowany wyłącznie w ocenie obciążenia guza.

Innym aspektem zaleceń GV-SOLAS jest to, że dla myszy stała średnica guza wynosząca 15 mm jest ustalana jako humanitarny punkt końcowy17. Często guz ma tendencję do szybkiego wzrostu wzdłuż kanału igły wykonanego przez wstrzyknięcie podskórne, jeśli po roztworze zawierającym komórki nowotworowe nie zostanie wstrzyknięte powietrze ani czopek. W związku z tym 15 mm są osiągane szybciej przy niektórych drogach aplikacji. Ponieważ, biorąc pod uwagę doświadczenie, niektóre guzy rosną w kształcie elipty, dostosowaliśmy i wykorzystaliśmy wyżej wspomnianą formułę objętości guza, aby dokonać bezstronnych porównań między różnymi drogami aplikacji.

Używane przez nas modele zwierzęce są projektowane zgodnie z wytycznymi ARRIVE17 i PREPARE18 , co pozwala na łatwą reprodukcję eksperymentalną. Model podlega pewnym zmianom, ponieważ tempo wzrostu guza różni się u różnych myszy, co utrudnia standaryzację i interpretację. Jednak różnice te odzwierciedlają heterogeniczność wewnątrz- i międzyguzową występującą u pacjentów z rakiem23.

Protokół ten nie jest pozbawiony ograniczeń. Zwierzęta muszą być uspokojone podczas wstrzyknięcia, zwłaszcza podczas badania PET/CT. Sedacja, szczególnie izofluranem, wpływa na przepływ krwi, a zwierzęta mogą stać się hipotermiczne, co wymaga użycia maty grzewczej i monitorowania głębokości sedacji. Tego problemu można uniknąć, skanując obudzone zwierzęta; Wymaga to jednak specjalistycznego oprogramowania i wiedzy specjalistycznej, które często nie są dostępne.

Kolejnym ograniczeniem jest dawka promieniowania. Chociaż dawka otrzymana przez zwierzęta jest znikoma dla pojedynczego skanowania, wykonanie wielu skanów (tj. zwłaszcza jeśli jest ich więcej niż 10) może skutkować znaczną dawką skumulowaną, potencjalnie wpływając na wzrost guza. Gdy wzrost guza jest parametrem odczytu, ważne jest, aby wszystkie zwierzęta otrzymały taką samą liczbę skanów i dawek, aby zapewnić porównywalne grupy, co zwiększa obciążenie całego projektu. Stosowanie systemu PET/MRI zamiast systemu PET/CT może zmniejszyć narażenie na promieniowanie. Takie podejście wiąże się jednak z dłuższym czasem skanowania, dodatkowymi kosztami i inną metodą pozyskiwania informacji anatomicznych.

Stosując się do zaleceń organizacji zajmujących się dobrostanem, takich jak GV-SOLAS w Niemczech, i postępując zgodnie z ustalonymi wytycznymi, takimi jak ARRIVE i PREPARE, dążymy do standaryzacji modeli zwierzęcych i minimalizacji zmienności w protokołach eksperymentalnych. Wysiłki te mają zasadnicze znaczenie dla zapewnienia wiarygodności i odtwarzalności badań przedklinicznych, co ostatecznie ułatwi translację obiecujących radiofarmaceutyków z laboratorium do łóżka pacjenta.

Oświadczenia

FMM jest doradcą medycznym dla NanoMab Technology Ltd. i Advanced Accelerator Applications (AAA) GmbH. Ostatnio otrzymał granty instytucjonalne od NanoMab Technology Ltd., Siemens i GE Precision Healthcare LLC. Ponadto posiada kontrakt na badania interwencyjne z CURIUM.

Podziękowania

Autorzy są wdzięczni Susanne Allekotte za jej wsparcie techniczne.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Equipment
Miernik aktywności ISOMED 2010Nuviatech Healthcare -
Wirówka MIKRO 185Andreas Hettich GmbH & Co. KG1203
Badanie endotoksyn Endosafe nexgen-PTSCharlesRiver-Blok
grzewczy NANOCOLOR VARIO C2Macherey-Nagel919350
System HPLC, w tym detektor radiowyKnauer & Oprogramowanie doRaytest-Pmod
4.4 PMOD Technologies LLC-
System PET/CT dla małych zwierząt β-CUBE i X-CUBEMolecubes NV-TLC
MiniGITA*Elysia-Raytest-
Materiały
Średnica 0,3 mm Rurka PE10fisher scientific22-204008
Igła 30GB|Braun4656300
Filtr odśrodkowy; 10 kDa MWCO, 0,5 mlmiliporówUFC501008
Pasek bibuły chromatograficznej iTLC-SGAgilent TechnologiesSGI0001
Endotoxin Cartridge, czułość 0,05 EU/ml Charles RiverPTS-2005
Kolumna HPLC Biosep SEC-s2000Phenomenex
(1,5 ml)Eppendorf0030125150
pasek pH 0,0 - 6,0Merck KGaA109531
pasek pH 0-14Merck KGaA109535
PS-H+ wkład SPEMacherey Nagel GmbH &; Co. KG731861
Sterylna fiolka 10 mlALK Life Science SolutionsSEV100
odczynniki
68Ge/68Ga-GeneratorNRF-iThembaLABS-Amonamacetate
Merck KGaA101116
Kwas cytrynowyMerck KGaA
Kwas solnyMerck KGaA320331
NaClMerck KGaAS9888
Nanobody NM-02Radiopharm Theranostics-P-SCN-Bz-DOTA-GA
CheMatechC115
Kwas trifluorooctowyMerck KGaAT6508
Woda ultraczystaMerck KGaA
analizy obrazu Probówka do mikrowirówek 100241101262

Bibliografia

  1. American Cancer Society. Cancer facts & figures 2024. , https://www.cancer.org/research/cancer-facts-statistics/all-cancer-facts-figures/2024-cancer-facts-figures.html (2024).
  2. Cancer Research UK. Ovarian cancer survival. , https://www.cancerresearchuk.org/about-cancer/ovarian-cancer/survival (2021).
  3. Siegel, R. L., Giaquinto, A. N., Jemal, A. Cancer statistics, 2024. CA Cancer J Clin. 74 (1), 12-49 (2024).
  4. Altunay, B., et al. Her2-directed antibodies, affibodies and nanobodies as drug-delivery vehicles in breast cancer with a specific focus on radioimmunotherapy and radioimmunoimaging. Eur J Nucl Med Mol Imaging. 48 (5), 1371-1389 (2021).
  5. Altunay, B., Morgenroth, A., Mottaghy, F. M. Use of radionuclide-based imaging methods in breast cancer. Semin Nucl Med. 52 (5), 561-573 (2022).
  6. Mcgale, J., et al. Pet/ct and spect/ct imaging of her2-positive breast cancer. J Clin Med. 12 (15), 4882(2023).
  7. Zhang-Yin, J. State of the art in 2022 pet/ct in breast cancer: A review. J Clin Med. 12 (3), 968(2023).
  8. USFD Administration. Pet drug products - current good manufacturing practice (cgmp). , https://www.fda.gov/regulatory-information/search-fda-guidance-documents/pet-drug-products-current-good-manufacturing-practice-cgmp (2018).
  9. Official Journal of the European Union, L238. 60, https://eur-lex.europa.eu/legal-content/EN/TXT/?uri=OJ:L:2017:238:TOC (2017).
  10. Korde, A., et al. Position paper to facilitate patient access to radiopharmaceuticals: Considerations for a suitable pharmaceutical regulatory framework. EJNMMI Radiopharm Chem. 9 (1), 2(2024).
  11. Korde, A., et al. Practical considerations for navigating the regulatory landscape of non-clinical studies for clinical translation of radiopharmaceuticals. EJNMMI Radiopharm Chem. 7 (1), 18(2022).
  12. European Pharmacopeia. , (2023).
  13. Volokhov, D. V., Graham, L. J., Brorson, K. A., Chizhikov, V. E. Mycoplasma testing of cell substrates and biologics: Review of alternative non-microbiological techniques. Mol Cell Probes. 25 (2-3), 69-77 (2011).
  14. Dülsner, A., et al. Technical information from the Committee for Animal Welfare Officers (GV-SOLAS) and Working Group 4 in the TVT Recommendation on substance administration to laboratory animals. GV-SOLAS. , (2017).
  15. derived xenograft (pdx) protocols at the jackson laboratory. , Available from: https://tumor.informatics.jax.org/mtbwi/live/www/html/SOCHelp.html (2020).
  16. Velikyan, I. 68ga-based radiopharmaceuticals: Production and application relationship. Molecules. 20 (7), 12913-12943 (2015).
  17. Percie Du Sert, N., et al. Reporting animal research: Explanation and elaboration for the arrive guidelines 2.0. PLoS Biol. 18 (7), e3000411(2020).
  18. Smith, A. J., Clutton, R. E., Lilley, E., Hansen, K. E. A., Brattelid, T. Prepare: Guidelines for planning animal research and testing. Lab Anim. 52 (2), 135-141 (2018).
  19. Landesamt Für Natur UUVN. Tierversuche. , https://www.lanuv.nrw.de/verbraucherschutz/tierversuche (2024).
  20. Herrmann, D., et al. Statistical controversies in clinical research: Publication bias evaluations are not routinely conducted in clinical oncology systematic reviews. Ann Oncol. 28 (5), 931-937 (2017).
  21. Johnsen, E., et al. A critical evaluation of amicon ultra centrifugal filters for separating proteins, drugs and nanoparticles in biosamples. J Pharm Biomed Anal. 120, 106-111 (2016).
  22. TVT-Veröffentlichungen zum Download. , Society for Laboratory Animal Science (GV-SOLAS). Available from: https://www.tierschutz-tvt.de/alle-merkblaetter-und-stellungnahmen/ (2024).
  23. Bedard, P. L., Hansen, A. R., Ratain, M. J., Siu, L. L. Tumour heterogeneity in the clinic. Nature. 501 (7467), 355-364 (2013).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Przebieg radiosyntezyPET małych zwierzątradiotracery 68Gaczystość radiochemicznawstrzyknięcie dożylnecewnik żyły ogonowejradio-HPLCobrazowanie PET-CTobrazowanie molekularne
Radiosynteza, kontrola jakości i obrazowanie pozytonowej tomografii emisyjnej małych zwierząt 68nanocząsteczek znakowanych Ga
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.