Artykuł metodologiczny

Badania nad przeciwzapalnym działaniem tabletek Xiaoyao w leczeniu osteoporozy pomenopauzalnej u myszy

1.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/67051

⸱

23 sierpnia 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Histology and Embryology, Youjiang Medical University for Nationalities, 2Department of Geriatric Orthopedics, Affiliated Hospital of Youjiang Medical University for Nationalities, 3Department of Pathophysiology, Youjiang Medical University for Nationalities

W tym artykule

Podsumowanie

Osteoporoza pomenopauzalna stała się globalnym problemem zdrowia publicznego. Celem tego badania jest zbadanie efektów terapeutycznych i powiązanych mechanizmów tradycyjnej medycyny chińskiej tabletek Xiaoyao na ten stan.

Streszczenie

Osteoporoza jest powszechną chorobą metaboliczną kobiet starszych i po menopauzie, bez widocznych objawów we wczesnych stadiach. W późniejszych stadiach tego stanu pacjenci są podatni na złamania, co może poważnie wpłynąć na ich zdrowie i jakość życia. Wzrost średniej długości życia na całym świecie sprawił, że osteoporoza stała się problemem globalnym. Tabletki Xiaoyao były wcześniej
stosowany w leczeniu depresji. Ponadto lek wydawał się mieć aktywność podobną do estrogenu, co wpływało na ekspresję ALP, wczesnego markera specyficznego dla osteoblastów, i COL-1, głównego składnika macierzy zewnątrzkomórkowej kości. Tabletki Xiaoyao oceniano pod kątem ich wpływu na osteoporozę pomenopauzalną (PMOM) u myszy. Dostęp do informacji docelowych każdego ziołowego składnika tabletek Xiaoyao uzyskano za pośrednictwem bazy danych Tradycyjnej Farmakologii Systemów Medycyny Chińskiej (TCMSP). Informacje z GeneCards, OMIM, PharmGkb, TTD, DrugBank i innych stron internetowych wykorzystano do skonstruowania sieci regulacyjnej kompleksu ziołowego za pomocą sieci Cytoscape i String w celu oceny interakcji białek. Myszy poddano owariektomii i leczono wysokimi i niskimi dawkami tabletek Xiaoyao, które porównano z grupą kontrolną. Ich objawy oceniano za pomocą immunocytochemii tkanek kostnych. Wyniki sugerowały, że tabletki Xiaoyao miały zdolność łagodzenia objawów PMOM u myszy poddanych owariektomii poprzez szlak sygnałowy IL-17. Lek ten ma potencjał, aby stać się nowym środkiem terapeutycznym w leczeniu osteoporozy.

Wprowadzenie

Światowa Organizacja Zdrowia (WHO) definiuje osteoporozę (OP) jako chorobę charakteryzującą się spadkiem masy kostnej i pogorszeniem mikroarchitektury tkanki kostnej, co prowadzi do wzrostu kruchości kości, a tym samym do zwiększonego ryzyka złamań1. Kliniczne znaczenie osteoporozy polega na tym, że może ona prowadzić do złamań, które wiążą się z wysoką śmiertelnością, zachorowalnością i kosztami ekonomicznymi2. Osteoporoza pomenopauzalna (PMOP) jest spowodowana spadkiem poziomu estrogenów u kobiet po menopauzie, co prowadzi do wzrostu aktywności osteoklastów, co skutkuje utratą masy kostnej i zniszczeniem mikrostruktury kości. To często powoduje osteoporozę, która ma poważny wpływ na zdrowie3. Obecne terapie PMOP obejmują estrogenową terapię zastępczą, bisfosfoniany i parathormon, ale mogą one mieć różny stopień działań niepożądanych, niewystarczające długoterminowe przestrzeganie zaleceń i wysokie koszty4. Dlatego niedrogie ziołolecznictwo jest realną alternatywą dla dużej części populacji.

Tabletki Xiaoyao są zawarte w chińskiej farmakopei5, a te zawierają osiem składników ziołowych, w tym Chai Hu, Angelica sinensis, White paeonia lactiflora, Atractylodes macrocephala, Poria cocos, Menthae Herba, lukrecja i świeży imbir. Wszystkie te zioła są znane z tego, że są skuteczne w detoksykacji wątroby i wzmacnianiu śledziony, odżywianiu krwi i regulowaniu cyklu miesiączkowego, a mieszanka była również stosowana w leczeniu depresji6. Jednak rola tabletek Xiaoyao w osteoporozie jest niejasna.

Wczesne badania sugerują, że stan zapalny może prowadzić do utraty masy kostnej7, oraz że spadek gęstości kości związany z tym procesem może być przyspieszony przez menopauzę. Ponadto istnieje silny związek między rozwojem osteoporozy a stanem zapalnym. Czynnik zapalny, interleukina-17 (IL-17), jest czynnikiem prozapalnym wydzielanym przez komórki Th17, podzbiór limfocytów T CD4 +. Komórki te są związane z kilkoma przewlekłymi stanami zapalnymi i odgrywają ważną rolę w rozwoju niszczenia kości w reumatoidalnym zapaleniu stawów8. Dodatkowo IL-17 stymuluje aktywator receptora liganda czynnika jądrowego κ B (RANKL), który reguluje osteoklastogenezę, prowadząc do większej resorpcji kości niż tworzenie kości9. IL-17 stymuluje ekspresję innych cytokin osteoklastogennych, takich jak TNFα, IL-1, IL-6 i IL-8. Ma zdolność do synergii z innymi czynnikami zapalnymi, co czyni go ważnym efektorem zapalnym10.

Badania wykazały również związek między tabletkami Xiaoyao a stanem zapalnym. Shi et al.11 oraz Fang et al.12 niedawno potwierdzili, że tabletki Xiaoyao mogą obniżać poziom IL-6 i TNF-α, odpowiednio. W innym badaniu stłuszczeniowego zapalenia wątroby związanego z metabolizmem doniesiono, że tabletki Xiaoyao mogą zwiększać ekspresję kwasu propionowego, który z kolei hamuje ekspresję TNF-α i wywiera działanie przeciwzapalne13. Jednak obecnie nie wiadomo, czy tabletki Xiaoyao mogą regulować rozwój PMOM poprzez pośredniczenie w odpowiedzi zapalnej poprzez IL-17, co było celem tego badania.

To badanie przewidziało przecięcie celów tabletek Xiaoyao i genów związanych z osteoporozą poprzez farmakologię sieciową i analizę bioinformatyczną oraz przeanalizowało przecinające się geny pod kątem interakcji białek, GO i KEGG. Na podstawie przewidywanych wyników można zaobserwować ekspresję Act1 i IL-6, które są kluczowymi białkami w szlaku sygnałowym IL-1714,15, a także markery obrotu kostnego fosfatazę alkaliczną (ALP) i kolagen typu I (COL-1), aby zaobserwować skuteczność terapeutyczną tabletek Xiaoyao w modelu myszy PMOM.

Protokół

Komisja Etyki Zwierząt Laboratoryjnych Uniwersytetu Medycznego Youjiang ds. Narodowości zatwierdziła protokół badania (numer zatwierdzenia: 2022101502). Samice myszy C57BL/6 w wieku 10-12 tygodni, klasa SPF i masa ciała (22 ± 2) g, zostały umieszczone w Centrum Eksperymentów na Zwierzętach klasy SPF Uniwersytetu Medycznego Youjiang dla Narodowości. Zwierzęta doświadczalne utrzymywano w temperaturze 24-26 °C i wilgotności względnej od 55% do 60%.

1. Baza danych i platforma analizy farmakologii tradycyjnej medycyny chińskiej

UWAGA: Baza danych i Platforma Analizy Farmakologii Tradycyjnej Medycyny Chińskiej (TCMSP; https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php) to platformy farmakologiczne medycyny chińskiej, które zawierają informacje o składnikach TCM, właściwościach związanych z ADME, celach i chorobach16,17.

  1. Uzyskaj dostęp do interfejsu internetowego TCMSP. Wyszukaj imię Herba, wprowadź nazwę chińskiego leku i kliknij przycisk Szukaj. Kliknij nazwę łacińską w wynikach wyszukiwania. Przeprowadzić przesiew na wynikach składników o parametrach OB ≥ 30% i DL ≥ 0,18.
  2. Skopiuj wszystkie wyniki i zapisz je w formacie TXT o nazwie Medycyna Chińska Name_ingredients.txt.
  3. W obszarze Informacje o celach na karcie Powiązane cele przefiltruj pod kątem identyfikatora mol (tj. wyniku w kroku 1.2).
  4. Skopiuj przefiltrowane wyniki i zapisz je w formacie TXT o nazwie Medycyna chińska Name_targets.txt.
    UWAGA: Wykonując powyższe kroki, uzyskano wszystkie kwalifikujące się składniki aktywne i odpowiadające im informacje docelowe tradycyjnej medycyny chińskiej (TCM).
  5. Umieść wszystkie powyższe pliki ingredients.txt i pliki targets.txt w tym samym folderze i umieść skrypty Perla (Supplementary Coding File 1) w tym folderze.
  6. Otwórz CMD, wpisz ścieżkę do folderu cd, wprowadź ją i uruchom skrypt Perl. Pobierz nowy plik tekstowy (allTargets.txt). Ten nowy plik tekstowy (allTargets.txt) zawiera nazwę zioła, nazwę składnika, identyfikator składnika i cel.

2. Baza danych UniProt

UWAGA: Baza danych UniProt (https://www.uniprot.org/) zawiera sekwencje ludzkich białek opatrzone adnotacjami funkcjonalnymi i służy do normalizacji nazw celów do ich oficjalnych nazw18.

  1. Przejdź do interfejsu internetowego UniProt . Kliknij kartę Szukaj, wybierz pozycję UniProtKB, a następnie kliknij przycisk Wyszukaj.
  2. Filtruj na lewym pasku bocznym, wybierz Sprawdzone (Swiss-Prot) dla Statusu i Człowiek dla Popularnych organizmów. Kliknij przycisk Pobierz, wybierz opcję Pobierz wszystko, wybierz pozycję TSV dla opcji Format, a następnie kliknij przycisk Pobierz, aby pobrać plik adnotacji.
  3. Rozpakuj pobrany plik do bieżącego folderu, otwórz rozpakowany plik, a następnie skopiuj go i wklej do pliku tekstowego o nazwie ann.txt.

3. Konwersja identyfikatora celu leku

  1. Umieść wszystkie pliki docelowe leku allTargets.txt uzyskane w sekcji 1 oraz plik adnotacji UniProt ann.txt uzyskany w sekcji 2 w folderze i umieść w nim skrypty Perla (Dodatkowy plik kodowania 2).
  2. Otwórz CMD, wpisz cd + spacja + ścieżka folderu, wprowadź go i uruchom skrypt Perl, aby uzyskać nowy plik tekstowy (allTargets.symbol.txt). Ten nowy plik tekstowy (allTargets.symbol.txt) zawiera nazwę zioła, identyfikator składnika, nazwę składnika i identyfikator genu.

4. Przeszukiwanie bazy danych

  1. GeneCards: Baza danych GeneCards (Human Gene Database)
    UWAGA: Baza danych GeneCards (https://www.genecards.org/) zawiera informacje o przewidywaniach i adnotacjach dotyczących ludzkich genów. Służy do uzyskiwania dostępu do celów choroby19,20.
    1. Przejdź do interfejsu internetowego GeneCards. Wpisz osteoporoza w polu wyszukiwania i kliknij przycisk Szukaj.
    2. Kliknij przycisk Eksportuj i wybierz opcję Eksportuj do programu Excel.
    3. Otwórz pobrany plik, skopiuj geny z wynikiem istotności ≥ 1, a następnie wklej i zapisz je w pliku o nazwie GeneCards.txt.
  2. Baza danych OMIM
    UWAGA: Baza danych OMIM (https://omim.org) zawiera ludzkie geny, choroby genetyczne i cechy21.
    1. Przejdź do interfejsu internetowego OMIM. Kliknij GENE Map, wpisz osteoporoza w polu wyszukiwania i kliknij Szukaj.
    2. Kliknij Pobierz jako i wybierz Plik Excel.
    3. Otwórz pobrany plik, skopiuj nazwę genu w kolumnie Zatwierdzony symbol, wklej go i zapisz w pliku o nazwie OMIM.txt.
  3. Baza danych PharmGkb
    UWAGA: PharmGkb (https://www.pharmgkb.org), baza wiedzy o farmakogenomice, zawiera adnotacje do etykiet leków, szlaki skoncentrowane na lekach, podsumowania farmakogenetyczne oraz relacje między genami, lekami i chorobami22.
    1. Przejdź do interfejsu strony internetowej PharmGkb. Wpisz osteoporoza w polu wyszukiwania, kliknij Szukaj i zaznacz Gen na lewym pasku bocznym.
    2. Wprowadź wszystkie wyniki ręcznie i zapisz je w pliku o nazwie PharmGkb.txt.
  4. TTD: Baza danych Bazy Danych Celów Terapeutycznych (TTD)
    UWAGA: Baza danych TTD (https://idrblab.org/ttd/) zawiera informacje o celach białkowych i kwasów nukleinowych, chorobach docelowych, informacje o szlaku i odpowiadających im lekach dla każdego celu23.
    1. Przejdź do interfejsu internetowego TTD. Wpisz osteoporoza w polu wyszukiwania i kliknij przycisk Szukaj.
    2. Kliknij pozycję Informacje o celu w obszarze Identyfikator celu w wyniku, skopiuj nazwę celu, wklej ją i zapisz w pliku o nazwie TTD.txt. Łącznie uzyskano 33 wyniki. Zapisz każdy wynik w ten sam sposób.
  5. Baza danych DrugBank Online (DrugBank)
    UWAGA: Baza danych DrugBank (https://go.drugbank.com) zawiera informacje o lekach i celach leków, interakcjach z lekami, mechanizmach działania leków i metabolizmie leków24.
    1. Przejdź do interfejsu strony internetowej DrugBank. Wybierz Wskazania na karcie wyszukiwania, wpisz osteoporoza w polu wyszukiwania i kliknij przycisk Szukaj.
    2. Kliknij na wpis Osteoporoza w wynikach, aby uzyskać więcej informacji, kliknij na zakładkę LEKI I CELE, a następnie kliknij na Odpowiedni link w kolumnie CEL w tabeli.
    3. Kliknij Szczegóły w Białko, skopiuj nazwę genu, wklej ją i zapisz w pliku o nazwie DrugBank.txt. Zapisz każdy wynik w ten sam sposób.

5. Diagram Venna

  1. Łączenie genów związanych z chorobą i mapowanie Venna
    1. Umieść zapisane pliki txt oraz skrypt w tym samym folderze.
    2. Otwórz kod R (Merge Disease-Related Genes), skopiuj i wklej ścieżkę, w której przechowywany jest powyższy plik txt, do wiersza, w którym znajduje się setwd w kodzie R.
    3. Otwórz oprogramowanie języka R, uruchom zmodyfikowany kod języka R i zapisz. Ustaw gen, nazwij plik Disease.txt.
    4. Otwórz stronę internetową Draw Venn Diagram; w sekcji wprowadzania skopiuj i wklej kolejno zawartość tekstową zapisaną w sekcjach od 4 do 8 do listy, nazywając ją odpowiednią bazą danych i klikając Prześlij.
    5. Kliknij Zapisz obraz jako PNG pod obrazem i zapisz wynik tekstowy w tym samym folderze.
  2. Skrzyżowanie celów leków i genów związanych z chorobą
    1. Umieść plik allTargets.symbol.txt uzyskany w sekcji 3 i plik Disease.txt uzyskany w kroku 5.1.3 w tym samym folderze.
    2. Otwórz kod R (przecięcie genu docelowego leku i genu związanego z chorobą), skopiuj i wklej ścieżkę, w której przechowywany jest powyższy plik txt, do wiersza, w którym znajduje się setwd w kodzie R.
    3. Otwórz oprogramowanie języka R, uruchom zmodyfikowany kod języka R i zapisz. Ustaw gen, nazwij plik Drug_Disease.txt.
    4. Otwórz witrynę internetową Draw Venn Diagram. W sekcji danych wejściowych skopiuj i wklej allTargets.symbol.txt i Disease.txt do listy i nazwij je po odpowiednich plikach.
    5. Kliknij Zapisz obraz jako PNG pod obrazem i zapisz wyniki tekstowe w tym samym folderze.

6. Budowa sieci regulacyjnej dla TCM compounding

  1. Umieść plik allTargets.symbol.txt uzyskany w sekcji 3 w tym samym folderze, co plik Disease.txt i odpowiadający mu skrypt Perla (Dodatkowy plik kodowania 3).
  2. Otwórz CMD, wpisz ścieżkę do pliku CD, naciśnij Enter i uruchom skrypt Perl. Pobierz cztery nowe pliki txt: net.geneLists.txt, net.molLists.txt, net.network.txt i net.type.txt. Plik network.txt zawiera identyfikator składnika TCM, gen docelowy, relację docelową i nazwę składnika. net.type.txt zawiera nazwę węzła, atrybuty i przynależność. net.geneLists.txt jest lista genów, a net.molLists.txt jest lista składników.
  3. Skopiuj nowo uzyskane pliki tekstowe do tego samego nowego folderu.
  4. Otwórz oprogramowanie Cytoscape 3.9.1, kliknij Plik, kliknij Importuj i wybierz Plik formularza sieciowego. Wybierz opcję net.network.txt, umieść pierwszą kolumnę identyfikatora komponentu jako węzeł źródłowy, drugą kolumnę Geny jako węzeł docelowy, a trzecią kolumnę Relacja kierowania jako typ interakcji, a następnie kliknij przycisk OK.
  5. Importuj net.type.txt z okna Tabela węzłów. Kliknij kartę Wybierz, wybierz pozycję Węzły, wybierz opcję Z pliku listy identyfikatorów, wybierz pozycję net.geneLists.txt i kliknij przycisk Otwórz.
  6. Kliknij kartę Układ, wybierz opcję Układ okręgu posortowany stopniowo, a następnie wybierz opcję Tylko wybrane węzły. Dostosuj zarówno wysokość, jak i szerokość węzłów do 70.
  7. Kliknij drugie pole w obszarze Wysokość, wybierz degree.layout w polu Kolumna, wybierz opcję Continuous Mapping (Ciągłe odwzorowanie) w polu Typ odwzorowania, a następnie kliknij dwukrotnie okno Height adjustment (Regulacja wysokości) po prawej stronie opcji Current Mapping (Bieżące odwzorowanie), aby dostosować górną i dolną granicę wysokości do odpowiedniego zakresu.
  8. Powtórz operację z opcją Szerokość.
  9. Kliknij ponownie kartę Układ, a następnie kliknij Narzędzia układu > Dostosuj skalę, aby węzły nie nakładały się na siebie.
  10. Kliknij prawe górne okno oprogramowania, aby odznaczyć sieć węzłów, kliknij kartę Wybierz, wybierz Węzły, wybierz Z pliku listy identyfikatorów, wybierz net.molLists.txt i kliknij przycisk Otwórz.
  11. Kliknij kartę Układ, wybierz opcję Układ atrybutów grupy, wybierz opcję Tylko wybrane węzły i kliknij przycisk Typ.
  12. Kliknij opcję Label Font Size (Rozmiar czcionki etykiety) w lewej kolumnie i ustaw wartość domyślną na 12. Kliknij opcję Wartość domyślna na obrazie/wykresie 1 w lewej kolumnie.
  13. Wybierz Wykresy w wyskakującym okienku, kliknij Wykres kołowy i wybierz elementy w kolumnie Dostępne kolumny z wyjątkiem stopnia. Ułóż na wybranej kolumnie kolumn i kliknij przycisk Zastosuj.
  14. Kliknij Farbowanie obramowania w lewej kolumnie i ustaw wartość domyślną na #003EF8. Kliknij kartę Krawędź u dołu lewego paska bocznego i ustaw Szerokość na 0,8.
  15. Kliknij Plik na górnym pasku narzędzi, wybierz Eksportuj, a następnie wybierz Sieć do obrazu.
  16. W wyskakującym oknie wybierz format PNG dla Format, wybierz katalog zapisu i nazwij sieć obrazów, dostosuj Powiększenie rozmiaru obrazu do maksimum 500%, wybierz Przezroczyste tło i kliknij OK, aby zakończyć zapisywanie obrazu.

7. Sieci interakcji białko-białko (PPI) konstrukty

  1. Otwórz witrynę STRING (https://string-db.org/), kliknij pozycję Multiple Protein, kliknij pozycję Browse (Przeglądaj) w obszarze Upload a file (Prześlij plik), wybierz plik Drug_Disease.txt uzyskany w kroku 5.2.3 i wybierz pozycję Homo sapiens w obszarze Organisms (Organizmy). Kliknij Szukaj, a następnie kliknij przycisk Kontynuuj.
  2. Kliknij przycisk Ustawienia, ustaw minimalny wymagany wynik interakcji na najwyższy poziom ufności (0,900) i zaznacz opcję Ukryj rozłączone węzły w sieci w opcjach wyświetlania sieci. Kliknij przycisk Aktualizuj.
  3. Dokonaj regulacji węzłów na diagramie sieci, aby nie nakładały się na siebie ani nie zasłaniały.
  4. Kliknij opcję Eksportuje, a następnie kliknij opcję Pobierz jako mapę bitową o wysokiej rozdzielczości, aby pobrać mapę sieci współpracującej między białkami w formacie PNG. Pobierz również plik TSV jako krótkie dane wyjściowe tekstu tabelarycznego. Zapisz oba pliki w ujednoliconym folderze. Plik TSV zawiera nazwę genu, wewnętrzny identyfikator STRING i wyniki dla różnych atrybutów.

8. Budowa rdzenia sieci PPI

  1. Umieść plik TSV uzyskany w sekcji 7 i wymagane skrypty Perla w nowym folderze.
  2. Otwórz oprogramowanie Cytoscape 3.9.1, kliknij Plik, wybierz Importuj, kliknij Sieć z pliku, wybierz Powyżej pliku TSV, umieść pierwszą kolumnę node1 jako węzeł źródłowy, a drugą kolumnę node2 jako węzeł docelowy i kliknij OK.
  3. Kliknij Styl na lewym pasku bocznym, kliknij opcję Wartość domyślna w polu Szerokość i ustaw ją na 60. Przeciągnij i upuść węzły, aby nie nakładały się na siebie ani nie zamykały sieci.
  4. Kliknij pozycję Aplikacje na górnym pasku narzędzi, kliknij pozycję CytoNCA, a następnie kliknij pozycję Otwórz.
  5. W lewej kolumnie wybierz opcję Bez wagi w obszarze Między, Bliskość, Stopień, Wektor własny, Metoda oparta na średniej lokalnej łączności i Sieć, a następnie kliknij przycisk Analizuj.
  6. Po zakończeniu analizy kliknij Tabela węzłów w prawym dolnym oknie, kliknij Eksportuj, zapisz ją w folderze i nadaj jej wynik 1.
    UWAGA: Wtyczka CytoNCA musi być zainstalowana w oprogramowaniu Cytoscape. Aby to zrobić, kliknij Aplikacje na górnym pasku narzędzi, kliknij APP Manager, wpisz CytoNCA w polu wyszukiwania, zaznacz CytoNCA w środkowej kolumnie zwróconych wyników i kliknij Zainstaluj.
  7. Otwórz wynik1, dostosuj kolumnę nazwy do pierwszej kolumny, skopiuj informacje z tabeli, wklej je do nowego pliku tekstowego, nazwij go score1.txt i zapisz.
  8. Otwórz kod języka R, a następnie skopiuj i wklej ścieżkę, w której znajduje się plik score1.txt, do wiersza, w którym znajduje się setwd w kodzie języka R.
  9. Otwórz oprogramowanie R i uruchom zmodyfikowany kod, aby uzyskać dwa nowe pliki, score2.txt i score2.gene.txt. Plik score2.txt zawiera geny, dla których wszystkie wyniki programu były wyższe niż mediana, oraz specyficzne wyniki dla każdego programu. score2.gene.txt zawiera geny, które uzyskały wynik większy niż mediana dla wszystkich pozycji.
  10. Aby kontynuować w Cytoscape, kliknij AnalysisPanel 1 w prawym dolnym oknie, kliknij Prześlij z pliku po lewej stronie okna, wybierz score2.gene.txt, kliknij Otwórz i dotknij OK w wyskakującym okienku.
  11. Kliknij Wybierz węzły u dołu i kliknij OK w wyskakującym okienku.
  12. Kliknij Plik na górnym pasku narzędzi, wybierz Eksportuj, kliknij Sieć do obrazu, dostosuj Powiększenie (%) w Rozmiarze obrazu do maksimum 500%, zaznacz opcję Przezroczyste tło i zapisz plik w tym samym folderze, nadaj mu nazwę network1.
  13. Kliknij Utwórz podsieć na prawym pasku bocznym dolnego okna, aby utworzyć podsieć, przeanalizuj podsieć, kliknij APP na pasku narzędzi u góry, kliknij CytoNCA i kliknij Otwórz.
  14. Na lewym pasku bocznym wybierz opcję Bez wagi w obszarze Pomiędzy, Bliskość, Stopień, Wektor własny, Metoda oparta na lokalnej średniej łączności i Sieć, a następnie kliknij przycisk Analizuj.
  15. Po zakończeniu analizy kliknij opcję Tabela węzłów w prawym dolnym oknie, kliknij opcję Eksportuj i zapisz ją w nowym folderze o nazwie score2.
  16. Otwórz wynik2, dostosuj kolumnę nazwy do pierwszej kolumny, skopiuj informacje z tabeli, wklej je do nowego pliku tekstowego, nazwij go score2.txt i zapisz.
  17. Otwórz kod języka R, a następnie skopiuj i wklej ścieżkę, w której znajduje się plik score2.txt, do wiersza, w którym znajduje się setwd w kodzie języka R.
  18. Otwórz oprogramowanie R i uruchom zmodyfikowany kod, aby uzyskać dwa nowe pliki: score3.txt i score3.gene.txt. Plik score3.txt zawiera geny, które uzyskały wynik większy niż mediana dla wszystkich pozycji oraz określone wyniki dla każdej pozycji. score3.gene.txt zawiera geny, które uzyskały wynik większy niż mediana dla wszystkich pozycji.
  19. Aby kontynuować w Cytoscape, kliknij AnalysisPanel 1 w prawym dolnym oknie, kliknij Prześlij z pliku po lewej stronie okna, wybierz score3.gene.txt, kliknij Otwórz i dotknij OK w wyskakującym okienku.
  20. Kliknij Wybierz węzły u dołu i kliknij OK w wyskakującym okienku.
  21. Kliknij Plik na górnym pasku narzędzi, wybierz Eksportuj, kliknij Sieć do obrazu, dostosuj Powiększenie (%) w Rozmiar obrazu do 500%, zaznacz opcję Przezroczyste tło i zapisz plik w tym samym folderze, co folder użyty w tym kroku, nadając mu nazwę network2.
  22. Kliknij Utwórz podsieć na prawym pasku bocznym okna poniżej, aby utworzyć podsieć.
  23. Kliknij Plik na pasku narzędzi u góry, wybierz opcję Eksportuj, kliknij opcję Sieć do obrazu, dostosuj powiększenie (%) w polu Rozmiar obrazu do maksymalnej wartości 500%, zaznacz opcję Przezroczyste tło i zapisz plik w tym samym folderze, który został użyty w tym kroku i nadaj mu nazwę sieć3.

9. Konwersja identyfikatora genu

  1. Umieść plik Drug_Disease.txt w tym samym nowym folderze, w którym znajduje się wymagany plik kodu.
  2. Otwórz kod R (Supplementary Coding File 4) i skopiuj i wklej ścieżkę, w której znajduje się plik Drug_Disease.txt, do wiersza, w którym znajduje się setwd w kodzie R.
  3. Otwórz oprogramowanie języka R, uruchom zmodyfikowany kod przy użyciu organizacji. Hs.eg.db pakietu, aby przekonwertować identyfikator genu i uruchomić go po zakończeniu tworzenia nowego pliku id.txt. id.txt zawiera symbol genu i odpowiadający mu identyfikator.

10. Analiza wzbogacenia GO

  1. Umieść plik id.txt z poprzedniego kroku w tym samym folderze, w którym znajduje się kod analizy wzbogacania języka GO.
  2. Otwórz kod R (Supplementary Coding File 5) i ustaw katalog roboczy na id.txt i ścieżkę, w której jest przechowywany kod GO.
  3. Otwórz oprogramowanie języka R, uruchom zmodyfikowany kod i użyj clusterProfiler, org. Hs.eg.db, wzbogać wykres, wykres ggplot2, histogramy analizy wzbogacania GO i wykresy bąbelkowe. Pobierz trzy nowe pliki, GO.txt, barplot.pdf i bubble.pdf, po zakończeniu przebiegu.
    UWAGA: GO.txt jest plikiem wyników wzbogacania zawierającym klasyfikację wzbogacenia (BP, CC, MF), GO ID, nazwę Go, proporcję genu, proporcję tła, wartość p istotności wzbogacenia, skorygowaną wartość p (p.adjust, wartość), identyfikator genu (nazwa) i liczbę genów wzbogaconych w każdym GO. barplot.pdf jest histogram, bańka. PDF jest wykresem bąbelkowym.

11. Analiza wzbogacenia KEGG

  1. Umieść plik id.txt w tym samym folderze, w którym znajduje się kod analizy wzbogacania firmy KEGG.
  2. Otwórz kod R (Supplementary Coding File 6) i ustaw katalog roboczy na ścieżkę, w której przechowywane są kody id.txt i KEGG.
  3. Otwórz oprogramowanie języka R, uruchom zmodyfikowany kod i użyj clusterProfiler, org. Hs.eg.db, enrichplot, pakiet ggplot2 do wykreślania histogramów analizy wzbogacania GO, wykresów bąbelkowych i wykresów ścieżek. Przebieg jest zakończony utworzeniem trzech nowych plików: KEGG.txt, barplot.pdf i bubble.pdf.
    UWAGA: Plik KEGG.txt jest plikiem wyników wzbogacania zawierającym identyfikator ścieżki, opis ścieżki, proporcję genu, proporcję tła, wartość p istotności wzbogacenia, skorygowaną wartość p (p.adjust, qvalue), identyfikator genu (nazwę) oraz liczbę genów wzbogaconych w każdym szlaku. barplot.pdf jest wykresem słupkowym, a bubble.pdf jest wykresem bąbelkowym.
  4. Wyszukaj IL-17 w pliku KEGG.txt; wynik pokazuje, że istnieje tylko jedna ścieżka; skopiuj identyfikator ścieżki.
  5. Otwórz kod języka R, wklej identyfikator ścieżki IL-17 w polu KEGGID i użyj pakietu pathview, aby oznaczyć mapę ścieżki. Uruchom zmodyfikowany kod języka R i pobierz dwa nowe pliki, hsa04657.pathview.png i hsa04657.png.
    UWAGA: Plik hsa04657.png to mapa szlaków, hsa04657.pathview.png jest mapą szlaków oznaczonych, a te oznaczone na czerwono to geny obecne w sieci interakcji.

12. Przygotowanie tabletek Xiaoyao

UWAGA: Aby zapoznać się z zastosowaną metodą przygotowania, zapoznaj się z Farmakopeą Chińską5.

  1. Weź 100 g Chai Hu, 100 g Angelica sinensis, 100 g White Paeonia lactiflora, 100 g smażonych Atractylodes macrocephala, 100 g Poria cocos, 80 g preparatu Radix glycyrrhizae i 20 g Menthae herba.
  2. Używając kamiennego młyna lub maszyny do sproszkowania, zmiażdż zioła na drobny proszek; kilka ziół łączy się w powyższych proporcjach i sproszkowuje na drobny proszek, aby naturalnie wymieszać się ze sobą. Użyć sita do leków o oczkach 80 μm i średnicy wewnętrznej 180 μm ± 7,6 μm i przesiać sproszkowany proszek. Dokładnie wymieszaj.
  3. Weź 100 g imbiru, dodaj wodę i gotuj 2x przez 20 minut za każdym razem. Odcedź i odłóż na bok.
  4. Weź płytkę leczniczą, zanurz małą miotłę w wodzie imbirowej, posmaruj nią płytkę nazębną, weź powyższy proszek, posyp nim wodę imbirową i obróć płytkę tak, aby cały proszek był mokry i można go było uformować w kształt kuli.
    UWAGA: Tworzenie się płytki leczniczej jest niezbędnym krokiem podczas przygotowywania tabletek TCM. Większość bambusa moso zostanie podzielona na paski i utkana w szkielet. Skóra bambusowa lub tengpi jest wpleciona w powierzchnię i staje się zaokrąglona. Powierzchnię płytki nazębnej należy cienko pokryć olejem tungowym, a następnie posmarować warstwą lakieru. Jest suszony, aby stał się wodoszczelny. Tabletki wykonane w ten sposób będą okrągłe i gładkie.
  5. Ponownie posmaruj wodą imbirową, posyp proszkiem i obróć płytkę nazębną, aby lek był stopniowo zaokrąglony i powiększony. Umieść w chłodnym miejscu do wyschnięcia.

13. Ustanowienie modelu zwierzęcego

  1. Po 7 dniach aklimatyzacji losowo podziel myszy eksperymentalne na 4 grupy, a mianowicie pozorowaną grupę operacyjną (Sham, w której usunięto tylko tłuszcz wokół jajników) i trzy grupy myszy po owariektomii, składające się z grupy modelowej (OVX), a także grup podawania tabletek Xiaoyao o niskim i wysokim stężeniu.
  2. Znieczulić myszy 3% pentobarbitalem sodu (40 mg / kg) wstrzykiwanym dootrzewnowo. Sprawdź, czy myszy wchodzą w stan znieczulenia, obserwując uogólnione rozluźnienie mięśni, głębokie i powolne oddychanie oraz spowolniony ruch. Nałóż maść do oczu na oczy myszy przed zabiegiem.
  3. Ułóż zwierzęta w pozycji leżącej i ogol okolicę nerek grzbietu maszynką do golenia dla zwierząt. Przeprowadzić miejscową dezynfekcję 75% etanolem.
  4. Wykonaj dwustronne nacięcie podłużne o długości około 1 cm, w pobliżu grzbietowej części nerki i naciąć powięź, aby oddzielić mięśnie i otrzewną.
  5. Zlokalizuj górną część rogu macicy i jajowody do podwiązania. Włóż kleszcze do nacięcia w celu eksploracji i zlokalizuj jajnik, otoczony tkanką tłuszczową w jaskrawoczerwony wzór kalafiora, ze spiralnie ułożonymi jajowodami poniżej jajnika, łączącymi jajnik z rogiem macicy25. Usuń jajniki nożyczkami chirurgicznymi i szwem.
  6. Usuń niewielką ilość tkanki tłuszczowej w pobliżu jajnika jako kontrolę w pozorowanej grupie operacyjnej. Obserwuj zwierzęta, aż odzyskają przytomność. Umieść zwierzęta pooperacyjne w oddzielnych klatkach do czasu pełnego wyzdrowienia.
  7. Aby zapobiec infekcji, podawaj myszom gentamycynę przez 3 dni po operacji. Po operacji należy zapewnić normalną dietę i dobre środowisko wzrostu zgodnie z rzeczywistym stanem myszy. W przypadku wystąpienia jakichkolwiek nieprawidłowości, takich jak zakażenie rany lub utrata apetytu, należy niezwłocznie skonsultować się z instruktorem Centrum dla Zwierząt Laboratoryjnych.

14. Podawanie leków

UWAGA: Zgodnie z Metodologią Eksperymentalną Farmakologii26, konwersja użytych dawek dla ludzi i zwierząt wynosiła 9 g tabletek Xiaoyao dla osoby dorosłej o wadze 70 kg, co odpowiada jednej dawce (dawka na pojedyncze podanie).

  1. W przypadku grup z małą i wysoką dawką należy stosować odpowiednio 0,683 g/kg i 2,73 g/kg dla grupy 8 zwierząt. Użyj lewej ręki, aby unieruchomić mysz tak, aby usta myszy znajdowały się w linii prostej z przełykiem. Trzymając igłębkę w prawej ręce, delikatnie włóż ją do przełyku wzdłuż tylnej ściany gardła od kącika ust myszy.
  2. W tym momencie kierunek igły do zgłębnika może zostać nieznacznie zmieniony, aby stymulować indukowane działanie połykania. Wstrzyknąć lek. Wykonuj to raz dziennie przez 12 tygodni.
  3. W przypadku grup operowanych pozorowo i modelowych należy podawać sól fizjologiczną raz dziennie przez 12 tygodni w ilości określonej na podstawie masy ciała zwierzęcia.
  4. Poddaj myszy eutanazji przez zwichnięcie szyjki macicy i przytnij im tylne kończyny. Obierz kończyny ze skóry, aby oddzielić mięsień od kości udowej. Traktuj kości udowe myszy roztworem odwapniającym EDTA przez 1 miesiąc i codziennie zastępuj świeżym roztworem.

15. Barwienie hematoksyliną i eozyną (HE)

  1. Odparafinować tkanki udowe przez 8 minut, a następnie umieścić w gradientowym etanolu na 3 minuty; płukać bieżącą wodą przez 1 minutę.
  2. Dodaj kroplami roztwór barwiący Hematoksylinę do sekcji, aby całkowicie pokryć tkankę, plamić przez 5 minut i zmyć wodą z kranu
  3. Dodaj roztwór różnicujący kwas solny do tkanki na szkiełku, upewniając się, że całkowicie zakrywa tkankę. Zatrzymaj się, gdy zaobserwuje się przebarwienia tkanki. Spłucz wodą z kranu.
  4. Dodawać kroplami roztwór barwnika Eosin i pozostawić do całkowitego pokrycia tkanki, działając przez 30 s do 2 minut. Nadmiar barwnika spłucz bieżącą wodą.
  5. Przeprowadzić gradientowe odwadnianie etanolu za pomocą 75% bezwodnego etanolu przez 5 minut, następnie bezwodnego etanolu przez 5 minut i klarować roztworem do odparafinowania przez 3 minuty.
  6. Upuść odpowiednią ilość neutralnej gumy na szkiełko w zależności od wielkości tkanki i ostrożnie opuść szkiełko nakrywkowe, unikając pęcherzyków powietrza.

16. Mikrotomografia komputerowa i analiza immunohistochemiczna

  1. Usuń nadmiar mięśni i więzadeł wokół próbki kości udowej od różnych grup myszy i utrwal tkanki próbki w 4% paraformaldehydzie przez 24 godziny.
  2. Osusz tkanki kostne na powietrzu i wykonaj mikro-CT poprzez skanowanie tkanki kostnej w celu uzyskania trójwymiarowych danych z mikro-CT.
  3. Z zachowanych bloków wosku mysiego pokrój je na ciągłe sekcje o grubości 6 μm i piecz plastry w temperaturze 70 °C -72 °C przez 30-60 minut.
  4. Odwoskuj przez 8 minut, a następnie poddaj działaniu 75% bezwodnego etanolu przez 5 minut, bezwodnego etanolu przez 5 minut i płucz PBS przez 5 minut przez 3 razy.
  5. Wykonuj naprawę wysokociśnieniową EDTA przez 15 minut, a następnie myj PBS przez 5 minut przez 3x.
  6. Dodaj kroplami 3% nadtlenku wodoru do tkanki, inkubuj w temperaturze pokojowej przez 10 minut i przemywaj PBS przez 5 minut przez 3x.
  7. Użyj pisaka immunohistochemicznego, aby narysować okrąg. Myć z praniem PBS przez 3 minuty przez 3x.
  8. Zabarwienie przeciwciała pierwszorzędowego (anty-ALP króliczego pAb (1:200), anty-COL-1 króliczego pAb (1:200), anty-IL-17 króliczego pAb (1:275), anty-Act1 (1:500), anty-IL-6 króliczego pAb (1:500)) przez noc, a następnie płukanie buforem PBS przez 5 minut przez 3x.
  9. Kroplami dodawać przeciwciało drugorzędowe (Affinipure Coivípure Anti-Rabbit IgG (H+L; 1:2000)) i inkubować w temperaturze pokojowej przez 60 min. Myć buforem PBS przez 3 minuty przez 3x.
  10. Inkubować w DAB gotowym do użycia przez 3-5 minut, a następnie spłukać PBS.
  11. Wykonaj ponowne barwienie Hematoxylin przez 3 minuty, a następnie spłucz PBS.
  12. Stosować roztwór różnicujący przez około 10 sekund, a następnie przepłukać PBS.
  13. Dodaj powrót niebieskiego roztworu przez 10 s, a następnie płucz PBS.
  14. Wykonaj obróbkę 75% bezwodnym etanolem przez 5 minut, bezwodnym etanolem przez 5 minut i przezroczystym przez 3 minuty. Użyj neutralnej żywicy do uszczelniania szkieł.

Wyniki

Składniki aktywne i cele działania pigułek Xiaoyao
Poprzez przeszukanie bazy danych TCMSP i przesiewanie zgodnie z kryteriami biodostępności doustnej (OB) ≥ 30% oraz właściwości podobieństwa do leków (DL) ≥ 0,18, stwierdzono obecność 125 składników aktywnych w pigułkach Xiaoyao. Wśród nich składniki 6, 4, 9, 13, 2, 6, 83 i 2 pochodziły odpowiednio z Paeonia lactiflora, Atractylodes macrocephala, Menthae herba, Chaihu, Angelica sinensis, Poria cocos, lukrecji i imbiru. Niektóre składniki aktywne przedstawiono w Tabeli 1. Ponadto z bazy danych TCMSP uzyskano łącznie 879 celów dla skutecznych składników aktywnych, a po konwersji identyfikatorów (ID) i usunięciu wartości powtarzających się pozostało 232 cele.

Analiza sieci TCM – składnik aktywny – wspólny cel – choroba
W kilku bazach danych wyszukano geny związane z chorobą, używając słowa kluczowego osteoporosis. W bazie GeneCards, po odfiltrowaniu wyników według wskaźnika Relevance score ≥1, uzyskano 1692 geny. W bazie OMIM uzyskano łącznie 35 genów. W bazach PharmGkb, TTD i DrugBank znajdowało się odpowiednio 3, 33 i 386 genów. Następnie do dalszych analiz wykorzystano część wspólną wyników z tych pięciu baz danych (Rysunek 1A). Jednym z genów obecnych w czterech bazach danych był CALCR. Po połączeniu genów związanych z chorobą i wyznaczeniu części wspólnej z celami leku uzyskano łącznie 102 wspólne geny (Rysunek 1B). Na podstawie oddziaływań między celami choroby a składnikami aktywnymi leku, za pomocą oprogramowania Cytoscape, skonstruowano sieć TCM–składnik aktywny–wspólny cel–choroba. W rezultacie uzyskano zależności między składnikami leku a polimorficzną regulacją skanów genów związanych z chorobą (Rysunek 2A).

W bazie danych String przeanalizowano oddziaływania białek na przecięciu genów chorobowych i celów lekowych, aby uzyskać schematy ich sieci interakcji (Rysunek 2B), a następnie przeszukano je w celu zidentyfikowania najbardziej centralnych białek (Rysunek 2C-D). Wyniki wykazały najsilniejsze oddziaływania między FOS, ESR1, MAPK3, TP53, MAPK1, oraz STAT3 spośród genów chorobowych i celów lekowych (Rysunek 2E).

Analiza wzbogacenia funkcji GO oraz szlaków KEGG
Analiza wzbogacenia GO wykazała łącznie 2177 wpisów, w tym 1990 wpisów dotyczących procesów biologicznych (BP), 58 wpisów dotyczących składników komórkowych (CC) oraz 129 wpisów dotyczących funkcji molekularnych (MF). W kategorii BP geny koncentrowały się głównie na odpowiedzi na poziom składników odżywczych, odpowiedzi na stres oksydacyjny oraz komórkowej odpowiedzi na stres oksydacyjny. Kategoria MF koncentrowała się na wiązaniu czynników transkrypcyjnych wiążących DNA, wiązaniu czynników transkrypcyjnych wiążących DNA specyficznych dla polimerazy RNA II, aktywności receptorów jądrowych, aktywności czynników transkrypcyjnych aktywowanych ligandem oraz aktywności cytokin (Rycina 3A-B).

W analizie wzbogacenia szlaków KEGG uzyskano łącznie 168 powiązanych szlaków sygnalizacyjnych, z których najbardziej istotne były szlak sygnalizacyjny AGE-RAGE, szlak sygnalizacyjny IL-17, szlak sygnalizacyjny TNF, szlak sygnalizacyjny HIF-1 oraz różnicowanie komórek Th17 (Rysunek 3C-D). Sugeruje to, że pigułki Xiaoyao mogą wywierać działanie terapeutyczne w PMOM na wiele sposobów. Stan zapalny jest silnie powiązany z osteoporozą i może być przyspieszany przez menopauzę, a IL-17 jest ważnym czynnikiem zapalnym7. W związku z tym kolejnym etapem planu jest zbadanie, czy pigułki Xiaoyao mogą leczyć osteoporozę z perspektywy stanu zapalnego w odniesieniu do IL-17.

Zmiany strukturalne w tkance kostnej przed i po usunięciu tkanki jajnika
Barwienie HE wykazało, że w kościach udowych myszy z grupy Sham beleczki były gęsto rozmieszczone, o dobrej ciągłości, z niewielkimi przerwami między beleczkami, rzadkimi złamaniami i prawidłową wielkością jamy szpiku kostnego. W porównaniu z grupą Sham, w kościach udowych grupy OVX beleczki były rozmieszczone rzadko, z licznymi złamaniami, zaburzoną ciągłością i wyraźnie powiększoną jamą szpiku kostnego, co wskazuje na typowe zmiany osteoporotyczne (Rycina 4A).

Porównanie mikro-TK pomiędzy grupami
Kości udowe myszy w grupie OVX wykazywały niepełną strukturę beleczkową, częściowo pustą jamę szpikową oraz ścieńczenie kory kostnej w porównaniu z myszami z grupy Sham. W grupie Sham u myszy zaobserwowano obfitą sieć beleczek, dobrą ciągłość oraz zwężenie jamy szpikowej w kościach udowych (Rycina 4B).

Wpływ pigułek Xiaoyao na zachowanie myszy
W okresie badania, z wyjątkiem grupy OVX, wszystkie myszy w pozostałych grupach wykazywały lepsze nawyki życiowe, prawidłowy kolor sierści, wysoką mobilność oraz dobry stan zdrowia. Mocz i kał każdej myszy wróciły do normy w ciągu 1 tygodnia po zastosowaniu pigułek Xiaoyao. Nie odnotowano przypadków pogryzień, infekcji ran, niedrożności przewodu pokarmowego, rozpadu szwów, martwicy skóry w miejscu nacięcia ani zgonów myszy. Myszy w grupie OVX były podatne na wypadanie włosów, ciemnienie koloru sierści, zmniejszoną mobilność, wydłużony czas reakcji, zwiększoną ekskrecję oraz zmniejszony apetyt i spożycie wody.

Barwienie HE przekrojów patologicznych kości udowych myszy po interwencji lekowej
W grupie Sham tkanka udowa była gęsta, siateczkowata i regularnie rozmieszczona. Wielkość i ciągłość jamy szpiku były prawidłowe, a odstępy między sąsiednimi beleczkami kostnymi były stosunkowo małe. W porównaniu z grupą Sham, kora kości udowej oraz kość gąbczasta w grupie OVX wykazywały wyraźne ubytki, zmniejszenie liczby beleczek, zwiększenie przerw, przerwanie ciągłości, pocienienie struktury, poszerzenie jamy szpiku oraz pocienienie kory kostnej. W porównaniu z grupą OVX, beleczki udowe myszy w grupach leczonych lekiem (dawki niskie i wysokie) wydawały się strukturalnie nienaruszone, z mniejszymi odstępami, zwiększoną łącznością, zwężonymi jamami szpiku i gęstszą strukturą (Rysunek 5A).

Wykrywanie wskaźników obrazowania u myszy po interwencji lekowej
W porównaniu z grupą Sham, kości udowe myszy w grupie OVX charakteryzowały się rzadkimi i przerwanymi beleczkami kostnymi oraz cienką korą kostną. W porównaniu z grupą OVX, u myszy w grupie otrzymującej wysoką dawkę pigułek Xiaoyao stwierdzono mniej złamanych beleczek kostnych, przywrócenie struktury siateczkowej oraz znaczny stopień częściowej redukcji jamy szpiku kostnego. Jednakże u myszy leczonych niską dawką pigułek Xiaoyao nadal występowały złamane beleczki kostne, mimo zwiększonej liczby beleczek i redukcji jamy szpiku kostnego. Struktura beleczkowa kości w grupie poddanej operacji pozorowanej wykazywała większą ciągłość i kompletność (Rycina 5B).

Wyniki immunohistochemiczne tkanek w grupach po interwencji lekowej
Act1 oraz IL-6 są kluczowymi białkami w szlaku sygnalizacyjnym IL-17, natomiast ALP i COL-1 są genami osteogenicznymi. Ekspresja białek ALP, COL-1, IL-6, IL-17 i Act1 prowadzi do powstania brązowych lub żółtych ziarnistości w tkance kostnej. Wyniki immunohistochemii wykazały, że średnie wartości gęstości optycznej ALP i COL-1 w grupie leczonej były wyższe niż w grupie OVX po podaniu pigułek Xiaoyao, a różnica ta była istotna statystycznie (p < 0.05). Średnie wartości gęstości optycznej IL-17, Act1 i IL-6 w grupie leczonej były niższe niż w grupie OVX, a różnica była istotna statystycznie (p < 0.05; Rycina 6). Pigułki Xiaoyao odwróciły spadek poziomu ALP i COL-1 spowodowany owariektomią, jednocześnie zmniejszając ekspresję kilku kluczowych białek: IL-17, IL-6 i Act1 w szlaku sygnalizacyjnym IL-17, co sugeruje, że lek może wywierać swoje działanie terapeutyczne poprzez ten szlak.

Diagramy Venna porównujące bazy danych geny-choroby oraz interakcje lek-choroba na potrzeby analizy badawczej.
Rysunek 1: Analiza sieciowa części wspólnej aktywnych składników chińskich ziół leczniczych i genów związanych z chorobą. (A) Część wspólna genów związanych z chorobą, uzyskana z baz danych GeneCards, OMIM, PharmGkb, TTD i DrugBank. Są one reprezentowane odpowiednio przez kolory niebieski, czerwony, zielony, żółty i brązowy z liczbą 1692, 35, 3, 33 i 386 genów. Częścią wspólną są geny związane z chorobą występujące w pięciu bazach danych, a obszary nakładania się wskazują liczbę genów wspólnych dla poszczególnych baz. (B) Przedstawiono część wspólną celów leku (kolor niebieski oznacza ten zestaw danych, tj. zbiór genów będących celami działania leków zgromadzonych w bazie TCMSP po transformacji ID i usunięciu duplikatów) i genów związanych z chorobą (kolor czerwony oznacza ten zestaw danych, który zawiera wszystkie geny z pięciu wspomnianych wyżej baz danych). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Schematy sieci biologicznych przedstawiające interakcje genów, mapowanie genów związanych z chorobą oraz analizę powiązań białkowych.
Rysunek 2: Interakcja składników aktywnych TCM z sieciami regulacyjnymi genów związanych z chorobą i białkami kluczowymi. (A) Sieć regulacyjna składników aktywnych i genów związanych z chorobą w TCM przedstawia zależności regulacyjne genów odpowiadające każdemu składnikowi aktywnemu w pigułkach Xiaoyao, gdzie każdy składnik jest połączony z regulowanym przez niego genem. (B) Wyniki analizy interakcji białko-białko dla genów wspólnych w bazie STRING (węzły sieci reprezentują białka, krawędzie reprezentują powiązania białko-białko, a wielokrotne połączenia wskazują na wielokrotne interakcje między dwoma białkami). (C-E) Interakcje białkowe uzyskane za pomocą String zostały poddane kilkukrotnej selekcji. (C) Sieć interakcji białkowych uzyskana po pierwszej selekcji; wyróżniona część to jej rdzeń. (D) Wynik drugiej selekcji; wyróżniona część to rdzeń. (E) Najbardziej centralna sieć interakcji białkowych w ramach ogólnej sieci interakcji białek. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Analiza wzbogacenia genów, wykresy słupkowe i kropkowe; stosunek genów do liczby; skala kolorów p-value.
Rysunek 3: Analiza wzbogacenia GO i KEGG. (A-B) Wyniki analizy wzbogacenia GO dla genów wspólnych zostały podzielone na 3 kategorie: procesy biologiczne (BP), komponenty komórkowe (CC) oraz funkcje molekularne (MF); każda kategoria przedstawia jedynie 10 najistotniej wzbogaconych genów. (C-D) Wyniki analizy wzbogacenia KEGG dla genów wspólnych (przedstawiające 30 najistotniej wzbogaconych). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Analiza histologiczna struktury kości; obrazy mikroskopowe porównujące grupy OVX i sham.
Rycina 4: Utworzenie i ocena modelu myszy po owariektomii. (A) Porównanie morfologii kości w obrębie metafizy między grupą poddaną operacji pozorowanej (sham) a grupą po owariektomii (10x). W grupie OVX stwierdzono nasilone złamania beleczek kostnych, przerwanie ciągłości struktury oraz znaczne powiększenie jamy szpiku, podczas gdy w grupie sham złamania beleczek były rzadkie, a jama szpiku miała prawidłowe wymiary. (B) Skanowanie Micro-CT kości udowej w grupach poddanych operacji pozorowanej oraz owariektomii. W grupie OVX sieć beleczkowa była niepełna, a jama szpiku była częściowo pusta. W grupie Sham beleczki były liczne i ciągłe, a jama szpiku wąska. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Obrazy mikroskopowe tkanki kostnej i analiza strukturalna w grupach OVX, Sham, Low i High; wyniki μCT.
Rysunek 5: Analiza HE i mikro-CT po leczeniu pigułkami Xiaoyao. (A) Barwienie HE (10x) przekrojów kości udowej myszy w każdej grupie po zastosowaniu pigułek Xiaoyao. W grupie OVX bela kostne były zredukowane, ciągłość została przerwana, struktura była rzadka, a jama szpiku powiększona. W grupie Sham bela kostne wykazywały dobrą ciągłość, tkanka kości udowej była strukturalnie gęsta, a jama szpiku prawidłowa. W porównaniu z grupą OVX, bela kostne w grupie leczonej lekiem wydawały się strukturalnie nienaruszone, z zwiększoną łącznością, zredukowaną jamą szpiku i gęstszą strukturą niż w grupie modelowej. (B) Porównanie mikro-CT kości udowych myszy w każdej grupie po leczeniu pigułkami Xiaoyao. Bela kostne w kościach udowych myszy w grupie po owariektomii były rzadkie i przerwane, natomiast w grupie Sham bela były bardziej ciągłe i nienaruszone. W porównaniu z grupą po owariektomii, myszy w grupie leczonej wysoką dawką leku miały mniej przerwanych bel kostnych, przywróconą strukturę siateczkową i częściowo zredukowaną jamę szpiku kostnego, podczas gdy zwierzęta w grupie leczonej niską dawką leku miały więcej bel kostnych i zredukowaną jamę szpiku, lecz przerwane bela kostne nadal występowały. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Analiza barwień histologicznych; markery ALP, COL-1, IL-6, IL-17 w grupach OVX, Sham, Low, High.
Rycina 6: Immunohistochemia w celu wykrycia wpływu pigułek Xiaoyao na szlak sygnalizacyjny IL-17 oraz ekspresję białek genów markerów osteogennych u myszy z osteoporozą (40x). Pozytywne reakcje na obecność białek ALP, COL-1, IL-6, a także IL-17 i Act1 objawiały się w postaci brązowych lub żółtych ziarnistości w tkance kostnej. Ekspresja ALP i COL-1 w grupie leczonej była wyższa niż w grupie OVX (p < 0.05). Ekspresja IL-17, Act1 i IL-6 w grupie leczonej była niższa niż w grupie OVX (p < 0.05). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Nazwa tradycyjnej medycyny chińskiejIdentyfikacja molekularnaNazwa cząsteczki
Biała *Paeonia lactiflora*MOL001918paeoniflorgenon
Biała *Paeonia lactiflora*MOL000211Mairin
Atractylodes macrocephalaMOL00002214-acetylo-12-senecyloilo-2E,8Z,10E-atractylentriol
Atractylodes macrocephalaMOL0000493β-acetoksyatraktylon
Menthae HerbaMOL000471aloe-emodyna
Menthae HerbaMOL005190eriodictyol
Chai HuMOL000354izoramnetyna
Chai HuMOL013187Kubebina
Angelica sinensisMOL000449Stygmasterol
Angelica sinensisMOL000358beta-sitosterol
Poria cocosMOL000282ergosta-7,22E-dien-3beta-ol
Poria cocosMOL000283Nadtlenek ergosterolu
LukrecjaMOL002311Glycyrol
LukrecjaMOL0049907,2',4'-trihydroksy-5-metoksy-3-arylukumaryna
Świeży imbirMOL0061296-metylo-iminodioctan
Świeży imbirMOL001771poriferast-5-en-3beta-ol

Tabela 1: Składniki aktywne w wybranych lekach chińskich. Pierwsza kolumna zawiera nazwy tradycyjnych leków chińskich, druga kolumna to identyfikator (ID) składnika aktywnego leku chińskiego, a trzecia kolumna to nazwa składnika aktywnego w leku chińskim.

Plik uzupełniający z kodem 1: Kod do łączenia nazw ziół, składników i identyfikatorów celów. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający z kodem 2: Konwersja identyfikatorów celów leków. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Uzupełniający plik z kodem 3: Pliki do analizy sieciowej. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Uzupełniający plik z kodem 4: Konwersja symboli na identyfikatory genów. Aby pobrać ten plik, kliknij tutaj.

Plik uzupełniający z kodem 5: Analiza wzbogacenia GO. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dodatkowy plik z kodem 6: Analiza wzbogacenia KEGG. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

Według statystyk osteoporoza powoduje 1,5 miliona złamań każdego roku w Stanach Zjednoczonych, a zdecydowana większość z nich występujeu kobiet po menopauzie. Przewiduje się, że wraz ze wzrostem starzejącej się populacji większość przyszłych złamań szyjki kości udowej na świecie wystąpi w Azji, a do 2050 r. ich całkowita liczba na świecie osiągnie 8,2 miliona. Koszt zapobiegania złamaniom jest prawie równy kosztom ich leczenia, a stosowanie leków nieuchronnie będzie miało pewne skutki uboczne29. W związku z tym istnieje pilna potrzeba znalezienia bardziej opłacalnego sposobu rozwiązania tego problemu w odpowiedzialnym społeczeństwie.

Tabletki Xiaoyao składają się z ośmiu składników. Badania nad wpływem jego składników na osteoporozę są w toku. Poria cocos hamuje osteoklastogenezę i aktywność osteolityczną w mysim modelu wywołanym osteoporozą po owariektomii30. Połączenie dwóch składników, lukrecji i Shu-di-huang, może wywierać działanie przeciwutleniające poprzez hamowanie szlaku sygnałowego NF-κB31. Tradycyjny chiński tonik ziołowy, Danggui buxue tang, może być przydatny w leczeniu osteoporozy dzięki swojej zdolności do hamowania obrotu kostnego i modulowania regulacji osi podwzgórze-przysadka-gonady (HPG), a tym samym zapobiegania utracie masy kostnej u szczurów po owariektomii32. Wszystkie te wyniki sugerują, że tabletki Xiaoyao mogą mieć terapeutyczny wpływ na osteoporozę. Wyniki tego badania sugerują również, że tabletki Xiaoyao mogą wywierać działanie przeciwosteoporozowe poprzez modulowanie aktywności szlaku sygnałowego IL-17 w sposób przeciwzapalny.

W sumie uzyskano 168 istotnych szlaków sygnałowych z sieci regulacyjnej celów leków i genów związanych z osteoporozą skonstruowanych w tym badaniu, a w tym badaniu dalej badano szlak sygnałowy IL-17. Rodzina IL-17 składa się z sześciu członków, w tym IL-17A-F, z których IL-17A była pierwszą i najważniejszą odkrytą33. We wczesnych badaniach uważano, że IL-17 jest związana z chorobami zapalnymi i autoimmunologicznymi u ludzi. Później badania sugerowały, że odgrywa rolę w utrzymaniu integralności bariery, a także stwierdzono, że jest związany z rakiem15. Jednak, chociaż nie odgrywa fizjologicznej roli w przebudowie kości, zachowuje się inaczej podczas nieprawidłowych warunków kostnych. Ponadto IL-17 może działać jako słaby aktywator i działa synergistycznie z innymi cytokinami w celu zwiększenia produkcji energii. Świadczy o tym jego koaktywacja z TNFα15,34.

Eksperymentyin vitro wykazały, że IL-17 może indukować proliferację i różnicowanie osteoblastycznychMSCs 35, a także może hamować indukowane przez BMP-2 różnicowanie pierwotnych osteoblastów szczurów36. IL-17 może stymulować osteoblasty do ekspresji RANKL, co z kolei sprzyja osteoklastogenezie, ale efekt ten wydaje się być zależny od obecności osteoblastów37,38. W tym badaniu różne stężenia tabletek Xiaoyao przyniosły efekty terapeutyczne na myszach modelowych PMOM, zwłaszcza gdy były stosowane w wyższych stężeniach. IL-17, Act1 i IL-6, które są skorelowane ze szlakiem sygnałowym IL-17, były znacznie zmniejszone u tych myszy w porównaniu z grupą kontrolną. Kiedy oceniono wyniki analizy wzbogacenia, sugerowały one udział szlaku IL-17, gdy zwierzęta były leczone tabletkami Xiaoyao.

W tym badaniu przetestowano również niektóre markery konwersji kostnej. ALP jest tetramerycznym enzymem związanym z błoną, który może być wydzielany przez osteoblasty i odgrywa ważną rolę w tworzeniu i mineralizacji kości poprzez degradację inhibitora mineralizacji, pirofosforanu39. Około 90% frakcji organicznej w macierzy zewnątrzkomórkowej tkanek kostnych składa się z COL-1, a podczas mineralizacji kości kolagen odgrywa w tym procesie kluczową rolę40. W wyniku tego badania poziomy ekspresji białek ALP i COL-1, obserwowane przez immunohistochemię myszy w grupie leku, były wyższe niż w grupie modelowej, co sugeruje, że wpływ tabletek Xiaoyao na złagodzenie osteoporozy można osiągnąć poprzez zwiększenie wskaźników genów osteogennych. Niektórzy uczeni wykazali, że ekspresja i aktywność transkrypcyjna receptora estrogenowego hepatocytów (ERα) może być regulowana w górę przez Xiaoyao san41. Wykazano, że ekstrakty z arcydzięgla chińskiego, białej Paeonii lactiflora i lukrecji w Xiaoyao san mają aktywność podobną do estrogenu. Te same składniki są również obecne w tabletkach Xiaoyao użytych w tym badaniu, które są wytwarzane na receptę Xiaoyao san przy użyciu nowoczesnych metod przygotowania. Dlatego można postawić hipotezę, że tabletki Xiaoyao mogą również zwiększać ekspresję genów osteogennych, takich jak ALP i COL-1 , wywierając działanie podobne do estrogenu na osteoblasty w celu zwiększenia ich aktywności i poprawy jakości kości.

W badaniu tym z powodzeniem ustanowiono model PMOM u myszy poprzez usunięcie obu jajników za pomocą jajnikomii grzbietowej. Model zwierzęcy jest podstawą dla wszystkich kolejnych eksperymentów w tym badaniu. Podczas chirurgicznego usuwania jajników myszy ważne było, aby upewnić się, że jajniki myszy w grupach OVX i leków zostały całkowicie usunięte, podczas gdy w grupie pozorowanej usunięto tylko tłuszcz w pobliżu jajników, a także ważne było, aby uniknąć infekcji ran.

Liczba beleczków kostnych i gęstość połączeń myszy uległy poprawie po leczeniu owariektomii tabletkami Xiaoyao, co sugerowało, że lek ten ma terapeutyczny wpływ na osteoporozę. Immunohistochemia i immunocytochemia zostały wykorzystane do oceny skuteczności leczenia w tym badaniu; Czas działania różnych odczynników nie jest bezwzględny, zwłaszcza w procesie opracowywania koloru, który wymaga obserwacji w czasie rzeczywistym i szybkiej reakcji, aby zapewnić najlepsze wyniki. Podczas inkubacji przeciwciał najpierw ustawia się gradient stężenia przeciwciał, a po obserwacji i porównaniu wybiera się najbardziej odpowiednie stężenie do kolejnych eksperymentów.

W tym badaniu wystąpiły jednak pewne ograniczenia. Dane z farmakologii internetowej miały tylko jedno źródło danych, a analiza składu leku pochodziła tylko z jednej bazy danych. Ponadto skuteczność tabletek Xiaoyao nie została porównana z pozytywnymi lekami w tym badaniu i nie było możliwe oszacowanie konkretnych różnic między tabletkami Xiaoyao a obecnymi metodami leczenia.

W przypadku PMOM dostępną opcją leczenia pierwszego rzutu są bisfosfoniany. Jednak stosowanie tych leków może prowadzić do przeciwwskazań żołądkowo-jelitowych, a nawet poważniejszych nietypowych złamań kości udowej i martwicy kości szczęk42,43. Opcje leczenia drugiego rzutu obejmują stosowanie denosumabu i terapii hormonalnej. Wykazano, że denosumab zmniejsza liczbę złamań szyjki kości udowej, kręgów i innych kręgów. Jednak po odstawieniu leku może dojść do nawrotu, a im dłuższy czas trwania odstawienia, tym większa utrata gęstości kości 42,44,45. Hormonalna terapia menopauzalna zmniejsza ryzyko złamań osteoporotycznych kręgosłupa, ale jej skutki są ograniczone do wieku, a długoterminowe ryzyko wydaje się przeważaćnad korzyściami. Terapia sekwencyjna jest długoterminową opcją leczenia PMOM, w której stosowanie leków tworzących kości, a następnie leków przeciwresorpcyjnych może osiągnąć największy wzrost masy kostnej. Konkretne leki są zwykle ustalane indywidualnie dla każdego pacjenta42.

W związku z tym można założyć, że tradycyjne zioła chińskie mogą mieć korzystny potencjał w leczeniu osteoporozy. Sposób działania ziołolecznictwa jest wielościeżkowy i wielokierunkowy, a nie działa za pośrednictwem jednego mechanizmu47. Niektórzy uczeni ocenili skuteczność i bezpieczeństwo niektórych chińskich leków ziołowych i wykazali, że liczba złamań podczas stosowania kombinacji leków chińskich i zachodnich w porównaniu z podawaniem tylko medycyny chińskiej była niższa niż w grupie48 osób stosujących samą medycynę zachodnią. W porównaniu z lekami chemicznymi, chińskie leki ziołowe mają mniej skutków ubocznych, są stosunkowo niedrogie i nadają się do długotrwałego stosowania. Chińskie leki ziołowe nie tylko naprawiają mikrostrukturę kości i zwiększają objętość kości, ale mogą również zmniejszać lub eliminować objawy osłabienia kręgosłupa lędźwiowego i bólu pleców49. Obecne badanie może pomóc w określeniu możliwego podejścia do odkrywania nowych leków i metod leczenia.

Zastosowanie tabletek Xiaoyao w leczeniu PMOM wydaje się być obiecujące. W niniejszym badaniu tabletki mogą poprawić masę kostną i jakość kości w mysim modelu PMOM poprzez tłumienie stanu zapalnego. Niektórzy uczeni sugerowali nawet, że połączenie medycyny chińskiej i akupunktury może być skuteczne w leczeniu PMOM50. Jednocześnie udowodniono, że połączenie medycyny chińskiej i zachodniej jest skuteczne51. Oba te możliwe środki zaradcze są ważne, chociaż każde zalecane leczenie przy użyciu tabletek Xiaoyao w połączeniu z akupunkturą i medycyną zachodnią powinno zostać potwierdzone przez badania kliniczne. Kliniczne znaczenie osteoporozy polega na złamaniach kości, a przyszłe badania powinny również koncentrować się na ich zapobieganiu.

Podsumowując, badanie to wykazało poprzez farmakologię sieciową i eksperymenty na zwierzętach, że myszy PMOM wykazały znaczną poprawę metabolizmu kości i zwiększoną masę kostną po leczeniu tabletkami Xiaoyao. Mechanizm działania tego zjawiska może być związany z hamowaniem szlaku sygnałowego IL-17 i wzmocnieniem czynników osteogennych, ALP i aktywności COL-1. Badanie to stanowi teoretyczne podstawy i eksperymentalne podstawy do klinicznego zastosowania tabletek Xiaoyao w leczeniu chorób związanych z osteoporozą.

Oświadczenia

Autorzy deklarują, że nie ma konfliktu interesów.

Podziękowania

Program Badań Naukowych i Rozwoju Technologii Miasta Baise (20224128) wspierał tę pracę. Autorzy dziękują dr Dev Sooranna z Imperial College London i YMUN za redakcję manuskryptu. YYX i ZYW wniosły równy wkład w to badanie.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Próbnik 1 mlGuangxi Beilunhe Medical Industrial Group Co.JYQ001Do znieczulenia u myszy
4% poliformaldehydBeijing Solarbio Science & Technologia Co., Sp. z o.o.P1110Do mocowania tkanek
6-0 wchłanialny szew (igła kątowa)Shanghai Pudong Jinhuan Medical Supplies Co.HZX-06Do szycia pooperacyjnego
Chłonny wacikZwycięzcaMIANQIU-500gDo sterylizacji i hemostazy
Szkiełka samoprzylepneJiangsu Shitai Experimental Equipment Co.188105Do cięcia tkanek
AmobarbitalSigma Aldrich (Shanghai) Trading Co.A-020-1MLDo znieczulenia u myszy
Roztwór do niebieszczeniaBeijing Solarbio Science & Technologia Co., Sp. z o.o.G1866Niebieskie zabarwienie jąder komórek po działaniu roztworu różnicowania hematoksyliny
C57BL / 6 myszyBeijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd.(SCXK 2033-0063)Do stosowania w eksperymentach na zwierzętach
Ostrza chirurgiczne ze stali węglowejPremier Medical Equipment Co.SP239Do chirurgii myszy
CIKS/TRAF3IP2 Królicze przeciwciała biosowe pAbbs-6202RWiąże się z Act1 w tkankach
Roztwór hematoksyliny Cole'a (do barwienia konwencjonalnego)Beijing Solarbio Science & Technologia Co., Sp. z o.o.G1140Do barwienia skrawków parafiny
Kolagen typu I Przeciwciało poliklonalneproteintech14695-1-APWiąże się z COL-1 w tkankach
Zestaw substratów DAB, 20xBeijing Solarbio Science & Technologia Co., Sp. z o.o.DA1010Do opracowywania koloru tkanek
Jednorazowy arkusz chirurgiczny 50 * 60 CMNanchang Xuhui Medical Equipment Co.SP4529777Do chirurgii myszy
Roztwór odwapniający EDTA (pH 7,2)Beijing Solarbio Science & Technologia Co., Sp. z o.o.E1171-500mlDo odwapniania tkanek
Wzmocniony endogenny bufor do pęcherzyków peroksydazyBeyotime BiotechnologyP0100BSekwestracja tkanek lub komórkowych endogennych peroksydaz
Przyjazny dla środowiska przezroczysty płyn do odparafinowaniaServicebioG1128-1LDo odparafinowania skrawków parafiny
Alkohol etylowyCHRON CHEMICALS64-17-5 (CAS)Do odwadniania skrawki parafiny
Rozcieńczalnik przeciwciał ogólnego przeznaczeniaEpizyme BiotechPS119LDo rozcieńczania przeciwciał
Roztwór do różnicowania HematoksylinyServicebioG1039-500MLDo różnicowania po barwieniu hematoksyliną i usuwania nadmiernie związanego i niespecyficznie zaadsorbowanego barwnika z tkanek
Zestaw do barwienia Hematoksyliny Eozyny (HE) PekinSolarbio Science & Technologia Co., Sp. z o.o.G1120-3 * 100 mlDo barwienia tkanek
Wysokiej jakości rękojeść noża chirurgicznego ze stali nierdzewnejPremier Medical Equipment Co.SP0088Do chirurgii myszy
Affinipure Anti-Rabbit Anti-Rabbit IgG(H+L)proteintech SA00001-2 Do chirurgii myszy sprzężone z HRP Affinipure Goat Anti-Rabbit IgG(H+L)proteintech-2Wiąże się z przeciwciałem pierwotnym i wzmacnia sygnał
IL-17A Przeciwciało poliklonalneproteintech13082-1-AP
Wiąże się z IL-6 w tkankach
Długopis immunohistochemicznyPekin Zhongshan Jinqiao Biotechnology Co.ZLI-9305 (YA0310)Do rysowania okręgów w immunohistochemii
Medyczny szew chirurgiczny Niechłonny (kulka) 5-0 3,5 mYangzhou Yuanlikang Medical Equipment Co.FHX-5-2Do pooperacyjnego szycia
Igły do szwów medycznych Igły kątowe 4 * 10 3/8Chaohu Binxiong Medical Equipment Co.FHZ612-4Do pooperacyjnego szycia
neutralnego balsamuBeijing Solarbio Science & Technologia Co., Sp. z o.o.G8590Jako zgrzewarka do plastrów
PBS(1X)Shenzhen Mohong Technology Co., LtdB0015Bufor do mycia szkiełek i częściowego rozcieńczania roztworu
Bezbiałkowy bufor szybkiego blokowania (1X)Epizyme BiotechPS108PUnikanie niespecyficznego wiązania białek
Przeciwciało przeciw fosfatazie alkalicznej przeciwkostnej królikaPRZECIWCIAŁA BIOSSBS-6292RWiąże się z fosfatazą alkaliczną w tkankach
stowarzyszony z soląYoujiang Uniwersytet Medyczny dla narodowościLHN500Dla zwierząt przez zgłębnik
Golenie/maszynki do strzyżeniaelektrycznego HANGZHOU HUAYUAN PET PRODUCTS CO., LTD.DTJ-002Do golenia myszy
Uchwyt na igłę medyczną ze stali nierdzewnej 14 cm Gruba igłaPremier Medical Equipment Co.SP784Do chirurgii myszy
Kleszcze okulistyczne ze stali nierdzewnej 10,5 cm zakrzywione (bez haczyka)ZhuoyouyueYKNWW-10,5Do chirurgii myszy
Nożyczki okulistyczne ze stali nierdzewnej / nożyczki chirurgiczne 10 CM Prosta końcówkaPremier Medical Equipment Co.ZYJD-10-ZJDo chirurgii myszy
Końcówka ze stali nierdzewnej Igła żołądkowa 12 Gauge 55mm KolankoGWJ-12-55WDo stosowania u myszy przez zgłębnik
Tris-EDTA Antigen Repair Fluid (50x)proteintechPR30002Do antygenowej naprawy skrawków parafiny
Drewniana deska sekcyjna 25 * 16 cmJP16 * 24Do chirurgii myszy
Xiaoyao tabletkiJiuzhitang Co., Ltd.YPG-041Do dostarczania leków dla zwierząt
Others
R 4.3.1Przetwarzanie danych
Cytoscape3.9.1National Resource for Network BiologyBudowa sieci sieci
ImageJ 1.54fNational Institutes of HealthPrzetwarzanie obrazów dla wyniki immunohistochemii
Adobe Photoshop 24.0.0AdobeDo kombinacji obrazów
GraphpadPrism 9.5Oprogramowanie GraphPadAnaliza statystyczna
komórek danych WymiarOLYMPUSDo krojenia i fotografowania
OLYMPUS BX53OLYMPUSDo barwienia HE i fotografii przekroju immunohistochemicznego
Szpital

Bibliografia

  1. Kanis, J. A., Melton, L. J. 3rd, Christiansen, C., Johnston, C. C., Khaltaev, N. The diagnosis of osteoporosis. J Bone Miner Res. 9 (8), 1137-1141 (1994).
  2. Amin, U., Mcpartland, A., O'sullivan, M., Silke, C. An overview of the management of osteoporosis in the aging female population. Womens Health (Lond). 19, 17455057231176655(2023).
  3. Słupski, W., Jawień, P., Nowak, B. Botanicals in postmenopausal osteoporosis. Nutrients. 13 (5), 1609(2021).
  4. Sharma, A., et al. Understanding the mechanistic potential of plant based phytochemicals in management of postmenopausal osteoporosis. Biomed Pharmacother. 163, 114850(2023).
  5. Pharmacopoeia of people's republic of china. Chinese Pharmacopeia Commission. , (2020).
  6. Ji, Y., et al. Xiaoyao pills ameliorate depression-like behaviors and oxidative stress induced by olfactory bulbectomy in rats via the activation of the pik3ca-akt1-nfe2l2/bdnf signaling pathway. Front Pharmacol. 12, 643456(2021).
  7. Lencel, P., Magne, D. Inflammaging: The driving force in osteoporosis. Med Hypotheses. 76 (3), 317-321 (2011).
  8. Daoussis, D., Andonopoulos, A. P., Liossis, S. N. Wnt pathway and il-17: Novel regulators of joint remodeling in rheumatic diseases. Looking beyond the rank-rankl-opg axis. Semin Arthritis Rheum. 39 (5), 369-383 (2010).
  9. Amarasekara, D. S., et al. Regulation of osteoclast differentiation by cytokine networks. Immune Netw. 18 (1), e8(2018).
  10. Amatya, N., Garg, A. V., Gaffen, S. L. Il-17 signaling: The yin and the yang. Trends Immunol. 38 (5), 310-322 (2017).
  11. Shi, B., et al. Xiaoyao pills prevent lipopolysaccharide-induced depression by inhibiting inflammation and protecting nerves. Front Pharmacol. 10, 1324(2019).
  12. Fang, Y., et al. Xiaoyao pills attenuate inflammation and nerve injury induced by lipopolysaccharide in hippocampal neurons in vitro. Neural Plast. 2020, 8841332(2020).
  13. Zhang, X., et al. Effect of xiaoyao pills on fecal endogenous metabolites in rats with metabolism-associated steatohepatitis. J Shanxi Med University. 55, 36-43 (2024).
  14. Xiao, J., et al. Il-17 in osteoarthritis: A narrative review. Open Life Sci. 18 (1), 20220747(2023).
  15. Mcgeachy, M. J., Cua, D. J., Gaffen, S. L. The il-17 family of cytokines in health and disease. Immunity. 50 (4), 892-906 (2019).
  16. Ru, J., et al. Tcmsp: A database of systems pharmacology for drug discovery from herbal medicines. J Cheminform. 6, 13(2014).
  17. Wang, T., et al. Exploring the mechanism of luteolin by regulating microglia polarization based on network pharmacology and in vitro experiments. Sci Rep. 13 (1), 13767(2023).
  18. UniProt Consortium. UniProt: The universal protein knowledgebase in 2023. Nucleic Acids Res. 51 (D1), D523-D531 (2023).
  19. Barshir, R., et al. Genecarna: A comprehensive gene-centric database of human non-coding rnas in the genecards suite. J Mol Biol. 433 (11), 166913(2021).
  20. Wang, T., Jiang, X., Lu, Y., Ruan, Y., Wang, J. Identification and integration analysis of a novel prognostic signature associated with cuproptosis-related ferroptosis genes and relevant lncrna regulatory axis in lung adenocarcinoma. Aging (Albany NY). 15 (5), 1543-1563 (2023).
  21. Amberger, J. S., Bocchini, C. A., Scott, A. F., Hamosh, A. Omim.Org: Leveraging knowledge across phenotype-gene relationships. Nuc Acid Res. 47 (D1), D1038-D1043 (2019).
  22. Whirl-Carrillo, M., et al. An evidence-based framework for evaluating pharmacogenomics knowledge for personalized medicine. Clin Pharmacol Ther. 110 (3), 563-572 (2021).
  23. Zhou, Y., et al. Ttd: Therapeutic target database describing target druggability information. Nucleic Acids Res. 52 (D1), D1465-D1477 (2024).
  24. Knox, C., et al. Drugbank 6.0: The drugbank knowledgebase for 2024. Nuc Acid Res. 52 (D1), D1265-D1275 (2024).
  25. Rendi, M. H., Muehlenbachs, A., Garcia, R. L., Boyd, K. L. Comparative anatomy and histology a mouse and human atlas. Chapter 17, Academic Press. 253-284 (2012).
  26. Chen, S. X. R. B. X. Pharmacology experimental methodology. , People's Medical Publishing House Co. Ltd. (2002).
  27. Black, D. M., Rosen, C. J. Clinical practice. Postmenopausal osteoporosis. N Engl J Med. 374 (3), 254-262 (2016).
  28. Cummings, S. R., Melton, L. J. Epidemiology and outcomes of osteoporotic fractures. Lancet. 359 (9319), 1761-1767 (2002).
  29. Walker, M. D., Shane, E. Postmenopausal osteoporosis. N Engl J Med. 389 (21), 1979-1991 (2023).
  30. Hwang, Y. H., Jang, S. A., Lee, A., Kim, T., Ha, H. Poria cocos ameliorates bone loss in ovariectomized mice and inhibits osteoclastogenesis in vitro. Nutrients. 12 (5), 1383(2020).
  31. Ling, X., et al. Shu-di-huang and gan-cao herb pair restored the differentiation potentials of mesenchymal stem progenitors in treating osteoporosis via downregulation of nf-κb signaling pathway. Evid Based Complement Alternat Med. 2021, 7795527(2021).
  32. Zhou, L. P., et al. protective effects of danggui buxue tang alone and in combination with tamoxifen or raloxifene in vivo and in vitro. Front Pharmacol. 9, 779(2018).
  33. Huangfu, L., Li, R., Huang, Y., Wang, S. The il-17 family in diseases: From bench to bedside. Signal Transduct Target Ther. 8 (1), 402(2023).
  34. Majumder, S., Mcgeachy, M. J. Il-17 in the pathogenesis of disease: Good intentions gone awry. Annu Rev Immunol. 39, 537-556 (2021).
  35. Le Goff, B., et al. Implication of il-17 in bone loss and structural damage in inflammatory rheumatic diseases. Mediators Inflamm. 2019, 8659302(2019).
  36. Zhang, J. R., et al. Different modulatory effects of il-17, il-22, and il-23 on osteoblast differentiation. Mediators Inflamm. 2017, 5950395(2017).
  37. Peng, R., et al. Il-17 promotes osteoclast-induced bone loss by regulating glutamine-dependent energy metabolism. Cell Death Dis. 15 (2), 111(2024).
  38. Sato, K., et al. Th17 functions as an osteoclastogenic helper t cell subset that links t cell activation and bone destruction. J Exp Med. 203 (12), 2673-2682 (2006).
  39. Shetty, S., Kapoor, N., Bondu, J. D., Thomas, N., Paul, T. V. Bone turnover markers: Emerging tool in the management of osteoporosis. Indian J Endocrinol Metab. 20 (6), 846-852 (2016).
  40. Selvaraj, V., Sekaran, S., Dhanasekaran, A., Warrier, S. Type 1 collagen: Synthesis, structure and key functions in bone mineralization. Differentiation. 136, 100757(2024).
  41. Hu, T., et al. Xiaoyao san attenuates hepatic steatosis through estrogen receptor α pathway in ovariectomized apoe-/- mice. J Ethnopharmacol. 282, 114612(2022).
  42. Ramchand, S. K., Leder, B. Z. Sequential therapy for the long-term treatment of postmenopausal osteoporosis. J Clin Endocrinol Metab. 109 (2), 303-311 (2024).
  43. Schroeder, R. J., et al. Oral therapeutics post menopausal osteoporosis. Cureus. 15 (8), e42870(2023).
  44. Patel, D., Gorrell, C., Norris, J., Liu, J. A narrative review of the pharmaceutical management of osteoporosis. Ann Jt. 8, 25(2023).
  45. Minisola, S. Denosumab discontinuation: Covid-19 pandemic and beyond. JBMR Plus. 8 (7), ziae046(2024).
  46. ACOG Committee on Clinical Practice Guidelines-Gynecology. Management of postmenopausal osteoporosis: ACOG clinical practice guideline no. 2. Obstet Gynecol. 139 (4), 698-717 (2022).
  47. Peng, Z., Xu, R., You, Q. Role of traditional Chinese medicine in bone regeneration and osteoporosis. Front Bioeng Biotechnol. 10, 911326(2022).
  48. Li, J., et al. Clinical practice of traditional Chinese medicine for the treatment of postmenopausal osteoporosis: A literature review. Climacteric. 25 (6), 562-569 (2022).
  49. Zhang, N. D., et al. Traditional Chinese medicine formulas for the treatment of osteoporosis: Implication for antiosteoporotic drug discovery. J Ethnopharmacol. 189, 61-80 (2016).
  50. Ping, R., et al. Identifying the effective combination of acupuncture and traditional Chinese medicinal herbs for postmenopausal osteoporosis therapy through studies of their molecular regulation of bone homeostasis. J Tradit Chin Med. 44 (1), 212-219 (2024).
  51. Li, B., Jiang, C., Zhan, X. Combined therapy of yishen zhuanggu decoction and caltrate d600 alleviates postmenopausal osteoporosis by targeting foxo3a and activating the wnt/β-catenin pathway. Evid Based Complement Alternat Med. 2022, 7732508(2022).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Myszy po owariektomiisygnalizacja IL-17immunohistochemiabeleczki kostnekolagen typu Ifosfataza alkalicznabarwienie hematoksyliną i eozyną
Badania nad przeciwzapalnym działaniem tabletek Xiaoyao w leczeniu osteoporozy pomenopauzalnej u myszy
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.