Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Laserowa ablacja komórek w nienaruszonych larwach Drosophila ujawnia konkurencję synaptyczną

1.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/67053

⸱

26 lipca 2024

 ,  , 
1Stiles-Nicholson Brain Institute, Florida Atlantic University, 2Department of Biological Sciences, Florida Atlantic University

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół demonstruje laserową ablację komórek pojedynczych neuronów u nienaruszonych larw Drosophila. Metoda umożliwia badanie efektu zmniejszenia konkurencji między neuronami w rozwijającym się układzie nerwowym.

Streszczenie

Protokół opisuje ablację pojedynczego neuronu za pomocą 2-fotonowego systemu laserowego w ośrodkowym układzie nerwowym (OUN) nienaruszonych larw Drosophila melanogaster. Za pomocą tej nieinwazyjnej metody można manipulować rozwijającym się układem nerwowym w sposób specyficzny dla komórki. Zakłócenie rozwoju pojedynczych neuronów w sieci może być wykorzystane do zbadania, w jaki sposób układ nerwowy może zrekompensować utratę danych synaptycznych. Poszczególne neurony zostały specjalnie poddane ablacji w systemie włókien olbrzymich Drosophila, ze szczególnym uwzględnieniem dwóch neuronów: presynaptycznego włókna olbrzymiego (GF) i postsynaptycznego neuronu ruchowego tergotrochantera (TTMn). GF łączy się z ipsilateralnym TTMn, co ma kluczowe znaczenie dla odpowiedzi ucieczki. Ablacja jednego z GF w 3. stadium mózgu, tuż po tym, jak GF zaczyna rosnąć aksonalnie, trwale usuwa komórkę podczas rozwoju OUN. Pozostały GF reaguje na nieobecnego sąsiada i tworzy ektopowe zakończenie synaptyczne do przeciwległego TTMn. To nietypowe, obustronnie symetryczne zakończenie unerwia oba TTMn, jak wykazano za pomocą sprzężenia barwnika, i steruje obydwoma neuronami ruchowymi, jak wykazano za pomocą testów elektrofizjologicznych. Podsumowując, ablacja pojedynczego interneuronu wykazuje konkurencję synaptyczną między obustronną parą neuronów, która może zrekompensować utratę jednego neuronu i przywrócić normalne reakcje na obwód ucieczki.

Wprowadzenie

Ablacja laserowa jest preferowanym narzędziem do badania obwodów neuronowych w wielu różnych organizmach. Opracowany w modelowych systemach genetycznych, takich jak robaki i muchy, został zastosowany w całym królestwie zwierząt do badania struktury, funkcji i rozwoju układu nerwowego1,2,3. W tym przypadku zastosowano ablację pojedynczego neuronu w celu zbadania, w jaki sposób neurony oddziałują na siebie podczas składania obwodów u Drosophila. System ucieczki muchy jest ulubionym obwodem do analizy, ponieważ zawiera największe neurony i największe synapsy u dorosłej muchy, a obwód ten został dobrze scharakteryzowany w ciągu ostatnich dziesięcioleci4. Rola, jaką interakcje neuron-neuron odgrywają w tworzeniu obwodu Giant Fiber, jest centralnym punktem tych badań.

Jednym z typów interakcji, który jest centralnym punktem w neuronauce od czasu pracy Hubela i Wiesela w latach 60., jest "konkurencja synaptyczna"5,6. W tym protokole ablacja laserowa została wykorzystana do ponownego zbadania roli konkurencji poprzez ablację pojedynczych komórek w systemie gigantycznych włókien (GFS) Drosophila, gdzie można odkryć molekularne podstawy tego zjawiska.

Ablacja neuronów u rozwijającej się muchy była trudna z wielu powodów, w tym wizualizacji docelowych neuronów, precyzji metody ablacji i przeżycia próbki. Aby przezwyciężyć te problemy w GFS, do oznaczania interesujących neuronów użyto systemu UAS/Gal47, a mikroskop dwufotonowy został użyty do usunięcia presynaptycznego włókna olbrzymiego lub postsynaptycznego neuronu ruchowego skoku (TTMn).

W tym badaniu, aby określić rolę, jaką odgrywają sąsiednie neurony obustronne w dostosowywaniu połączeń synaptycznych i siły synaps w GFS, jedna z obustronnych par neuronów (presynaptyczny GF lub postsynaptyczny neuron ruchowy) została usunięta tuż przed rozwojem poczwarki. Na tym etapie rozwoju aksonogeneza GF nie została zakończona8. Następnie zbadano strukturę i funkcję obwodu synaptycznego u osoby dorosłej, zwracając szczególną uwagę na wydajność pozostałej GF.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie zwierzęta wykorzystane w protokole należały do gatunku Drosophila melanogaster. Wykorzystanie tego gatunku nie budzi żadnych kwestii etycznych. Przeprowadzenie tych badań nie wymagało zgody komisji etycznej. Szczegółowe informacje o gatunku Drosophila, odczynnikach i sprzęcie użytych w badaniu znajdują się w Tabeli materiałów.

1. Hodowla Drosophila i wybór odpowiedniego stadium larwalnego

  1. Wybierz linię sterownika Gal4, która kieruje ekspresją w komórkach przeznaczonych do ablacji, i skrzyżuj ją z linią reporterową UAS-GFP. Hoduj muchy na standardowej pożywce w temperaturze 25 °C.
    UWAGA: W przypadku ablacji włókien olbrzymich (GF) zastosowano rekombinację R91H05-Gal4 lub A307-Gal4 z UAS-GFP. Do ablacji TTMn wykorzystano ShakB(lethal)-GAL4 rekombinowany z UAS-GFP (patrz Tabela materiałów).
  2. Wybierz larwy, które zaczęły wynurzać się z pożywki i pełzać po ściankach fiolki. Larwy te znajdują się w stadium wędrownym, które jest preferowanym etapem do przeprowadzania ablacji komórek GF.
    UWAGA: Ablację można przeprowadzić na każdym etapie rozwoju larwalnego. Ostatnie stadium larwalne było istotne dla manipulacji rozwojem GFS, ponieważ ciała komórek GF można łatwo zidentyfikować w mózgu, natomiast aksony GF nie utworzyły jeszcze w tym stadium połączeń z ich celami.

2. Przygotowanie 3rd stadium larwalne

UWAGA: Larwy zostały znieczulone metodą podobną do Burra i wsp.9. Aby skrócić czas trwania procedury, należy przygotowywać tylko jedną larwę na raz. Krótka ekspozycja na środek znieczulający zwiększy przeżywalność zwierząt doświadczalnych10.

  1. Przygotować szklaną płytkę z dopasowaną pokrywką. Włożyć do płytki kulkę waty, a następnie, pracując pod dygestorium, dodać około 3–5 ml eteru etylowego (ciecz niebezpieczna, łatwopalna; wymagany fartuch laboratoryjny, rękawiczki i okulary ochronne). Przykryć płytkę pokrywką.
  2. Pobierz osobnika 3Badań i rozwoju larwy w stadium trzecim z fiolek z muchami. W 3.rd stadium larwalne, larwy opuszczają podłoże pożywkowe i pełzną w górę wzdłuż ścianki fiolki z pożywką11.
    1. Należy upewnić się, że larwy nadal się poruszają i nie rozpoczęły procesu formowania puparium. Larwy nieruchome, wykazujące skrócenie ciała, rozpoczynają przepociwawianie i nie nadają się do ablacji. Larwy należy pobrać za pomocą małego pędzla.
      UWAGA: 3rd stadium larwalne rozpoczyna się po drugiej linie w 72. godzinie rozwoju (po zniesieniu jaj) i trwa do powstania puparium w 120. godzinie dla much hodowanych w 25 °C.
  3. Przenieś jedną larwę do małego, otwartego pojemnika. Umieść pojemnik w szklanym naczyniu z eterem etylowym i szczelnie zamknij naczynie. Podczas otwierania szklanego naczynia należy umieścić je pod wyciągiem punktowym lub w dygestorium, aby zapobiec ucieczce oparów.
    1. W odstępach 30 s należy wyjmować z naczynia pokrywkę z larwą i sprawdzać ruchomość larwy pod mikroskopem stereoskopowym. Larwa zazwyczaj zostaje unieruchomiona w ciągu 1 min. Gdy haczyki gębowe przestaną drgać, larwa jest gotowa do montowania. Larwy, które nie zostały całkowicie unieruchomione po 3 min, należy odrzucić.
      UWAGA: Jako pojemnik można wykorzystać górną część odwróconej do góry dnem zakrętki probówki do mikrocentryfugi (po zdjęciu zakrętki z probówki).

3. Montowanie larw na szkiełkach do ablacji

  1. Umieść znieczuloną larwę na szklanym przeźroczniku mikroskopowym. Zanurz larwę w kropli soli fizjologicznej dla owadów; pozwoli to usunąć resztki pokarmu, które mogą przylegać do ciała larwy.
  2. Pod mikroskopem dissectnym usuń większość soli fizjologicznej za pomocą ręcznika papierowego. Ułóż larwę grzbietem do góry w przypadku ablacji GF lub brzuchem do góry w przypadku ablacji TTMn. Powoli nałóż na larwę szklaną lamelkę. Dodaj sól fizjologiczną z boku lamelki, aby wypełnić przestrzeń między przeźrocznikiem a lamelką.
  3. W przypadku ablacji GF sprawdź położenie mózgu przy dużym powiększeniu pod mikroskopem dissectnym. Upewnij się, że mózg leży poziomo i jest widoczny przez kutykulę. Często mózg jest pokryty tkanką tłuszczową, co uniemożliwia wizualizację i ablację komórek.
    1. Aby przesunąć tkankę tłuszczową pokrywającą mózg, wywrzyj lekki nacisk na lamelkę za pomocą pęsety i przesuwaj ją z boku na bok. Jeśli tkanki tłuszczowej nie można w ten sposób odsunąć od mózgu, użyj innej larwy.

4. Lokalizacja komórek docelowych

UWAGA: System wielofotonowy wykorzystany w tej badaniu został zamontowany na mikroskopie odwróconym. Do sterowania akwizycją oraz ustawieniami stymulacji laserowej użyto specjalistycznego oprogramowania systemowego. System był wyposażony w źródło światła epifluorescencyjnego do lokalizacji próbek. Obiektyw był soczewką imersyjną w wodzie o powiększeniu 25x, długiej odległości roboczej 2 mm i aperturze numeryczną NA 1,10.

  1. Umieść próbkę na stoliku mikroskopu wielofotonowego i użyj filtra GFP, aby zlokalizować próbkę w trybie epifluorescencji. W przypadku ablacji GF ciała komórek można zidentyfikować w mózgu, jak pokazano na Rysunku 1A,C,D. W przypadku ablacji TTMn od strony brzusznej w brzusznym sznurze nerwowym (VNC) można zidentyfikować skupisko czterech komórek, jak pokazano na Rysunku 1A,B. Po ustawieniu ostrości wyśrodkuj komórki w polu widzenia i przełącz urządzenie w tryb 2-fotonowy.

5. Konfiguracja parametrów ablacji

  1. Dostrój ustawienia lasera oraz wzmocnienie detektora, aby zobrazować komórki wykazujące ekspresję GFP za pomocą skanera Galvano. Do wizualizacji sygnału GFP najlepiej sprawdza się długość fali 870 nm. Wyśrodkuj komórkę w polu widzenia.
  2. Użyj okrągłego obszaru zainteresowania (ROI), aby zdefiniować miejsce ablacji. Upewnij się, że ROI obejmuje większość powierzchni komórki (Rysunek 1E,G).
  3. Skonfiguruj protokół ablacji w oprogramowaniu. Ustaw jedną klatkę akwizycji, następnie stymulację, a po niej kolejną klatkę akwizycji.
  4. Rozpocznij ustawianie mocy lasera stymulującego od niskiej wartości (10%-20 %) i uruchom protokół stymulacji. Pomyślną ablację można rozpoznać po wyraźnym okręgu w centrum somy komórki w miejscu ROI oraz zwiększeniu fluorescencji wokół ROI (Rysunek 1F).
    1. Jeśli ablacja nie powiodła się i nastąpiło jedynie wybielenie komórki (Rysunek 1H), zwiększ moc lasera o 5% lub zwiększ liczbę pętli pojedynczo, a następnie ponownie uruchom protokół. W systemie użytym w niniejszym protokole zastosowana moc lasera wynosiła od 10% do 40%.
      UWAGA: Ustawienia mocy lasera do ablacji w dużej mierze zależą od głębokości położenia komórek w tkance oraz od innych czynników, takich jak pofałdowanie kutykuli. Jeśli komórki są jasne i wyraźnie widoczne, moc lasera będzie znajdować się w dolnym zakresie. Moc lasera będzie się różnić dla każdego systemu w zależności od modelu oraz wieku lasera.

Ekspresja GFP w układzie nerwowym muchy; mikroskopia fluorescencyjna ujawnia struktury neuronalne; schemat panelu.
Rycina 1: Identyfikacja neuronów do ablacji laserowej w nienaruszonych larwach L3 Drosophila. (A) Schemat lokalizacji somy włókna olbrzymiego (GF) w mózgu oraz skupiska neuronów ruchowych zawierającego neuron ruchowy tergotrochanteralny (TTMn) w brzuszny sznurze nerwowym (VNC). (B) Projekcja maksymalnej intensywności shakB(lethal)-Gal4 sterującego ekspresją GFP w larwalnym VNC. Linia środkowa jest zaznaczona linią przerywaną. Koło wskazuje skupisko neuronów zawierające TTMn, które są celem ablacji laserowej. Pasek skali: 50 µm. (C) Częściowy widok projekcyjny larwalnego mózgu z ekspresją GFP pod kontrolą A307-Gal4. Koło wskazuje somę GF będącą celem ablacji laserowej. Pasek skali: 50 µm. (D) Projekcja maksymalnej intensywności mózgu z R91H05-Gal4 sterującym UAS-GFP. Oba GF (koła) są możliwe do zidentyfikowania po lokalizacji, kształcie i wielkości. Pasek skali: 50 µm. (E) Powiększony widok somy GF przed ablacją laserową. Purpurowe koło wskazuje obszar docelowy ablacji laserowej. Pasek skali: 10 µm. (F) Powiększony widok somy GF po dostarczeniu zlokalizowanej mocy lasera i udanej ablacji. Pasek skali: 10 µm. (G) Powiększony widok somy GF przed ablacją laserową. Purpurowe koło wskazuje obszar docelowy ablacji laserowej. Pasek skali: 10 µm. (H) Powiększony widok somy GF po dostarczeniu zlokalizowanej mocy lasera i nieudanej ablacji (wyblaknięcie). Pasek skali: 10 µm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.

6. Odzyskiwanie larw

  1. Po pomyślnej ablacji komórki należy zdjąć szkiełko zakrywe i delikatnie przenieść larwy z preparatu do fiolki z pożywką za pomocą pędzelka. Larwy zaczną ponownie pełzać w ciągu 30 min.
    UWAGA: Skrócenie czasu trwania procedury zwiększa przeżywalność zwierząt. Dzięki doświadczeniu eksperyment można przeprowadzić w czasie krótszym niż 10 min.
  2. Kontynuuj hodowlę larw w standardowych warunkach aż do momentu ich wyjścia z poczwarki.

7. Badanie funkcjonalności GFS u dorosłych much

UWAGA: Następujące kroki zostały szczegółowo opisane w pracy Allana i Godenschwege12 oraz Augustina i współpracowników13.

  1. Badaj dorosłe muchy w wieku od 2 do 5 dni po wyjściu z poczwarki. Zestresuj muchy CO2 i zamocuj je na wosku dentystycznym, wciskając odnóża w wosk. Rozczapierz skrzydła pod kątem 90° i utrwal je w tej pozycji za pomocą wosku. Unieruchom głowę, wciskając trąbkę w wosk.
  2. Wprowadź przewody stymulujące do obu oczu, przewód uziemiający do odwłoka oraz szklane elektrody rejestrujące do mięśni skoku (TTMs) po każdej stronie.
  3. Stymuluj obwód GF pojedynczymi impulsami, aby zmierzyć latencję odpowiedzi w obu mięśniach. Stymuluj obwód kolejno seriami impulsów o częstotliwości 100 Hz i 200 Hz, aby zmierzyć następującą częstotliwość dla obu mięśni.

8. Disekcja i znakowanie systemu włókien olbrzymich do obrazowania konfokalnego

UWAGA: Disekcja OUN muchy oraz wstrzykiwanie barwnika zostały szczegółowo opisane przez Boernera i Godenschwege14.

  1. Ostrożnie usuń muchę z wosku dentystycznego za pomocą pęsety i przenieś ją do szalki Petriego wyłożonej elastomerem silikonowym pod stereomikroskopem.
  2. Usuń odnóża, skrzydła i trąbkę za pomocą nożyczek, a następnie użyj szpilek entomologicznych, aby przymocować muchę grzbietem do góry do powłoki elastomerowej.
  3. Wykonaj nacięcie boczne wzdłuż linii środkowej od środka odwłoka, przez cały toraks, aż do szyi, łącząc toraks z głową. Rozchyl ciało muchy za pomocą szpilek entomologicznych. Usuń narządy i gruczoły z ciała muchy, uważając, aby nie uszkodzić układu nerwowego.
    UWAGA: Na tym etapie do aksonów GF można wstrzyknąć barwniki w celu oznakowania GF oraz elektrycznie sprzężonych neuronów13.
  4. Usuń torebkę głowową z głowy, aby odsłonić mózg.

9. Immunohistochemia układu nerwowego

  1. Po wypreparowaniu ośrodkowego układu nerwowego (CNS), utrwalone muchy inkubowano w 4% PFA w PBS przez 45 min w temperaturze pokojowej (RT). Następnie płukano przez 20 min w PBS w RT (3 razy).
  2. Próbkę blokowano przez 1 h w RT w 3% BSA w PBS z 0,5% roztworem detergentu.
  3. Inkubowano przez 2-3 noce w 4 °C w 3% BSA w PBS z 0,3% roztworem detergentu oraz przeciwciałem króliczym anty-GFP (1:500). Następnie płukano przez 20 min w PBS w RT (6 razy).
  4. Inkubowano przez noc w 4 °C w PBS z przeciwciałem anty-króliczym Alexa 488. Następnie płukano przez 20 min w PBS w RT (6 razy).
  5. Próbki odwadniano w szeregu rosnących stężeń etanolu (50%, 70%, 90%, 100% etanolu) przez 10 min na każdym etapie. Usunięto szpilki oraz odcięto odwłok i mięśnie latające. Pozostałą część klatki piersiowej zawierającą układ nerwowy przeniesiono na szkiełko i pokryto medium montażowym, np. salicylanem metylu. Na próbkę nałożono szkiełko nakrywkowe i zabezpieczono je lakierem do paznokci.
  6. Wykonano obrazowanie układu nerwowego przy użyciu mikroskopu konfokalnego w celu analizy anatomii zakończeń GF.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Tę metodę można wykorzystać do manipulowania rozwojem specyficznych sieci neuronalnych w układzie nerwowym Drosophila. Głównym pytaniem badawczym w tym przypadku było tworzenie połączeń synaptycznych. Usunięcie presynaptycznego neuronu GF lub postsynaptycznego neuronu TTMn umożliwiło zbadanie reaktywnej synaptogenezy w tej synapsie centralnej oraz molekularnych mechanizmów kluczowych dla funkcji i rozwoju synaps. Zgodnie z opisem w protokole, przeprowadzono laserową ablację komórkową jednego z neuronów GF lub je...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Ablacja komórek za pomocą mikroskopu 2-fotonowego okazała się bardzo skuteczną metodą manipulowania rozwojem obwodów neuronalnych u Drosophila. Ponieważ ta metoda jest nieinwazyjna, powoduje minimalne szkody u zwierzęcia. Dane potwierdzają przydatność tej specyficznej dla komórki manipulacji znanymi obwodami.

Kluczowe dla powodzenia ablacji był wybór najodpowiedniejszego sterownika Gal4. Ponieważ GFS jest dobrze zbadany, opisano wiele specyficznych linii sterowników Gal4

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Eksperymenty na mikroskopie 2-fotonowym zostały przeprowadzone w FAU Stiles-Nicholson Brain Institute Advanced Cell Imaging Core. Serdecznie dziękujemy Jupiter Life Science Initiative za wsparcie finansowe.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Alexa Fluor 488 AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)Jaxkson ImmunoResearch111-545-003
Anty-zielone białko fluorescencyjne, królikFisher ScientificA111221:500 stężenie
Apo LWD 25x/1.10W ObiektywNikonMRD77220zanurzenie w wodzie duża odległość robocza
Albumina surowicy bydlęcej (BSA)SigmaB4287-25G
Chameleon Ti:Sapphire Vision II Laserowakoherentna
kulka bawełnianaGenesee Scientific51-101
Dextra, tetrametylorodamina, 10 000 MW, lizyna utrwalana (fluoro-rubinowa)Fisher ScientificD1817
soli fizjologicznejod Gu i O'Dowd, 2006
Eter etylowyFisher ScientificE134-1Niebezpieczeństwo, łatwopalna ciecz
Pokarm dla much B (przepis Bloomington)LabExpress7001-NV
Salicylan metyluFisher ScientificO3695-500
Probówka do mikrowirówek 1,5 mlEppendorf22363204
Mikroskop na okładkę 18x18 #1,5Fisher Scientific12-541A Wektor znacznikowy
neurobiotyny LaboratoriaSP-1120
Mikroskop wielofotonowy Nikon A1RNikonna pionowym statywie mikroskopowym FN1
NIS Elements Zaawansowane badaniaNikonOprogramowanie do akwizycji i analizy danych
Paraformaldehyd (PFA)Fisher ScientificT353-500
PBS (sól buforowana fosforanem)Fisher BioReagentsBP2944-100Tabletki
R91H05-Gal4Bloomington Drosophila Stock Center40594
shakB(lethal)-GAl4Bloomington Drosophila Stock Center51633
Szkiełko mikroskopowe SuperfrostFisher Scientific12-550-143
Triton X-100Fisher Scientific422355000roztwór detergentu
UAS-10xGFPBloomington Centrum magazynowe Drosophila32185
Receptura Drosophila

Bibliografia

  1. Chung, S. H., Mazur, E. Femtosecond laser ablation of neurons in C. elegans for behavioral studies. Appl Phys A Mater Sci Process. 96 (2), 335-341 (2009).
  2. Bower, D. V., et al. Airway branching has conserved needs for local parasympathetic innervation but not neurotransmission. BMC Biol. 12, 92(2014).
  3. Angelo, J. R., Tremblay, K. D. Laser-mediated cell ablation during post-implantation mouse development. Dev Dyn. 242 (10), 1202-1209 (2013).
  4. Allen, M. J., Godenschwege, T. A., Tanouye, M. A., Phelan, P. Making an escape: Development and function of the Drosophila giant fibre system. Semin Cell Dev Biol. 17 (1), 31-41 (2006).
  5. Hubel, D. H., Wiesel, T. N. Binocular interaction in striate cortex of kittens reared with artificial squint. J Neurophysiol. 28 (6), 1041-1059 (1965).
  6. Wiesel, T. N., Hubel, D. H. Comparison of the effects of unilateral and bilateral eye closure on cortical unit responses in kittens. J Neurophysiol. 28 (6), 1029-1040 (1965).
  7. Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
  8. Allen, M. J., Drummond, J. A., Moffat, K. G. Development of the giant fiber neuron of Drosophila melanogaster. J Comp Neurol. 397 (4), 519-531 (1998).
  9. Burra, S., Wang, Y., Brock, A. R., Galko, M. J. Using Drosophila larvae to study epidermal wound closure and inflammation. Methods Mol Biol. 1037, 449-461 (2013).
  10. Kakanj, P., Eming, S. A., Partridge, L., Leptin, M. Long-term in vivo imaging of Drosophila larvae. Nat Protoc. 15 (3), 1158-1187 (2020).
  11. Bainbridge, S. P., Bownes, M. Staging the metamorphosis of Drosophila melanogaster. J Embryol Exp Morphol. 66, 57-80 (1981).
  12. Allen, M. J., Godenschwege, T. A. Electrophysiological recordings from the Drosophila giant fiber system (GFs). Cold Spring Harb Protoc. 2010 (7), 5453(2010).
  13. Augustin, H., Allen, M. J., Partridge, L. Electrophysiological recordings from the giant fiber pathway of d. Melanogaster. J Vis Exp. (47), e2412(2011).
  14. Boerner, J., Godenschwege, T. A. Whole mount preparation of the adult Drosophila ventral nerve cord for giant fiber dye injection. J Vis Exp. (52), e3080(2011).
  15. Blagburn, J. M., Alexopoulos, H., Davies, J. A., Bacon, J. P. Null mutation in shaking-b eliminates electrical, but not chemical, synapses in the Drosophila giant fiber system: A structural study. J Comp Neurol. 404 (4), 449-458 (1999).
  16. Kennedy, T., Broadie, K. Newly identified electrically coupled neurons support development of the Drosophila giant fiber model circuit. eNeuro. 5 (6), 0346(2018).
  17. Mcfarland, B. W., et al. Axon arrival times and physical occupancy establish visual projection neuron integration on developing dendrites in the Drosophila optic glomeruli. bioRxiv. , (2024).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

mikroskopia dwufotonowamontaż obwodów neuronalnychsystem włókien olbrzymichoptogenetykaablacja pojedynczego neuronuzachowanie ucieczkowekomórki wykazujące ekspresję GFP
Laserowa ablacja komórek w nienaruszonych larwach Drosophila ujawnia konkurencję synaptyczną
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.