Artykuł metodologiczny

Laserowa ablacja komórek w nienaruszonych larwach Drosophila ujawnia konkurencję synaptyczną

1.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/67053

⸱

26 lipca 2024

 ,  , 
1Stiles-Nicholson Brain Institute, Florida Atlantic University, 2Department of Biological Sciences, Florida Atlantic University

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół demonstruje laserową ablację komórek pojedynczych neuronów u nienaruszonych larw Drosophila. Metoda umożliwia badanie efektu zmniejszenia konkurencji między neuronami w rozwijającym się układzie nerwowym.

Streszczenie

Protokół opisuje ablację pojedynczego neuronu za pomocą 2-fotonowego systemu laserowego w ośrodkowym układzie nerwowym (OUN) nienaruszonych larw Drosophila melanogaster. Za pomocą tej nieinwazyjnej metody można manipulować rozwijającym się układem nerwowym w sposób specyficzny dla komórki. Zakłócenie rozwoju pojedynczych neuronów w sieci może być wykorzystane do zbadania, w jaki sposób układ nerwowy może zrekompensować utratę danych synaptycznych. Poszczególne neurony zostały specjalnie poddane ablacji w systemie włókien olbrzymich Drosophila, ze szczególnym uwzględnieniem dwóch neuronów: presynaptycznego włókna olbrzymiego (GF) i postsynaptycznego neuronu ruchowego tergotrochantera (TTMn). GF łączy się z ipsilateralnym TTMn, co ma kluczowe znaczenie dla odpowiedzi ucieczki. Ablacja jednego z GF w 3. stadium mózgu, tuż po tym, jak GF zaczyna rosnąć aksonalnie, trwale usuwa komórkę podczas rozwoju OUN. Pozostały GF reaguje na nieobecnego sąsiada i tworzy ektopowe zakończenie synaptyczne do przeciwległego TTMn. To nietypowe, obustronnie symetryczne zakończenie unerwia oba TTMn, jak wykazano za pomocą sprzężenia barwnika, i steruje obydwoma neuronami ruchowymi, jak wykazano za pomocą testów elektrofizjologicznych. Podsumowując, ablacja pojedynczego interneuronu wykazuje konkurencję synaptyczną między obustronną parą neuronów, która może zrekompensować utratę jednego neuronu i przywrócić normalne reakcje na obwód ucieczki.

Wprowadzenie

Ablacja laserowa jest preferowanym narzędziem do badania obwodów neuronowych w wielu różnych organizmach. Opracowany w modelowych systemach genetycznych, takich jak robaki i muchy, został zastosowany w całym królestwie zwierząt do badania struktury, funkcji i rozwoju układu nerwowego1,2,3. W tym przypadku zastosowano ablację pojedynczego neuronu w celu zbadania, w jaki sposób neurony oddziałują na siebie podczas składania obwodów u Drosophila. System ucieczki muchy jest ulubionym obwodem do analizy, ponieważ zawiera największe neurony i największe synapsy u dorosłej muchy, a obwód ten został dobrze scharakteryzowany w ciągu ostatnich dziesięcioleci4. Rola, jaką interakcje neuron-neuron odgrywają w tworzeniu obwodu Giant Fiber, jest centralnym punktem tych badań.

Jednym z typów interakcji, który jest centralnym punktem w neuronauce od czasu pracy Hubela i Wiesela w latach 60., jest "konkurencja synaptyczna"5,6. W tym protokole ablacja laserowa została wykorzystana do ponownego zbadania roli konkurencji poprzez ablację pojedynczych komórek w systemie gigantycznych włókien (GFS) Drosophila, gdzie można odkryć molekularne podstawy tego zjawiska.

Ablacja neuronów u rozwijającej się muchy była trudna z wielu powodów, w tym wizualizacji docelowych neuronów, precyzji metody ablacji i przeżycia próbki. Aby przezwyciężyć te problemy w GFS, do oznaczania interesujących neuronów użyto systemu UAS/Gal47, a mikroskop dwufotonowy został użyty do usunięcia presynaptycznego włókna olbrzymiego lub postsynaptycznego neuronu ruchowego skoku (TTMn).

W tym badaniu, aby określić rolę, jaką odgrywają sąsiednie neurony obustronne w dostosowywaniu połączeń synaptycznych i siły synaps w GFS, jedna z obustronnych par neuronów (presynaptyczny GF lub postsynaptyczny neuron ruchowy) została usunięta tuż przed rozwojem poczwarki. Na tym etapie rozwoju aksonogeneza GF nie została zakończona8. Następnie zbadano strukturę i funkcję obwodu synaptycznego u osoby dorosłej, zwracając szczególną uwagę na wydajność pozostałej GF.

Protokół

Wszystkie zwierzęta wykorzystane w protokole należały do gatunku Drosophila melanogaster. Wykorzystanie tego gatunku nie budzi żadnych kwestii etycznych. Przeprowadzenie tych badań nie wymagało zgody komisji etycznej. Szczegółowe informacje o gatunku Drosophila, odczynnikach i sprzęcie użytych w badaniu znajdują się w Tabeli materiałów.

1. Hodowla Drosophila i wybór odpowiedniego stadium larwalnego

  1. Wybierz linię sterownika Gal4, która kieruje ekspresją w komórkach przeznaczonych do ablacji, i skrzyżuj ją z linią reporterową UAS-GFP. Hoduj muchy na standardowej pożywce w temperaturze 25 °C.
    UWAGA: W przypadku ablacji włókien olbrzymich (GF) zastosowano rekombinację R91H05-Gal4 lub A307-Gal4 z UAS-GFP. Do ablacji TTMn wykorzystano ShakB(lethal)-GAL4 rekombinowany z UAS-GFP (patrz Tabela materiałów).
  2. Wybierz larwy, które zaczęły wynurzać się z pożywki i pełzać po ściankach fiolki. Larwy te znajdują się w stadium wędrownym, które jest preferowanym etapem do przeprowadzania ablacji komórek GF.
    UWAGA: Ablację można przeprowadzić na każdym etapie rozwoju larwalnego. Ostatnie stadium larwalne było istotne dla manipulacji rozwojem GFS, ponieważ ciała komórek GF można łatwo zidentyfikować w mózgu, natomiast aksony GF nie utworzyły jeszcze w tym stadium połączeń z ich celami.

2. Przygotowanie 3rd stadium larwalne

UWAGA: Larwy zostały znieczulone metodą podobną do Burra i wsp.9. Aby skrócić czas trwania procedury, należy przygotowywać tylko jedną larwę na raz. Krótka ekspozycja na środek znieczulający zwiększy przeżywalność zwierząt doświadczalnych10.

  1. Przygotować szklaną płytkę z dopasowaną pokrywką. Włożyć do płytki kulkę waty, a następnie, pracując pod dygestorium, dodać około 3–5 ml eteru etylowego (ciecz niebezpieczna, łatwopalna; wymagany fartuch laboratoryjny, rękawiczki i okulary ochronne). Przykryć płytkę pokrywką.
  2. Pobierz osobnika 3Badań i rozwoju larwy w stadium trzecim z fiolek z muchami. W 3.rd stadium larwalne, larwy opuszczają podłoże pożywkowe i pełzną w górę wzdłuż ścianki fiolki z pożywką11.
    1. Należy upewnić się, że larwy nadal się poruszają i nie rozpoczęły procesu formowania puparium. Larwy nieruchome, wykazujące skrócenie ciała, rozpoczynają przepociwawianie i nie nadają się do ablacji. Larwy należy pobrać za pomocą małego pędzla.
      UWAGA: 3rd stadium larwalne rozpoczyna się po drugiej linie w 72. godzinie rozwoju (po zniesieniu jaj) i trwa do powstania puparium w 120. godzinie dla much hodowanych w 25 °C.
  3. Przenieś jedną larwę do małego, otwartego pojemnika. Umieść pojemnik w szklanym naczyniu z eterem etylowym i szczelnie zamknij naczynie. Podczas otwierania szklanego naczynia należy umieścić je pod wyciągiem punktowym lub w dygestorium, aby zapobiec ucieczce oparów.
    1. W odstępach 30 s należy wyjmować z naczynia pokrywkę z larwą i sprawdzać ruchomość larwy pod mikroskopem stereoskopowym. Larwa zazwyczaj zostaje unieruchomiona w ciągu 1 min. Gdy haczyki gębowe przestaną drgać, larwa jest gotowa do montowania. Larwy, które nie zostały całkowicie unieruchomione po 3 min, należy odrzucić.
      UWAGA: Jako pojemnik można wykorzystać górną część odwróconej do góry dnem zakrętki probówki do mikrocentryfugi (po zdjęciu zakrętki z probówki).

3. Montowanie larw na szkiełkach do ablacji

  1. Umieść znieczuloną larwę na szklanym przeźroczniku mikroskopowym. Zanurz larwę w kropli soli fizjologicznej dla owadów; pozwoli to usunąć resztki pokarmu, które mogą przylegać do ciała larwy.
  2. Pod mikroskopem dissectnym usuń większość soli fizjologicznej za pomocą ręcznika papierowego. Ułóż larwę grzbietem do góry w przypadku ablacji GF lub brzuchem do góry w przypadku ablacji TTMn. Powoli nałóż na larwę szklaną lamelkę. Dodaj sól fizjologiczną z boku lamelki, aby wypełnić przestrzeń między przeźrocznikiem a lamelką.
  3. W przypadku ablacji GF sprawdź położenie mózgu przy dużym powiększeniu pod mikroskopem dissectnym. Upewnij się, że mózg leży poziomo i jest widoczny przez kutykulę. Często mózg jest pokryty tkanką tłuszczową, co uniemożliwia wizualizację i ablację komórek.
    1. Aby przesunąć tkankę tłuszczową pokrywającą mózg, wywrzyj lekki nacisk na lamelkę za pomocą pęsety i przesuwaj ją z boku na bok. Jeśli tkanki tłuszczowej nie można w ten sposób odsunąć od mózgu, użyj innej larwy.

4. Lokalizacja komórek docelowych

UWAGA: System wielofotonowy wykorzystany w tej badaniu został zamontowany na mikroskopie odwróconym. Do sterowania akwizycją oraz ustawieniami stymulacji laserowej użyto specjalistycznego oprogramowania systemowego. System był wyposażony w źródło światła epifluorescencyjnego do lokalizacji próbek. Obiektyw był soczewką imersyjną w wodzie o powiększeniu 25x, długiej odległości roboczej 2 mm i aperturze numeryczną NA 1,10.

  1. Umieść próbkę na stoliku mikroskopu wielofotonowego i użyj filtra GFP, aby zlokalizować próbkę w trybie epifluorescencji. W przypadku ablacji GF ciała komórek można zidentyfikować w mózgu, jak pokazano na Rysunku 1A,C,D. W przypadku ablacji TTMn od strony brzusznej w brzusznym sznurze nerwowym (VNC) można zidentyfikować skupisko czterech komórek, jak pokazano na Rysunku 1A,B. Po ustawieniu ostrości wyśrodkuj komórki w polu widzenia i przełącz urządzenie w tryb 2-fotonowy.

5. Konfiguracja parametrów ablacji

  1. Dostrój ustawienia lasera oraz wzmocnienie detektora, aby zobrazować komórki wykazujące ekspresję GFP za pomocą skanera Galvano. Do wizualizacji sygnału GFP najlepiej sprawdza się długość fali 870 nm. Wyśrodkuj komórkę w polu widzenia.
  2. Użyj okrągłego obszaru zainteresowania (ROI), aby zdefiniować miejsce ablacji. Upewnij się, że ROI obejmuje większość powierzchni komórki (Rysunek 1E,G).
  3. Skonfiguruj protokół ablacji w oprogramowaniu. Ustaw jedną klatkę akwizycji, następnie stymulację, a po niej kolejną klatkę akwizycji.
  4. Rozpocznij ustawianie mocy lasera stymulującego od niskiej wartości (10%-20 %) i uruchom protokół stymulacji. Pomyślną ablację można rozpoznać po wyraźnym okręgu w centrum somy komórki w miejscu ROI oraz zwiększeniu fluorescencji wokół ROI (Rysunek 1F).
    1. Jeśli ablacja nie powiodła się i nastąpiło jedynie wybielenie komórki (Rysunek 1H), zwiększ moc lasera o 5% lub zwiększ liczbę pętli pojedynczo, a następnie ponownie uruchom protokół. W systemie użytym w niniejszym protokole zastosowana moc lasera wynosiła od 10% do 40%.
      UWAGA: Ustawienia mocy lasera do ablacji w dużej mierze zależą od głębokości położenia komórek w tkance oraz od innych czynników, takich jak pofałdowanie kutykuli. Jeśli komórki są jasne i wyraźnie widoczne, moc lasera będzie znajdować się w dolnym zakresie. Moc lasera będzie się różnić dla każdego systemu w zależności od modelu oraz wieku lasera.

Ekspresja GFP w układzie nerwowym muchy; mikroskopia fluorescencyjna ujawnia struktury neuronalne; schemat panelu.
Rycina 1: Identyfikacja neuronów do ablacji laserowej w nienaruszonych larwach L3 Drosophila. (A) Schemat lokalizacji somy włókna olbrzymiego (GF) w mózgu oraz skupiska neuronów ruchowych zawierającego neuron ruchowy tergotrochanteralny (TTMn) w brzuszny sznurze nerwowym (VNC). (B) Projekcja maksymalnej intensywności shakB(lethal)-Gal4 sterującego ekspresją GFP w larwalnym VNC. Linia środkowa jest zaznaczona linią przerywaną. Koło wskazuje skupisko neuronów zawierające TTMn, które są celem ablacji laserowej. Pasek skali: 50 µm. (C) Częściowy widok projekcyjny larwalnego mózgu z ekspresją GFP pod kontrolą A307-Gal4. Koło wskazuje somę GF będącą celem ablacji laserowej. Pasek skali: 50 µm. (D) Projekcja maksymalnej intensywności mózgu z R91H05-Gal4 sterującym UAS-GFP. Oba GF (koła) są możliwe do zidentyfikowania po lokalizacji, kształcie i wielkości. Pasek skali: 50 µm. (E) Powiększony widok somy GF przed ablacją laserową. Purpurowe koło wskazuje obszar docelowy ablacji laserowej. Pasek skali: 10 µm. (F) Powiększony widok somy GF po dostarczeniu zlokalizowanej mocy lasera i udanej ablacji. Pasek skali: 10 µm. (G) Powiększony widok somy GF przed ablacją laserową. Purpurowe koło wskazuje obszar docelowy ablacji laserowej. Pasek skali: 10 µm. (H) Powiększony widok somy GF po dostarczeniu zlokalizowanej mocy lasera i nieudanej ablacji (wyblaknięcie). Pasek skali: 10 µm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.

6. Odzyskiwanie larw

  1. Po pomyślnej ablacji komórki należy zdjąć szkiełko zakrywe i delikatnie przenieść larwy z preparatu do fiolki z pożywką za pomocą pędzelka. Larwy zaczną ponownie pełzać w ciągu 30 min.
    UWAGA: Skrócenie czasu trwania procedury zwiększa przeżywalność zwierząt. Dzięki doświadczeniu eksperyment można przeprowadzić w czasie krótszym niż 10 min.
  2. Kontynuuj hodowlę larw w standardowych warunkach aż do momentu ich wyjścia z poczwarki.

7. Badanie funkcjonalności GFS u dorosłych much

UWAGA: Następujące kroki zostały szczegółowo opisane w pracy Allana i Godenschwege12 oraz Augustina i współpracowników13.

  1. Badaj dorosłe muchy w wieku od 2 do 5 dni po wyjściu z poczwarki. Zestresuj muchy CO2 i zamocuj je na wosku dentystycznym, wciskając odnóża w wosk. Rozczapierz skrzydła pod kątem 90° i utrwal je w tej pozycji za pomocą wosku. Unieruchom głowę, wciskając trąbkę w wosk.
  2. Wprowadź przewody stymulujące do obu oczu, przewód uziemiający do odwłoka oraz szklane elektrody rejestrujące do mięśni skoku (TTMs) po każdej stronie.
  3. Stymuluj obwód GF pojedynczymi impulsami, aby zmierzyć latencję odpowiedzi w obu mięśniach. Stymuluj obwód kolejno seriami impulsów o częstotliwości 100 Hz i 200 Hz, aby zmierzyć następującą częstotliwość dla obu mięśni.

8. Disekcja i znakowanie systemu włókien olbrzymich do obrazowania konfokalnego

UWAGA: Disekcja OUN muchy oraz wstrzykiwanie barwnika zostały szczegółowo opisane przez Boernera i Godenschwege14.

  1. Ostrożnie usuń muchę z wosku dentystycznego za pomocą pęsety i przenieś ją do szalki Petriego wyłożonej elastomerem silikonowym pod stereomikroskopem.
  2. Usuń odnóża, skrzydła i trąbkę za pomocą nożyczek, a następnie użyj szpilek entomologicznych, aby przymocować muchę grzbietem do góry do powłoki elastomerowej.
  3. Wykonaj nacięcie boczne wzdłuż linii środkowej od środka odwłoka, przez cały toraks, aż do szyi, łącząc toraks z głową. Rozchyl ciało muchy za pomocą szpilek entomologicznych. Usuń narządy i gruczoły z ciała muchy, uważając, aby nie uszkodzić układu nerwowego.
    UWAGA: Na tym etapie do aksonów GF można wstrzyknąć barwniki w celu oznakowania GF oraz elektrycznie sprzężonych neuronów13.
  4. Usuń torebkę głowową z głowy, aby odsłonić mózg.

9. Immunohistochemia układu nerwowego

  1. Po wypreparowaniu ośrodkowego układu nerwowego (CNS), utrwalone muchy inkubowano w 4% PFA w PBS przez 45 min w temperaturze pokojowej (RT). Następnie płukano przez 20 min w PBS w RT (3 razy).
  2. Próbkę blokowano przez 1 h w RT w 3% BSA w PBS z 0,5% roztworem detergentu.
  3. Inkubowano przez 2-3 noce w 4 °C w 3% BSA w PBS z 0,3% roztworem detergentu oraz przeciwciałem króliczym anty-GFP (1:500). Następnie płukano przez 20 min w PBS w RT (6 razy).
  4. Inkubowano przez noc w 4 °C w PBS z przeciwciałem anty-króliczym Alexa 488. Następnie płukano przez 20 min w PBS w RT (6 razy).
  5. Próbki odwadniano w szeregu rosnących stężeń etanolu (50%, 70%, 90%, 100% etanolu) przez 10 min na każdym etapie. Usunięto szpilki oraz odcięto odwłok i mięśnie latające. Pozostałą część klatki piersiowej zawierającą układ nerwowy przeniesiono na szkiełko i pokryto medium montażowym, np. salicylanem metylu. Na próbkę nałożono szkiełko nakrywkowe i zabezpieczono je lakierem do paznokci.
  6. Wykonano obrazowanie układu nerwowego przy użyciu mikroskopu konfokalnego w celu analizy anatomii zakończeń GF.

Wyniki

Tę metodę można wykorzystać do manipulowania rozwojem specyficznych sieci neuronalnych w układzie nerwowym Drosophila. Głównym pytaniem badawczym w tym przypadku było tworzenie połączeń synaptycznych. Usunięcie presynaptycznego neuronu GF lub postsynaptycznego neuronu TTMn umożliwiło zbadanie reaktywnej synaptogenezy w tej synapsie centralnej oraz molekularnych mechanizmów kluczowych dla funkcji i rozwoju synaps. Zgodnie z opisem w protokole, przeprowadzono laserową ablację komórkową jednego z neuronów GF lub jednego z neuronów TTMn, a następnie przeanalizowano wpływ tego procesu na synapsę w dorosłej musze po rozwoju poczwarki.

Aby upewnić się, że procedura nie wpływa negatycznie na przeżywalność zwierząt, równolegle przeprowadzono ablacje pozorowane. W przypadku ablacji pozorowanych zwierzęta były traktowane w ten sam sposób co zwierzęta doświadczalne, jednak impulsy laserowe dostarczano przy mocy lasera wynoszącej 0%. W 82,4% przypadków zwierzęta z grupy ablacji pozorowanych rozwinęły się w dorosłe muchy. GF much po ablacji pozorowanej wykazywały zdolność do odpowiedzi z latencją poniżej 1 ms i śledziły stymulację o częstotliwości 100 Hz w 79,3% bodźców. Anatomia GF była nieodróżnialna od anatomii much niepoddanych zabiegowi.

W przypadku każdego zwierzęcia doświadczalnego ablacja została zweryfikowana anatomicznie. U zwierząt z ablacją GF do nieusuniętego GF wstrzyknięto barwnik i wykonano obrazowanie (patrz poniżej). Jeśli w łączniku szyjnym (CvC) widoczny był tylko jeden akson GF, uznano, że drugi GF został usunięty. Ablację można było również zweryfikować poprzez brak somy znakowanej GFP po stronie mózgu, w której wykonano zabieg (Rysunek 2A, okrąg). Aby ocenić ablację TTMn, przeanalizowano sygnał GFP w dorosłym VNC, gdzie somę i dendryt TTMn można łatwo zidentyfikować. Brak TTMn po jednej stronie był łatwo rozpoznawalny ze względu na brak somy i dendrytów (Rysunek 2B, okrąg).

Aby zbadać funkcję GFS u potraktowanych much, zarejestrowano potencjały synaptyczne z mięśni skocznych12,13, które są unerwione przez TTMn (Rysunek 3A). GFs tworzą mieszaną synapsę elektryczno-chemiczną z dendrytą przyśrodkową TTMn15. Terminal GF jest nierozgałęziony i wykazuje typowe boczne zagięcie przeciwstawne do dendryty TTMn w obszarze synaptycznym (Rysunek 3D, Rysunek 4A groty strzałek). U much kontrolnych każdy GF unerwia wyłącznie swój ipsilateralny motoneuron. W rejestracjach z włókien TTM siłę połączenia oceniano poprzez analizę latencji odpowiedzi przy stymulacji 1 Hz oraz zdolności do podążania za częstotliwością przy stymulacji 100 Hz (Rysunek 3B,C). Muchy kontrolne wykazały średnią latencję odpowiedzi poniżej 1 ms i mogły podążać za stymulacją 100 Hz dla 78,1% bodźców (Rysunek 3B). Po wykonaniu rejestracji fizjologicznych preparat poddano sekcji, aby odsłonić OUN i GFs, do których wstrzyknięto barwnik w postaci mieszaniny TRITC-Dekstranu i neurobiotyny. Duża cząsteczka dekstranu znakuje akson i terminal GF, ale nie przenika przez połączenia szczelinowe. Neurobiotyna może przenikać przez połączenia szczelinowe między GF a TTMn, a sygnał neurobiotyny wykryto w dendrycie postsynaptycznym (Rysunek 3E,F, groty strzałek). To sprzężenie barwnikowe neurobiotyną potwierdziło sprzężenie elektryczne między dwoma neuronami. Neurobiotynę można wykryć również w wielu innych neuronach w VNC, które są połączone z GF poprzez połączenia szczelinowe16 (Rysunek 3E,F).

Te same testy fizjologiczne i anatomiczne przeprowadzono po ablacji jednego GF w segmencie L3. Aksony większości (13/15) pozostałych GF u much po ablacji wykazują podział zakończenia na dwie gałęzie: jedną w zwykłej lokalizacji ipsilateralnej oraz drugą przekraczającą linię środkową do pozycji homologicznej po stronie kontralateralnej w stosunku do nienaruszonego GF (Rysunek 3G, strzałka). Każda gałąź była sprzężona barwnikiem z jednym z dendrytów TTMn (Rysunek 3H,I, groty strzałek). Rejestracje fizjologiczne z TTM potwierdziły to połączenie synaptyczne jednego GF z oboma TTMn, choć było ono słabsze niż w warunkach normalnych. Latencje odpowiedzi TTM były większe niż 1 ms dla obu stron, a następujące częstotliwości przy 100 Hz wynosiły 37,1% dla TTMn ipsilateralnego do nienaruszonego GF oraz 28% dla TTM kontralateralnego (Rysunek 3C).

Ponieważ ablacja jednego GF spowodowała, że pozostały GF unerwił oba neurony docelowe, kolejny eksperyment miał na celu obserwację odpowiedzi sąsiednich GF w sytuacji, gdy jeden z nich nie posiadał normalnego ipsylateralnego docelowego neuronu ruchowego. W tym eksperymencie usunięto jeden z neuronów postsynaptycznych, a następnie oceniono anatomię i funkcję pozostałego TTMn, a także morfologię zakończeń GF. Podczas wizualizacji obu TTMn i GF u dorosłych zwierząt kontrolnych, obszar domniemanego kontaktu synaptycznego był wyraźnie widoczny (Rysunek 4A, groty strzałek). Każda dendryta przyśrodkowa TTMn przylegała do ipsylateralnego zakończenia presynaptycznego GF. Małe wypustki dendrytów TTMn z obu stron kontaktowały się z linią środkową (Rysunek 4C; wstawka). Sprzęganie barwnika z Neurobiotiną było wyraźnie widoczne w obu TTMn (Rysunek 4D, groty strzałek).

Po ablacji jednego TTMn morfologia dendryty przyśrodkowej pozostałego TTMn uległa zmianie. Dendryta przyśrodkowa w tych preparatach wysyłała długą, grubą gałąź przez linię środkową (Rysunek 4I,K; żółte strzałki). Dodatkowo, w kierunku przednim wyciągały się cieńsze wypustki skierowane ku obu zakończeniom GF (Rysunek 4E,G; żółte groty strzałek). GF po stronie ipsilateralnej względem TTMn wykazywał typową anatomię z zakończeniem przebiegającym wzdłuż dendryty TTMn.

Głównym przedmiotem zainteresowania była odpowiedź „osieroconego” GF, który nie posiadał docelowego motoneuronu. W większości przypadków (61,5% zwierząt) osierocony GF wykazywał podział terminalny, z jednym terminalem po stronie ipsilateralnej, a drugim przekraczającym linię środkową i projektującym w kierunku kontralateralnego dendrytu TTMn (Rysunek 4J, strzałki). Te skrzyżowane gałęzie GF były zawsze mniejsze niż te zaobserwowane w eksperymencie uzupełniającym, w którym abladowano sąsiedni GF (Rysunek 3F). Terminal ipsilateralny kontaktował się z gałęzią TTMn, która rozciągała się przez linię środkową (Rysunek 4I, żółta strzałka). W 23% preparatów osierocony GF przekroczył linię środkową (Rysunek 4F, strzałka), projektował wzdłuż jednej z przednich gałęzi TTMn (Rysunek 4E, żółte groty strzałek) i był sprzężony barwnikowo z pozostałym TTMn (Rysunek 4H, grot strzałki).

U much z ablacją TTMn zaobserwowano dwa kolejne fenotypy (Rysunek 4M). U jednej z 13 much oba GF wykonały prawidłowy zakręt i pozostały po swoich stronach układu nerwowego. W innym przypadku osierocony GF wykazywał fenotyp bez zakrętu, w którym osierocony GF nie utworzył zakończenia i zatrzymał się przed obszarem, w którym zazwyczaj zakręca. Dla wszystkich czterech fenotypów pomiary TTM po stronie nienaruszonego TTMn były porównywalne z fizjologią typu dzikiego (WT), z latencją odpowiedzi poniżej 1 ms i częstotliwością śledzenia wynoszącą 100 Hz przy 100% lub blisko 100%. Usunięcie jednego celu może pozwolić obu GF na współdzielenie pozostałego TTMn. W większości przypadków oba GF nawiążą połączenie z pozostałym TTMn. Zazwyczaj osierocony GF będzie wykazywał zakończenie bilateralne. U much kontrolnych GF nigdy nie przekraczają linii środkowej; jednak w około 85% much z ablacją TTMn jeden GF przekroczył linię środkową, aby skontaktować się z przeciwległym TTMn. Inerwacja jednego TTMn przez dwa GF nie wpłynęła negatywnie na funkcję synaptyczną.

Warto zauważyć, że brak sąsiedniego GF wywołuje silniejszy efekt niż brak docelowego neuronu ruchowego. Zakończenie obustronne tworzące się w przypadku braku przeciwległego GF jest znacznie większe i wykazuje wyraźniejszą funkcjonalność niż zmiany obserwowane po usunięciu celu.

Mikroskopia fluorescencyjna, mózg i VNC Drosophila, A307:GFP, shakB::GFP, schemat szlaków neuronalnych.
Rysunek 2: Przykłady udanych ablacji w dorosłym OUN. (A) Projekcja maksymalnej intensywności mózgu dorosłej muchy po ablacji GF w stadium larwalnym. GFP (zielony) jest napędzany przez A307-GAL4. Okrąg wskazuje obszar, w którym brakuje ablacyjnego GF. Grot strzałki wskazuje pozostały GF wykazujący ekspresję GFP po przeciwnej stronie mózgu. GF został wypełniony TRITC-Dextran (czerwony). Akson projektuje się tylnie w kierunku VNC. Pasek skali: 20 µm. (B) Projekcja maksymalnej intensywności dorosłego VNC, w którym jeden TTMn został poddany ablacji w stadium L3. Pozostały TTMn (grot strzałki) wykazuje ekspresję GFP pod sterowaniem shakB(lethal). Obszar brakującego TTMn jest zaznaczony okręgiem. Pasek skali: 20 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Układ eksperymentalny ablacji neuronalnej z danymi elektrofizjologicznymi, infuzją barwnika i wynikami mikroskopowymi.
Rycina 3: Ablacja jednego włókna olbrzymiego (GF) w stadium larwalnym powoduje obustronne rozgałęzienie terminala presynaptycznego pozostałego GF. (A) Schemat układu eksperymentalnego do badania struktury i funkcji dorosłego systemu włókien olbrzymich (GFS). Elektroda rejestrująca mierzy latencję oraz następującą częstotliwość wyjść neuronów ruchowych tergotrochanteralnych (TTMn) w mięśniach tergotrochanteralnych (TTM) po stymulacji mózgu u nienaruszonego zwierzęcia. Po sekcji układu nerwowego barwnik został wstrzyknięty do aksonów GF w połączeniu szyjnym (CvC). (B,C) Przykładowe zapisy latencji odpowiedzi TTM i następującej częstotliwości przy 100 Hz (n oznacza liczbę zarejestrowanych TTM dla każdej sytuacji, przedstawiono średnią latencję i następującą częstotliwość). (B) Zwierzęta kontrolne z dwoma nienaruszonymi GF wykazują latencje TTM poniżej 1 ms i następujące częstotliwości bliskie 100% przy 100 Hz. (C) Pojedyncze pozostałe GF u zwierząt po ablacji unerwia oba TTMn. Latencje dla obu TTMn są dłuższe niż w grupie kontrolnej, a przy 100 Hz następująca częstotliwość jest znacznie obniżona. (D-I) Maksymalna projekcja intensywności stosów obrazów konfokalnych dla wypełnionych barwnikiem GF. TRITC-Dextran (D,G,F,I na czerwono) i Neurobiotyna (E,H,F,I na szaro) zostały wstrzyknięte jednocześnie. Neurobiotyna może przekraczać połączenia szczelinowe między GF a TTMn, znakując neurony postsynaptyczne. Linie przerywane wskazują linię środkową. (D) Typowa anatomia GF zwierząt kontrolnych z zagięciem terminalnym. (E,F) Neurobiotyna znakuje wiele neuronów postsynaptycznych sprzężonych elektrycznie z GF. Dendryty TTMn znakowane transsynaptycznie są wskazane grotami strzałek. (G) Po ablacji pozostałe GF rozwija dodatkowy terminal (strzałka), który przekracza linię środkową, aby unerwić przeciwległy TTMn. (H,I) Oba TTMn (groty strzałek) są sprzężone barwnikiem z tym samym GF. Paski skali: 20 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Analiza obrazowania neuronalnego połączeń synaptycznych; przedstawiono wyniki fluorescencji GFP i testu z neurobiotyną.
Rycina 4. Ablacja jednego neuronu ruchowego tergotrochanteralnego (TTMn) w stadium larwalnym powoduje unerwienie pozostałego TTMn przez oba włókna olbrzymie (GF). (A-L) Maksymalne projekcje intensywności stosów obrazów konfokalnych TTMn znakowanych GFP (zielony) pod kontrolą shakB(lethal)-Gal4 i GF wypełnionych barwnikiem TRITC-Dextran (magenta) oraz neurobiotyną (czerwony). Linia przerywana oznacza linię środkową układu nerwowego. (A-D) Okazy kontrolne z nienaruszonymi oboma neuronami TTMn. GF tworzą typowe zgięcie końcowe z dala od linii środkowej w celu kontaktu z TTMn (A,B), a każde GF kontaktuje się z jednym TTMn. Dendryty TTMn spotykają się na linii środkowej (C). Każde GF jest sprzężone barwnikiem ze swoim TTMn (D, białe groty strzałek). (E-H) Lewy TTMn został usunięty. Medialny dendryt pozostałego TTMn wystaje poza linię środkową (G, żółta strzałka). Osierocone GF przekracza linię środkową (biała strzałka) w obszarze synaptycznym i kontaktuje się z przeciwległym dendrytem TTMn (E,F). GF są sprzężone barwnikiem z pozostałym TTMn (H, grot strzałki). (I-L) Przykład innego fenotypu GF, w którym lewy TTMn został usunięty. Medialny dendryt pozostałego TTMn wystaje poza linię środkową (I oraz K, żółta strzałka). Lewe osierocone GF tworzy zakończenie bilateralne; jedna gałąź kieruje się przeciwlegle, a druga pozostaje po stronie ipsilateralnej (J, strzałki), aby połączyć się z TTMn. Paski skali: 20 µm. (M) Schemat czterech różnych zaobserwowanych fenotypów GF u zwierząt po ablacji TTMn. n oznacza liczbę zwierząt w każdej klasie. Podano średnie z błędem standardowym dla opóźnienia odpowiedzi TTM oraz częstotliwości następstwa (FF) przy 100 Hz dla strony z nienaruszonym TTMn. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Dyskusja

Ablacja komórek za pomocą mikroskopu 2-fotonowego okazała się bardzo skuteczną metodą manipulowania rozwojem obwodów neuronalnych u Drosophila. Ponieważ ta metoda jest nieinwazyjna, powoduje minimalne szkody u zwierzęcia. Dane potwierdzają przydatność tej specyficznej dla komórki manipulacji znanymi obwodami.

Kluczowe dla powodzenia ablacji był wybór najodpowiedniejszego sterownika Gal4. Ponieważ GFS jest dobrze zbadany, opisano wiele specyficznych linii sterowników Gal47. Większość sterowników Gal4 jest bardzo ograniczona, ale nadal ulega ekspresji w wielu innych neuronach. Jednym z wyzwań była wiarygodna identyfikacja komórek docelowych w nienaruszonym zwierzęciu. W przypadku zwierząt z wyraźnie widocznym znacznikiem GFP ablacja mogła być wykonywana przy niskiej mocy lasera i często wymagała tylko jednej próby. U zwierząt, u których tkanka tłuszczowa pokrywała mózg lub ekspresja GFP była słaba, delecja komórek docelowych wymagała większej mocy lasera i wielu pętli ekspozycji na laser. Ciała komórek GF znajdowały się na głębokości około 100 μm od grzbietowej strony mózgu. W przypadku eksperymentów, w których komórki docelowe znajdują się na większej głębokości, przydatne może być przeprowadzenie ablacji we wcześniejszych stadiach larwalnych, gdy układ nerwowy jest mniejszy.

W poprzednich eksperymentach w laboratorium badano różne metody ablacji komórek. Wykorzystanie systemu UAS/Gal4 do sterowania ekspresją toksyn doprowadziło również do usunięcia określonych neuronów. Jednak znacznie trudniej jest kontrolować delecję pojedynczych komórek i uniknąć efektów off-target. Inną trudnością jest kontrolowanie dokładnego czasu wystąpienia zdarzenia delecji komórki. Laserowa ablacja komórek umożliwiła precyzyjną kontrolę nad lokalizacją docelową i czasem delecji, ale nadal istniały pewne wyzwania do pokonania, zanim metoda została udoskonalona i osiągnięto wskaźniki sukcesu przekraczające 80% (przeżycie zwierząt i udana ablacja komórek). Na przeżywalność zwierząt negatywnie wpłynęła długa ekspozycja na eter etylowy i długi czas zabiegu. Badania wykazały, że wysokie wskaźniki przeżywalności do przepoczwarzenia (78%) i eklozji u dorosłych (67%) można osiągnąć przy 3,5-minutowej ekspozycji larw L3 Drosophila na eter etylowy10. Ekspozycja przez 3,5 minuty zapewni, że zwierzę będzie unieruchomione do 8 godzin. W przypadku laserowej ablacji komórek zwierzęta muszą być unieruchomione przez 30 minut lub krócej. W związku z tym czas ekspozycji na eter etylowy może być utrzymywany znacznie poniżej 3,5 minuty. W większości przypadków larwy były całkowicie unieruchomione w ciągu 1 minuty.

Wyniki ablacji laserowej pokazują, że GF można czysto usunąć, a wpływ na przeciwległą sąsiednią GF można łatwo ocenić. Wynik ablacji był wyraźny i spójny. W 13 z 15 ablacji jednokomórkowych pozostali partnerzy GF wykazują obustronne zakończenie, które nigdy nie występuje u zwierząt kontrolnych. To obustronnie symetryczne zakończenie jest łatwe do rozpoznania, a niezwykła przeciwległa gałąź jest podobna pod względem wielkości do normalnego zakończenia i jest sprzężona barwnikiem z przeciwległym docelowym neuronem ruchowym. Obustronny terminal jest sprzężony barwnikiem z oboma docelowymi neuronami ruchowymi i funkcjonuje prawie jak dziki u większości próbek, napędzając zarówno normalny cel, jak i przeciwległy docelowy neuron ruchowy z opóźnieniami i częstotliwościami podążającymi w pobliżu wartości kontrolnych.

Eksperyment uzupełniający, polegający na jednostronnej ablacji docelowego neuronu ruchowego, dostarcza interesującego porównania. Pozostały neuron ruchowy często wykazuje reaktywny wzrost dendrytyczny, rozciągając proces w poprzek linii środkowej do przestrzeni normalnie zajmowanej przez usuniętego sąsiada. Chociaż ten dendryt nie jest tak duży jak usunięty, wykazuje reakcję podobną do tego, że GF tęsknią za swoim dwustronnym partnerem. W przeciwieństwie do tego, teraz pozbawiony celu GF reaguje tylko nieznacznie na nieobecny cel, rozciągając drobne procesy w poprzek linii środkowej i wzdłuż pozostałych dendrytów neuronów ruchowych. Ta skromna odpowiedź ostro kontrastuje z dramatyczną reakcją GF na brak obustronnie homologicznego GF, w którym tworzy się duży kontralateralny koniec, który uzupełnia normalny koniec i tworzy dwustronny koniec.

Niedawno przeprowadzono równoległy eksperyment ablacyjny na presynaptycznych wejściach do GF w mózgu,gdzie ujawniono podobny rodzaj "konkurencji" o przestrzeń synaptyczną. Wizualne dane wejściowe do GF kafelkują kłębuszki nerkowe, w których neurony projekcji wzrokowej (VPN) docierają do dendrytów GF. Usunięcie jednej grupy VPN (w tym przypadku genetycznie) pokazuje, że pozostałe VPN przejmują i unerwiają część przestrzeni synaptycznej nieobecnego sąsiada i powodują kompensacyjne fizjologiczne odzyskanie reakcji wzrokowej na zbliżające się bodźce. Gdy pierwsi przychodzący aferenty są usuwane, późniejsze przybycia zajmują miejsce i nie są już zajęte. Głównym fenomenologicznym podobieństwem do niniejszej pracy jest widoczna rola, jaką odgrywa fizyczne obłożenie w określaniu równowagi między różnymi danymi wejściowymi. Zaciski wyjściowe dwóch GF wydają się konkurować ze sobą o fizyczną przestrzeń synaptyczną.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Eksperymenty na mikroskopie 2-fotonowym zostały przeprowadzone w FAU Stiles-Nicholson Brain Institute Advanced Cell Imaging Core. Serdecznie dziękujemy Jupiter Life Science Initiative za wsparcie finansowe.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Alexa Fluor 488 AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)Jaxkson ImmunoResearch111-545-003
Anty-zielone białko fluorescencyjne, królikFisher ScientificA111221:500 stężenie
Apo LWD 25x/1.10W ObiektywNikonMRD77220zanurzenie w wodzie duża odległość robocza
Albumina surowicy bydlęcej (BSA)SigmaB4287-25G
Chameleon Ti:Sapphire Vision II Laserowakoherentna
kulka bawełnianaGenesee Scientific51-101
Dextra, tetrametylorodamina, 10 000 MW, lizyna utrwalana (fluoro-rubinowa)Fisher ScientificD1817
soli fizjologicznejod Gu i O'Dowd, 2006
Eter etylowyFisher ScientificE134-1Niebezpieczeństwo, łatwopalna ciecz
Pokarm dla much B (przepis Bloomington)LabExpress7001-NV
Salicylan metyluFisher ScientificO3695-500
Probówka do mikrowirówek 1,5 mlEppendorf22363204
Mikroskop na okładkę 18x18 #1,5Fisher Scientific12-541A Wektor znacznikowy
neurobiotyny LaboratoriaSP-1120
Mikroskop wielofotonowy Nikon A1RNikonna pionowym statywie mikroskopowym FN1
NIS Elements Zaawansowane badaniaNikonOprogramowanie do akwizycji i analizy danych
Paraformaldehyd (PFA)Fisher ScientificT353-500
PBS (sól buforowana fosforanem)Fisher BioReagentsBP2944-100Tabletki
R91H05-Gal4Bloomington Drosophila Stock Center40594
shakB(lethal)-GAl4Bloomington Drosophila Stock Center51633
Szkiełko mikroskopowe SuperfrostFisher Scientific12-550-143
Triton X-100Fisher Scientific422355000roztwór detergentu
UAS-10xGFPBloomington Centrum magazynowe Drosophila32185
Receptura Drosophila

Bibliografia

  1. Chung, S. H., Mazur, E. Femtosecond laser ablation of neurons in C. elegans for behavioral studies. Appl Phys A Mater Sci Process. 96 (2), 335-341 (2009).
  2. Bower, D. V., et al. Airway branching has conserved needs for local parasympathetic innervation but not neurotransmission. BMC Biol. 12, 92(2014).
  3. Angelo, J. R., Tremblay, K. D. Laser-mediated cell ablation during post-implantation mouse development. Dev Dyn. 242 (10), 1202-1209 (2013).
  4. Allen, M. J., Godenschwege, T. A., Tanouye, M. A., Phelan, P. Making an escape: Development and function of the Drosophila giant fibre system. Semin Cell Dev Biol. 17 (1), 31-41 (2006).
  5. Hubel, D. H., Wiesel, T. N. Binocular interaction in striate cortex of kittens reared with artificial squint. J Neurophysiol. 28 (6), 1041-1059 (1965).
  6. Wiesel, T. N., Hubel, D. H. Comparison of the effects of unilateral and bilateral eye closure on cortical unit responses in kittens. J Neurophysiol. 28 (6), 1029-1040 (1965).
  7. Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
  8. Allen, M. J., Drummond, J. A., Moffat, K. G. Development of the giant fiber neuron of Drosophila melanogaster. J Comp Neurol. 397 (4), 519-531 (1998).
  9. Burra, S., Wang, Y., Brock, A. R., Galko, M. J. Using Drosophila larvae to study epidermal wound closure and inflammation. Methods Mol Biol. 1037, 449-461 (2013).
  10. Kakanj, P., Eming, S. A., Partridge, L., Leptin, M. Long-term in vivo imaging of Drosophila larvae. Nat Protoc. 15 (3), 1158-1187 (2020).
  11. Bainbridge, S. P., Bownes, M. Staging the metamorphosis of Drosophila melanogaster. J Embryol Exp Morphol. 66, 57-80 (1981).
  12. Allen, M. J., Godenschwege, T. A. Electrophysiological recordings from the Drosophila giant fiber system (GFs). Cold Spring Harb Protoc. 2010 (7), 5453(2010).
  13. Augustin, H., Allen, M. J., Partridge, L. Electrophysiological recordings from the giant fiber pathway of d. Melanogaster. J Vis Exp. (47), e2412(2011).
  14. Boerner, J., Godenschwege, T. A. Whole mount preparation of the adult Drosophila ventral nerve cord for giant fiber dye injection. J Vis Exp. (52), e3080(2011).
  15. Blagburn, J. M., Alexopoulos, H., Davies, J. A., Bacon, J. P. Null mutation in shaking-b eliminates electrical, but not chemical, synapses in the Drosophila giant fiber system: A structural study. J Comp Neurol. 404 (4), 449-458 (1999).
  16. Kennedy, T., Broadie, K. Newly identified electrically coupled neurons support development of the Drosophila giant fiber model circuit. eNeuro. 5 (6), 0346(2018).
  17. Mcfarland, B. W., et al. Axon arrival times and physical occupancy establish visual projection neuron integration on developing dendrites in the Drosophila optic glomeruli. bioRxiv. , (2024).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

mikroskopia dwufotonowamonta obwod w neuronalnychsystem w kien olbrzymichoptogenetykaablacja pojedynczego neuronuzachowanie ucieczkowekom rki wykazuj ce ekspresj GFP
Laserowa ablacja komórek w nienaruszonych larwach Drosophila ujawnia konkurencję synaptyczną
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.