Method Article

Model in vitro do badania różnicowania i zmian multiomiki na mysich komórkach nabłonka dróg oddechowych stymulowanych ekstraktem z dymu papierosowego

DOI:

10.3791/67057

⸱

July 12th, 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Immunology, School of Basic Medical Sciences, Capital Medical University, 2Department of Pulmonary and Critical Care Medicine, Center of Respiratory Medicine, China-Japan Friendship Hospital, 3National Center for Respiratory Medicine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj opisujemy model in vitro do izolowania i różnicowania mysich komórek nabłonka dróg oddechowych, skupiając się na ich aklimatyzacji do przewlekłego ekstraktu z dymu papierosowego (CSE). Model może zostać wykorzystany do kompleksowego scharakteryzowania multiomicznego wpływu CSE, co może dostarczyć informacji na temat reakcji komórkowych na przewlekłe narażenie na dym tytoniowy.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przewlekła obturacyjna choroba płuc (POChP) jest w dużej mierze przypisywana ekspozycji na dym tytoniowy. Zbadanie, w jaki sposób komórki nabłonka dróg oddechowych funkcjonalnie przystosowują się do dymu tytoniowego, ma kluczowe znaczenie dla zrozumienia patogenezy POChP. Niniejsze badanie miało na celu stworzenie modelu in vitro z wykorzystaniem pierwotnych mysich komórek nabłonka dróg oddechowych w celu naśladowania rzeczywistego wpływu dymu tytoniowego. W przeciwieństwie do ustalonych linii komórkowych, komórki pierwotne zachowują więcej właściwości podobnych do in vivo, w tym wzorce wzrostu, starzenie się i różnicowanie. Komórki te wykazują wrażliwą reakcję zapalną i skuteczne różnicowanie, dzięki czemu ściśle reprezentują warunki fizjologiczne. W tym modelu pierwotne mysie komórki nabłonka dróg oddechowych hodowano przez 28 dni na granicy faz powietrze-ciecz z optymalnym stężeniem ekstraktu dymu papierosowego (CSE), co doprowadziło do przekształcenia monowarstwy niezróżnicowanych komórek w pseudostratyfikowany nabłonek walcowaty, wskazujący na aklimatyzację CSE. Następnie zastosowano kompleksowe analizy multiomiczne w celu wyjaśnienia mechanizmów, za pomocą których CSE wpływa na różnicowanie komórek podstawnych dróg oddechowych. Te spostrzeżenia pozwalają lepiej zrozumieć procesy komórkowe leżące u podstaw progresji POChP w odpowiedzi na dym tytoniowy.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przewlekła obturacyjna choroba płuc (POChP) to niejednorodna choroba płuc o złożonej charakterystyce, podczas gdy pacjenci z POChP stopniowo stają się młodsi1. Palenie tytoniu, główny czynnik ryzyka POChP2, ma ogromny wpływ na komórki nabłonka dróg oddechowych, które służą jako początkowa bariera przed dymem tytoniowym. Pomimo tego znanego związku, szczegółowe mechanizmy, za pomocą których dym tytoniowy indukuje zmiany w komórkach nabłonka dróg oddechowych, pozostają niewystarczająco zbadane. Dokładne zrozumienie tych zmian molekularnych jest niezbędne do identyfikacji wczesnych markerów diagnostycznych i celów terapeutycznych POChP.

Aby wypełnić tę lukę, opracowaliśmy nowy model in vitro wykorzystujący mysie komórki nabłonka dróg oddechowych. Komórki te poddano długotrwałej stymulacji ekstraktem z dymu papierosowego (CSE), co umożliwiło nam monitorowanie dynamicznych zmian komórkowych i badanie zmian w komórkach nabłonka dróg oddechowych pod wpływem długotrwałej stymulacji tytoniem oraz mechanizmu leżącego u ich podstaw. W tym modelu transwell zastosowano w celu zapewnienia granicy faz powietrze-ciecz komórek nabłonka dróg oddechowych, a ekstrakt z dymu papierosowego był stymulowany we wczesnym etapie różnicowania komórek nabłonka aż do końca różnicowania po 28 dniach. Wcześniejsze badania dotyczyły jedynie różnicowania i krótkotrwałej stymulacji komórek nabłonka dróg oddechowych (dominacja linii komórkowej). Były one ograniczone do jednej ścieżki regulacyjnej3,4,5,6. Jednak przedstawiony tutaj protokół wykorzystuje pierwotne komórki nabłonka dróg oddechowych myszy i optymalizuje proces ekstrakcji komórek w celu uzyskania lepszej aktywności komórek niż poprzednie metody hodowli komórek nabłonka dróg oddechowych. Model ten koncentruje się na zmianach w różnicowaniu komórkowym wraz z kompleksowymi analizami transkryptomicznymi, proteomicznymi, metabolomicznymi i epigenomicznymi. Wykorzystując immunofluorescencję i zaawansowane techniki multiomiczne, naszym celem było wyjaśnienie odpowiedzi komórkowych komórek nabłonka dróg oddechowych na przewlekłą ekspozycję na dym tytoniowy, przyczyniając się w ten sposób do głębszego zrozumienia patogenezy POChP. Model ten może być wykorzystany do zbadania zmian we wzorcu różnicowania komórek nabłonka dróg oddechowych i jego mechanizmu spowodowanego długotrwałą stymulacją różnych zanieczyszczeń.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ogólny protokół wymaga 44 dni, w tym 1 dzień na przygotowanie komórek nabłonka dróg oddechowych wyizolowanych z mysich tchawic, 15 dni na proliferację komórek i 28 dni na stymulację CSE na granicy powietrze-ciecz. Wszystkie zwierzęta doświadczalne są trzymane w pomieszczeniu dla zwierząt barierowych SPF w Centrum Doświadczeń na Zwierzętach Stołecznego Uniwersytetu Medycznego i zostały sprawdzone i zatwierdzone przez Komisję Etyki Zwierząt Doświadczalnych i Laboratoryjnych Stołecznego Uniwersytetu Medycznego (AEEI-2020-100) w celu spełnienia wymagań wytycznych ARRIVE7.

1. Izolacja pierwotnych komórek nabłonka mysich dróg oddechowych od mysich tchawic

  1. preparat
    1. Przygotuj kompletną pożywkę ekspandacyjną, łącząc 1 ml 50-krotnego suplementu i 0,05 ml bulionu hydrokortyzonu z 48,95 ml podłoża podstawowego do ekspandacji. Przechowywać w temperaturze 4 °C i zużyć w ciągu 4 tygodni.
    2. Rozpuścić 7,5 mg proteinazy i 5 mg dezoksyrybonukleazy I w 5 ml Ham's F-12, aby przygotować roztwór proteinazy. Przefiltrować go do sterylizacji i przechowywać w temperaturze 4 °C i zużyć w ciągu 4 tygodni.
    3. Przygotuj roztwory antybiotyków, dodając 0,05 ml 100x penicyliny/streptomycyny i 0,01 ml 500x gentamycyny/amfoterycyny do 5 ml pożywki o pełnej ekspandacji, PBS i roztworu proteinazy (100 j./ml penicyliny, 100 μg/ml streptomycyny, 10 μg/ml gentamycyny i 0,25 μg/ml amfoterycyny B). Przechowywać w temperaturze 4 °C i zużyć w ciągu 4 tygodni.
    4. Wysterylizuj narzędzia chirurgiczne i przygotuj komorę bezpieczeństwa biologicznego do izolacji komórek. Jednocześnie upewnij się, że standardowy sprzęt do hodowli komórkowych jest gotowy do użycia.
    5. Przygotuj naczynia pokryte kolagenem ze szczurzego ogona, dodając kolagen z ogona szczura (100 μg/ml w 0,02 N kwasu octowego) do naczyń hodowlanych o średnicy 100 mm i transwelli o średnicy 24 mm (0,05 ml/cm2). Pozostaw otwarte na noc w świetle UV do sterylizacji.
  2. Izolacja pierwotnych komórek nabłonka mysich dróg oddechowych
    1. Użyj myszy C57BL/6 (6-8 tygodni, samce, hodowane z SPF) do izolacji komórek nabłonka tchawicy. Eutanazja z użyciem 1% roztworu pentobarbitalu sodu (około 200 mg/kg). Użyj pięciu myszy, aby uzyskać wystarczającą wydajność komórek.
    2. Wysterylizuj mysz przez zanurzenie w 75% roztworze etanolu, nie zanurzając nosa i ust w alkoholu, aby zapobiec przedostawaniu się alkoholu do tchawicy.
    3. Przeanalizuj mysz.
      1. Użyj ostrzy chirurgicznych i kleszczy, jednego zestawu urządzeń do cięcia i otwierania naskórka od dolnej szczęki do jamy brzusznej myszy.
      2. Użyj innego zestawu narzędzi chirurgicznych, aby rozerwać tarczycę po obu stronach i usunąć połączenia między tchawicą, otaczającą tkanką mięśniową i przełykiem.
      3. Następnie ostrożnie wciąć klatkę piersiową, za pomocą kleszczy zagłębić się głębiej w jamę klatki piersiowej, wyjąć całe płuco i znaleźć koniec tchawicy.
    4. Przetwórz tchawicę.
      1. Wytnij tchawicę od chrząstki tarczycy do gałęzi tchawiczo-oskrzelowej i umieść ją w pożywce do rozprężania przed zimnem zawierającej cztery antybiotyki.
      2. Potrząśnij rurką, aby spłukać jak najwięcej krwi z powierzchni tchawicy, trzymaj ją na lodzie, a następnie rozpocznij operację dla następnej myszy.
    5. Przenieś wszystkie zebrane tchawice do wstępnie zimnego buforu PBS zawierającego cztery antybiotyki (200 U/ml penicyliny, 200 U/ml streptomycyny, 20 μg/ml gentamycyny i 0,5 μg/ml amfoterycyny B) w celu wstępnego leczenia przed trawieniem.
    6. Użyj zestawu narzędzi chirurgicznych, aby usunąć skrzepy i inne tkanki z powierzchni tchawicy, a następnie pokrój je na rozmiar 1cm2.
    7. Inkubować tkankę tchawicy w roztworze proteinazy w temperaturze 37 °C przez 40 minut.
    8. Po 40 minutach kilkakrotnie rozkołysz probówkę i użyj sitka do komórek o wielkości 40 μm, aby usunąć pozostałe tkanki. Rozdrobnione tchawice przepłukać na sitku z 5 ml pożywki ekspandującej, odwirować zawiesinę komórkową o sile 400 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C i odrzucić sklarowany nad osadem.
    9. Otrzymane komórki zawiesić ponownie w 8 ml pożywki ekspandcyjnej.
    10. Policz żywe komórki za pomocą błękitu trypanowego i hemocytometru.
    11. Zawiesinę komórek P0 na płytce P0 na szalkach o średnicy 100 mm (1 x 104 żywe komórki/cm2) wstępnie pokrytą kolagenem z ogona szczura, a następnie wyhodować komórki w inkubatorze w temperaturze 37 °C, 5% CO2 .

2. Hodowla ekspansywna i pasaż pierwotnych komórek nabłonka mysich dróg oddechowych

  1. Wymieniaj pożywkę do hodowli komórek P0 co 3 dni, aż komórki osiągną zbieżność 70%-80%, zwykle w ciągu 6 dni. W tym momencie mysie komórki nabłonka tchawicy mogą tworzyć nienaruszoną monowarstwę o wyglądzie kostki brukowej (Rysunek 1A-D).
  2. Wstępnie podgrzej do temperatury 37 °C wystarczające ilości PBS, pożywki do pełnej dylatacji i zestawu do dysocjacji komórek bez składników zwierzęcych (ACF).
  3. Delikatnie przepłucz komórki 3 ml PBS.
  4. Wykonaj dysocjację enzymatyczną.
    1. Dodać 3 ml roztworu dysocjacji enzymatycznej ACF do naczynia i inkubować w temperaturze 37 °C przez 5 minut. Po pipetowaniu delikatnie usunąć komórki i przenieść zawiesinę komórek do 3 ml roztworu hamującego enzymy ACF.
    2. Powtórzyć dodawanie 3 ml roztworu dysocjacji enzymatycznej ACF i ponownie inkubować przez 5 minut, aby zapewnić maksymalne oderwanie komórek.
  5. Wirować zawiesinę komórek w temperaturze 400 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant.
  6. Ponownie zawiesić komórki w 1 ml pożywki ekspandatoryjnej.
  7. Policz żywe komórki za pomocą błękitu trypanowego i hemocytometru.
  8. Zawiesina komórek P1 na kilku szalkach o średnicy 100 mm (5 x 104 żywe komórki/cm2) wstępnie pokryta kolagenem z ogona szczura, a następnie hodować komórki w inkubatorze w temperaturze 37 °C, 5% CO2 .

3. Różnicowanie i stymulacja CSE pierwotnych komórek nabłonka mysich dróg oddechowych na granicy powietrze-ciecz

  1. Potwierdź typ komórki.
    1. Sprawdź pochodzenie nabłonkowe izolowanych komórek za pomocą testu immunofluorescencyjnego (IFA) z przeciwciałami przeciwko cytokeratynom. Komórki nasienne na szkiełkach pokrytych kolagenem z ogona szczura i użyj paraformaldehydu, aby je utrwalić przez co najmniej 12 godzin po tym, jak komórki osiągną 80% zbieżności.
    2. Myć szkiełka 3 razy roztworem PBS przez 5 minut i inkubować je z 3% BSA i 0,1% trytonem X-100 w roztworze PBS w temperaturze pokojowej (RT) przez 1 godzinę.
    3. Inkubować szkiełka podstawowe przez noc w temperaturze 4 °C z dostępnym w handlu przeciwciałem anty-cytokeratynowym w rozcieńczeniu 1:500.
    4. Następnego dnia przemyć szkiełka 3 razy roztworem PBS przez 5 minut i inkubować je z drugorzędowym buforem przeciwciał w rozcieńczeniu 1:1000 w temperaturze słonecznej przez 2 godziny w ciemności.
    5. Po inkubacji przemyj szkiełka 3 razy PBS (5 minut na pranie) i dodaj do nich DAPI w rozcieńczeniu 1:1000. Po inkubacji w temperaturze pokojowej przez 15 minut, przemywać szkiełka jednorazowo PBS przez 5 minut.
    6. Obserwuj preparaty pod mikroskopem fluorescencyjnym i porównaj wzorce ekspresji z kontrolą pozytywną (linia komórkowa A549) i kontrolą negatywną (linia komórkowa Raw264.7) (Rysunek 2).
  2. Zasiej komórki do różnicowania.
    1. Odłączyć i odwirować komórki P2 zgodnie z poprzednim opisem, a następnie ponownie zawiesić osad komórkowy w odpowiedniej objętości podłoża ekspandacyjnego, aby ułatwić posiew 1 x 104 żywe komórki/cm2.
    2. Odpipetować 1 ml zawiesiny komórek na komorę wierzchołkową wkładu membrany poliwęglanowej transwell. Do komory podstawowej transwella dodać 1,5 ml pożywki proliferacyjnej.
  3. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C i całkowicie zmieniać całe podłoże w komorze podstawowej i wierzchołkowej co 3 dni za pomocą pożywki ekspansywnej, aż do osiągnięcia konfluencji. Zwykle trwa to od 3 do 6 dni.
  4. Przygotuj 50 ml pożywki do całkowitego różnicowania, dodając 5 ml suplementu ALI 10x, 500 μl suplementu podtrzymującego ALI, 100 μl roztworu heparyny i 250 μl roztworu podstawowego hydrokortyzonu do 44,15 ml podłoża podstawowego ALI.
  5. Przygotuj szyfranta po stronie.
    1. Przetrzyj jednego papierosa przez 12,5 ml pożywki różnicującej, a następnie przefiltruj go przez filtr porowy 0,22 μm, aby przygotować CSE. Aby zapewnić standaryzację między eksperymentami i partiami CSE, zmierz absorbancję przy 320 nm na spektrofotometrze i zdefiniuj gęstość optyczną (OD) 1 jako 100%8.
  6. Użyć pożywki różnicującej zawierającej CSE o odpowiednim stężeniu w celu stymulacji pierwotnych komórek nabłonka mysich dróg oddechowych w celu wykrycia wpływu na różnicowanie komórek.
  7. Pozwól komórkom różnicować się przez 28 dni, podczas których zmienia się podłoże komory podstawnej, a stronę wierzchołkową przemuje się dwa razy w tygodniu poprzez usunięcie pożywki komory wierzchołkowej i zastąpienie pożywki komory podstawowej pożywką różnicującą zawierającą odpowiednie stężenie CSE.
  8. Przeanalizuj komórki po ekspozycji.
    1. Po wystawieniu na działanie pożywki różnicującej zawierającej CSE, należy pobrać komórki i supernatanty hodowlane w dowolnym momencie (tj. 0-28 dni) w celu wykrycia zmian morfologicznych (tj. test immunofluorescencyjny (IFA) lub barwienie hematoksyliną-eozyną (HE) lub w bioinformatycznych procedurach analitycznych (tj. transkryptomika, proteomika, metabolomika itp.).

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Różnicowanie
Mysie komórki nabłonka dróg oddechowych pomyślnie różnicowały się po hodowli na granicy faz powietrze-ciecz z pożywką różnicującą przez 28 dni. Obecność komórek rzęskowych i kubkowych wykazano za pomocą testu immunofluorescencyjnego markera rzęsek acetylowanej α-tubuliny (zielony; Rysunek 3A) i marker komórki kubkowej Mucin5AC, odpowiednio6 (czerwony; Rysunek 3B).

Oznaczanie stężenia CSE dla różnicowania komórek
Stymulować izolowane komórki nabłonkowe różnymi stężeniami CSE przez 24 godziny. Wyniki wykazały, że żywotność komórek nabłonkowych spadała, gdy stężenie CSE było wyższe niż 6% (p <0,05, Figura 4A). W celu utrzymania aktywności komórek w warunkach długotrwałej stymulacji, pożywki hodowlane zawierające 2%, 4% i 6% CSE stosowano w celu stymulacji różnicowania komórek nabłonka przez 28 dni. Co więcej, wyniki wykazały, że wraz ze wzrostem stężenia CSE nie doszło do znaczącej śmierci komórek nabłonkowych (Figura 4B), ale nastąpiła stopniowa zmiana liczby międzykomórkowej odporności transbłonowej (TEER) (Figura 4C) i złuszczonych komórek (Rysunek 4D). Ponadto zaobserwowano ogólne zmniejszenie liczby komórek zróżnicowanych i komórek rzęskowych, gdy hodowle mysich komórek nabłonka dróg oddechowych były przewlekle narażone na CSE (Figura 4E-H). W związku z tym wybrano pożywkę różnicującą zawierającą 6% CSE, aby rozregulować funkcję bariery nabłonkowej i zmniejszyć liczbę komórek rzęskowych bez spadku żywotności komórek podczas różnicowania komórek nabłonkowych przez 28 dni.

Analiza multiomiczna
Pobrano dwie grupy komórek stymulowanych pożywką różnicową zawierającą 0% lub 6% CSE przez 28 dni. Całkowite mRNA wyekstrahowano do analizy transkryptomicznej. Po przygotowaniu biblioteki, sekwencjonowaniu, kontroli jakości, mapowaniu odczytów do genomu referencyjnego i kwantyfikacji ekspresji genów, przeanalizowano różnicową ekspresję genów między obiema grupami. Pakiet clusterProfiler R został wykorzystany do przeprowadzenia analizy wzbogacenia ontologii genów (GO) dla genów, które wykazywały zróżnicowaną ekspresję, z poprawkami dokonanymi w celu uwzględnienia rozbieżności w długości genów (Figura 5A)". Encyklopedia Genów i Genomów z Kioto (KEGG) służy jako obszerna baza danych, która ułatwia zrozumienie złożonych funkcji i ról systemów biologicznych na różnych poziomach, w tym komórkowym, organizmowym i ekologicznym, poprzez integrację danych na poziomie molekularnym pochodzących z obszernych zestawów danych, takich jak te uzyskane przez sekwencjonowanie genomu i wysokoprzepustowe metodologie eksperymentalne (Rysunek 5B). W przypadku proteomiki białka ogółem wyekstrahowano z dwóch grup komórek po 28 dniach od hodowli z pożywkami różnicowymi zawierającymi 0% lub 6% CSE. Po badaniu jakości białka, usuwaniu soli, hydrolizie enzymatycznej białek, znakowaniu peptydów Tandem Mass Tags (TMT), oddzieleniu frakcji, analizie LC-MS, identyfikacji białek i ilościowym określeniu ilości białek, można zdefiniować białka o zróżnicowanej ekspresji między dwiema grupami. Analizę GO przeprowadzono przy użyciu programu interproscan w stosunku do nieredundantnej bazy danych białek (Figura 6A), a KEGG wykorzystano do analizy szlaku (Figura 6B). Do celów metabolomicznych supernatanty hodowlane pobrano z dwóch grup komórek nabłonka dróg oddechowych po 28 dniach od hodowli z pożywką różnicującą zawierającą 0% lub 6% CSE. Po analizie HPLC-MS/MS, identyfikacji i ilościowym określeniu metabolitów można określić metabolity różnicujące między tymi dwiema grupami. Baza danych KEGG (Rysunek 7A), Baza danych metabolomu człowieka (Figura 7B) oraz Baza danych Lipidmaps (Rysunek 7C) zostały wykorzystane do opisu wszystkich metabolitów. Baza danych KEGG została wykorzystana do analizy funkcji tych zróżnicowanych metabolitów i szlaków metabolicznych (Rysunek 7D). W przypadku epigenomiki ATAC-seq wykonano zgodnie z wcześniejszymi raportami9. Jądra ekstrahowano z dwóch grup komórek po 28 dniach od hodowli z pożywką różnicową zawierającą 0% lub 6% CSE, a osad jądra zawieszono ponownie w mieszaninie reakcyjnej transpozazy Tn5. Reakcję transpozycji inkubowano w temperaturze 37 °C przez 30 minut. Po dodaniu adaptera, przygotowaniu biblioteki, ocenie jakości, grupowaniu i sekwencjonowaniu można zdefiniować epigenomikę różnicową między dwiema grupami. Analiza wzbogacenia GO genów związanych z różnicowo pikami bezpośrednio odzwierciedla rozkład liczby genów związanych z różnicami związanymi z pikami w pozycjach GO wzbogaconych w procesy biologiczne, składniki komórkowe i funkcję molekularną (Rysunek 8A). Baza danych KEGG została wykorzystana do analizy funkcji tych zróżnicowanych genów i szlaków (Rysunek 8B).

Geny kodujące białka o ścisłym połączeniu
Dane transkryptomiczne wykazały, że po długotrwałej stymulacji CSE nastąpiła zmniejszona ekspresja wielu genów kodujących białka połączeń ścisłych, w tym Cgn, Cldn2, Cldn3, Cldn8, Cldn10, Cldn20, Cldn23, Jam2 i Ocln (Figura 9A), w których zmniejszona ekspresja Cldn3 i Ocln została dodatkowo potwierdzona przez Western-Blot i immunohistochemię (IHC) (Ryciny 9B-E). Dane te sugerują, że narażenie na CSE znacznie zmniejsza ekspresję białek połączeń ścisłych komórek nabłonka dróg oddechowych.

Wyrażenie cytokin i chemokin
Oprócz rozpadu ścisłych połączeń, transkryptomika wykazała również, że po długotrwałej stymulacji CSE, ekspresja niektórych cytokin i chemokin, w tym Cxcl5, Csf3, Il1a, Il34, Ccl20 i Il33, wzrosła, ale ekspresja Ccl5 zmniejszyła się (Figura 10A). Test Luminex potwierdził ponadto, że w supernatancie mysich komórek nabłonka dróg oddechowych wystąpiły zwiększone stężenia CXCL-5, CSF-3 i IL-1α (Rycina 10B-D), ale zmniejszone CCL-5 (Figura 10E). Wyniki te sugerują, że ekspozycja na CSE selektywnie wpływa na ekspresję cytokin i chemokin.

figure-results-1
Rysunek 1: Wzrost pierwotnych komórek nabłonka mysich dróg oddechowych. (A) Nowo wyizolowane komórki wydają się okrągłe i przezroczyste. (B) Do 2 dnia po izolacji, rozszerzone komórki uformowały się w małe wyspy komórkowe. (C) Do 4 dnia, tworzenie się większych wysp komórkowych. (D) Do 6 dnia ponad 90% fuzji z morfologią kostki brukowej. (4-krotne powiększenie; podziałka liniowa: 250 μm). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Test immunofluorescencyjny markerów komórek nabłonkowych. Ekspresja cytokeratyny w pierwotnych mysich komórkach nabłonka dróg oddechowych, A549 (kontrola pozytywna) i Raw264.7 (kontrola ujemna). Jądra barwione DAPI (powiększenie 63x; podziałka skali: 40 μm). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3: Test immunofluorescencyjny dla markerów komórek rzęskowych i kubkowych. Stosowanymi markerami były acetylowana (A) α-tubulina i (B) mucyna 5AC do potwierdzania odpowiednio komórek rzęsek i komórek kubkowych (powiększenie 100; podziałka skali: 10 μm w panelu A i 50 μm w panelu B). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rysunek 4: Wpływ stężeń CSE na komórki nabłonkowe. (A) Żywotność komórek po 24 godzinach przy różnych stężeniach CSE. (B) Żywotność komórek po 28 dniach. (C) Pomiar TEER. (D) Liczba złuszczonych komórek. (E-H) Immunofluorescencja dla komórek rzęskowych (zielonych) i kubkowych (fioletowych) przy stężeniach 0%, 2%, 4% i 6% CSE (powiększenie 20x; podziałka skali: 50 μm). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-5
Rysunek 5: Analizy wzbogacenia GO i KEGG pod kątem ekspresji genów. (A) Znaczenie terminu GO we wzbogaconym procesie biologicznym, komponencie komórkowym i funkcji molekularnej. (B) Odsetek genów o zróżnicowanej ekspresji w szlakach KEGG. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-6
Rysunek 6: Analiza ekspresji białek. (A) Wykres słupkowy wzbogacający GO pokazujący różnicową ekspresję białka. (B) Analiza szlaku KEGG w oparciu o białka o zróżnicowanej ekspresji. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-7
Rysunek 7: Analiza szlaku metabolitów KEGG. (A) Adnotacja wszystkich metabolitów za pomocą bazy danych KEGG. (B) Opisywanie wszystkich metabolitów przy użyciu bazy danych metabolomu ludzkiego. (C) Opisywanie wszystkich metabolitów za pomocą bazy danych Lipidmaps. (D) Dystrybucja metabolitów o zróżnicowanej ekspresji w różnych szlakach KEGG. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-8
Rysunek 8: Analiza ekspresji genów związanych z pikami różnicowymi. (A) Wykres słupkowy wzbogacania GO pokazujący różnicową ekspresję białek. (B) Analiza szlaku KEGG w oparciu o białka o zróżnicowanej ekspresji. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-9
Rysunek 9: Ekspresja białka ścisłego połączenia w komórkach nabłonka mysich dróg oddechowych ze stymulacją lub bez stymulacji CSE. (A) Mapa cieplna ekspresji białka połączenia ścisłego w transkryptomie. (B-E) Poziomy ekspresji (B,C) Cldn3 i (D,E) Ocln w mysich komórkach nabłonka dróg oddechowych wykryto za pomocą Western Blot i immunohistochemii dla Cldn3 i Ocln (powiększenie 80; paski skali: 50 μm). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-10
Rysunek 10: Analiza ekspresji cytokin. (A) Mapa cieplna transkryptomu ekspresji cytokin. (B-E) Test Luminex dla poziomów CXCL-5, CSF-3, IL-1α i CCL-5 w komórkach z/bez stymulacji CSE. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

POChP jest powszechną przewlekłą chorobą zapalną dróg oddechowych. Narażenie na dym tytoniowy prowadzi do przewlekłego zapalenia dróg oddechowych, przebudowy dróg oddechowych i zniszczenia strukturalnego płuc, co jest wynikiem interakcji różnych komórek strukturalnych i komórek odpornościowych10. Komórki nabłonka dróg oddechowych, jako pierwsza linia wrodzonego układu odpornościowego w płucach, odgrywają bardzo ważną rolę podczas rozwoju choroby11. Z tego punktu widzenia wyjaśnienie, w jaki sposób komórki nabłonkowe zmieniają się i regulują dalsze komórki pod wpływem stymulacji szkodliwych substancji, jest problemem naukowym, który należy pilnie rozwiązać.

Ostatnio opisano kilka zwierzęcych modeli POChP, które pokonały pewneograniczenia12. W tych modelach można zaobserwować umiarkowane poziomy neutrofilowego zapalenia dróg oddechowych, sygnaturę zapalną Th1/Th17, wyraźną nadprodukcję śluzu, zwiększoną przebudowę dróg oddechowych, pogorszoną czynność płuc i powiększone przestrzenie powietrzne. Chociaż modele te potrzebują tylko 1 miesiąca, aby ustalić zmiany podobne do POChP, to, co stało się u myszy wystawionych na dym papierosowy w ciągu 1 miesiąca, jest nadal niejasne. Stosowanie długotrwałej stymulacji CSE ma tę zaletę, że jest łatwiejsze do skalibrowania, co oznacza, że komórki nabłonka dróg oddechowych mogą być narażone na jak najcięższy bodziec papierosowy bez śmierci, podobnie jak komórki nabłonka dróg oddechowych u palaczy. W tym przypadku monitorowanie dynamicznych zmian patologicznych prowadzących do zapalenia dróg oddechowych i powstawania rozedmy płuc ma kluczowe znaczenie dla dalszego zrozumienia patogenezy POChP związanej z paleniem tytoniu. W związku z tym stworzyliśmy model in vitro , aby naśladować stan dymu i staraliśmy się monitorować dynamiczne zmiany podczas ekspozycji CSE na komórki nabłonka dróg oddechowych. Co więcej, stosunkowo oczyszczone komórki nabłonka dróg oddechowych sprawiają, że badanie multiomiczne jest łatwiejsze niż badanie całych tkanek, co może pomóc nam znaleźć odpowiedzi molekularne i komórkowe w ekspozycji komórek nabłonka dróg oddechowych na CSE oraz zidentyfikować kluczowe szlaki i cele terapeutyczne POChP w wysokiej przepustowości.

W tym przypadku protokół opisujący izolację mysich komórek nabłonka tchawicy jest zaadaptowany z protokołów Hilaire i wsp.13 oraz You i wsp.14 z pewnymi modyfikacjami. W protokole zastosowanym w tym badaniu mysie komórki nabłonka dróg oddechowych rozmnożono i różnicowano w pseudostratyfikowaną strukturę zawierającą komórki rzęskowe i kubkowe przy użyciu granicy faz powietrze-ciecz i pożywki zawierającej CSE, ustanawiając w ten sposób model aklimatyzacji przewlekłej CSE. Następujące zdarzenia są kluczowymi punktami obecnego modelu.

Biorąc pod uwagę, że zwichnięcie szyjki macicy może mechanicznie nadwyrężyć szyję i fizycznie uszkodzić komórki nabłonka, a znieczulenie wodzianem chloralu może również wpływać na drogi oddechowe, pentobarbital sodu zastosowano do eutanazji15. Podczas zabiegów chirurgicznych na myszach zanurzenie tylko szyi i dolnych obszarów, aby zapobiec przedostawaniu się alkoholu do nosa, może zwiększyć żywotność komórek nabłonka dróg oddechowych16. Wstępne dane z niniejszego badania wykazały, że komórki nabłonka dróg oddechowych poddane intubacji tchawicy lub zanurzeniu w alkoholu miały niską żywotność i nie rozszerzały się. Ponadto, aby uzyskać komórki nabłonka dróg oddechowych bez erytrocytów, należy zachować ostrożność podczas zabiegów chirurgicznych, aby uniknąć zanieczyszczenia krwi podczas izolowania głównych dróg oddechowych.

Nawet u myszy wolnych od specyficznych patogenów drogi oddechowe skolonizowały znaczące drobnoustroje. Dodanie odpowiednich antybiotyków do pożywki ekspansyjnej pierwotnych mysich komórek nabłonka dróg oddechowych P0 jest niezbędne do uniknięcia zanieczyszczenia patogenami bakteryjnymi lub grzybiczymi. Roztwór koktajlowy penicyliny, streptomycyny, amfoterycyny B i gentamycyny17 skutecznie zapewnia ekspansję mysich komórek nabłonka dróg oddechowych P0 w sterylnym środowisku in vitro . Wstępne eksperymenty wykazały, że jeśli nie ma skutecznego hamowania zanieczyszczenia bakteryjnego, mysie komórki nabłonka dróg oddechowych P0 umrą przed pierwszym pasażem.

W metodach trawienia badano zarówno 4 °C, jak i 37 °C. Wyniki wstępnych eksperymentów wykazały, że trawienie w temperaturze 37 °C przewyższało 4 °C pod względem efektywności czasowej, żywotności komórek i wydajności komórek.

Przed wysiewem komórek nabłonkowych kolagen z ogona szczura rozpuszczono w kwasie octowym i użyto do pokrycia naczynia hodowlanego w celu poprawy adhezji komórek nabłonka18. Jednak gęstość powłoki kolagenowej nie powinna być ani zbyt wysoka, ani zbyt niska; Niewystarczająca gęstość nie zapewnia odpowiednich warunków adhezji, podczas gdy nadmierna gęstość powoduje powstawanie krystalicznej pozostałości na powierzchni hodowli.

Kluczowym krokiem jest utrzymanie przy życiu większej liczby komórek nabłonka i uniknięcie zanieczyszczenia fibroblastami. Aby to osiągnąć, zalecamy, aby 1) użycie zestawu do dysocjacji komórek bez składników zwierzęcych mogło delikatnie wyizolować komórki nabłonkowe i zmniejszyć niepotrzebne uszkodzenia komórek oraz 2) użycie pożywki różnicowej zawierającej hydrokortyzon może hamować wzrost fibroblastów i promować proliferację komórek nabłonkowych.

Tradycyjne zanurzone monowarstwowe hodowle komórek nabłonka dróg oddechowych są podstawą badań oddechowych i badań toksykologicznych. Jednak metody te nie są w stanie dokładnie odtworzyć zróżnicowanych cech tkanek nabłonka dróg oddechowych, które stwierdzono in vivo. Aby rozwiązać ten problem, zdecydowaliśmy się na alternatywny model nabłonka dróg oddechowych. Model ten opiera się na hodowli pierwotnych komórek dróg oddechowych na mikroporowatych rusztowaniach błonowych, takich jak te dostarczane przez systemy transwell, na granicy faz powietrze-ciecz19. Wystawienie powierzchni wierzchołkowej na otaczające powietrze w tej konfiguracji hodowli ALI odgrywa zasadniczą rolę we wspieraniu różnicowania komórkowego, a tym samym ściślej naśladuje warunki in vivo 20.

Jeśli różnicowanie nie jest skuteczne, kluczowe jest oszacowanie potencjalnych przyczyn. Obejmuje to możliwość, że komórki nabłonka dróg oddechowych mogły ulec nadmiernemu pasażowaniu, co może upośledzać ich zdolność różnicowania. Ponadto konieczne jest zapewnienie, że nagromadzenie śluzu i płynu w komorze wierzchołkowej zostanie całkowicie wyeliminowane podczas dwutygodniowego procesu wymiany pożywki, ponieważ zawartość resztkowa może utrudniać proces różnicowania.

Chociaż model ten ma pewne ograniczenia, pozostaje cennym narzędziem badawczym. Jednym z ograniczeń jest to, że zastosowanie pożywki zawierającej CSE do stymulacji komórek nabłonka dróg oddechowych może nie w pełni odtworzyć warunków in vivo , których doświadczają komórki nabłonka dróg oddechowych u palaczy. Ponadto żywotność zróżnicowanych komórek nabłonka rzęsek in vitro jest zwykle ograniczona do miesiąca. Pomimo tych ograniczeń model skutecznie integruje kilka kluczowych aspektów: ułatwia badanie różnicowania komórek nabłonka dróg oddechowych na granicy faz powietrze-ciecz, długoterminową aklimatyzację do CSE oraz zastosowanie analizy multiomicznej w określonych ramach czasowych. To kompleksowe podejście oferuje wyrafinowane i holistyczne ramy dla przyszłych badań nad fizjologicznymi i patologicznymi mechanizmami komórek nabłonka dróg oddechowych. Ponadto pomaga w identyfikacji potencjalnych biomarkerów i celów terapeutycznych w chorobach dróg oddechowych. Mamy nadzieję, że nasze doświadczenia dostarczą przydatnych informacji dla tych, którzy chcieliby wykorzystać ten model do odpowiednich badań.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To badanie było wspierane przez Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (82090013).

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
100x roztwór penicyliny/streptomycynyGibco15140122
24 mm Transwell z 0,4 &mikro; m Wkład membrany poliestrowej porowej, sterylnyBIOFILTCS016012
40 µ m Sitko komórkoweFalcon352340
500x Roztwór gentamycyny/amfoterycynyGibcoR01510
acetylowana &alfa;-tubulinaCST#5335
Acetylo-&alfa;-tubulina (Lys40) (D20G3)XP Królik mAb cellsignal#5335
Zestaw do dysocjacji komórek wolnych od składników zwierzęcychStemcell05426
Przeciwciało anty-pan Cytokeratynaabcamab7753
PapierosMarlboro
Claudin3immunowayYT0949
Deoksyrybonuklaza I z trzustki bydlęcejSigma-AldrichDN25
Deoksyrybonuklaza I z trzustki bydlęcejSigmaDN25
Ham" s F-12Sigma-AldrichN6658
Roztwór heparyny Stemcell07980
Roztwór podstawowy hydrokortyzonuStemcell07925
Mucyna 5ACabcamab212636
Occludinproteintech27260-1-AP
PBSCytosciCBS004S-BR500
Roztwór penicyliny i streptomycynyGibco15140122
PneumaCult-ALI
Podstawowa średnia		komórka macierzysta05002 
PneumaCult-ALI 10x SuplementStemcell05003 
PneumaCult-ALI Suplement pielęgnacyjnyStemcell05006
PneumaCult-Ex Plus 50x SuplementStemcell05042
PneumaCult-Ex Plus Basal MediumStemcell05041
Pronase ESigma-AldrichP5147
Kolagen z ogona szczuraCorning354236
Trypan BlueKomórka macierzysta07050 

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ritchie, A. I., Martinez, F. J. The challenges of defining early chronic obstructive pulmonary disease in the general population. Am J Respir Crit Care Med. 203 (10), 1209-1210 (2021).
  2. Caramori, G., Kirkham, P., Barczyk, A., Di Stefano, A., Adcock, I. Molecular pathogenesis of cigarette smoking-induced stable COPD. Ann N Y Acad Sci. 1340, 55-64 (2015).
  3. Leino, M. S., et al. Barrier disrupting effects of alternaria alternata extract on bronchial epithelium from asthmatic donors. PLoS One. 8 (8), e71278(2013).
  4. Benediktsdóttir, B. E., Arason, A. J., Halldórsson, S., Gudjónsson, T., Másson, M., Baldursson, Ó Drug delivery characteristics of the progenitor bronchial epithelial cell line VA10. Pharm Res. 30 (3), 781-791 (2013).
  5. Walters, M. S., et al. Generation of a human airway epithelium derived basal cell line with multipotent differentiation capacity. Respir Res. 14 (1), 135(2013).
  6. Prytherch, Z., Job, C., Marshall, H., Oreffo, V., Foster, M., BéruBé, K. Tissue-specific stem cell differentiation in an in vitro airway model. Macromol Biosc. 11 (11), 1467-1477 (2011).
  7. Kilkenny, C., Browne, W., Cuthill, I. C., Emerson, M., Altman, D. G. Animal research: Reporting in vivo experiments: The ARRIVE guidelines. Br J Pharmacol. 160 (7), 1577-1579 (2010).
  8. Brekman, A., Walters, M. S., Tilley, A. E., Crystal, R. G. FOXJ1 prevents cilia growth inhibition by cigarette smoke in human airway epithelium in vitro. Am J Respir Cell Mol Biol. 51 (5), 688-700 (2014).
  9. Bajic, M., Maher, K. A., Deal, R. B. Identification of open chromatin regions in plant genomes using ATAC-seq. Methods Mol Biol. 1675, 183-201 (2018).
  10. Shaykhiev, R., Crystal, R. G. Early events in the pathogenesis of chronic obstructive pulmonary disease. Smoking-induced reprogramming of airway epithelial basal progenitor cells. Ann Am Thorac Soc. 11, Suppl 5 (Suppl 5) S252-S258 (2014).
  11. Raby, K. L., Michaeloudes, C., Tonkin, J., Chung, K. F., Bhavsar, P. K. Mechanisms of airway epithelial injury and abnormal repair in asthma and COPD. Front Immunol. 14, 1201658(2023).
  12. Zhou, J. -S., et al. Cigarette smoke-initiated autoimmunity facilitates sensitisation to elastin-induced COPD-like pathologies in mice. Eur Respir J. 56 (3), 2000404(2020).
  13. Lam, H. C., Choi, A. M. K., Ryter, S. W. Isolation of mouse respiratory epithelial cells and exposure to experimental cigarette smoke at air-liquid interface. J Vis Exp. (48), e2513(2011).
  14. You, Y., Brody, S. L. Culture and differentiation of mouse tracheal epithelial cells. Methods Mol Biol. 945, 123-143 (2012).
  15. Wandalsen, G. F., Lanza, F. deC., Nogueira, M. C. P., Solé, D. Efficacy and safety of chloral hydrate sedation in infants for pulmonary function tests. Rev Paul Pediatr. 34 (4), 408-411 (2016).
  16. Jiang, D., Schaefer, N., Chu, H. W. Air-liquid interface culture of human and mouse airway epithelial cells. Methods Mol Biol. 1809, 91-109 (2018).
  17. Takagi, R., et al. How to prevent contamination with Candida albicans during the fabrication of transplantable oral mucosal epithelial cell sheets. Regen Ther. 1, 1-4 (2015).
  18. Culp, D. J., Latchney, L. R. Mucinlike glycoproteins from cat tracheal gland cells in primary culture. Am J Physiol. 265 (3), Pt 1 L260-L269 (1993).
  19. Cao, X., et al. Invited review: human air-liquid-interface organotypic airway tissue models derived from primary tracheobronchial epithelial cells-overview and perspectives. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 57 (2), 104-132 (2021).
  20. Bebök, Z., Tousson, A., Schwiebert, L. M., Venglarik, C. J. Improved oxygenation promotes CFTR maturation and trafficking in MDCK monolayers. Am J Physiol Cell Physiol. 280 (1), C135-C145 (2001).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Airway Epithelial CellsCigarette Smoke ExtractIn Vitro ModelMurine Airway CellsAir Liquid InterfaceCell DifferentiationMulti Omics AnalysisChronic Smoke ExposureImmunofluorescence AssayCOPD Pathogenesis

Related Articles