Artykuł metodologiczny

Identyfikacja komórek w stanie spoczynku w modelu ostrej białaczki limfoblastycznej limfoblastycznej limfocytów T danio pręgowanego za pomocą barwienia proliferacji komórek

1.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/67059

⸱

19 lipca 2024

 ,  , 
1Pharmacology and Nutritional Sciences, The University of Kentucky, 2Markey Cancer Center, The University of Kentucky, 3Department of Molecular and Cellular Biochemistry, The University of Kentucky

W tym artykule

Podsumowanie

Użyliśmy barwienia proliferacji komórek, aby zidentyfikować komórki w stanie spoczynku w modelu T-ostrej białaczki limfoblastycznej u danio pręgowanego. Barwnik jest zatrzymywany w komórkach niedzielących się i redukowany podczas proliferacji komórek, co umożliwia selekcję uśpionych komórek do dalszego badania. Protokół ten zapewnia funkcjonalne narzędzie do badania samoodnowy w kontekście spoczynku komórkowego.

Streszczenie

Spoczynek komórkowy to stan zatrzymania wzrostu lub spowolnionej proliferacji, który jest opisany w normalnych i rakowych komórkach macierzystych (CSC). Spoczynek może chronić CSC przed antyproliferacyjnymi lekami chemioterapeutycznymi. W mysich modelach ksenoprzeszczepu (PDX) pochodzących od pacjentów z ostrą białaczką limfoblastyczną (T-ALL) komórki spoczynkowe są związane z opornością na leczenie i macierzystym. Barwniki proliferacji komórek są popularnymi narzędziami do śledzenia podziału komórek. Barwnik fluorescencyjny jest kowalencyjnie zakotwiczony w grupach aminowych na błonie i makrocząsteczkach wewnątrz komórki. Pozwala to na śledzenie znakowanych komórek przez maksymalnie 10 podziałów, które można rozwiązać za pomocą cytometrii przepływowej.

Ostatecznie, komórki o najwyższych wskaźnikach proliferacji będą miały niską retencję barwnika, ponieważ będzie on rozcieńczany przy każdym podziale komórki, podczas gdy uśpione, wolniej dzielące się komórki będą miały najwyższą retencję. Zastosowanie barwników proliferacji komórek do izolowania uśpionych komórek zostało zoptymalizowane i opisane w mysich modelach T-ALL. Uzupełnienie istniejących modeli mysich, model T-ALL danio pręgowanego pochodzącego z rag2:Myc stanowi doskonałe miejsce do badania samoodnawiania się w T-ALL ze względu na wysoką częstotliwość białaczkowych komórek macierzystych (LSC) i wygodę danio pręgowanego w eksperymentach transplantacyjnych na dużą skalę.

Tutaj opisujemy przebieg procesu barwienia komórek T-ALL zebry za pomocą barwnika proliferacji komórek, optymalizacji stężenia barwnika dla komórek danio pręgowanego, pasażu pomyślnie wybarwionych komórek in vivo, oraz zbierania komórek o różnym poziomie zatrzymywania barwnika poprzez sortowanie żywych komórek od przeszczepionych zwierząt. Biorąc pod uwagę brak ugruntowanych twórców powierzchni komórek dla LSC w T-ALL, podejście to zapewnia funkcjonalne środki do badania komórek w stanie spoczynku in vivo. Aby uzyskać reprezentatywne wyniki, opisujemy skuteczność wszczepienia i częstość LSC komórek o wysokim i niskim poziomie zatrzymywania barwnika. Metoda ta może pomóc w badaniu dodatkowych właściwości komórek w stanie spoczynku, w tym odpowiedzi na lek, profili transkrypcyjnych i morfologii.

Wprowadzenie

Dorosłe komórki macierzyste są odpowiedzialne za regenerację zróżnicowanych typów komórek w danym narządzie i są głównie obecne w stanie uśpienia, bez podziału1,2. Na przykład hematopoetyczne komórki macierzyste (HSC), które utrzymują krew, w dużej mierze pozostają w stanie spoczynku, a tylko niewielka część wchodzi w cykl komórkowy, aby samoodnawiać się lub różnicować w celu wytworzenia dojrzałych składników krwi3. Podobnie, w nowotworach, rzadka subpopulacja komórek zwana rakowymi komórkami macierzystymi (CSC) posiada zdolność do samoodnawiania się i jest odpowiedzialna za długoterminowe utrzymanie złośliwości4. Nowotworowe komórki macierzyste istnieją in vivo w stanie spoczynku lub powolnego wzrostu, co może umożliwić im uniknięcie antyproliferacyjnych terapii przeciwnowotworowych5, uniknięcie klirensu przez układ odpornościowy6, zmniejszenie stresu oksydacyjnego i wzmocnienie ich szlaków naprawy DNA7. Nawet niewielka liczba CSC pozostawionych po leczeniu może potencjalnie ponownie zasiedlić guz, powodując nawrót choroby u pacjenta8. W związku z tym zrozumienie spoczynku komórkowego jest bardzo obiecujące dla identyfikacji potencjalnych luk w zabezpieczeniach CSC i opracowania nowych sposobów ich zwalczania.

Barwniki proliferacji komórek, takie jak barwnik ester sukcynimidylowy karboksyfluoresceiny (CFSE) i jego pochodne, są powszechnie używane do śledzenia częstotliwości podziałów komórkowych9. Barwnik przenika przez błonę komórkową, a po wejściu do komórki ulega aktywacji przez wewnątrzkomórkowe esterazy w produkt fluorescencyjny. Powstały w ten sposób związek fluorescencyjny jest zatrzymywany wewnątrz komórki dzięki kowalencyjnym wiązaniom amidowym utworzonym między ugrupowaniem sukcynimidylowym a aminowymi grupami funkcyjnymi białek wewnątrzkomórkowych10. Przy każdym podziale komórkowym związek fluorescencyjny jest dzielony równo między dwie powstałe komórki, powodując dwukrotne rozcieńczenie sygnału. Barwnik ten umożliwia wykrycie do 10 podziałów komórkowych poprzez analizę cytometrii przepływowej11.

To podejście było wcześniej wykorzystywane do wzbogacania populacji CSC in vitro poprzez identyfikację populacji komórek o niskiej retencji barwnika11,12. W T-ALL CFSE wykorzystano do śledzenia wzrostu guza in vivo w ksenoprzeszczepach pobranych od pacjentów u myszy. Po znakowaniu komórek i trzech tygodniach od przeszczepu, analiza cytometrii przepływowej wykazała rzadką populację komórek, które nadal zachowywały fluorescencję CFSE. Populacja ta była związana z macierzystym, opornością na leczenie i wysokim podobieństwem do komórek powodujących nawroty u pacjentów13. W związku z tym barwnik ten stanowi użyteczne narzędzie do badania fenotypów komórek macierzystych białaczki (LSC) w T-ALL.

Celem pracy jest rozszerzenie zastosowania barwnika proliferacji komórek do badania spoczynku in vivo przy użyciu modelu T-ALL danio pręgowanego. W szczególności, rag2:Myc-driven danio pręgowany T-ALL model14 stanowi doskonałe miejsce do badania samoodnawiania się ze względu na wysoką częstotliwość LSC w porównaniu z modelami mysimi i chorobami ludzkimi15. Ponadto wykorzystanie danio pręgowanego pozwala na prowadzenie badań transplantacyjnych na dużą skalę, które można przeprowadzić przy znacznie niższych kosztach opieki i utrzymania w porównaniu z ich mysimi odpowiednikami16. Danio pręgowany doskonale nadaje się również do obrazowania na żywo, ponieważ znakowane fluorescencyjnie komórki nowotworowe można łatwo oglądać za pomocą prostego mikroskopu fluorescencyjnego w celu oszacowania tempa rozwoju guza16.

W tym protokole opisujemy proces barwienia komórek T-ALL zebry za pomocą barwnika proliferacji komórek, a następnie rozmnażania in vivo barwionych komórek w syngenicznym CG1 danio pręgowanym. Po rozwoju białaczki opisujemy sortowanie komórek, które zachowały barwnik i ich zastosowanie w późniejszym eksperymencie przeszczepu z ograniczeniem rozcieńczenia w celu ilościowego określenia wskaźników samoodnawiania LSC. Protokół ten można rozszerzyć o dodatkowe zastosowania, w tym badania przesiewowe in vivo potencjalnych związków do celowania w spoczynkowe LSC. Ponadto pobrane komórki mogą być wykorzystywane do różnych dalszych analiz, takich jak profilowanie transkryptomiczne, proteomika i metabolomika, oferując unikalny wgląd w zachowanie spoczynkowych LSC w T-ALL.

Protokół

W niniejszym protokole wykorzystujemy komórki T-ALL ryb zebrafish znakowane GFP, które zostały wcześniej wytworzone w szczepie CG1, dzięki czemu mogą być one bezpośrednio wstrzykiwane do syngeneicznych ryb zebrafish linii CG115. W skrócie, białaczka została wywołana poprzez mikrowstrzyknięcie DNA rag2:Myc oraz rag2:GFP do embrionów ryb zebrafish linii CG1 na etapie pojedynczej komórki. Rozwój białaczki u zwierząt monitorowano od 3 tygodnia po wstrzyknięciu, wykorzystując mikroskopię fluorescencyjną. Komórki białaczkowe GFP-dodatnie wyizolowano metodą FACS i poddawano seryjnym przeszczepom do odbiorczych ryb zebrafish CG1 w celu uzyskania klonów o wysokiej częstotliwości LSC. Szczegóły całego protokołu zostały opisane przez Blackburna i współpracowników15.

Alternatywnie, pierwotne T-ALL pochodne rag2:Myc można generować poprzez mikroiniekcję DNA do zarodków rybek danio-ostropłoryszych17. Mikroiniekcja DNA rag2:Myc wraz z fluorescencyjnym reporterem sterowanym przez rag2, takim jak GFP, może prowadzić do rozwoju ALL z komórek B, komórek T oraz ALL mieszanej18. Klony białaczki użyte w niniejszym protokole zostały wcześniej zweryfikowane jako T-ALL15. Wszystkie procedury eksperymentalne z udziałem rybek danio-ostropłoryszych zostały sprawdzone i zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt Uniwersytetu Kentucky, protokół 2019-3399.

1. Propagowanie komórek T-ALL danio pręgowanego in vivo

  1. Rozmroź jedną fiolkę zawierającą 1 mL zamrożonych komórek T-ALL ryb zebrafish znakowanych GFP w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C, delikatnie wstrząsając do czasu całkowitego rozmrożenia. Po rozmrożeniu przenieś próbkę na lód.
  2. Powoli pipetuj zawartość probówki do probówki stożkowej o pojemności 15 mL zawierającej 4 mL pożywki dla ryb (0.9x PBS + 5% FBS), aby rozcieńczyć medium do mrożenia.
  3. Wiruj przez 5 min przy 2 500 × g w temperaturze 4 °C. Usuń pożywkę znad pelletu. Resuspenduj komórki w 0,5 mL pożywki dla ryb i przechowuj je na lodzie.
  4. Policz komórki i w razie potrzeby rozcieńcz je do stężenia 100 000 komórek/5 µL.
  5. Znieczul dorosłe ryby zebrafish CG1, dodając 200 µL anestetyku (MS-222) o stężeniu 4 mg/mL do 25 mL wody systemowej dla ryb w czarce Petriego. Trzymając rybę CG1 brzuszną stroną do góry, wstrzyknij 5-6 µL do jamy otrzewnej (IP) za pomocą mikrostrzykawki Hamiltona. Przenieś zwierzęta z powrotem do zbiorników i monitoruj powrót do normalnego pływania przed ponownym umieszczeniem ich w systemie.
    UWAGA: Do badań nad transplantacją opisanych w niniejszym protokole wykorzystano dorosłe ryby zebrafish w wieku 60 dni lub starsze.
  6. Monitoruj wzrost białaczki raz w tygodniu za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego. Szczegóły procedury przesiewowej znajdują się w sekcji 2 poniżej.

2. Pozyskiwanie fluorescencyjnie znakowanych komórek białaczki

  1. Przybliźnie 21-28 dni po przeszczepie, uśpij dorosłego danio pręgowanego CG1, dodając 200 µL (4-5 kropli) środka anestetycznego w stężeniu 4 mg/mL do 25 mL wody z systemu dla ryb w czalce Petriego.
  2. Oceń stopień rozwoju białaczki u danio pręgowanego CG1, analizując procentowo liczbę komórek białaczkowych znakowanych GFP w organizmie zwierzęcia za pomocą mikroskopu epifluorescencyjnego, stosując odpowiedni filtr do detekcji fluorescencji GFP. Białaczka GFP-dodatnia jest gotowa do zbioru, jeśli objęła >70% organizmu zwierzęcia.
  3. Uśmierć zwierzę, dodając 1 mL środka anestetycznego w stężeniu 4 mg/mL do czalki Petriego zawierającej 9 mL wody z systemu dla ryb. Odczekaj do ustąpienia wszelkich oznak życia; na przykład obserwuj rybę do momentu zatrzymania ruchu opercularnego (~5 min).
  4. Przenieś danio pręgowanego do nowej czalki Petriego i dodaj 1 mL medium dla ryb, aby służyło ono jako bufor dla komórek. Używając nowego ostrza żyletki, najpierw odetnij głowę rybie, a następnie rozdrobnij tkankę za pomocą tej samej żyletki. Pipetuj zawiesinę w górę i w dół, aby rozbić duże skupiska komórek.
  5. Przepuść komórki przez sitko komórkowe o rozmiarze oczek 40 µm do probówki stożkowej 50 mL, aby uzyskać jednokomórkową zawiesinę. Przechowuj komórki w lodzie.

3. Optymalizacja stężenia barwnika do proliferacji komórek (CellTrace Far Red) dla barwienia i żywotności komórek ryby danio pręgowanej

UWAGA: W tym protokole, ze względu na to, że komórki nowotworowe są znakowane GFP, zastosowano far-redowy barwnik do proliferacji komórek (CellTrace Far Red), aby uniknąć nakładania się widm, który będzie dalej określany jako CT-FR.

  1. Przygotuj 1 mM roztwór barwnika fluorescencyjnego bezpośrednio przed użyciem, dodając odpowiednią objętość DMSO zgodnie z zaleceniami producenta. Przygotuj roztwory robocze o stężeniach 1 mM, 0,5 mM, 0,1 mM i 0,01 mM; w razie potrzeby rozcieńcz je w pożywce dla ryb, aby przebadać żywotność komórek po barwieniu.
  2. Policz komórki i odzyskaj 1 × 106 komórki w probówkach do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 ml.
  3. Wirować przy 2500 × g w 4 °C przez 5 min. Odpiśnik ciecz i resuspenduj komórki w 1 ml 0,9x PBS.
  4. Rozdziel zawiesinę komórkową pomiędzy cztery probówki z 250 µL każda z nich poddana leczeniu preparatem CT-FR.
  5. Dodaj 250 µL 0,9x PBS, aby zwiększyć objętość do 500 µL każda z około 250 000 komórek/probówkę.
  6. Do każdej z czterech probówek dodać wymagane ilości opisanych powyżej roztworów roboczych, aby uzyskać następujące stężenia końcowe 1 µM, 0.5 µM, 0.1 µMi 0.05 µMInkubować przez 20 min w temperaturze 37 °Cchroniąc przed światłem.
  7. Odwiruj komórki z prędkością 2 500 × g przez 5 min w temperaturze pokojowej. Usunąć ciecz i przemyć komórki za pomocą 500 µL pożywki do ryb w celu usunięcia nadmiaru barwnika.
  8. Ponownie odwiruj w celu uzyskania osadu, usuń ciecz i resuspenduj w 25 µL pożywek dla ryb. Użyj 1 µL do policzenia komórek w rozcieńczeniu 1:10 w 50% błękicie trypanowym.
  9. Obejrzyj komórki pod mikroskopem w celu oceny ich żywotności; komórki żywe nie zatrzymują błękitu trypanowego i pozostaną jasne pod mikroskopem, natomiast komórki martwe pochłoną barwnik i będą ciemne. Najpierw obejrzyj komórki w odpowiednim kanale fluorescencyjnym, aby zidentyfikować komórki nowotworowe, a następnie użyj kanału jasnego pola, aby ocenić ich żywotność.
  10. Wybierz stężenie, które zapewnia skuteczne barwienie przy jednoczesnym zachowaniu żywotności komórek (>90% komórek niebarwiących się błękitem trypanu).
    UWAGA: W przypadku komórek T-ALL rybki danio-ostrogonia (zebrafish) badanych w tym eksperymencie, 1 µM stężenie zastosowano w celu uzyskania prawidłowego barwienia, a >90% żywotności komórek.

4. Propagowanie komórek T-ALL rybek zebrafish barwionych CT-FR in vivo

  1. Używając zoptymalizowanego stężenia CT-FR z Sekcji 3, zabarw komórki rybek danio. Pozostaw część komórek nowotworowych niezabarwionych w celu wytworzenia guza T-ALL znakowanego GFP, który posłuży jako kontrola GFP-dodatnia podczas sortowania FACS. Rozcieńcz zarówno zabarwione, jak i niezabarwione komórki do stężenia 50 000 komórek/5 µL przed transplantacją.
  2. Zanurz dorosłe rybki danio CG1 w roztworze z 200 µL środka znieczulającego o stężeniu 4 mg/mL dodanego do 25 mL wody systemowej dla ryb w szalce Petriego w celu znieczulenia.
  3. Wstrzyknij 5 µL zawiesiny komórkowej do jamy otrzewnej (IP) rybek danio, zgodnie z opisem w Sekcji 1, zarówno w przypadku komórek zabarwionych, jak i niezabarwionych. Wykonaj iniekcje u 5-6 rybek na grupę, aby uwzględnić potencjalną śmiertelność po zabiegu.
  4. Badaj zwierzęta pod sedacją za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej dwa razy w tygodniu pod kątem rozwoju białaczki.
    UWAGA: Po około 10-14 dniach białaczka powinna zajmować około 30-40% ciała. Zaplanuj pobranie białaczki i późniejszy sort w tym przedziale czasowym. Oczekiwanie na wzrost guza do dużych rozmiarów może spowodować większe rozcieńczenie fluorescencyjnego barwnika komórkowego i utrudnić wykrycie sygnału. Rozważ optymalizację czasu pobrania guza dla wybranego modelu nowotworowego. Ponadto zaleca się tutaj częstsze monitorowanie guza, aby zapewnić uchwycenie pożądanego rozmiaru nowotworu.

5. Przygotowanie do sortowania komórek T-ALL z organizmów zebrafish barwionych CT-FR

  1. Przygotować następujące kontrole do sortowania komórek: kontrolę bezbarwną (niebarwione, nietransgeniczne, zawiesiny jednokomórkowe z dzikiego typu danio przebrzmiałego), komórki T-ALL znakowane GFP oraz nowo barwione komórki CT-FR dzikiego typu danio przebrzmiałego (w celu ustawienia maksymalnego progu sygnału Far-Red).
  2. Przygotowanie kontroli niebarwionych i CT-FR
    1. Pobrać komórki ryb typu dzikiego (WT), uśmiercając nieprzeszczepionego danio przebrzmiałego CG1 poprzez dodanie 1 mL anestetyka o stężeniu 4 mg/mL do szalki Petriego zawierającej 9 mL wody systemowej dla ryb.
    2. Przenieść rybę do nowej szalki Petriego i dodać 1 mL medium dla ryb, aby służyło jako bufor dla komórek. Używając nowej żyletki, najpierw oddzielić głowę, a następnie rozdrobić rybę; pipetować w górę i w dół, aby rozbić duże skupiska komórek.
    3. Przepuścić komórki przez sitko komórkowe 40 µm do probówki stożkowej 50 mL, aby uzyskać zawiesinę jednokomórkową. Przechowywać komórki w lodzie.
    4. W przypadku kontroli CT-FR przenieść 250 000 komórek WT do probówki do mikrocentryfugi iyściągnąć komórki poprzez wirowanie przy 2 500 × g przez 5 min w temperaturze pokojowej. Usunąć medium dla ryb i dodać 500 µL 0,9x PBS + 1% FBS.
    5. Dodać 0,5 µL roztworu zapasowego barwnika CT-FR o stężeniu 1 mM, aby uzyskać stężenie końcowe 1 µM. Delikatnie wymieszać pipetą 1 000 µL. Inkubować w 37 °C przez 20 min, chroniąc przed światłem.
    6. Usunąć ciecz i przemyć komórki 500 µL medium dla ryb, aby usunąć nadmiar barwnika.
    7. Ponownie zwirować komórki, usunąć ciecz, resuspendować komórki w 500 µL 0,9x PBS + 1% FBS i przepuścić przez nakrętkę z filtrem 35 µm do probówki FACS. Przechowywać w lodzie.
  3. Przygotowanie płytki donora
    UWAGA: Płytka donora to płytka 96-dołkowa z dnem w kształcie litery V, do której sortowane będą barwione CT-FR komórki T-ALL z przeszczepionych ryb danio przebrzmiałego. Każdy dołek płytki zawiera 5 000 niebarwionych komórek WT CG1 w 50 µL medium dla ryb, które służy jako nośnik pomagający w osadzaniu sortowanych komórek w kolejnych krokach.
    1. Odliczyć 500 000 komórek WT CG1 i przenieść je do probówki stożkowej 15 mL.
    2. Rozcieńczyć ten zapas komórek do stężenia 100 komórek/µL, dodając 5 mL medium dla ryb.
    3. Rozdzielić po 50 µL zawiesiny komórkowej do każdego dołka płytki 96-dołkowej. Mieszać probówkę z zapasem zawiesiny komórkowej po każdym rzędzie, aby zachować jednorodność zawiesiny. Przechowywać płytkę w temperaturze 4 °C do momentu sortowania.
  4. Przygotowanie próbek z przeszczepionych ryb
    1. Wybrać przeszczepione ryby z obciążeniem T-ALL na poziomie 30-40%. Zebrać ryby, którym przeszczepiono zarówno komórki barwione CT-FR, jak i niebarwione komórki nowotworowe GFP.
    2. Pobrać komórki zgodnie z opisem w Sekcji 2.
      UWAGA: Ponieważ oczekuje się niskiej liczby komórek zatrzymujących barwnik, należy przygotować się na sortowanie dużej liczby komórek z próbki CT-FR GFP.
    3. Rozcieńczyć do odpowiedniego stężenia do sortowania (~3-5 × 106 komórek/mL) w 0,9x PBS + 1% FBS i przepuścić przez nakrętkę z filtrem 35 µm do probówki FACS. Dodać DAPI (1 mg/mL) w rozcieńczeniu 1:1 000 jako barwnik żywotności w celu wykluczenia martwych komórek. Przechowywać w lodzie.
    4. W przypadku niebarwionych komórek nowotworowych GFP przenieść 250 000 komórek do probówki do mikrocentryfugi i zwirować przy 2 500 × g przez 5 min w temperaturze pokojowej. Usunąć medium dla ryb, dodać 500 µL PBS i przepuścić przez nakrętkę z filtrem 35 µm do probówki FACS. Przechowywać w lodzie.

6. Sortowanie

UWAGA: Wszystkie probówki oraz płytkę donora należy przez cały czas przechowywać w lodzie, z wyjątkiem momentów wykorzystania ich do sortowania.

  1. W celu ustalenia parametrów sortowania i bramek, należy rozpocząć od zastosowania bramkowania rozproszenia przedniego i bocznego (forward and side scatter), aby zidentyfikować komórki zainteresowania na podstawie ich wielkości i wyeliminować szczątki komórkowe. Następnie należy wykorzystać wysokość rozproszenia przedniego w stosunku do powierzchni rozproszenia przedniego (forward scatter height versus forward scatter area), aby wykluczyć komórki zdublowane i zachować wyłącznie singlety. Na koniec należy użyć kontroli bezbarwnych i jednobarwnych do wyznaczenia kwadrantów w celu identyfikacji populacji komórek GFP-dodatnich i CT-FR-dodatnich.
    UWAGA: Kontrola CT-FR powinna być znacznie jaśniejsza niż próbki do sortowania, ponieważ barwienie kontroli wykonano bezpośrednio przed analizą, bez podziałów komórkowych; przewiduje się, że komórki z próbek CT-FR GFP pojawią się w dolnej części bramki CT-FR-dodatnich.
  2. Należy posortować liczbę komórek przeznaczonych do przeszczepienia do każdej ryby do jednego dołka płytki donorowej.
    UWAGA: W tym eksperymencie wykorzystano test rozcieńczeń ograniczających (limiting dilution assay), aby oszacować częstotliwość występowania leukemicznych komórek macierzystych w grupach CT-FR High i CT-FR Low. W teście tym zastosowano dawkę 25 komórek, przeszczepioną 3 zwierzętom, oraz dawkę 10 komórek, przeszczepioną 10 zwierzętom. Typowy test rozcieńczeń ograniczających z wykorzystaniem T-ALL pochodzącego od zebrafish rag2:Myc obejmowałby grupę z większą liczbą komórek (500 lub 1 000), ponieważ częstotliwość LSC w tym modelu szacuje się na 1 LSC na setki komórek. Jednak w tym teście używamy jednego z klonów T-ALL opisanych wcześniej przez Blackburn i wsp.15. Częstotliwość LSC w próbce użytej w tym przypadku wynosi ~1 LSC na dziesiątki komórek; przewidujemy, że białaczka zostanie wykryta u zwierząt z grupy 25 komórek. Podczas optymalizacji tego testu dla danego modelu choroby należy zachować ostrożność przy wyborze grupy z większą liczbą komórek, aby zapewnić przyjęcie się guza.
  3. Po sortowaniu płytkę należy przechowywać w lodzie do momentu przeszczepienia.
    UWAGA: Procedury sortowania mogą być stresogenne i wpływać na żywotność komórek. Przed przeprowadzeniem właściwego eksperymentu z rozcieńczeniami ograniczającymi wykonano pilotażowy eksperyment sortowania. Posortowane komórki zostały przeszczepione, a rozwój białaczki monitorowano, aby ustalić, czy sortowanie nie wpłynęło negatywnie na żywotność komórek. Alternatywnie żywotność komórek można ocenić, barwiąc posortowane komórki błękitem trypanu i badając je pod mikroskopem przed przeszczepieniem.

7. Przeszczepianie posortowanych komórek w rozcieńczeniu ograniczającym i śledzenie wystąpienia guza

  1. Odwiruj płytkę w dużej wirówce laboratoryjnej przy 2,500 × g w temperaturze 4 °C.
  2. Ostrożnie usuń 45 µL supernatantu z każdej studni, pozostawiając 5 µL cieczy i dbając o to, aby nie dotknąć granulatu komórkowego na dnie studni.
  3. Resuspenduj komórki za pomocą pipety o objętości 20 µL. Resuspenduj 2-3 studnie pipetą, a następnie, używając mikrosyringi Hamiltona, wstrzyknij zawiesiny komórkowe z każdej studni do odpowiedniej liczby rybek zebrafish linii CG1 poprzez transplantację dootrzewnową (IP). Następnie resuspenduj komórki w kolejnej grupie studni, aby zapobiec ponownemu osadzaniu się komórek.
  4. Raz w tygodniu przez co najmniej 6 tygodni badaj rybki zebrafish za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej w stanie sedacji, aby monitorować rozwój T-ALL.

8. Oznaczanie częstotliwości występowania leukemicznych komórek macierzystych

  1. Zapisz liczbę zwierząt dodatnich dla każdej dawki komórek i grupy terapeutycznej w 6. tygodniu po transplantacji, uznając za dodatnie zwierzęta z dowolną ilością sygnału GFP. Uznać, że zwierzęta mają znaczne obciążenie białaczką, gdy sygnał GFP zajmuje >50% ciała.
  2. Użyj internetowego oprogramowania statystycznego ELDA (Extreme Limiting Dilution Analysis) (http://bioinf.wehi.edu.au/software/elda/)19 do obliczenia częstotliwości występowania LSC w każdej populacji komórek.
    UWAGA: Schematyczny opis przebiegu pracy przedstawiono na Rysunku 1.

Propagacja, barwienie i sortowanie komórek T-ALL rybki zebrafish; cytometria przepłyewowa, schemat testu rozcieńczeń ograniczonych.
Rysunek 1: Procedura wykorzystania barwnika do śledzenia komórek w celu wyizolowania komórek spoczynkowych w modelu T-ALL rybki zebrafish. Schematyczne przedstawienie barwienia komórek T-ALL rybki zebrafish barwnikiem proliferacji komórkowej, ich propagacji w rybce zebrafish linii CG1 (panel górny) oraz sortowania komórek na podstawie retencji barwnika proliferacji komórkowej (panel środkowy). Zebrane komórki wykorzystano do testu rozcieńczeń ograniczonych w celu określenia częstości występowania LSCs (panel dolny). Skróty: T-ALL = t-komórkowa ostra białaczka limfoblastyczna; LSCs = leukemiczne komórki macierzyste; CT-FR = CellTrace Far Red; FITC = izotiocyjanian fluoresceiny; PE = fikoerytryna. Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Wyniki

Postępowaliśmy zgodnie z powyższym protokołem w celu posortowania komórek, które zachowały barwnik proliferacji komórkowej CT-FR, a następnie wykorzystaliśmy je do analizy rozcieńczeń ograniczających (LDA), aby oszacować częstotliwość występowania LSC w populacjach CT-FR High oraz CT-FR Low. Aby ustawić bramkowanie dla eksperymentu cytometrii przepływowej, oprócz kontroli jednobarwnych zastosowaliśmy kontrolę bez fluoroforu (bez koloru) (Rysunek 2A). Kwadranty te posłużyły do zidentyfikowania populacji FITC- i PE-pozytywnych oraz -negatywnych w celu ustawienia bramek sortowania. Jednobarwna kontrola pozytywna CT-FR została przygotowana w dniu sortowania poprzez barwienie komórek WT z nieprzeszczepionego danio-pręgowanego, w związku z czym spodziewane natężenie sygnału jest znacznie wyższe niż sygnał z komórek propagowanych w próbce.

W przypadku GPF T-ALL barwionego na CT-FR (Rysunek 2B), komórki pojawiające się w prawym górnym kwadrancie z niską częstotliwością 0,13% uznano za CT-FR High, a w tym kwadrancie umieszczono bramkę sortowania oznaczoną jako „CT-FR high”. Inną bramkę utworzono w prawym dolnym kwadrancie w celu zebrania komórek białaczkowych, które są CT-FR Low. Ponieważ komórki CT-FR High występowały w niewielkiej ilości w próbce guza, posortowano dużą liczbę komórek (~2,5 × 106), aby zebrać liczbę komórek niezbędną do przeprowadzenia eksperymentu z rozcieńczeniem ograniczającym.

Po przeszczepieniu posortowanych komórek do rybek danio pręgowanych linii CG1 w celu przeprowadzenia LDA, ryby monitorowano przez 6 tygodni. Komórki z grupy CT-FR High charakteryzowały się czterokrotnie wyższą częstotliwością występowania LSC w porównaniu z populacją komórek CT-FR Low (p = 0.0134) (Rysunek 3A). Reprezentatywne obrazy zwierząt w 28. dniu po przeszczepieniu przedstawiono na (Rysunku 3B). W grupie CT-FR High przy dawce 10 komórek białaczka rozwinęła się u 8 z 9 zwierząt (89%), w porównaniu do 2 z 10 (20%) w grupie CT-FR Low (Rysunek 3A). Zwierzęta z grupy CT-FR High wykazały znacznie krótszy czas do wystąpienia białaczki (p = 0.0014) (Rysunek 3C). Ostatecznie zwierzęta z grupy CT-FR High miały znacznie niższą przeżywalność całkowitą (p = 0.0408) (Rysunek 3D); w 6. tygodniu przy życiu pozostało 70% zwierząt z grupy CT-FR Low w porównaniu do zaledwie 10% zwierząt z grupy CT-FR High. Wyniki te demonstrują wzbogacenie samoodnawiających się LSC w populacji komórek spoczywających o powolnym tempie podziałów w modelu T-ALL u rybek danio pręgowanych indukowanym przez rag2:Myc oraz skuteczność zastosowania barwienia proliferacji komórek do izolacji tej populacji.

Wykresy cytometrii przepływowej T-ALL barwionych CT-FR, pokazujące rozkład fluorescencji PE-Texas Red względem FITC.
Rycina 2: Sortowanie komórek za pomocą cytometrii przepływowej. (A) Wykresy FACS z nowo zabarwionych CT-FR komórek WT oraz komórek T-ALL znakowanych GFP zostały wykorzystane do utworzenia bram (gates) w celu sortowania komórek T-ALL GFP+ zabarwionych CT-FR. (B) Reprezentatywny przykład namnożonych komórek T-ALL GFP+ zabarwionych CT-FR. Komórki z prawego górnego kwadrantu uznano za CT-FR High, a komórki z prawego dolnego kwadrantu za CT-FR Low. Skróty: T-ALL = ostra białkowa białaczka limfoblastyczna z komórek T; CT-FR = CellTrace Far Red; GFP = zielone fluorescencyjne białko; FITC = izotiocyjanian fluoresceiny; PE = fikoerytryna; FACS = sortowanie komórek aktywowane fluorescencją; WT = typ dziki. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Badanie białaczki: tabela danych, obrazowanie zebrafish, wykresy przeżywalności; porównanie traktowania komórek.
Rycina 3: Znacznie wyższa częstotliwość występowania LSC w komórkach o wysokiej retencji barwnika proliferacji komórkowej. (A) Dane z testu rozcieńczeń ograniczających określające liczbę zwierząt z dodatnim wynikiem na białaczkę po przeszczepieniu dwóch zwiększających się dawek komórek (10 i 25 komórek). Obliczona częstotliwość LSC oraz 95% przedział ufności są podane (p = 0,0134). (B) Reprezentatywne obrazy zwierząt po 28 dniach od przeszczepienia; pasek skali = 10 mm. (C) Latencja do wystąpienia istotnej białaczki, rozumiana jako czas potrzebny, aby >50% zwierzęcia stało się GFP-dodatnie, co reprezentuje istotne obciążenie białaczką. (D) Krzywa przeżywalności zwierząt, którym przeszczepiono 10 komórek. Skróty: LSCs = leukemic stem cells (białaczkowe komórki macierzyste); CT-FR = CellTrace Far Red. Aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny, kliknij tutaj.

Dyskusja

Wiadomo, że LSC są oporne na konwencjonalne, antyproliferacyjne leczenie chemioterapią, a znalezienie ukierunkowanych terapii przeciwko tym komórkom jest bardzo obiecujące w zmniejszaniu występowania nawrotów i poprawie rokowaniapacjentów. Wcześniejsze badania opisywały zastosowanie barwników proliferacji komórek fluorescencyjnych do identyfikacji niewielkiej populacji komórek w stanie spoczynku związanych z opornością na leki i macierzystą w modelach T-ALL PDX13. W tej pracy opisujemy zastosowanie podobnego barwnika proliferacji komórek do rozwiązywania wolno dzielących się lub spoczynkowych komórek w modelu T-ALL danio pręgowanego. Użyliśmy tego narzędzia do opisania wzbogacenia LSC w komórkach o największej retencji barwnika proliferacji komórek. Rozszerzenie tych badań na danio pręgowanego ma wiele zalet. Danio pręgowany jest bardzo płodny; Każda para kryjąca może generować setki potomstwa każdego tygodnia, co napędza przeszczepy i ogranicza badania rozcieńczania, które wymagają dużej liczby zwierząt 15,17,21. Ponadto danio pręgowany jest bardzo wygodny do obrazowania in vivo, umożliwiając szybkie badania przesiewowe zwierząt z dodatnim wynikiem za pomocą prostej mikroskopii fluorescencyjnej16. W związku z tym protokół ten może służyć jako podstawa do dodatkowych badań komórek w stanie spoczynku w modelu T-ALL danio pręgowanego.

Tutaj opisujemy zastosowanie klonów T-ALL z dużą częstotliwością LSC, które zostały wcześniej wygenerowane w CG1 danio pręgowanym15, w ten sposób zamrożone komórki zostały po prostu rozmrożone i rozmnożone do użytku. Alternatywnie, T-ALL napędzany przez rag2: Myc może być generowany przez mikroiniekcję DNA zarodków danio pręgowanego, badania przesiewowe pod kątem zwierząt, u których rozwija się T-ALL i zbieranie białaczki od dodatniego danio pręgowanego, jak opisano wcześniej17. Wykorzystanie syngenicznego danio pręgowanego ma również wiele zalet dla tego typu badań. Ponieważ zwierzęta są genetycznie identyczne, przeszczepione komórki mogą solidnie wszczepiać się w gospodarza bez konieczności przystosowywania się do nowego mikrośrodowiska, co umożliwia dokładne oszacowanie częstości LSC 15,17,22.

Jako alternatywę dla wykorzystywania zwierząt syngenicznych, protokół ten może być stosowany przy użyciu dzikiego szczepu danio pręgowanego, który został poddany chemicznej lub radiacyjnej ablacji immunologicznej. W przypadku stosowania zwierząt poddanych ablacji immunologicznej należy zachować ostrożność w celu optymalizacji testu rozcieńczenia granicznego, ponieważ do pomyślnego wszczepienia w przeszczepie allogenicznym może być potrzebnych więcej komórek. Ponadto, ze względu na regenerację układu odpornościowego po 21 dniach, prawdopodobnie będzie potrzebny krótszy czas obserwacji17. Protokół ten może być również rozszerzony na ksenotransplantację komórek ludzkich. Danio pręgowany okazał się wydajnym i opłacalnym modelem ksenotransplantacji nowotworów, uzupełniającym ich mysie odpowiedniki16. Dorosłe rybki prkdc−/−, il2rga−/− z niedoborem odporności wykorzystano do skutecznego wszczepienia komórek ludzkich w temperaturze 37 °C przez okres do 60 dni23. Dzięki temu modelowi, zamiast rozmnażać się i dzielić barwione komórki in vivo, jak opisano tutaj, komórki ludzkie można wybarwić i pozwolić na podział in vitro, a następnie posortować i przeszczepić do prkdc−/−, il2rga−/− pręgowanego do badań in vivo. Podczas stosowania danio pręgowanego jako modelu ksenoprzeszczepu należy wziąć pod uwagę kilka ograniczeń. Na przykład danio pręgowany musi być przystosowany do przetrwania w temperaturze 37 °C. Ponadto przeszczepy ortotopowe mogą nie być możliwe w przypadku niektórych nowotworów ze względu na brak niektórych narządów u danio pręgowanego, takich jak płuca i piersi16.

Podsumowując, zastosowanie barwników proliferacji komórek w modelu T-ALL danio pręgowanego stanowi obiecującą drogę do badania spoczynkowych LSC i ich roli w rozwoju choroby i oporności na leczenie. Wykorzystując zalety danio pręgowanego CG1, w tym ich opłacalność i jednorodność genetyczną, protokół ten oferuje solidną platformę do zrozumienia biologii LSC w T-ALL. Wykorzystanie modelu danio pręgowanego może stanowić uzupełnienie modeli mysich i PDX, umożliwiając opracowanie zoptymalizowanych i ukierunkowanych terapii, które ostatecznie poprawią rokowanie pacjentów z T-ALL.

Oświadczenia

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

Finansowanie tych badań zostało zapewnione przez National Cancer Institute (R37CA227656 do JSB). Badania te były również wspierane przez Cytometrię Przepływową i Monitorowanie Immunologiczne Wspólne Zasoby University of Kentucky Markey Cancer Center (P30CA177558).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Mikrostrzykawka 26 G/2"Hamilton87930NA
35 & micro; m nasadka filtracyjna Rurki FACSFalcon352235NA
40 µ m Sitko komórkoweCELLTREAT229482
NA 96-dołkowa płytka PCR z listwąThermo Fisher ScientificAB0800NA
Sorter komórekSony BiotechnologySY3200NA
CellTrace Far RedThermo Fisher ScientificC34564NA
Rurki stożkoweVWR10026-078NA
DAPIThermo Fisher Scientific62248NA
DMSOSigma-AldrichD4818NA
Dulbecco's Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)Caisson Labs22110001NA
Mikroskop stereoskopowy epifluorescencjiNikonSMZ25NA
Surowica bydlęca płodu (FBS)Sigma-Aldrich12306CNA
Woda z systemu rybnegoNie dotyczyNiedotyczyZasolenie 0,03-0,05%, pH 6,5-8, buforowane wodorowęglanem sodu
Probówki do mikrowirówekThermo Fisher ScientificC2171NA
MS-222PentaireTRS-1mesylan trikainy, środek znieczulający
Petriego Corning07-202-011NA
ŻyletkiAmerican Line66-0089NA
Trypan BlueThermo Fisher NaukowyT10282NA
szalki

Bibliografia

  1. Reya, T., Morrison, S. J., Clarke, M. F., Weissman, I. L. Stem cells, cancer, and cancer stem cells. Nature. 414 (6859), 105-111 (2001).
  2. Arai, F., et al. Tie2/angiopoietin-1 signaling regulates hematopoietic stem cell quiescence in the bone marrow niche. Cell. 118 (2), 149-161 (2004).
  3. Li, L., Bhatia, R. Stem cell quiescence. Clin. Cancer Res. 17 (15), 4936-4941 (2011).
  4. Kreso, A., Dick, J. E. Evolution of the cancer stem cell model. Cell Stem Cell. 14 (3), 275-291 (2014).
  5. Chen, W., Dong, J., Haiech, J., Kilhoffer, M. -C., Zeniou, M. Cancer stem cell quiescence and plasticity as major challenges in cancer therapy. Stem Cells Int. 2016, 1740936(2016).
  6. Kleffel, S., Schatton, T. Tumor dormancy and cancer stem cells: Two sides of the same coin. Adv Exp Med Biol. 734, 145-179 (2013).
  7. Tuy, K., Rickenbacker, L., Hjelmeland, A. B. Reactive oxygen species produced by altered tumor metabolism impacts cancer stem cell maintenance. Redox Biol. 44, 101953(2021).
  8. Zhou, B. -B. S., et al. Tumour-initiating cells: Challenges and opportunities for anticancer drug discovery. Nat Rev Drug Discov. 8 (10), 806-823 (2009).
  9. Lyons, A. B., Blake, S. J., Doherty, K. V. Flow cytometric analysis of cell division by dilution of cfse and related dyes. Curr Protoc Cytom. 64 (1), 11-12 (2013).
  10. Lyons, A. B. Analysing cell division in vivo and in vitro using flow cytometric measurement of cfse dye dilution. J Immunol Methods. 243 (1-2), 147-154 (2000).
  11. Azari, H., Deleyrolle, L. P., Reynolds, B. A. Using carboxy fluorescein succinimidyl ester (cfse) to identify quiescent glioblastoma stem-like cells. Methods Mol Biol. 1686, 59-67 (2018).
  12. Deleyrolle, L. P., Rohaus, M. R., Fortin, J. M., Reynolds, B. A., Azari, H. Identification and isolation of slow-dividing cells in human glioblastoma using carboxy fluorescein succinimidyl ester (cfse). J Vis Exp. (62), e3918(2012).
  13. Ebinger, S., et al. Characterization of rare, dormant, and therapy-resistant cells in acute lymphoblastic leukemia. Cancer Cell. 30 (6), 849-862 (2016).
  14. Langenau, D. M., et al. Myc-induced t cell leukemia in transgenic zebrafish. Science. 299 (5608), 887-890 (2003).
  15. Blackburn, J. S., et al. Clonal evolution enhances leukemia-propagating cell frequency in t cell acute lymphoblastic leukemia through akt/mtorc1 pathway activation. Cancer Cell. 25 (3), 366-378 (2014).
  16. Al-Hamaly, M. A., Turner, L. T., Rivera-Martinez, A., Rodriguez, A., Blackburn, J. S. Zebrafish cancer avatars: A translational platform for analyzing tumor heterogeneity and predicting patient outcomes. Int J Mol Sci. 24 (3), 2288(2023).
  17. Blackburn, J. S., Liu, S., Langenau, D. M. Quantifying the frequency of tumor-propagating cells using limiting dilution cell transplantation in syngeneic zebrafish. J Vis Exp. (53), e2790(2011).
  18. Borga, C., et al. Simultaneous b and t cell acute lymphoblastic leukemias in zebrafish driven by transgenic myc: Implications for oncogenesis and lymphopoiesis. Leukemia. 33 (2), 333-347 (2019).
  19. Hu, Y., Smyth, G. K. Elda: Extreme limiting dilution analysis for comparing depleted and enriched populations in stem cell and other assays. J Immunol Methods. 347 (1-2), 70-78 (2009).
  20. Bhojwani, D., Pui, C. -H. Relapsed childhood acute lymphoblastic leukaemia. Lancet Oncol. 14 (6), e205-e217 (2013).
  21. Zon, L. I., Peterson, R. T. In vivo drug discovery in the zebrafish. Nat Rev Drug Discov. 4 (1), 35-44 (2005).
  22. Al-Hamaly, M. A., et al. Zebrafish drug screening identifies erlotinib as an inhibitor of wnt/β-catenin signaling and self-renewal in t-cell acute lymphoblastic leukemia. Biomed Pharmacother. 170, 116013(2024).
  23. Yan, C., et al. Visualizing engrafted human cancer and therapy responses in immunodeficient zebrafish. Cell. 177 (7), 1903-1914 (2019).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

T ALL u danio pr gowanegokom rki macierzyste bia aczkisortowanie kom rekcytometria przep ywowaretencja barwnikatransplantacja in vivoanaliza ograniczonych rozcie czekom rki macierzyste nowotworu

Powiązane artykuły