Artykuł metodologiczny

Zmodyfikowany model preparatu do reperfuzji niedrożności tętnicy środkowej mózgu

2.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/67060

⸱

31 maja 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1School of Medicine, Foshan University, 2School of Medicine, Shaanxi University of International Trade and Commerce

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół opisuje proces przygotowania do reperfuzji niedrożności tętnicy środkowej mózgu przez tętnicę szyjną wspólną.

Streszczenie

Model reperfuzji okluzji tętnicy środkowej mózgu (MCAO/R) jest kluczowy dla zrozumienia patologicznych mechanizmów udaru mózgu i dla rozwoju leków. Jednak wśród powszechnie stosowanych metod modelowania, metoda Koizumi często spotyka się z analizą ze względu na podwiązanie tętnicy szyjnej wspólnej (CCA) i niemożność uzyskania odpowiedniej reperfuzji. Podobnie metoda Longa była krytykowana za odłączenie i podwiązanie tętnicy szyjnej zewnętrznej (ECA). Badanie to ma na celu wprowadzenie zmodyfikowanej metody przygotowania modelu, która zachowuje integralność ECA, polega na wprowadzeniu monofilamentowego szwu nylonowego przez CCA, naprawie podwiązanego nacięcia CCA i utrzymaniu reperfuzji z CCA. Reperfuzję przepływu krwi potwierdzono za pomocą laserowego obrazowania przepływu plamkowego. Metody oceny, takie jak skala Longa, zmodyfikowana ocena nasilenia neurologicznego, barwienie chlorkiem trifenylotetrazolu (TTC) i znakowanie immunofluorescencyjne neuronów wykazały, że podejście to może wywołać stabilne uszkodzenie nerwów niedokrwiennych. Ten zmodyfikowany protokół modelowy MCAO/R jest prosty i stabilny, dostarczając cennych wskazówek dla praktyków w dziedzinie niedokrwienia mózgu.

Wprowadzenie

Według Światowej Organizacji Zdrowia, udar mózgu pozostał drugą najczęstszą przyczyną zgonów na świecie przez ostatnią dekadę, z wysokim wskaźnikiem zachorowalności, wysoką śmiertelnością i wysokim wskaźnikiem niepełnosprawności1,2. Oczekuje się, że wraz ze starzeniem się światowej populacji częstość występowania udaru mózgu w krajach rozwijających się wzrośnie, stając się potencjalnie główną przyczyną przedwczesnych zgonów i niepełnosprawności u dorosłych. Ponadto istnieje tendencja do występowania udarów w młodszym wieku3. Utrata siły roboczej po udarze stanowi również duże obciążenie dla rodzin i społeczeństwa4. Dlatego opracowanie bezpiecznych i skutecznych metod leczenia stanowi poważne wyzwanie w badaniach nad udarem.

Modele zwierzęce służą jako kluczowe narzędzia do badania zapobiegania i leczenia chorób ludzkich. Skuteczna translacja strategii leczenia udaru zależy od odtwarzalności i wiarygodności modeli zwierzęcych po udarze5,6. Tętnica środkowa mózgu (MCA) jest częstym miejscem klinicznego udaru mózgu, co sprawia, że model MCAO jest najbardziej zbliżony do udaru niedokrwiennego u ludzi. Model MCAO, przygotowany metodą szwów, został doceniony przez badaczy ze względu na takie zalety, jak brak kraniotomii i łatwa kontrola czasu niedokrwiennego. Został wykorzystany w ponad 40% eksperymentów neuroprotekcyjnych7. Jednak pomimo licznych zalet, szczegóły operacyjne tego modelu pozostają kontrowersyjnym tematem dla wielu badaczy.

Dla modelu MCAO (ang. cuclesion of midcebral artery ocluzji) wywołanego szwem, reperfuzja następuje poprzez wycofanie szwu. Obecnie do zakładania szwów stosuje się dwie główne metody: metodę Koizumiego8 oraz metodę Longa9. W metodzie Koizumiego szew wchodzi do tętnicy szyjnej wewnętrznej (ICA) głównie przez nacięcie tętnicy szyjnej wspólnej (CCA), podczas gdy w metodzie Longa przechodzi przez przeciętą tętnicę szyjną zewnętrzną (ECA) do ICA. Podczas reperfuzji metoda Koizumi wymaga trwałego podwiązania nacięcia CCA i opiera się na okręgu Willisa do reperfuzji10. Jednak niektóre badania sugerują, że skuteczna reperfuzja nie może być osiągnięta wyłącznie poprzez kompensacyjną podaż koła Willisa po utracie podaży CCA. Co więcej, krąg Willisa wykazuje wysoką zmienność anatomiczną, szczególnie u myszy C57Bl/6, zwiększając zmienność zawału i zmniejszając wiarygodność danych eksperymentalnych. W związku z tym metoda ta jest coraz częściej kwestionowana przez badaczy11.

Metoda Longa polega na wprowadzeniu szwu przez przerwane ECA, a następnie trwałym podwiązaniu wewnętrznej tętnicy szyjnej (ICA) po wycofaniu szwu. Pozwala to zachować drożność CCA, umożliwiając perfuzję krwi do 100% wartości wyjściowych. Jednak ta metoda wymaga oddzielenia zewnętrznej tętnicy szyjnej i małych odgałęzień tętnic, odcięcia ich lub elektrokoagulacji, co sprawia, że procedura jest trudna. Zaburza również pełną strukturę przepływu krwi w mózgu, która różni się od stanu klinicznego pacjenta12. Co ważne, badania wskazują, że przecięcie lub podwiązanie ECA może powodować zmiany niedokrwienne w mięśniach kontrolujących żucie i połykanie, wpływając na dietę zwierząt i prowadząc do pooperacyjnej śmierci zwierząt oraz poważnych uszkodzeń czuciowych i motorycznych u szczurów13,14.

Dlatego pilnie potrzebna jest zmodyfikowana metoda przygotowania modelu, aby rozwiązać te problemy. W badaniu tym przedstawiono zmodyfikowaną metodę modelowania MCAO, która naprawia nacięcie przyczepu CCA i osiąga skuteczną reperfuzję. Procedura jest prosta, praktyczna i wykonalna, wywołując znaczne uszkodzenia neurologiczne i powtarzalne zmiany zawałowe oraz dostarczając cennych wskazówek dla badaczy udaru.

Protokół

Protokół eksperymentalny został przeprowadzony zgodnie z wytycznymi Komitetu ds. Wykorzystania Zwierząt Laboratoryjnych oraz Instytucjonalnej Opieki i Użytkowania Zwierząt na Uniwersytecie Tradycyjnej Medycyny Chińskiej w Chengdu (numer rekordu: 2019-DL-002). Wszystkie dane z badań na zwierzętach zostały udokumentowane zgodnie z wytycznymi ARRIVE (Animal Research: Reporting In Vivo Experiments). Do tego badania wykorzystano samce szczurów Sprague Dawley (SD) o wadze 250 g ± 20 g i w wieku 6-8 tygodni. Specyfika dotycząca stosowanych zwierząt, odczynników i sprzętu jest wymieniona w Tabeli Materiałów.

1. Przygotowanie zwierząt

  1. Wywołać i utrzymać głębokie znieczulenie u szczurów za pomocą Zoletil 50 (50 mg/kg, domięśniowo) i chlorowodorku ksylazyny (40 mg/kg, IP). Upewnij się, że temperatura ciała jest utrzymywana na poziomie 37 ± 0,5 °C za pomocą sondy doodbytniczej podłączonej do poduszki grzewczej przez cały czas trwania zabiegu chirurgicznego. Nałóż maść weterynaryjną na oczy szczura, aby zapobiec ich wysuszeniu.
  2. Ogol włosy z głowy i szyi szczurów. Użyj kremu do depilacji, aby usunąć sierść z głowy i szyi, a następnie zmyj krem zwykłą solą fizjologiczną. Zdezynfekuj skórę w miejscu operacji, trzykrotnie nakładając etanol i powidon-jod za pomocą sterylnych wacików.
  3. Wykonaj 2 cm nacięcie na środku głowy szczura wzdłuż kierunku szwu strzałkowego za pomocą skalpela i ostrożnie usuń mięśnie pokrywające czaszkę.
  4. Rozcieńczyć czaszkę po niedokrwiennej stronie szczura za pomocą wiertła do czaszki. Użyj zwykłej soli fizjologicznej, aby schłodzić i usunąć zanieczyszczenia podczas procesu mielenia. Rejestruj wyjściowy przepływ krwi szczurów za pomocą laserowego obrazowania z kontrastem plamkowym (LSCI).
  5. Nałóż etanol i powidon-jod trzykrotnie na skórę szyi za pomocą sterylnych wacików. Wykonaj 2 cm nacięcie wzdłuż linii środkowej szyi za pomocą ostrza chirurgicznego. Użyj retraktorów, aby bocznie odciągnąć skórę i gruczoły ślinowe, odsłaniając mięśnie mostkowo-obojczykowo-sutkowe i szyjne.
  6. Oddziel mięśnie mostkowo-obojczykowo-sutkowe i szyjne, aby odsłonić obszar szyjny. Zidentyfikuj anatomię naczyniową tętnicy szyjnej wspólnej (CCA), tętnicy szyjnej wewnętrznej (ICA) i tętnicy szyjnej zewnętrznej (ECA). Na podstawie anatomii naczyniowej oddziel CCA, a także ECA i ICA15.
    UWAGA: Budowa anatomiczna szczura wskazuje, że obszar CCA jest pokryty głównie mięśniami mostkowo-obojczykowo-sutkowymi i szyjnymi, przy czym ICA i ECA pochodzą z CCA. Po oddzieleniu odsłaniającym CCA, wzdłuż CCA można zobaczyć widelec w kształcie litery Y, reprezentujący ICA i ECA. Uważaj, aby nie uszkodzić nerwu błędnego, który biegnie równolegle do CCA.

2. Okluzja MCA

  1. Zawiąż łatwy do rozplątania węzeł nad tętnicą szyjną zewnętrzną (ECA) i tętnicą szyjną wspólną (CCA) za pomocą nici jedwabnej 3-0, aby tymczasowo zablokować przepływ krwi. Umieść klips do naczynia na CCA w odległości około 0.5 cm od pierwszego węzła.
    1. Ufarbuj igłę strzykawki o pojemności 5 ml na czarno. Wykonaj małe nakłucie w CCA za pomocą barwionej na czarno igły i zaznacz otwory na czarno.
  2. Włóż nylonowy szew monofilamentowy do CCA przez znak. Otwórz zacisk naczyniowy i poprowadź nylonowy drut do tętnicy szyjnej wewnętrznej (ICA), aż zatrzyma się z lekkim oporem. Mocno zaciśnij drugi węzeł, aby utrzymać szew nylonowy z monofilamentu na miejscu wewnątrz tętnicy, zapobiegając przemieszczeniu się z pozycji blokującej.
  3. Zanotuj czas niedokrwienia w tym momencie i zmierz wartość przepływu krwi po stronie niedokrwiennej za pomocą LSCI. Podawać krople bupiwakainy na ranę szyi w celu złagodzenia bólu i zamknięcia rany. Zdejmij maskę anestezjologiczną i pozwól szczurowi dojść do siebie.
    UWAGA: Jeśli szew nylonowy z monofilamentu napotka trudności z wejściem do ICA, należy go lekko schować i spróbować ponownie włożyć.

3. Reperfuzja MCAO

  1. Po 90 minutach niedokrwienia należy ponownie znieczulić szczury izofluranem. Zmierz przepływ krwi w mózgu od strony niedokrwiennej za pomocą LSCI i upewnij się, że szew nylonowy z monofilamentu nie uległ przesunięciu.
  2. Rozwiąż węzły na tętnicy szyjnej zewnętrznej (ECA), aby umożliwić reperfuzję krwi. Zwolnij węzeł na tętnicy szyjnej wspólnej (CCA), zabezpiecz szew monofilamentowy i zdejmij szew. Założyć klips naczyniowy przed zamocowanym szwem monofilamentowym, aby zapobiec krwawieniu.
  3. Zastąp pierwszy węzeł CCA klipsem naczyniowym. Użyj pęsety, aby obrócić nacięcie naczynia na boki (Rysunek 1). Zacisnąć nacięcie pęsetą i podwiązać je za pomocą nici 6-0, aby naprawić nacięcie. Zdejmij klips naczyniowy, sprawdź, czy nie ma wycieków i potwierdź całkowitą reperfuzję (Wideo 1).
    UWAGA: Wykonaj podwiązanie, aby naprawić nacięcie, aby uniknąć nadmiernego zaciskania naczyń, co może prowadzić do zwężenia CCA.
  4. Rejestruj wartości przepływu krwi w korze mózgowej za pomocą LSCI po podwiązaniu nacięcia, aby potwierdzić udaną reperfuzję. Zamknij nacięcie szyi szwami i podaj 1 000 000 jednostek penicyliny i 2 ml soli fizjologicznej, aby zapobiec infekcji i odwodnieniu.
  5. Utrzymuj ciepło, aż szczury odzyskają przytomność. Oferuj miękkie jedzenie po operacji i monitoruj parametry życiowe zwierząt.

4. Ocena funkcji nerwów i uszkodzenia niedokrwiennego mózgu

  1. Gdy szczury w pełni się przebudzą, ich funkcje neuronalne zostaną ocenione przez badaczy nieświadomych grupowania zwierząt. Wykorzystaj skalę punktacji Longa (Tabela 1) i zmodyfikowaną skalę oceny ciężkości neurologicznej (mNSS) (Tabela 2), aby ocenić funkcje neurologiczne wszystkich szczurów.
  2. Po 24 godzinach od operacji należy poddać szczury eutanazji w znieczuleniu indukowanym izofluranem (4% izofluranu przy 4 l/min tlenu) poprzez zwichnięcie szyjki macicy16 (zgodnie z instytucjonalnie zatwierdzonymi protokołami). Opłucz mózg lodowatą wodą, aby usunąć pozostałą krew.
  3. Podziel tkankę mózgową na 5 sekcji i wybarwij je TTC. Zrób obrazy obu stron wycinków tkanki mózgowej, zmierz obszar niedokrwienia przedniej i tylnej strony za pomocą oprogramowania Image J i oblicz częstość zawałów za pomocą następującego wzoru:
    figure-protocol-1
    UWAGA: S1 i S2 reprezentują odpowiednio obszar zawału bliższej części przodomózgowia i bliższej strony pnia mózgu wycinków mózgu. Obszar zawału każdego wycinka mózgu jest korygowany za pomocą wzoru Swansona, gdzie h oznacza grubość wycinka mózgu. Ten wzór, wcześniej opisany przez autora we wcześniejszych badaniach17, pozwala na dokładniejsze obliczenie wielkości zmiany w zawale.
  4. Analizuj dane za pomocą oprogramowania statystycznego i graficznego, aby ocenić wskaźnik sukcesu i stabilność modelu.
  5. Zastosuj metodę immunofluorescencji do znakowania neuronów korowych u szczurów, co dodatkowo potwierdza uszkodzenia neuronów spowodowane tą metodą. Po 24 godzinach niedokrwienno-reperfuzji u szczurów przeprowadzono perfuzję serca przy użyciu wstępnie schłodzonego PBS w celu uzyskania tkanki mózgowej.
  6. Osadź i zamroź tkankę mózgową w sekcjach. Użyj przeciwciał neuronalnych, takich jak niedojrzały marker neuronalny Doublecortin (DCX)18, marker jądra neuronalnego Neuronal Nuclei (NeuN)18 i marker dendrytyczny neuronów Microtubule-associated protein-2 (MAP-2)19. Obserwuj ekspresję neuronów niedokrwiennych za pomocą laserowej mikroskopii konfokalnej.

Wyniki

Laserowe obrazowanie przepływu plamek wykazało, że przed zamknięciem monofilamentowego nylonowego szwu, w obszarze tętnicy środkowej mózgu (MCA) występował obfity przepływ krwi i zarejestrowano podstawowe wartości przepływu krwi u szczurów. Po niedrożności MCA wartość przepływu krwi po niedokrwiennej stronie mózgu gwałtownie spadła. Przed wycofaniem szwu ponownie sprawdzono wartości przepływu krwi po stronie niedokrwiennej, aby potwierdzić, czy szew zasłania MCA. Wyniki wskazały tylko na niewielką zmianę w przepływie krwi. Po wycofaniu szwu perfuzja przepływu krwi szybko się przywróciła (Ryc. 2). Film 1 pokazuje również silny impuls wypełniający tętnicę szyjną wspólną, co sugeruje, że ta metoda może osiągnąć wystarczającą perfuzję przepływu krwi po niedokrwieniu mózgu.

Wyniki wyników funkcji neurologicznych (Rysunek 3) ujawniły, że w porównaniu z grupą pozorowanej operacji, wynik Longa w grupie modelowej wynosił 1,80 ± 0,27 (p < 0,05), a wynik mNSS wynosił 7,4 ± 0,89 (p < 0,05). Wyniki te wskazują, że model niedrożności/reperfuzji tętnicy środkowej mózgu (MCAO/R) przygotowany tą metodą doprowadził do znacznych uszkodzeń neurologicznych. Film 2 pokazuje charakterystyczne zachowanie szczurów z grupy modelowej obracających się podczas czołgania się, co jest cechą charakterystyczną urazu wywołanego udarem, co dodatkowo potwierdza słuszność tej metody.

Barwienie TTC wykazało, że częstość występowania zawału u szczurów z grupy modelowej wynosiła 5,58 ± 1,79 (p < 0,05), przy czym obszar zawału dotyczył głównie prążkowia i kory, a rozmiar zawału pozostał stosunkowo stabilny. Barwienie immunofluorescencyjne zilustrowało utratę neuronów korowych po niedokrwieniu-reperfuzji (Ryc. 4). Odkrycia te wskazują łącznie, że metoda ta może ustanowić stabilny model MCAO/R odpowiedni do oceny skuteczności przedklinicznej leku.

figure-results-1
Rysunek 1: Schemat ideowy podwiązania złącza CCA. Żółte kółko oznacza punkt wkłucia i miejsce podwiązania czopa drutu, podczas gdy pozycja podwiązania (żółta strzałka) wskazuje, gdzie tętnica szyjna wspólna (CCA) została podwiązana drutem. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Laserowe obrazy przepływu krwi w czasie szczurów po stronie niedokrwiennej przed, po okluzji oraz przed i po reperfuzji. (A) Obrazy przepływu krwi w mózgu szczurów, gdzie niebieskie obszary wskazują na niskie wartości przepływu krwi, a czerwone obszary wskazują na wysokie wartości przepływu krwi. Podziałka skali: 200 mm. (B) Zmiany w niedokrwieniu-reperfuzji mózgu u szczurów, przedstawione jako średnia ± odchylenie standardowe, przy wielkości próbki n = 5. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3: Wyniki obszaru zawału i wyników funkcji neurologicznych w grupie pozorowanej i grupie modelowej. (A) Barwienie TTC przedstawiało obszary tkanki mózgowej po zawale zarówno w grupie pozorowanej, jak i w grupie modelowej, z białymi obszarami wskazującymi na tkankę po zawale, a czerwone obszary wskazującymi na normalną tkankę. (B) Przedstawiono wyniki ilościowe skali Longa i mNSS, a także częstość występowania zawałów. Istotność statystyczna w porównaniu z grupą pozorowaną jest oznaczona przez *p < 0,05, przy wielkości próby n = 5. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rysunek 4: Wyniki uszkodzenia neuronów korowych w grupie pozorowanej i grupie modelowej. Ekspresja NeuN (A), DCX (B) i MAP-2 (C) w neuronach korowych. Podziałka skali: 100 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-5
Rysunek 5: Diagram okluzji i reperfuzji MCA przez Koizumi, Longa i zmodyfikowaną metodę. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

)
Testy motoryczne/silne>Punktów
Podnoszenie szczura za ogon3
1 Zgięcie kończyny przedniej
1 Zgięcie kończyny tylnej
1 Głowica przesunięta > 10° do osi pionowej w ciągu 30 sekund
Układanie szczura na podłodze3
0 Normalny chód
1 Niezdolność do chodzenia prosto
2 Krążąc w stronę niedowładnej
3 Upadek na stronę niedowładną
Testy sensorycznecyfra arabska
1 Test umieszczania (test wzrokowy i dotykowy)
2 Test proprioceptywny (głębokie czucie, dociskanie łapy do krawędzi stołu, aby
stymulują mięśnie kończyn)
Badania wyważenia belki6
0 Balansuje przy stabilnej postawie
1 Chwyta stronę belki
2 Przytula się do belki, a jedna kończyna spada z belki
3 Przytula się do belki i dwie kończyny spadają z belki, lub obraca się na belce (>60 s)
4 Próbuje balansować na belce, ale spada (>40 s)
5 Próbuje balansować na belce, ale spada (>20 s)
6 Odpada: Brak próby utrzymania równowagi lub trzymania się belki (<20 s)
Odruchy, brak i nieprawidłowe ruchy4
1 Odruch małżowiny usznej (potrząsanie głową podczas dotykania przewodu słuchowego)
1 Odruch rogówkowy (mruganie oczami przy lekkim dotknięciu rogówki bawełną)
1 Odruch zaskoczenia (reakcja motoryczna na krótki dźwięk spowodowany pstryknięciem papieru ze schowka
1 Napady padaczkowe, mioklonie, miodystony
Maksymalna liczba punktówRozdział 18

Tabela 1: Zmodyfikowana ocena nasilenia neurologicznego.

Wyniki Zea-Longa
wynikObjaw
0 punktówBrak deficytów neurologicznych
1 punktŁagodny: niezdolny do całkowitego wysunięcia prawej przedniej łapy, gdy ogon jest podniesiony
2 punktyUmiarkowany: zatacza kręgi w prawo/w lewo podczas chodzenia
3 punktyCiężki: przewraca się w prawo/w lewo podczas chodzenia
4 punktyNiezdolność do samoistnego chodzenia z utratą przytomności

Tabela 2: Wyniki Zea-Longa.

Wideo 1: Kluczowe kroki do naprawy ligatury nacięcia CCA podczas reperfuzji u szczurów. Kliknij tutaj, aby pobrać ten film.

Wideo 2: Filmy behawioralne szczurów poddawanych MCAO/R. Kliknij tutaj, aby pobrać ten film.

Dyskusja

Model niedrożności tętnicy środkowej mózgu (MCAO) indukowany szwem nylonowym z monofilamentu jest najpowszechniejszą metodą stosowaną do przygotowania modeli MCAO. Podejście to jest szeroko stosowane w badaniach przedklinicznych i zyskało uznanie wielu praktyków ze względu na swoją prostotę, brak potrzeby kraniotomii, minimalny uraz chirurgiczny i zdolność do uzyskania reperfuzji.

Istnieją dwie klasyczne techniki chirurgiczne dla włókna śródświetlnego MCAO: metoda Koizumi8 i metoda Longa9. Główna różnica między tymi metodami polega na tym, w jaki sposób szew jest wprowadzany w celu zamknięcia MCA. W metodzie Koizumi szew wprowadzany jest przez nacięcie tętnicy szyjnej wspólnej (CCA) do tętnicy szyjnej wewnętrznej (ICA). Przedni koniec szwu jest pokryty silikonem, aby zablokować punkt początkowy MCA. I odwrotnie, w metodzie Longa, szew jest wprowadzany do ICA przez przeciętą tętnicę szyjną zewnętrzną (ECA). Przedni koniec szwu jest rozszerzony do kulistego kształtu, aby zablokować punkt początkowy MCA (ryc. 5). Podczas reperfuzji szew jest delikatnie wycofywany, aby przywrócić przepływ krwi.

Metoda Longa polega na wprowadzeniu szwu do tętnicy szyjnej wewnętrznej (ICA) przez przeciętą tętnicę szyjną zewnętrzną (ECA). Proces ten wymaga oddzielenia i odłączenia ECA, a także oddzielenia i usunięcia małych gałęzi, które są następnie odcinane za pomocą wstrzykiwacza do elektrokoagulacji, aby zapobiec krwawieniu. W związku z tym metoda ta wymaga starannego i precyzyjnego działania. Co więcej, krótki pozostały/a koniec odciętego ECA może ułatwić zsuwanie się szwu podczas wprowadzania, co jeszcze bardziej zwiększa złożoność procedury. Wyzwanie to jest szczególnie widoczne podczas przygotowywania mysiego modelu niedokrwienia mózgu, ponieważ często wymaga użycia mikroskopu w celu zapewnienia dokładności, co zwiększa ogólną złożoność operacji.

Główny problem związany z metodą Koizumi polega na podwiązaniu tętnicy szyjnej wspólnej (CCA), co powoduje kompensacyjną reperfuzję tkanki mózgowej po stronie niedokrwiennej wyłącznie przez koło Willisa. CCA jest kluczową gałęzią łuku aorty od serca i służy jako główna tętnica zapewniająca perfuzję przepływu krwi w mózgu. W związku z tym model niedokrwienno-reperfuzyjny mózgu stworzony metodą Koizumi często doświadcza stanu hipoperfuzji. Ta hipoperfuzja nie jest ograniczona do obszaru tętnicy środkowej mózgu, ale rozciąga się na całą półkulę niedokrwienną po tej samej stronie. Nawet po 35 dniach modelowania wartość przepływu krwi nie wraca do wartości wyjściowej, co sugeruje, że metoda Koizumi powinna być traktowana jako model niedokrwienny z przewlekłą hipoperfuzją, a nie model niedokrwienno-reperfuzyjny10.

Natomiast metoda Longa może osiągnąć wartość przepływu krwi na poziomie 100% u zwierząt z MCAO/R. Należy jednak zauważyć, że osiągnięcie całkowitej rekanalizacji nie musi oznaczać, że należy zrezygnować z metody Koizumi. Rozważając translację kliniczną, metoda Koizumi może być bardziej odpowiednia dla pacjentów ze spontaniczną powolną rekanalizacją po niedrożności tętnicy. Zjawisko to jest jednak stosunkowo rzadkie w praktyce klinicznej. Tylko niewielki odsetek pacjentów z udarem niedokrwiennym mózgu spełnia kryteria trombolizy i otrzymuje skuteczne leczenie w okresie leczenia20,21. Ponadto niektórzy pacjenci nie osiągają całkowitej rewaskularyzacji nawet po leczeniu trombolitycznym22. W związku z tym metoda Koizumi może być wykorzystana do symulacji stanu takich pacjentów.

Z drugiej strony, metoda Longa pozwala na szybką reanalizę naczyń po okluzji, dzięki czemu jest bardziej odpowiednia do symulacji pacjentów, którzy otrzymują skuteczną terapię trombolityczną lub trombektomię w praktyce klinicznej. W celu symulacji pacjentów, którzy nie przeszli terapii trombolitycznej, model trwałego niedokrwienia mózgu przygotowany metodą Koizumi może zaoferować pełniejszą okluzję i prostszy zabieg chirurgiczny.

Metoda Longa do indukowania okluzji/reperfuzji tętnicy środkowej mózgu (MCAO/R) może prowadzić do bardziej znaczącego uszkodzenia reperfuzyjnego poprzez zachowanie rekanalizacji naczyniowej pochodzącej z tętnicy szyjnej wspólnej (CCA)23,24. Należy jednak pamiętać, że tętnica szyjna zewnętrzna (ECA) musi zostać odcięta i trwale podwiązana podczas metody Longa, co zaburza całą strukturę przepływu krwi w mózgu i nie jest zgodne z pacjentami klinicznymi. Ponadto tętnice językowe, szczękowe i potyliczne są gałęziami ECA13. W związku z tym przecięcie lub trwałe podwiązanie ECA może powodować zaburzenia odżywiania i picia, co skutkuje utratą masy ciała25. Wcześniejsze badania wykazały, że zgony myszy po modelowaniu MCAO są głównie spowodowane nieodpowiednim spożyciem pokarmu lub wody, a nie uszkodzeniem niedokrwiennym mózgu14,26. Dodatkowo podwiązanie ECA może zmniejszyć przepływ krwi w siatkówce i wywołać uszkodzenie siatkówki w postaci śmierci komórki27.

Ponadto najważniejszym wskaźnikiem w badaniach nad udarem mózgu jest objętość zawału; Udowodniono jednak, że objętość zawałów wywołanych metodą szwów ma znaczne odchylenie standardowe, nawet przy zachowaniu ścisłych protokołów chirurgicznych i gromadzenia danych. We wcześniejszych doniesieniach objętość zawału była związana ze stopniem reperfuzji28, a reperfuzja modelu udaru przygotowanego metodą Koizumiego zależy od krążenia Willisa 29,30,31. Udowodniono jednak, że cykl Willisa ma wysoką zmienność anatomiczną, szczególnie u myszy C57Bl / 6, gdzie 90% zwierząt może nie mieć jednej lub dwóch tylnych tętnic komunikacyjnych32, co jest kluczowym wyznacznikiem wysokiej zmienności w urazie niedokrwiennym33. Dlatego zachowanie perfuzji CCA może zmniejszyć zmienność objętości zawału34. Podano, że średni współczynnik zmienności wielkości zawału w badaniach z udarem mózgu wynosił 29,5%31, co przyczyniło się do niskiej mocy statystycznej badań dotyczących udaru. Stanowi to również ogromne wyzwanie dla potencjalnych odkryć leków. Niewątpliwie zwiększa to koszty rozwoju i tłumaczenia klinicznego i może prowadzić do tego, że naukowcy tracą dostęp do potencjalnie skutecznych leków. Zwiększa również liczbę zwierząt, które mają być uwzględnione w analizie statystycznej eksperymentu, co jeszcze bardziej narusza zasadę etyki zwierząt 3R.

Dlatego w tym badaniu metody modelowania zostały zmodyfikowane, aby zapewnić integralność struktury przepływu krwi w tkance mózgowej i wystarczającą reperfuzję po niedokrwieniu mózgu. Główne modyfikacje obejmują dwa etapy: (1) wprowadzenie szwu do CCA za pomocą igły strzykawkowej o pojemności 5 ml zamiast wykonywania małego nacięcia; ten krok zmniejsza nacięcie CCA i bardziej sprzyja podwiązaniu nacięcia; (2) wycofanie szwu i użycie cieńszych nici jedwabnych do podwiązania otworu igły CCA, bez wpływu na perfuzję przepływu krwi w CCA. Oczywiście wymaga to również starannej operacji chirurgicznej, ale różni się od wprowadzenia szwu przez ECA; metoda ta zachowuje integralność struktury przepływu krwi w mózgu, umożliwiając jednocześnie pełne reperperowanie przepływu krwi przez CCA, upraszczając procedurę operacyjną i zmniejszając zmienność objętości zawału. Niektórzy badacze stosowali podobne metody badawcze do naprawy nacięć za pomocą kleju tkankowego, ale ma to potencjał do zakrzepicy, która przyniesie niekontrolowane skutki. A ustabilizowanie nacięcia trwa dłużej25.

Podsumowując, badanie to zapewnia zmodyfikowane podejście do przygotowania modelu niedokrwienia i reperfuzji mózgu, który pozwala na odpowiednią perfuzję krwi po odłączeniu włókien i może skutkować znacznie powtarzalnymi objętościami zawału i uszkodzeniami neurologicznymi. Wszystkie powyższe wyniki pokazują, że zmodyfikowana metoda jest wykonalna i odtwarzalna oraz może stanowić punkt odniesienia dla praktyków w przygotowaniu modeli ułatwiających skuteczne kliniczne tłumaczenie leków na niedokrwienie mózgu.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (82173781 i 82373835), projekt badawczy podoktorancki (BKS212055), Projekt Innowacji Naukowych i Technologicznych Biura Nauki i Technologii Foshan (2320001007331), Fundację Podstawowych i Stosowanych Badań Podstawowych Guangdong (2019A1515010806), Kluczowe Projekty Terenowe (Inteligentna Produkcja) Ogólnych Uniwersytetów w Prowincji Guangdong (2020ZDZX2057) oraz Projekty Naukowo-Badawcze (Charakterystyczna innowacja) uniwersytetów ogólnych w prowincji Guangdong (2019KTSCX195).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
System znieczulenia dla zwierzątRayward Life Technology Co., LtdR500IE
Utrzymywanie temperatury zwierzątRayward Life Technology Co., Ltd69020
Przeciwciało wtórne Cy3Wuhan Saiweier Biotechnology Co., LtdGB21303
przeciwciało DAP1Wuhan Saiweier Biotechnology Co., LtdPrzeciwciało
DCXWuhan Saiweier Biotechnology Co., LtdGB13434
Kozia surowicaBeyotime Biotechnology Co., LTDC0265
GraphPadPrism Oprogramowanie GraphPad GraphPadPrism 8.0
ImageJNarodowe Instytuty ZdrowiaOprogramowanie
IsofluranRayward Life Technology Co., LtdR510-22
Laserowa krew plamkowa system obrazowania przepływuRayward Life Technology Co., LtdPrzeciwciało PeriCam PSI NR
MAP-2Wuhan Saiweier Biotechnology Co., LtdGB11128
Miniaturowa ręczna wiertarka do czaszkiRayward Life Technology Co., Ltd87001
szew monofilamentowyRayward Life Technology Co., Ltd250-280g
Przeciwciało NeuNWuhan Saiweier Biotechnology Co., LtdGB11138
OCT środek do zatapianiaBIOSHARPBL557A
Penicylina sodowaChengdu Kelong Chemical Co., Ltd.17121709-2
Szybki roztwór do odzyskiwania antygenu do zamrożonych sekcjiBeyotime Biotechnology Co., LTDP0090
SD szczurySPF (Pekin) Biotechnology Co., Ltd.250-280g
Triton X-100Beyotime Biotechnology Co., LTDST795
TTCChengdu Kelong Chemical Co., Ltd.
G1012 ImageJ2019030101

Bibliografia

  1. Paul, S., Candelario-Jalil, E. Emerging neuroprotective strategies for the treatment of ischemic stroke: An overview of clinical and preclinical studies. Exp Neurol. 335, 113518(2021).
  2. Feigin, V. L., Owolabi, M. O. Pragmatic solutions to reduce the global burden of stroke: a World Stroke Organization-Lancet Neurology Commission. Lancet Neurol. 22 (12), 1160-1206 (2023).
  3. Putaala, J. Ischemic Stroke in Young Adults. Continuum (Minneapolis, Minn). 26 (2), 386-414 (2020).
  4. Girotra, T., Lekoubou, A., Bishu, K. G., Ovbiagele, B. A contemporary and comprehensive analysis of the costs of stroke in the United States. J Neurol Sci. 410, 116643(2020).
  5. Howells, D. W., et al. Different strokes for different folks: The rich diversity of animal models of focal cerebral ischemia. JCBFM. 30 (8), 1412-1431 (2010).
  6. Matur, A. V., et al. Translating animal models of ischemic stroke to the human condition. Transl Stroke Res. 14 (6), 842-853 (2023).
  7. O'Collins, V. E., et al. 1,026 experimental treatments in acute stroke. Ann Neurol. 59 (3), 467-477 (2006).
  8. Koizumi, J., Yoshida, Y., Nakazawa, T., Ooneda, G. Experimental studies of ischemic brain edema 1. A new experimental model of cerebral embolism in rats in which recirculation can be introduced in the ischemic area. Nosotchu. , 1-7 (1986).
  9. Longa, E. Z., Weinstein, P. R., Carlson, S., Cummins, R. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats. Stroke. 20 (1), 84-91 (1989).
  10. Faber, J. E., Moore, S. M., Lucitti, J. L., Aghajanian, A., Zhang, H. Sex differences in the cerebral collateral circulation. Transl Stroke Res. 8 (3), 273-283 (2017).
  11. Justić, H., et al. Redefining the Koizumi model of mouse cerebral ischemia: A comparative longitudinal study of cerebral and retinal ischemia in the Koizumi and Longa middle cerebral artery occlusion models. J Cereb Blood Flow Metab. 42 (11), 2080-2094 (2022).
  12. Li, Y., et al. Comparison of cerebral microcirculation perfusion in rat models of middle cerebral artery occlusion prepared through common carotid artery insertion and external carotid artery insertion. CJTER. 27 (11), 1683-1691 (2023).
  13. Dittmar, M., Spruss, T., Schuierer, G., Horn, M. External carotid artery territory ischemia impairs outcome in the endovascular filament model of middle cerebral artery occlusion in rats. Stroke. 34 (9), 2252-2257 (2003).
  14. Trueman, R. C., et al. A critical re-examination of the intraluminal filament MCAO model: impact of external carotid artery transection. Transl Stroke Res. 2 (4), 651-661 (2011).
  15. Ziegler, K. A., et al. Local sympathetic denervation attenuates myocardial inflammation and improves cardiac function after myocardial infarction in mice. Cardiovasc Res. 114 (2), 291-299 (2018).
  16. Pitoulis, F. G., et al. Remodelling of adult cardiac tissue subjected to physiological and pathological mechanical load in vitro. Cardiovasc Res. 118 (3), 814-827 (2022).
  17. Ma, R., et al. Animal models of cerebral ischemia: A review. Biomed Pharmacother. 131, 110686(2020).
  18. Belayev, L., et al. Docosanoids promote neurogenesis and angiogenesis, blood-brain barrier integrity, penumbra protection, and neurobehavioral recovery after experimental ischemic stroke. Mol Neurobiol. 55 (8), 7090-7106 (2018).
  19. Guo, H., et al. Carthamin yellow improves cerebral ischemia-reperfusion injury by attenuating inflammation and ferroptosis in rats. Int J Mol Med. 47 (4), 52(2021).
  20. Chia, N. H., et al. Determining the number of ischemic strokes potentially eligible for endovascular thrombectomy: a population-based study. Stroke. 47 (5), 1377-1380 (2016).
  21. Henninger, N., Fisher, M. Extending the time window for endovascular and pharmacological reperfusion. Transl Stroke Res. 7 (4), 284-293 (2016).
  22. Zhang, P. L., et al. Use of Intravenous thrombolytic therapy in acute ischemic stroke patients: evaluation of clinical outcomes. Cell Biochem Biophys. 72 (1), 11-17 (2015).
  23. Morris, G. P., et al. A comparative study of variables influencing ischemic injury in the Longa and Koizumi methods of intraluminal filament middle cerebral artery occlusion in mice. PLOS One. 11 (2), e0148503(2016).
  24. Smith, H. K., Russell, J. M., Granger, D. N., Gavins, F. N. Critical differences between two classical surgical approaches for middle cerebral artery occlusion-induced stroke in mice. J Neurosci Methods. 249, 99-105 (2015).
  25. Dittmar, M. S., et al. The role of ECA transection in the development of masticatory lesions in the MCAO filament model. Exp Neurol. 195 (2), 372-378 (2005).
  26. Lourbopoulos, A., et al. Inadequate food and water intake determine mortality following stroke in mice. J Cereb Blood Flow Metab. 37 (6), 2084-2097 (2017).
  27. Ogishima, H., et al. Ligation of the pterygopalatine and external carotid arteries induces ischemic damage in the murine retina. Invest Ophth Vis Sci. 52 (13), 9710-9720 (2011).
  28. Irvine, H. J., et al. Reperfusion after ischemic stroke is associated with reduced brain edema. J Cereb Blood Flow Metab. 38 (10), 1807-1817 (2018).
  29. Carmichael, S. T. Rodent models of focal stroke: Size, mechanism, and purpose. NeuroRx. 2 (3), 396-409 (2005).
  30. Dirnagl, U., Dirnagl, U. Bench to bedside: The quest for quality in experimental stroke research. J Cereb Blood Flow Metab. 26 (12), 1465-1478 (2006).
  31. Ingberg, E., Dock, H., Theodorsson, E., Theodorsson, A., Ström, J. O. Method parameters' impact on mortality and variability in mouse stroke experiments: A meta-analysis. Sci Rep. 6, 21086(2016).
  32. McColl, B. W., Carswell, H. V., McCulloch, J., Horsburgh, K. Extension of cerebral hypoperfusion and ischaemic pathology beyond MCA territory after intraluminal filament occlusion in C57Bl/6J mice. Brain Res. 997 (1), 15-23 (2004).
  33. Kitagawa, K., et al. Cerebral ischemia after bilateral carotid artery occlusion and intraluminal suture occlusion in mice: Evaluation of the patency of the posterior communicating artery. J Cereb Blood Flow Metab. 18 (5), 570-579 (1998).
  34. Trotman-Lucas, M., Kelly, M. E., Janus, J., Fern, R., Gibson, C. L. An alternative surgical approach reduces variability following filament induction of experimental stroke in mice. Dis Model Mech. 10 (7), 931-938 (2017).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Reperfuzja MCAOmodel niedokrwienia m zgunylonowa szszyta monofilamentowat tnica szyjna wsp lnat tnica szyjna zewn trznaobrazowanie laserowe speckleskala neurologicznego stopnia ci ko cibarwienie TTCznakowanie immunofluorescencyjne

Powiązane artykuły