Model obturacyjnego przewlekłego zapalenia trzustki ustanowiony poprzez elektrokoagulację

Przewlekłe zapalenie trzustki (MPD) to ciężkie, postępujące zaburzenie zapalne, prowadzące do zniszczenia trzustki i objawiające się bólem brzucha oraz zaburzeniami trawiennymi. Z czasem może powodować cukrzycę i zwiększać ryzyko raka trzustki. Ustanowienie zwierzęcego modelu CP i opracowanie skutecznych strategii terapeutycznych jest zatem kluczowe.

Komórki akcynarne z zewnątrzskrzyny trzustki produkują i wydzielają dużą liczbę enzymów trawiennych. Gdy zaburzenia organelli i regulacji homeostazy białek są zaburzone, może to prowadzić do nieprawidłowej aktywacji wewnątrzkomórkowego trypsinogenu, co ostatecznie prowadzi do uszkodzenia komórek acinowych i rozwoju zapalenia trzustki¹.

Wcześniejsze badania wykazały, że modele mysie, zwłaszcza te wywołane przez powtarzające się zastrzyki ceruleiny^{2 oraz} chirurgiczne podwiązanie przewódów^{trzustkowych 3,4}, odegrały kluczową rolę w badaniach CP. Ceruleina może wywołać ostre zapalenie trzustki, które może przejść w stan przewlekły, jednak brak specyficznej niedrożności przewódu trzustkowego ogranicza jej znaczenie kliniczne w symulacji obturacyjnego zapalenia trzustki. Chociaż podwiązanie chirurgiczne lepiej naśladuje obturacyjny charakter ludzkiej porażki mózgowej, jest wysoce inwazyjne, trudne do wykonania i często prowadzi do poważnych skutków ogólnoustrojowych, utrudniając badania miejscowych patologii przewodów.

Aby rozwiązać te ograniczenia, zaproponowano nowy model obturacyjnego CP poprzez elektrokoagulację. Podobnie jak zasada podwiązywania przewódu trzustkowego, blokuje przewód trzustkowy, ale jest łatwiejszy do wykonania i ma wyższy wskaźnik skuteczności. Naukowcy zaproponowali, że ablacja radiowa w głównym przewodzie trzustkowym świń jest bezpieczną i skuteczną metodą wywoływania zaniku trzustki⁵, co sugeruje również, że odcięcie głównego przewodu trzustkowego za pomocą elektrokoagulacji wysokiej częstotliwości może wywołać podobne efekty. Technika ta obejmuje przekłucie przewodów trzustkowych wstecznie wsteczne i wstrzyknięcie roztworu błękitu metylenowego do barwienia przewodów, a następnie elektrokoagulację w celu wywołania miejscowej niedrożności przewodów (Rysunek 1). Takie podejście wywołuje stan zapalny i włóknienie naśladujące ludzką obturacyjną porażkę mózgową, unikając jednocześnie rozległej reakcji zapalnej i powikłań ogólnoustrojowych. W porównaniu z konwencjonalnymi modelami, model elektrokoagulacji oferuje kilka zalet: celuje konkretnie w przewód trzustkowy, zmniejsza zmienność i łagodzi komplikacje układowe. Zapewnia bardziej specyficzne dla choroby, powtarzalne i wszechstronne podejście do zrozumienia mechanizmów leżących u podstaw niedrożności przewodów w CP oraz jego roli w postępie choroby.

Wszystkie opisane eksperymenty na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Wykorzystania i Opieki nad Zwierzętami Naval Medical University. Upewnij się, że wszystkie materiały chirurgiczne są sterylne.

1. Laparotomia

1. Podaj mieszankę ketaminy (80 mg/kg) i ksylazyny (10 mg/kg) za pomocą iniekcji dootrzewnowej w celu indukcji znieczulenia. Monitoruj głębokość znieczulenia, oceniając utratę odruchu pedałowego i rogówkowego. Podawaj dodatkowe dawki (20% początkowej dawki) w razie potrzeby, aby utrzymać odpowiednią znieczulenie podczas zabiegu. Potwierdź odpowiednią głębokość znieczulenia, szczypiąc palce. Połóż zwierzę na termoforze, aby utrzymać temperaturę ciała.
2. Użyj trymera do golenia włosów (~2 cm²) między klatką piersiową a dolną częścią brzucha. Dezynfekuj obszar operacyjny 3 razy, na przemian podawając chlorheksydynę/jod i alkohol.
3. Przymocuj myszy do płytki chirurgicznej taśmą chirurgiczną i zaklej sterylne zasłony.
4. Nożyczkami wykonaj nacięcie o długości 2 cm w środkowej części jamy brzusznej, a następnie nacięcie o długości 1 cm między górną częścią brzucha a wyrostkiem ksunofidalnym.

2. Lokalizowanie i odsłonięcie trzustki

1. Za pomocą ekspanzera brzusznego zlokalizuj obszar trzustki, gdzie będzie wykonywana elektrokoagulacja.
2. Za pomocą sterylnego wacika rozpoznaj dwunastnicę od tyłu lewej górnej części brzucha i obróć dwunastnicę, aby zobaczyć przezroczysty przewód żółciowy łączący wątrobę.

3. Śledzenie miejsca operacji

1. Użyj klipsa mikronaczyniowego, aby tymczasowo zatkać bliższy wspólny przewód żółciowy i zapobiec przeciekowi wlewu wstecznego do wątroby.
2. Połącz rurkę polietylenową o średnicy wewnętrznej 0,25 mm i zewnętrznej 0,35 mm do igły o średnicy zewnętrznej 0,25 mm. Użyj tego urządzenia, aby włożyć je wokół ampuły. Celuj w główną brodawkę dwunastnicy i włóż do niej rurkę. Włóż cewnik do przewodu żółciowego w połowie i zatrzymaj jego włożenie.
3. Uruchom pompę infuzyjną i mikropompuj 0,2% roztwór błękitu metylenowego (rozcieńczony w soli fizjologicznej 0,9%) w dawce 50 μL/10 g przez 2 minuty w tempie 50 μL/min. Przewód trzustkowy stopniowo stanie się niebieski.
4. Na koniec sesji wyciągnij rurkę polietylenową i wyjmij klips mikronaczyniowy.

4. Indukcja procedury elektrokoagulacji

1. Przy pomocy sterylnych patyczków watowych napraw trzustkę i skieruj nóż elektrokoagulacyjny na niebieską część do elektrokoagulacji. Miejsce elektrokoagulacji znajduje się w środkowej i dolnej części 2/3 między wspólnym przewodem żółciowym a tętnicą trzustkową dwunastnicową górną.
   1. Aby kontynuować to badanie, zastosuj następujące parametry pracy elektrokoagulacji: napięcie: 220 V; materiał elektrody: czysta miedź; Czas leczenia: Leczenie w pozycji trzustki, z unikaniem naczyń krwionośnych przez 2-3 sekundy, aż po elektrokoagulacji niebieski lub metylenowy zostanie zastąpiony żółtym lub brązowym; Wielkość obszaru operacyjnego: W zależności od myszy, obszar elektrokrzepu znajduje się z tyłu trzustki. Wybierz pozycję między wspólnym przewodem żółciowym a przednią tętnicą trzustkowo-duodenalną górną; Temperatura: 300 °C.
2. Zakończ elektrokoagulację, gdy nie zauważymy roztworu barwienia niebieskiego.
3. Zamknąć brzuch szwami 4-0 chłonnymi, a skórę niechłonnymi szwami z polipropylenu 4-0. Nie zajmuj więcej niż 20 minut między laparotomią a szyciem.
4. Traktuj grupę kontrolną tak samo jak myszy eksperymentalne, ale upewnij się, że składniki infuzji składają się wyłącznie z błękitu metylenowego. W grupie kontrolnej (Sham) podano zastrzyk z błękitu metylenowego, ale nie przeprowadzano operacji elektrokoagulacyjnej.

5. Utrzymanie zwierząt przy życiu

1. W przypadku leczenia rany pooperacyjnej myszy po operacji jamy brzusznej codziennie sprawdzaj nacięcie pod kątem krwawienia lub zaczerwienienia: jeśli pojawi się krwawienie, delikatnie naciskaj sterylną gazą, aby je zatrzymać, a następnie zmień opatrunek, a jeśli pojawi się zaczerwienienie, nałóż raz dziennie maść erytromycynową, jednocześnie podejmując działania, aby zapobiec gryzieniu rany przez mysz. W przypadku analgezji podawaj karprofen (5 mg/kg) bezpośrednio po operacji dootrzewnowkowo, a następnie raz co 24 godziny przez 3 kolejne dni.

6. Metody analizy

1. Mierz indeksy biochemiczne surowicy i obserwuj zmiany patologiczne tkanki trzustki w 7., 14., 21. i 28. dniu elektrokrzepnięcia.
2. Znieczulać zwierzę mieszanką ketaminy (80 mg/kg) i ksylazyny (10 mg/kg) za pomocą zastrzyku otrzewnejowego i pobrać około 500 μL krwi przez splot oczodołowy.
3. Delikatnie trzymaj skórę z tyłu, aby umożliwić lekkie wysunięcie gałki ocznej.
4. Umieść koniec kapilary w kącie oka i delikatnie włóż ją pod gałkę oczną pod kątem około 30°-45°. Obróć kapilarę, aż krew zacznie płynąć.
5. Na koniec zbierania trzymaj powieki zamknięte, delikatnie naciskając gazą.
6. Wirówka surowicy (1 200 × g, 15 min) i usunięcie supernatantu w celu wyznaczenia amylazy, bilirubiny i kwasu hialuronowego (krok 6.10).
7. Znieczulać myszy ketaminą-ksylazyną, potwierdzić, że są w stanie głębokiego znieczulenia (brak odruchu pedałowego ani rogówkowego), a następnie wykonać zwichnięcie szyjki macicy w celu eutanazji.
8. Umieść uśpione myszy na stole operacyjnym w temperaturze 4 °C i użyj nożyczek oraz kleszczy, aby wykonać nacięcie w kształcie litery "V" w ścianie brzucha, odsłaniając jamę brzuszną. Usuń trzustkę myszy i podziel organ na trzy części do barwienia.
9. Przetworz trzustkę, utrwalając ją w roztworze 4% poliformaldehydu i osadzając w parafinie. Pociąć bloki parafiny trzustki na fragmenty o grubości 0,5 mm i barwić je hematoksyliną i eozyną (HE) oraz barwieniem Massona, aby zobaczyć je pod mikroskopem świetlnym. Do analizy immunohistochemicznej wykorzystaj tkankę trzustkową osadzoną w parafinie.
10. Mierz amylazę (U/dL), bilirubinę (mmol/L) oraz kwas hialuronowy (μg/L) za pomocą dostępnych komercyjnie zestawów zgodnie z zaleceniami producentów.

Zwierzęta podzielono na grupę kontrolną (wstrzykiwanie tylko błękitu metylenowego do koagulacji elektrycznej) oraz grupę koagulującą elektryczną, łącznie 20 myszy w każdej grupie. Wskaźnik śmiertelności wynosił 0% w grupie kontrolnej i 15% w grupie z koagulacją elektryczną; wskaźnik sukcesu budowy modelu (liczba żywych myszy) wynosił 71%. W każdej grupie wybrano tuzin zwierząt do oceny patologicznej. Trzy myszy z każdej grupy zostały losowo wybrane 7., 14., 21.i 28. dnia do barwienia HE, Massona oraz immunohistochemicznego. Proces modelowania przedstawiono na Rysunku 1. Po przerysowaniu za pomocą błękitu metylenowego, elektrokoagulowaliśmy położenie między wspólnym przewodem żółciowym a przednią tętnicą trzustkową dwunastnicową u myszy. Jeśli obszar elektrokoagulacji zostanie wybrany w środkowej i dolnej części pozycji z powierzchnią mniejszą niż jedna trzecia, efekt prawdopodobnie nie spełni oczekiwań. Jednak jeśli przekroczy 2/3, myszy prawdopodobnie umrą w ciągu 72 godzin od elektrokoagulacji, co jest prawdopodobnie spowodowane ciężkim ostrym zapaleniem trzustki, które pojawia się po całkowitym zablokowaniu przewodu trzustkowego.

Z tego wnioskujemy, że 14. dnia po elektrokoagulacji można zaobserwować histologiczne zdjęcie przewlekłego zapalenia trzustki myszy (jak pokazano na Rysunku 1), które nie jest całkowicie zablokowane, lecz powstaje po częściowym zablokowaniu przewodu trzustkowego. Na tkance 7. dnia wykazywały lekki obrzęk tkanki, a nie wykazywały przewlekłego zapalenia trzustki. Czternastego dnia barwienie HE tkanki trzustki wykazało, że komórki acynarne trzustki zostały rozproszone. 21. dnia stopniowo się odbudowywał stan zapalny komórek acinowych w tkance trzustkowej. Na 28. dniu (Rysunek 2) zaobserwowano oznaki odwrócenia zmian patologicznych w tkance. Może to wynikać z niewystarczającej elektrokoagulacji przewodu trzustkowego podczas procesu elektrokrzepnięcia, a także z efektu kompensacyjnego pozostałego przewodu trzustkowego po częściowej niedrożności przewodu trzustkowego.

Barwienie Masona wykazało, że stopień zwłóknienia w grupie operacyjnej był istotnie poważniejszy niż w grupie pozorowanej operacji. Wyniki immunohistochemiczne barwienia col-1 oraz (aktyny mięśni alfa-gładkich) były wyższe (Rysunek 3). Obecność przewlekłego zapalenia trzustki w tkance trzustki zaobserwowano analizą patologiczną 14. dnia, a zmiany przed i po powodowaniu porównano za pomocą barwienia HE dopiero w późniejszej analizie patologicznej. Analiza biochemicznych wskaźników surowicy wykazała, że stężenia amylazy surowicowej, bilirubiny i kwasu hialuronowego są wyższe w grupie koagulującej elektrycznej niż w grupie kontrolnej, co wskazuje na rozpoczęcie przewlekłego zapalenia trzustki (Rysunek 4).

Rysunek 1: Schematyczna ilustracja obturacyjnego przewlekłego zapalenia trzustki wywołanego elektrokoagulacją u myszy.Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Rysunek 2: Barwienie tkanek trzustkowych hematoksylinowo-eozyną w czasie. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Rysunek 3: Barwienie hematoksylin-eozyny i Massona oraz immunohistochemia trzustki. Skróty: Col-1 = kolagen alfa-1 typu 1; SMA = alfa-gładka mięśniowa aktyna. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Rysunek 4: Reprezentatywne wyniki indeksów biochemicznych surowicy u myszy w różnych okresach. (A) Stężenie kwasu hialuronowego w surowicy (μg/L). (B) Stężenie bilirubiny w surowicy (mmol/L). (C) stężenie amylazy w surowicy (U/dL). Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Autorzy deklarują, że nie mają żadnych konfliktów interesów.