Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Protokół integracyjny do generowania 3D ludzkich organoidów wątrobowych pochodzących z iPSC

2.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/67070

⸱

6 grudnia 2024

 ,  ,  , 
1Section of Adult and Pediatric Endocrinology, Diabetes and Metabolism, University of Chicago

W tym artykule

Podsumowanie

Streszczenie

Uzyskanie stabilnych komórek wątroby w hodowli stanowi poważne wyzwanie dla badań nad wątrobą. Mając to na uwadze, przedstawiono zoptymalizowaną metodę wykorzystującą ludzkie indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (hiPSC) do generowania kultur 3D ludzkich organoidów wątrobowych (HHO). Wykorzystanie HHO stanowi cenne podejście do zrozumienia rozwoju wątroby, rozwikłania chorób wątroby, prowadzenia wysokoprzepustowych badań nad opracowywaniem leków i badania potencjału przeszczepu wątroby. W pierwszym badaniu, za pomocą technik immunofluorescencyjnych i ilościowych RT-PCR, monitorowano progresję, identyfikując obecność różnych populacji komórek, takich jak hepatoblasty i dwa typy komórek pochodzących z hepatoblastów: cholangiocyty lub komórki podobne do hepatocytów, na różnych etapach rozwoju. Niniejszy raport przedstawia prosty protokół 3D, począwszy od hiPSC, a skończywszy na uzyskaniu HHO, które odzwierciedlają etapy rozwoju ludzkiego zarodka. Protokół, obejmujący 46-50 dni, obejmuje kilka etapów: (i) skrupulatne zarządzanie hodowlą hiPSC w celu wygenerowania HHO, (ii) inicjację różnicowania komórek w 2D i późniejsze przejście do 3D oraz (iii) zoptymalizowaną strategię dysocjacji w celu rozbicia HHO na pojedyncze komórki w celu sekwencjonowania RNA pojedynczej komórki. Jako ilustrację szerokich zastosowań tego podejścia, niniejszy protokół został wcześniej zastosowany w celu rozwikłania roli sygnalizacji hormonów tarczycy w rozwoju komórek wątroby.

Wprowadzenie

Wątroba pełni różnorodne funkcje metaboliczne, takie jak regulacja dostępności łatwo użytecznych substratów energetycznych, takich jak glukoza i ciała ketonowe, a także detoksykacja związków ksenobiotycznych. W ostatnich latach nastąpił znaczny wzrost częstości występowania chorób wątroby, w dużej mierze przypisywanych niealkoholowemu stłuszczeniowemu zapaleniu wątroby (NASH), które, jeśli nie jest leczone, może rozwinąć się w marskość wątroby lub raka1. Dlatego konieczne jest zrozumienie funkcji metabolicznych wątroby i związanych z nią chorób, aby ułatwić opracowanie skutecznych metod leczenia2,3.

Pojawienie się kultur trójwymiarowych (3D) doprowadziło do stworzenia modelu organoidowego, reprezentującego przełomowe i innowacyjne podejście do rozwiązywania problemów związanych z funkcjonalnością i złożonością rozwoju narządów4. Organoidy definiuje się jako samoorganizujące się agregaty 3D zróżnicowanych komórek, które naśladują funkcje i cytoarchitekturę danego narządu5.

W ciągu ostatnich dziesięcioleci, niezliczone protokoły ludzkiego organoidu wątrobowego (HHO) zyskały szerokie zainteresowanie, począwszy od wykorzystania różnych ludzkich komórek pochodzących z iPSC6 lub wyłącznie komórek podobnych do hepatocytów7 do inkorporacji różnorodnych skomplikowanych mikrośrodowisk czynników wzrostu lub inhibitorów oraz różnicowania komórek progenitorowych w monowarstwie7 lub 3D8. Podejścia te nadają się do realizacji wielu potencjalnych celów, od wysokoprzepustowych badań przesiewowych leków9 po uzyskanie dalszych informacji na temat mechanizmów leżących u podstaw chorób wątroby10.

Tutaj przeprowadzany jest krok po kroku protokół różnicowania HHO na podstawie wspomnianych sygnałów chemicznych11, z metodologicznie dostosowanymi wariantami. Protokół ten rozpoczyna się od odpowiedniego obchodzenia się i hodowli ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (hiPSC), szczegółowo opisując techniki manipulacji żelem macierzy zewnątrzkomórkowej, pasażowania komórek i różnicowania w HHO. Proces rozpoczyna się od stymulowania różnicowania hiPSC w ostateczną endodermę (DE)12, a następnie naśladowania efektów in vivo FGF i BMP w celu promowania rozwoju komórek jednowarstwowych tylnego jelita przedniego (PFG)13. Architektura 3D jest osiągana w dniu 10, kiedy komórki PFG są różnicowane w niedojrzałą fazę wątrobową, która stanie się hepatoblastami, komórką prekursorową płodu cholangiocytów i hepatocytów2. Na koniec struktury 3D są dysocjowane na pojedyncze komórki w celu przeprowadzenia badań sekwencjonowania RNA. Jako przykład zastosowania tego protokołu wykazano, w jaki sposób ten model HHO nadaje się do badania działania hormonów tarczycy i dejodynazy typu 2 (D2) na rozwój hepatocytów i cholangiocytów14.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Zarządzanie hiPSC

UWAGA: hiPSC (linia komórkowa CS03iCTR-n3) zostały zakupione komercyjnie. Odpowiednie zarządzanie powłoką żelową macierzy zewnątrzkomórkowej i pożywką hiPSC ma kluczowe znaczenie dla przymocowania hiPSC do płytek i ich podawania. W tym miejscu opisano objętości potrzebne na jedną płytkę 6-dołkową. Pozostałe hiPSC z płytki 6-dołkowej, które nie różnicują się w organoidy, mogą być przechowywane w ciekłym azocie w celu długotrwałego przechowywania.

  1. Dozowanie żelu do macierzy zewnątrzkomórkowej i pożywki hiPSC
    1. Prawidłowo rozmrozić butelkę z żelem do macierzy zewnątrzkomórkowej, umieszczając ją na noc w pojemniku z lodem w temperaturze 4 °C.
      UWAGA: Przed porcjowaniem należy sprawdzić certyfikat analizy w celu sprawdzenia objętości dla współczynnika rozcieńczenia. Reprezentuje to stężenie białka w żelu macierzy zewnątrzkomórkowej; Dlatego różni się w zależności od partii.
    2. Rozprowadzić żel macierzy zewnątrzkomórkowej do odpowiednich porcji zgodnie ze współczynnikiem rozcieńczenia (4x, 2x i 1x) za pomocą wstępnie schłodzonych i oznakowanych probówek. Dodać 4-krotny współczynnik rozcieńczenia żelu macierzy zewnątrzkomórkowej do 25 ml zimnego DMEM/F12, aby pokryć cztery 6-dołkowe płytki. Niezwłocznie zamknąć pokrywki laboratoryjną folią uszczelniającą i zamrozić je w temperaturze -80 °C. Należy unikać długotrwałego wystawienia na działanie powietrza i tworzenia się pęcherzyków w podwielokrotnościach.
    3. Rozmrozić 100 ml pożywki uzupełniającej hiPSC w temperaturze 4 °C przez noc. Dodać go do 400 ml podłoża podstawowego hiPSC. Po homogenizacji za pomocą pipety serologicznej o pojemności 50 ml podwielokrotnić pożywkę hiPSC do probówek o pojemności 40 ml i zamrozić w temperaturze -20 °C do momentu użycia.
  2. Powlekanie płytek do hodowli hiPSC
    1. Ponumeruj i oznacz płytkę (płytki) 6-dołkową. Trzymaj w pobliżu jedną porcję żelu do macierzy zewnątrzkomórkowej, zanurzoną w suchym lodzie.
    2. W celu pokrycia jednej płytki 6-dołkowej należy rozcieńczyć jedną porcję żelu do macierzy zewnątrzkomórkowej (1x) w 6,25 ml zimnego DMEM/F12 (2x w 12,5 ml i 4x w 25 ml DMEM/F12).
    3. Odpipetować niewielką objętość DMEM/F12 (~500 μL) do probówki z żelem do macierzy zewnątrzkomórkowej. Obracaj w górę iw dół, aby rozmrozić i homogenizować żel macierzy zewnątrzkomórkowej zimnym DMEM / F12, zapobiegając tworzeniu się pęcherzyków, i zwróć go do reszty zimnej probówki zawierającej DMEM / F12 za pomocą pipety serologicznej do całkowitego wymieszania.
    4. Zanurz 1 ml żelu macierzy zewnątrzkomórkowej w DMEM/F12 w jednym dołku w celu pokrycia płytki 6-dołkowej (6 ml na całą płytkę). Rozprowadzić 1 ml równomiernie na powierzchni, przesuwając płytkę bez potrząsania, aż zostanie całkowicie pokryta.
    5. Pozostawić w temperaturze pokojowej (RT) na 1 godzinę przed użyciem. Jeżeli płytka 6-dołkowa nie jest w pełni wykorzystana, należy ją zamknąć laboratoryjną folią uszczelniającą i przechowywać w lodówce w temperaturze 4 °C.
      UWAGA: Powlekany talerz można przechowywać przez 1 tydzień w lodówce w temperaturze 4 °C.
  3. Rozmrażanie i hodowla hiPSC
    1. Oblicz z góry objętość pożywki hiPSC i ogrzej ją w temperaturze pokojowej wraz z 6-dołkową płytką powlekaną na 1 godzinę przed użyciem (2 ml na studzienkę).
      UWAGA: W przypadku zimnych lub mrożonych porcji zanurzyć je w inkubatorze o temperaturze 37 °C lub łaźni wodnej na 15 minut przed użyciem.
    2. Podzielić 1 ml hiPSC w cieczyN2 z kriowialu na 3 dołki 6-dołkowej płytki (stosunek 1:3). Na całą płytkę 6-dołkową użyj 2 kriowialiów. W tym przypadku protokół opisuje rozmrażanie i hodowlę hiPSC z jednego kriowialu. Powtórz proces dla 2 kriowialiów.
    3. Wprowadzić kriowial zawierający około 1 ml zamrożonych hiPSC, trzymając go przez nakrętkę i przesuwając przez powierzchniową wodę, z dnem fiolki zanurzonym w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C aż do rozmrożenia.
    4. Po rozmrożeniu spryskaj kriowial etanolem i odpipetuj 1 ml hiPSC. Dozować powoli do pustej stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Dodaj 5 ml ciepłej pożywki hiPSC kropla po kropli, delikatnie potrząsając probówką.
    5. Odwirować probówkę o sile 300 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Delikatnie usunąć supernatant poprzez zasysanie szklaną pipetą podłączoną do próżni, nie przerywając pracy osadu, pozostawiając pewną ilość pozostałego podłoża. Ostrożnie ponownie zawiesić osad w 6 ml pożywki, a następnie dodać 2 ml na studzienkę w 3 dołkach płytki 6-dołkowej.
      UWAGA: Pozostaw małe agregaty hiPSC dla prawidłowego wzrostu.
    6. Zegnij 6-dołkową płytkę i odessaj żel macierzy zewnątrzkomórkowej z poprzednio pokrytej płytki, nie dotykając końcówki do dna dołka.
    7. Przenieść 2 ml pożywki z hiPSC na studzienkę. Delikatnie potrząśnij płytką do przodu, do tyłu i z boku na bok, aby równomiernie rozprowadzić agregaty hiPSC na płytce.
    8. Umieścić 6-dołkową płytkę w inkubatorze w temperaturze 37 °C, 5% CO2 i wilgotności 95%. Zmieniaj pożywkę codziennie (2 ml na studzienkę), sprawdzając postępujący wzrost.
    9. Przejście hiPSC po uzyskaniu 80% konfluencji wzrostu (po 4-5 dniach; patrz Rysunek 1A). Cechy charakterystyczne zdrowych i proliferacyjnych hiPSC obejmują wyraźne granice i ciasne upakowanie dużych jąder w centrum rosnących skupisk komórek.
  4. Pasażowanie hiPSC
    1. Gdy hiPSC osiągną 80% konfluencji, co wskazuje na około 1,2 x 106 komórek na dołek, przejdź do nowej płytki 6-dołkowej. Podziel w stosunku 1:3 (od 1 dobrze do 3) lub dostosuj proporcje (1:4; 1:6) zgodnie z wymaganiami eksperymentu.
    2. Przed pasażowaniem należy przygotować wymagany żel do zatapiania w macierz zewnątrzkomórkową dla odpowiedniej liczby płytek 6-dołkowych, jak opisano w kroku 1.2.
    3. Usunąć supernatant z każdej studzienki i dodać 2 ml PBS na studzienkę. Odessać PBS, a następnie dodać 1 ml pożywki oddzielającej hiPSC na dołek przez 1 minutę. Następnie usunąć 1 ml pożywki oddzielającej hiPSC.
    4. Umieścić 6-dołkową płytkę w inkubatorze w temperaturze 37 °C na 7 minut. Dodać 1 ml pożywki hiPSC do dołka. Odłączyć i zebrać, pipetując 1 ml pożywki hiPSC z komórkami do probówki o pojemności 15 ml.
    5. Odwirować probówkę o sile 300 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Aby umieścić komórki na płytce 6-dołkowej, powtórz kroki 1.3.5-1.3.7. Umieścić 6-dołkową płytkę w inkubatorze w temperaturze 37 °C, 5% CO2 i wilgotności 95%. Przejdź do kroku 1.5. , aby w razie potrzeby zamrozić hiPSC.
  5. Zamrażanie hiPSC (opcjonalnie)
    UWAGA: Liczba hiPSC wymagana do awansu do HO może skutkować resztkami studzienek, które można przechowywać przez długi czas. Jeśli zajdzie potrzeba rozszerzenia kanału do przechowywania kriowialnego, hiPSC mogą być utrzymywane przez dłuższy czas.
    1. Rozmrozić wymaganą objętość pożywki do kriokonserwacji (1 ml na studzienkę komórek) w lodzie w temperaturze 4 °C. Oznaczyć krioprobówki liczbą pasaży, datą i linią komórkową. Odłączyć ogniwa za pomocą pożywki odłączającej hiPSC, jak w kroku 1.4. w stożkowej probówce o pojemności 15 ml.
    2. Wirować przy 300 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Całkowicie zassać supernatant, ostrożnie pozostawiając osad komórkowy w spokoju. Ostrożnie ponownie zawiesić osad w 1 ml zimnej pożywki do kriokonserwacji (na studzienkę), pozostawiając agregaty hiPSC.
      UWAGA: Jeśli studzienki mają niską gęstość, mniej niż 50% zlewania się, można użyć 1 ml pożywki do kriokonserwacji na każde 2 studzienki.
    3. Przenieś 1 ml pożywki do kriokonserwacji z hiPSC do krioprobówki. Delikatnie wymieszaj krioprobówkę, aby homogenizować zawartość komórek.
      UWAGA: Jeśli przygotowujesz więcej probówek do krioprezerwacji, pozostaw już przygotowane probówki w lodzie.
    4. Umieścić probówki w pojemniku do zamrażania o kontrolowanej szybkości w temperaturze -80 °C przez noc. Po 24 godzinach przenieść probówki do zbiornika ciekłego azotu.

2. Różnicowanie krok po kroku od hiPSC do organoidów wątrobowych

UWAGA: Rekonstytucja odczynników została przeprowadzona i przeprowadzona zgodnie z wytycznymi producenta.

  1. Różnicowanie 2D od hiPSC do DE (dzień 0-dzień 4 (D-0 do D-4); Rysunek 1B)
    1. Po 3 przejściach, jeśli komórki są zdrowe i dobrze i szybko rosną, przystąp do różnicowania hiPSC. Pokryj płytkę 6-dołkową zgodnie z opisem w kroku 1.2. Aby odróżnić hiPSC od DE, użyj zestawu DE, postępując zgodnie z instrukcjami producenta.
    2. Przed rozpoczęciem różnicowania należy hodować hiPSC w stosunku pasażu 2:1 (z 6 dołków do uzyskania 3, aby rozpocząć różnicowanie) przez 24 godziny, aby osiągnąć stężenie komórek w studzience wskazanej w instrukcjach DE.
    3. Wykonaj różnicowanie zgodnie z protokołem producenta z następującymi modyfikacjami.
      1. Zwiększyć stężenie Y-27632 dodanego do hiPSC z 10 μM do 50 μM (dzień przed rozpoczęciem różnicowania).
      2. Zwiększyć 1,5 ml na studzienkę odczynnika dysocjacyjnego, a także objętość DMEM/F12 do tej samej ilości na studzienkę, co odczynnik dysocjacyjny. Dodaj 1 ml DMEM/F12 (z 1,5) do każdej studzienki i dodatkowe 0,5 ml zgromadzone w probówce o pojemności 15 lub 50 ml.
  2. Różnicowanie komórek DE w komórki PFG (D-4 do D-10; Rysunek 1C)
    1. Przygotować pożywkę PFG (Advanced DMEM/F12 jako pożywkę podstawową, 1x suplement Glutamax, 1x suplement B27, 20 ng/mL BMP4, 10 ng/mL FGF2) do różnicowania komórek DE na kilka dni przed indukcją do PFG i przechowywać w temperaturze 4 °C.
      UWAGA: B27 zawiera T3 jako część swojego składu. W przypadku badań nad hormonami tarczycy (TH), od tego momentu witamina B27 powinna zostać zastąpiona domowym preparatem B2615, który nie zawiera TH.
    2. Ogrzać pożywkę PFG (2 ml na studzienkę) i zaawansowany DMEM/F12 w temperaturze 37 °C przez 15 minut lub RT przez 1 godzinę. Pochylić się nad płytką i zassać pożywkę DE ze studzienek za pomocą szklanej pipety podłączonej do próżni (lub ręcznie za pomocą pipety P1000) bez rysowania komórek.
    3. Dodaj 2 ml ciepłego zaawansowanego DMEM/F12 do dołka, a następnie odessać. Dodać 2 ml ciepłej pożywki PFG na dołek do płytki 6-dołkowej. Zmieniaj podłoże codziennie przez następne 6 dni.
  3. Indukcja z komórek 2D PFG do niedojrzałych organoidów wątrobowych 3D (IHO; od D-10 do D-18)
    UWAGA: Potrzeba prawie 30 000-35 000 komórek w 30 μl dodanych do każdej studzienki 96-dołkowej płytki ULA. Współczynnik pasażu wynosi 2:1, z 2 dołków (płytka 6-dołkowa) z monowarstwą zróżnicowanych komórek PFG; zapewni pełną 96-dołkową płytkę o ultraniskim mocowaniu (ULA) ( Rysunek 1D).
    1. Przed rozpoczęciem organoidów 3D lub we wcześniejszych dniach należy przygotować wcześniej pożywkę IHO (Advanced DMEM/F12 jako podłoże podstawowe, 1x suplement N2, 1x B27, 50 nM A83-01, 30 μM deksametazon, 5 μM CHIR99021, 500 nM kwas walproinowy, 50 ng/ml ludzkiego naskórkowego czynnika wzrostu (EGF), 20 ng/ml ludzkiego czynnika wzrostu hepatocytów (HGF), 40 ng/ml Jagged-1, 300 ng/ml N-6,20-O-dibutyryloadenozyna 30,50-cykliczna sól sodowa 35 monofosforanu (dbCAMP), 10 μM nikotynamidu) i przechowywać w temperaturze 4 °C.
    2. Oznacz 96-dołkową płytkę o bardzo niskim mocowaniu (ULA). Do odłączenia komórek PFG należy użyć enzymu dysocjacji komórek zgodnie z instrukcjami producenta.
    3. Przed użyciem ogrzej enzym dysocjacyjny, zaawansowany DMEM/F12 i PBS w temperaturze 37 °C. Odessać i wyrzucić pożywkę PFG ze studzienek. Dodaj 2 ml PBS na studzienkę, a następnie odessać.
    4. Dodać 1,5 ml enzymu dysocjacji komórek na studzienkę w temperaturze 37 °C przez 7 minut, aby odłączyć komórki od studzienki. Nie usuwając enzymu dysocjacji komórek, dodaj 1 ml zaawansowanego DMEM. Zbierz wszystkie komórki i dodaj je do probówki o pojemności 50 ml.
    5. Policz liczbę komórek na ml za pomocą licznika komórek lub hemocytometru. Wirować przy 150 x g przez 8 min.
    6. Do osadu dodaj odpowiednią objętość (3 ml pożywki IHO na całą 96-dołkową płytkę ULA) i 1x żel do macierzy zewnątrzkomórkowej, aby dostosować się do ostatecznej liczby potrzebnych komórek (30 000-35 000 komórek).
    7. Umieść 96-dołkową płytkę w inkubatorze ustawionym w temperaturze do 37 °C, 5% CO2 i wilgotności 95%. Po 24 godzinach (D-11) komórki przegrupują się w okrągły kształt; dodać 50 μl na studzienkę pożywki IHO.
    8. Następnego dnia (D-12) zwiększyć do 100 μl pożywki IHO na studzienkę. W D14 usuń ~100-120 μl z każdej studzienki za pomocą szklanej pipety podłączonej do próżni lub pipety jeden po drugim. Uważaj, aby nie zasysać organoidów. Dodać 100 μl pożywki IHO o stężeniach D-14 i D-16,
      UWAGA: Po D-16, ze względu na to, że nie jest wprawiany w ruch, pojawia się nadmierny wzrost, który znika po D18.
  4. Organoidy hepatoblastów (HBO, od D-18 do D-26)
    UWAGA: Na tym etapie IHO z 96-dołkowej płytki ULA zostaną przeniesione do 6-dołkowej płytki ULA. Dla 96 IHO z poprzedniego etapu, 10 organoidów umieszczono w każdym dołku, reprezentujących w sumie 1 i 1/2 6-dołkowych płytek ULA, aby przejść do dojrzewania (Rysunek 1E).
    1. Podobnie jak w poprzednich krokach różnicowania, przygotuj medium różnicujące HBO w poprzednich dniach.
      1. Koktajl odczynników używanych do różnicowania w HBO opisano w kroku 2.3. Usuń kwas walproinowy i włącz do koktajlu następujące substancje biochemiczne: BMP7, BMP4 i FGF7. Ostateczny skład to Advanced DMEM/F12 jako podłoże podstawowe, 1x suplement N2, 1x B27, 50 nM A83-01, 30 μM deksametazon, 5 μM CHIR99021, 500 nM kwas walproinowy, 50 ng/ml ludzkiego naskórkowego czynnika wzrostu (EGF), 20 ng/ml ludzki czynnik wzrostu hepatocytów (HGF), 40 ng/ml Jagged-1, 300 ng/mL sól sodowa N-6,20-O-dibutyryloadenozyny 30,50-cyklicznej 35 monofosforanu (dbCAMP), 10 μM nikotynamidu, 25 ng/ml FGF7, 50 ng/ml BMP4, 20 ng/ml BMP7.
    2. Ogrzej wcześniej pożywkę HBO (3 ml na studzienkę) i Advanced DMEM/F12 (3 ml na studzienkę) w temperaturze 37 °C. Dodaj 3 ml ciepłego zaawansowanego DMEM/F12 do każdej studzienki.
    3. Rozprowadzić 10 organoidów IHO na basenik z 96-dołkowej płytki z końcówką o szerokim otworze 200 ml. Wyjmij zaawansowany DMEM/F12, pochylając się nad płytką i odsysając ją szklaną pipetą podłączoną do próżni (lub ręcznie za pomocą P1000).
    4. Dodaj 3 ml ciepłej pożywki HBO na dołek. Włącz i umieść 6-dołkowe płytki ULA na wytrząsarce wieloplatformowej z prędkością 65 obr./min w inkubatorze ustawionym na 37 °C, 5% CO2 i 95% wilgotności. Po 4 dniach (D-22) i 6 dniach (D-24) wymień pożywkę HBO (3 ml na dołek).
  5. Dojrzewanie do organoidów wątrobowych (HO) w 2 różnych fazach (od D-26 do D-46)
    UWAGA: Jest to ostatni proces dojrzewania, który zachodzi w dwóch okresach różnicowania ze względu na zawartość i rodzaj odczynników w pożywce.
    1. Przygotować z wyprzedzeniem pierwszą pożywkę HO (HO1) i przechowywać ją w temperaturze 4 °C. Usunąć Jagged1 i zmniejszyć stężenie CHIR99021 w porównaniu z podłożem HBO. Ostateczny skład to: Zaawansowany DMEM/F12 jako podłoże podstawowe, 1x suplement N2, 1x B27, 500 nM A83-01, 30 μM deksametazon, 2 μM CHIR99021, 50 ng/ml ludzkiego naskórkowego czynnika wzrostu (EGF), 20 ng/ml ludzki czynnik wzrostu hepatocytów (HGF), 300 ng/ml N-6,20-O-dibutyryloadenozyna 30,50-cykliczna sól sodowa 35 monofosforanu (dbCAMP), 10 μM nikotynamidu, 25 ng/ml FGF7, 20 ng/ml BMP4, 20 ng/ml BMP7.
    2. Przed użyciem ogrzej Advanced DMEM/F12 i pożywkę HO1 w temperaturze 37 °C. W tej samej 6-dołkowej płytce ULA ostrożnie zassaj poprzednie podłoże HBO, pochylając się nad płytką i przykładając końcówkę szklanej pipety podłączonej do próżni do ściany (lub ręcznie za pomocą pipety P1000).
    3. Dodaj 3 ml ciepłego Advanced DMEM/F12 do dołka i odessać. Dodać 3 ml ciepłej pożywki HO1 do dołka. Zmieniaj pożywkę HO1 co 3 dni (D-29, D-32, D-35, D-38) wraz z pobraniem próbki.
    4. W D 38 zmodyfikuj koktajl odczynników dla drugiego okresu HO (HO2), usuwając CHIR99021, BMP4, dbcAMP i FGF7 i zastępując je FGF19 i DAPT. Ostateczny skład pożywki to Advanced DMEM / F12 jako podłoże podstawowe, 1x suplement N2, 1x B27, 500 nM A83-01, 30 μM deksametazon, 50 ng / ml ludzkiego naskórkowego czynnika wzrostu (EGF), 20 ng / ml ludzkiego czynnika wzrostu hepatocytów (HGF), 10 μM nikotynamidu, 20 ng / ml BMP7, 25 ng / ml FGF19, 5 μM DAPT.
    5. Przed użyciem ogrzać zaawansowany DMEM/F12 i pożywkę HO2 w temperaturze 37 °C. Kontynuuj z tą samą 6-dołkową płytką ULA i ostrożnie odessaj poprzednią pożywkę HO1. Dodaj 3 ml Advanced DMEM/F12 do dołka i usuń go.
    6. Dodać 3 ml ciepłej pożywki HO2 do dołka. Zmieniaj pożywkę HO2 co 4 dni (D-42, D-46, D-50, ...) i pobieraj próbki w tych samych dniach, w których zmieniana jest pożywka.

3. Dysocjacja pojedynczej komórki

UWAGA: Ten krok jest kluczowy dla techniki sekwencjonowania RNA pojedynczej komórki. Liczba organoidów może się różnić w zależności od wielkości, a im starszy dzień dysocjacji, tym większa ilość komórek w organoidach. W dawnych czasach liczba zdysocjowanych organoidów wzrastała, a czasy dysocjacji skracały się przy równych ilościach. Dysocjację przeprowadzono z 10 organoidami w D-14 i D-17, 8 organoidami w D-23 i D-26 oraz 6 organoidami w D-30 i D-45. Procedury dla jednej grupy organoidów są szczegółowo opisane (Rysunek 1F).

  1. Przygotowanie odczynników
    1. Przygotować Advanced-DMEM o końcowym stężeniu 7,5% frakcji albuminy bydlęcej V (BSA) i przefiltrować po homogenizacji.
    2. Przygotuj 1 ml pożywki enzymu dysocjacyjnego z 1 ml trypsyny 0,5% - EDTA (10x) jako podłoża podstawowego, 50 μM Y-27632, 40 U/μL inhibitora RNazy i 1 U/μL DNazy I.
    3. Przygotuj pożywkę do inaktywacji trypsyny z 2 ml Advanced DMEM/F12 + 7,5% BSA jako pożywki podstawowej, 50 μM Y-27632, 40 U/μL inhibitora RNazy i 1 U/μL DNazy I.
    4. Przed rozpoczęciem podgrzej zarówno nośnik, jak i PBS w temperaturze 37 °C.
  2. Dysocjacja HHO
    1. Oczyść miejsce pracy i narzędzia za pomocą środka czyszczącego RNase. Zebrać liczbę organoidów według dnia różnicowania w probówce polipropylenowej o pojemności 15 ml z szeroko otwartą końcówką.
    2. Umyć PBS 2x-3x. Dodać 1 ml pożywki enzymatycznej dysocjującej do probówki o pojemności 15 ml z zebranymi organoidami i utrzymywać w temperaturze 37 °C w bujaku przy 30 obr./min przez 5 min.
      UWAGA: Uważaj, aby nie upuścić rurki z wahacza.
    3. Po 5 minutach najpierw sprawdź nasadkę pod kątem pozostałych organoidów, a następnie mechanicznie rozerwij organoidy za pomocą P1000, obracając w górę iw dół 10 razy na organoid (w sumie 60 razy). Powtórz to samo zakłócenie z P200. Sprawdź nakrętkę probówki na wypadek, gdyby organoidy utknęły na niej.
    4. Umieścić probówkę o pojemności 15 ml ponownie na kołysce w inkubatorze na kolejne 5 minut. Powtórzyć proces opisany w punkcie 4, zaczynając od obracania w górę i w dół P200, a następnie stosując pipetę serologiczną o pojemności 1 ml podłączoną do końcówki P10.
    5. Umieść probówkę o pojemności 15 ml ponownie na kołysce w inkubatorze na ostatnie 5 minut. W przypadku braku dysocjacji pozostaw ją na dodatkowe 5 minut i powtórz ręczne zakłócenie.
    6. Dodaj 1 ml pożywki do inaktywacji trypsyny i homogenizuj. Umieść na wierzchu nową probówkę polipropylenową o pojemności 15 ml z sitkiem do komórek o pojemności 40 μm. Przefiltrować 2 ml (komórki z pożywką enzymatyczną dysocjacyjną i pożywką do inaktywacji trypsyny) przez sitko do komórek 40 μm do probówki o pojemności 15 ml.
    7. Dodaj kolejny 1 ml pożywki do inaktywacji trypsyny, aby odzyskać pozostałe komórki z sitka do komórek o wielkości 40 μm.
    8. Weź 5 μl pożywki jednokomórkowej zmieszanej z 5 μl roztworu barwnika, aby policzyć liczbę zdysocjowanych komórek, aby kontynuować ich utrwalanie. Policzyć komórki po odwirowaniu i ponownym zawieszeniu za pomocą pierwszego odczynnika z zestawu utrwalającego i przeprowadzić filtrację komórek za pomocą sitka do komórek o wielkości 40 μm.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Każdy etap niniejszego protokołu stopniowego różnicowania hiPSC w HHO został zdefiniowany przy użyciu pomiarów ilościowych metodą qPCR oraz immunofluorescencji z wykorzystaniem znanych markerów specyficznych dla danego etapu, opisanych w literaturze (Rycina 2). Szczegółowy przebieg obu technik oraz wyniki uzyskane w kontekście prawidłowego różnicowania w HO przedstawiono w14. W poprzednim badaniu hiPSC zdefiniowano na podstawie poziomów mRNA POU5F1 (znanego r...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Obecny protokół zawiera różne szczegóły metodologiczne dotyczące postępowania z hiPSC i późniejszymi hodowlami organoidów 3D. Obejmuje to dwa główne krytyczne etapy: (i) odłączenie kultur 2D, a następnie ich rozwój w organoidy wątrobowe 3D po 10 dniach, a także (ii) delikatną dysocjację struktury 3D na pojedyncze komórki. Opierając się na dostępnych informacjach, jest to pierwszy raport z modelu 3D HHO do badania działania hormonów tarczycy, wykazując szczytową ekspresję DIO2 w komórkach podobnych do hepatoblastów

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Antonio C. Bianco jest konsultantem firm Abbvie, Acella, Aligos, Synthonics. Pozostali autorzy nie ujawnili żadnych istotnych informacji.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez Narodowy Instytut Cukrzycy oraz Chorób Układu Pokarmowego i Nerek (NIDDK -DK58538, DK65066, DK77148; ACB).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
10 &mikro; L Uniwersalne końcówki do pipet z filtrem, niski czynsz, wstępnie sterylneVWR613-6462Wszystkie procedury
1000 i mikro; L Uniwersalne końcówki do pipet z filtrem, o niskim czynszu, wstępnie sterylneVWR613-6470Wszystkie procedury
15 ml polipropylenowa rurka stożkowaFalcon (Corning)352097Organoidy wątrobowe dysocjacyjne
200 i mikro; L Uniwersalne końcówki do pipet Filtrowane, Niski czynsz, Wstępnie sterylneVWR613-6465Wszystkie procedury
3,3',5-Triiodo-L-tyroninaSigmaT2877-100Różnicowanie organoidów wątrobowych
40 μ m Sitko komórkowe Corning431750Dysocjacyjne organoidy wątrobowe
50 ml tubka Sokół (Corning)352070Wszystkie procedury
6 płytki dołkowej Nunc Hodowla komórkowa Traktowane wielonaczyniaThermo fisher naukowe140675konserwacji hiPSC
A83-01 R& D Systems2939/10Różnicowanie organoidów wątrobowych
Zaawansowane DMEM/F12Gibco12634010Różnicowanie organoidów wątrobowych
ART Końcówki do pipet z filtrem szerokootworowymART2069GPKWszystkie procedury
B27 suplement Gibco17504044Różnicowanie organoidów wątrobowych
BMP7 R& D Systems354-BP-010/CFRóżnicowanie organoidów wątrobowych
Albumina bydlęca frakcja V (7,5% roztwór) Gibco15260037Dysocjacja Organoidy wątrobowe
BSA, frakcja V, wolne od kwasów tłuszczowych do hodowli tkankowychGoldBioA-421-100Dysocjacja organoidów wątrobowych
CHIR99021R& D Systems4423/10Różnicowanie organoidów wątrobowych
Corning 96-well Clear Flat Bottom Ultra-Low AttachmentCorning3474Różnicowanie organoidów wątrobowych
Costar 6-well Clear Flat Bottom Ultra-Low Attachment Corning3471Różnicowanie organoidów wątrobowych
CS03iCTR-n3 indukowana przez człowieka pluripotencjalna linia komórek macierzystychUtrzymanie cedru-synajhiPSC
DAPTR& D Systems2634/10Różnicowanie organoidów wątrobowych
dbCAMPMillipore SigmaD0627-100MGRóżnicowanie organoidów wątrobowych
DeksametazonR& D Systems1126/100Różnicowanie organoidów wątrobowych
DMEM/F12Gibco11320033utrzymanie hiPSC
DNAzy I, wolne od RNaz, HCThermo Fisher scientificEN0523Dysocjacja organoidów wątrobowych
Falcon 10 ml Pipet serologiczny, polistyren, przyrost 0,1, pakowany pojedynczo, sterylnyCorning357551Wszystkie procedury
Pipet serologiczny Falcon 5 mL, polistyren, przyrost 0,1, pakowany pojedynczo, sterylnyCorning357543Wszystkie procedury
Falcon 50 ml pipeta serologiczna, polistyren, przyrosty 1,0, pakowana pojedynczo, sterylnaCorning357550Wszystkie procedury
Odczynnik do delikatnej dysocjacji komórek (GCDR)Stemcell Technologies100-0485Różnicowanie organoidów wątrobowych
Glutamax suplementGibco35050061Różnicowanie organoidów wątrobowych
L-tyroksynaSigmaT1775-1GRóżnicowanie organoidów wątrobowych
Matrigel Matryca kwalifikowana przez hESC, wolna od LDEV, 5 mlCorning354277Żel do macierzy zewnątrzkomórkowej
mFreSRStemcell Technologies5855pożywka do kriokonserwacji hiPSC
mTeSR 5x Suplement Stemcell Technologies100-0276hiPSC medium
mTeSR Plus Stemcell Technologies100-0276hiPSC
średni wytrząsarka wieloplatformowa Fisherbrand (technologie Thermo Fisher)88861021na różnicowanie organoidów wątrobowych
 Gibco17502048Różnicowanie organoidów wątrobowych
Nikotynamid R& D Systems4106/50Różnicowanie organoidów wątrobowych
PBS, pH 7,4Utrzymanie 10010023 hiPSCGibco
Rekombinowany ludzki BMP4   R& D Systems314-BP-010/CFRóżnicowanie organoidów wątrobowych
Rekombinowany ludzki EGFR& D Systems236-EG-200Różnicowanie organoidów wątrobowych
Rekombinowany ludzki FGF zasadowy/FGF2/bFGFR& D Systems233-FB-010/CFRóżnicowanie organoidów wątrobowych
Rekombinowany ludzki FGF19R& D Systems959-FG-025/CFRóżnicowanie organoidów wątrobowych
Rekombinowany ludzki HGFR& D Systems294-HG-005/CFRóżnicowanie organoidów wątrobowych
Rekombinowana ludzka chimera Jagged-1 Fc R& D Systems1277-JG-050Różnicowanie organoidów wątrobowych
Rekombinowany ludzki KGF / FGF7R& D Systems251-KG-010/CFRóżnicowanie organoidów wątrobowych
ReLeSRStemcell Technologies100-0483hiPSC odłączające podłoże
Inhibitor RNAzy Ambion, sklonowany, 40 U/μ LInvitrogenAM2682Dysocjacja Organoidy wątrobowe
RNase ZapInvitrogenAM9780Dysocjacja Organoidy wątrobowe
Sorvall  Seria wirówek Legend XT/XFThermo Fisher Scientific75004539Wszystkie procedury
STEMdiff Definitive Endoderm KitStemcell Technologies5110Różnicowanie organoidów wątrobowych
Roztwór błękitu trypanowego (0,4%) Gibco15250061Roztwór barwnika
TrypLE Express EnzymGibco12604013Enzym dysocjacji komórek
Trypsyna 0,5% - EDTA (10X) Gibco15400054Dysocjacja Organoidy wątrobowe
Kwas walproinowy, sól sodowaR& D Systems2815/100Różnicowanie organoidów wątrobowych
Vari-Mix Platform Rocker Thermo Fisher M79735Q naukoweDysocjacja Organoidy wątrobowe
Y-27632 dichlorowodorekR& D Systems1254Różnicowanie organoidów wątrobowych
Suplement N2

Bibliografia

  1. Peiseler, M., et al. Immune mechanisms linking metabolic injury to inflammation and fibrosis in fatty liver disease - novel insights into cellular communication circuits. J Hepatol. 77 (4), 1136-1160 (2022).
  2. Gordillo, M., Evans, T., Gouon-Evans, V. Orchestrating liver development. Development. 142 (12), 2094-2108 (2015).
  3. Lemaigre, F. P. Mechanisms of liver development: concepts for understanding liver disorders and design of novel therapies. Gastroenterology. 137 (1), 62-79 (2009).
  4. He, C., et al. Liver organoids, novel and promising modalities for exploring and repairing liver injury. Stem Cell Rev Rep. 19 (2), 345-357 (2023).
  5. Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Organogenesis in a dish: modeling development and disease using organoid technologies. Science. 345 (6194), 1247125(2014).
  6. Takebe, T., et al. Vascularized and functional human liver from an iPSC-derived organ bud transplant. Nature. 499 (7459), 481-484 (2013).
  7. Si-Tayeb, K., et al. Highly efficient generation of human hepatocyte-like cells from induced pluripotent stem cells. Hepatology. 51 (1), 297-305 (2010).
  8. Wu, F., et al. Generation of hepatobiliary organoids from human induced pluripotent stem cells. J Hepatol. 70 (6), 1145-1158 (2019).
  9. Shinozawa, T., et al. High-fidelity drug-induced liver injury screen using human pluripotent stem cell-derived organoids. Gastroenterology. 160 (3), 831-846.e10 (2021).
  10. Ouchi, R., et al. Modeling steatohepatitis in humans with pluripotent stem cell-derived organoids. Cell Metab. 30 (2), 374-384.e6 (2019).
  11. Ramli, M. N. B., et al. Human pluripotent stem cell-derived organoids as models of liver disease. Gastroenterology. 159 (4), 1471-1486.e12 (2020).
  12. Shen, M. M. Nodal signaling: developmental roles and regulation. Development. 134 (6), 1023-1034 (2007).
  13. Ang, L. T., et al. A roadmap for human liver differentiation from pluripotent stem cells. Cell Rep. 22 (8), 2190-2205 (2018).
  14. Hidalgo-Álvarez, J., Salas-Lucia, F., Vera Cruz, D., Fonseca, T. L., Bianco, A. C. Localized T3 production modifies the transcriptome and promotes the hepatocyte-like lineage in iPSC-derived hepatic organoids. JCI Insight. 8 (23), e173780(2023).
  15. B27 Supplement. , Hanna Lab Protocol – Weizmann Institute of Science. https://www.weizmann.ac.il/molgen/hanna/sites/molgen.hanna/files/users/user52/HANNA-LAB-B22-B27-PROTOCOL-V3.pdf (2016).
  16. Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
  17. Zhu, X., Sun, J. CircHIPK3 regulates melanoma cell behaviors by binding with miR-215-5p to upregulate YY1. Mol Cell Probes. 53, 101644(2020).
  18. Guan, Y., et al. Human hepatic organoids for the analysis of human genetic diseases. JCI Insight. 2 (17), e94954(2017).
  19. Walesky, C., Apte, U. Role of hepatocyte nuclear factor 4α (HNF4α) in cell proliferation and cancer. Gene Expr. 16 (3), 101-108 (2015).
  20. Fonseca, T. L., et al. Hepatic inactivation of the type 2 deiodinase confers resistance to alcoholic liver steatosis. Alcohol Clin Exp Res. 43 (7), 1376-1383 (2019).
  21. Kleinman, H. K., Martin, G. R. Matrigel: basement membrane matrix with biological activity. Semin Cancer Biol. 15 (5), 378-386 (2005).
  22. Kozlowski, M. T., Crook, C. J., Ku, H. T. Towards organoid culture without Matrigel. Commun Biol. 4 (1), 1387(2021).
  23. Arceneaux, D., et al. A contamination focused approach for optimizing the single-cell RNA-seq experiment. iScience. 26 (7), 107242(2023).
  24. Matsumoto, K., Nakamura, T. Hepatocyte growth factor: molecular structure and implications for a central role in liver regeneration. J Gastroenterol Hepatol. 6 (5), 509-519 (1991).
  25. Kimura, M., Moteki, H., Ogihara, M. Role of hepatocyte growth regulators in liver regeneration. Cells. 12 (2), 208(2023).
  26. Michalopoulos, G. K., Bowen, W. C., Mulè, K., Luo, J. HGF-, EGF-, and dexamethasone-induced gene expression patterns during formation of tissue in hepatic organoid cultures. Gene Expr. 11 (2), 55-75 (2003).
  27. Kaur, I., et al. Primary hepatocyte isolation and cultures: Technical aspects, challenges and advancements. Bioengineering (Basel). 10 (2), 131(2023).
  28. Baxter, M., et al. Phenotypic and functional analyses show stem cell-derived hepatocyte-like cells better mimic fetal rather than adult hepatocytes. J Hepatol. 62 (3), 581-589 (2015).
  29. Blohm, M. E., Vesterling-Hörner, D., Calaminus, G., Göbel, U. Alpha 1-fetoprotein (AFP) reference values in infants up to 2 years of age. Pediatr Hematol Oncol. 15 (2), 135-142 (1998).
  30. Liu, Q., Zeng, A., Liu, Z., Wu, C., Song, L. Liver organoids: From fabrication to application in liver diseases. Front Physiol. 13, 956244(2022).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

Różnicowanie iPSCtrójwymiarowa hodowla komórekludzkie organoidy wątrobyróżnicowanie hepatoblastówsekwencjonowanie RNA pojedynczych komórekanaliza immunofluorescencyjnailościowy RT-PCRmodelowanie chorób wątrobysygnalizacja hormonów tarczycy

Ten artykuł został opublikowany

Film wkrótce dostępny

Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.