Artykuł metodologiczny

Zintegrowana metoda tworzenia elastycznych i wygodnych optymór elektrofizjologicznych do wieloregionalnego zapisu in vivo

1.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/67071

⸱

21 listopada 2024

 ,  ,  , 
1State Key Laboratory of Medical Neurobiology and MOE Frontiers Center for Brain Science, Institutes of Brain Science, Fudan University

W tym artykule

Podsumowanie

Opracowaliśmy uproszczone i opłacalne podejście do produkcji elektrod i przeprowadziliśmy zapisy sygnałów w wielu regionach u swobodnie poruszających się myszy. Wykorzystanie optogenetyki, wraz z elektrofizjologią wieloregionalną i rejestracją sygnału wapnia, umożliwiło ujawnienie aktywności neuronalnej w różnych regionach w modelu rozpalania napadów.

Streszczenie

Epilepsja to zaburzenie neurologiczne charakteryzujące się zsynchronizowanymi nieprawidłowymi wyładowaniami obejmującymi wiele obszarów mózgu. Zmiany ogniskowe ułatwiają propagację sygnałów padaczkowych przez powiązane obwody nerwowe. Dlatego rejestracja in vivo potencjału pola lokalnego (LFP) z krytycznych obszarów mózgu jest niezbędna do rozszyfrowania obwodów zaangażowanych w propagację napadów. Jednak obecne metody wytwarzania i implantacji elektrod są nieelastyczne. Prezentujemy poręczne urządzenie przeznaczone do zapisów elektrofizjologicznych (LFP i elektroencefalografii [EEG]) w wielu regionach. Dodatkowo bezproblemowo zintegrowaliśmy manipulację optogenetyczną i rejestrację sygnalizacji wapniowej z rejestracją LFP. Podczas napadów padaczkowych zaobserwowano silne wyładowania końcowe w kilku oddzielnych regionach, którym towarzyszyła zwiększona sygnalizacja wapniowa. Podejście zastosowane w tym badaniu oferuje wygodną i elastyczną strategię synchronicznych nagrań neuronowych w różnych obszarach mózgu. Ma on potencjał do przyspieszenia badań nad zaburzeniami neurologicznymi, dostarczając wglądu w profile neuronalne wielu regionów zaangażowanych w te zaburzenia.

Wprowadzenie

Epilepsja to powszechny stan neurologiczny charakteryzujący się nawracającymi napadami, które objawiają się drgawkami, zaburzeniami czucia i utratą przytomności1. Mechanizmy patofizjologiczne leżące u podstaw padaczki są złożone i obejmują wiele połączonych ze sobą obszarów mózgu2,3. Ostatnie postępy w neuroobrazowaniu rzuciły światło na duże sieci zaangażowane w padaczkę4,5. Jednak zrozumienie skomplikowanych obwodów i mechanizmów sieciowych leżących u podstaw powstawania i rozprzestrzeniania się padaczki pozostaje ograniczone, częściowo z powodu niewystarczającego zastosowania wieloregionalnych technik rejestracji neuronowej6. Dlatego konieczne jest opracowanie elastycznej, zintegrowanej metody zdolnej do jednoczesnego monitorowania aktywności neuronalnej w różnych regionach mózgu.

Rejestracje elektrofizjologiczne są przeprowadzane w celu wychwycenia napadów i określenia obecności epilepsji7. Oprócz rejestrowania aktywności elektrofizjologicznej, w badaniach nad padaczką coraz większy nacisk kładzie się na dokładną aktywność wapnia w określonych populacjach neuronów8,9. Postępy w syntezie wskaźnika wapnia i różne konstrukcje sond skłoniły naukowców do zastosowania fotometrii światłowodowej do rejestrowania zmian w aktywności neuronalnej i substancjach nerwowych w mózgu10,11. Dwie niezależne metody wykrywania aktywności neuronalnej, a mianowicie elektrofizjologia i zapis fotometrii światłowodowej, uzupełniają się wzajemnie, ułatwiając pełniejsze zrozumienie dynamicznych procesów neuronalnych.

Dodatkowo, synchroniczne nagrywanie i modulowanie aktywności neuronalnej są kluczowe dla uzyskania wglądu w funkcjonowanie mózgu zarówno na poziomie sieci, jak i komórkowym. Takie podejście umożliwia naukowcom obserwowanie i manipulowanie złożonymi procesami zachodzącymi w mózgu w czasie rzeczywistym. Optogenetyka stała się nieodzownym narzędziem do badania sygnalizacji neuronalnej, ze względu na jej charakterystyczną zdolność do selektywnej stymulacji lub hamowania12. Pomimo powszechnych zastosowań wieloośrodkowego zapisu elektrofizjologicznego w neurobiologii13, integracja wieloobszarowego zapisu elektrofizjologicznego z fotometrią światłowodową i manipulacją optogenetyczną pozostaje ograniczona. Co ważniejsze, obecnym metodom wytwarzania i wszczepiania elektrod wieloobszarowych brakuje elastyczności14. Ograniczenia te ograniczają naszą zdolność do analizowania określonych funkcji obwodów i interakcji w wielu regionach. W tym miejscu przedstawiamy opłacalne i wygodne wieloregionalne podejście do rejestracji in vivo, które rzuca światło na procesy neuronalne w różnych regionach w napadach padaczkowych wywołanych rozpalaniem i innych zaburzeniach neuropsychiatrycznych.

Protokół

Ten protokół został zatwierdzony przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt na Uniwersytecie Fudan i został przeprowadzony zgodnie z wytycznymi i przepisami opracowanymi przez National Institutes of Health Guide for Care and Use of Laboratory Animals. Podjęto wszelkie możliwe działania w celu zminimalizowania liczby zwierząt wykorzystywanych w tym badaniu. Czas potrzebny na wykonanie każdego kroku jest zawarty w odpowiednich krokach.

1. Przygotowanie elektrod (Rysunek 1)

  1. Wytnij odpowiednią długość drutu wolframowego (~20 mm) i wypal warstwę izolacyjną na jednym końcu, aby odsłonić drut wolframowy (1,6-2 mm). Zegnij drugi koniec drutu w kształt litery "L" (patrz Rysunek 1A, ~1 min)
  2. Ostrożnie umieść końcówkę "L" drutu wolframowego na światłowodzie (patrz Rysunek 1B, ~1 min).
    UWAGA: Drut wolframowy powinien być o 0,2-0,4 mm dłuższy niż końcówka światłowodu.
  3. Zanurz kroplę kleju i nałóż ją na styk światłowodu i drutu wolframowego (patrz Rysunek 1C, ~ 1 min). Ze względu na napięcie powierzchniowe cieczy, drut wolframowy przyczepi się do światłowodu.
  4. Nałóż klej raz i pozostaw do wyschnięcia. Następnie nałóż drugą warstwę. To jeszcze bardziej zacieśni połączenie między drutem wolframowym a światłowodem (patrz Rysunek 1C, ~1 min).
    UWAGA: Podczas procesu aplikacji należy uważać, aby klej nie spływał na końcówkę światłowodu, ponieważ może to wpłynąć na jego przepuszczalność.
  5. W rogu kształtu litery "L" użyj kleju, aby ściśle połączyć ze sobą podstawę światłowodu i drut wolframowy (~1 min).
    UWAGA: Zwiększona powierzchnia styku i kuliste krzepnięcie kropli kleju zapewniają mocne połączenie między światłowodem a drutem wolframowym.
  6. Użyj, aby ustanowić połączenie między drutem wolframowym a stykiem złącza żeńskiego (patrz Rysunek 1D, ~ 3 minuty dla każdego)
    UWAGA: Ponieważ drut wolframowy nie jest wrażliwy na ciepło, wskaźnik powodzenia można zwiększyć do prawie 100% za pomocą metalowej tulei uformowanej przez wycięcie miejsca na sworzeń w celu fizycznego połączenia dwóch elementów. Następnie lut wypełniający tuleję zapewnia stabilne połączenie pomiędzy włożonym drutem wolframowym a trzpieniem.
  7. Zgodnie z eksperymentalnym projektem, wymaganą liczbę optrodów (patrz Rysunek 1E, ~10 min)
    UWAGA: W tym badaniu wykorzystano trzy optrody.
  8. Przyciąć emaliowany drut na odpowiednią długość (~30 mm) i wypalić izolację na obu końcach. Owiń jeden koniec emaliowanego drutu wokół podstawy i go. Podłącz drugi koniec emaliowanego przewodu do styków złącza żeńskiego za pomocą lutownicy, służącej jako zapis EEG i połączenie uziemiające dla elektrody czaszki (patrz Rysunek 1F, ~5 min)
    UWAGA: Ze względu na elastyczność emaliowanego drutu wygodnie jest podłączyć czaszkę i styki złącza żeńskiego. po nawinięciu emaliowanego drutu wokół jest bardziej niezawodne niż powierzchniowe.
  9. Nałóż klej topliwy na układ pinów złącza żeńskiego, aby otoczyć złącze żeńskie i upewnić się, że połączenia lutowane są całkowicie obwiednione. Podczas krzepnięcia kleju topliwego uformuj klej za pomocą plastikowej płyty, aby zminimalizować zajmowanie miejsca podczas implantacji (patrz Rysunek 1F, ~ 3 min)
    UWAGA: Ze względu na potencjalne ryzyko poparzenia związane ze stosowaniem kleju topliwego, klej AB jest uważany za bezpieczniejszą alternatywę.
  10. Następnie użyj miernika natężenia światła i multimetru cyfrowego, aby zmierzyć jasność i przewodność. Po pomyślnym przejściu tych testów, konfiguracja jest gotowa do użycia (patrz Rysunek 1G, ~2 min)
    UWAGA: Podczas pracy z laserami zawsze noś okulary ochronne odpowiednie do określonej długości fali i mocy światła laserowego. Wysokiej jakości włókna są wymagane do przepuszczania co najmniej 80% światła z końca krosowego do końcówki wszczepialnego włókna. Dodatkowo zmierzono rezystancję od końcówki drutu wolframowego do gniazda listwy pinowej w dopuszczalnym zakresie 1-5 Ω.
  11. Przed użyciem należy zanurzyć przygotowane elektrody w 75% alkoholu na 15 min, a następnie przenieść je do sterylnego roztworu soli fizjologicznej (~16 min).
    UWAGA: Całkowita waga zamkniętego urządzenia elektrodowego (0,6701 ± 0,01123 g, n = 4) nie wpływa na aktywność myszy. Elektrody są wcześniej sterylizowane za pomocą sterylizacji plazmowej.

2. Protokół implantacji elektrod (Rysunek 2)

  1. Znieczulenie myszy izofluranem (2%-4%) i zabezpieczenie ich w aparacie stereotaktycznym (patrz Rysunek 2A, ~2 min). Użyj maści do oczu na oczy myszy, aby zapobiec wysuszeniu podczas znieczulenia. Nałożyć lidokainę na skórę na obwodzie nacięcia czaszki i wstrzyknąć podskórnie karprofen w dawce 5 mg/kg.
    UWAGA: Prawidłowe znieczulenie potwierdza brak odruchu prostującego i utrata reakcji na uszczypnięcie palca. W przypadku długotrwałych zabiegów chirurgicznych bardziej odpowiednie jest stosowanie środka znieczulającego do wstrzykiwań.
  2. Po zabezpieczeniu zwierzęcia w aparacie stereotaktycznym należy przyciąć skórę głowy wzdłuż krawędzi czaszki i przetrzeć powierzchnię czaszki 75% alkoholem, aby odsłonić pozycje bregmy i lambdy (patrz Rysunek 2B, ~3 min).
    UWAGA: Procedura przedoperacyjna obejmuje strzyżenie włosów, dezynfekcję miejsca operowanego, wstępną sterylizację narzędzi i narzędzi chirurgicznych.
  3. Wypoziomuj mózg i wywierć otwory (~0,8 mm) powyżej obszarów zainteresowania (ROI) za pomocą mikrowiertła. Wstrzyknąć odpowiednie wirusy za pomocą pompy strzykawkowej (patrz Rysunek 2C - F, ~20 min).
    UWAGA: Szczegółowe informacje na temat wirusów i ROI w tym badaniu znajdują się w Tabeli Materiałów i Rysunek 3.
  4. Przytrzymaj optrody z uchwytem i przesuń ich końcówkę do punktu bregma, ustawiając tę pozycję na "zero". Używając punktu bregma jako współrzędnej odniesienia, przesuń optrody do obszarów docelowych (patrz Rysunek 2G, ~3 min). Umieść optrody 0,3 mm powyżej miejsca wstrzyknięcia wirusa.
    UWAGA: W strategii implantacji pionowej minimalna odległość między dwiema elektrodami wynosi około 2 mm, w zależności od grubości tulei światłowodowej i średnicy zewnętrznej tulejki. Metoda wstawiania pod kątem może być używana do jednoczesnego nagrywania z blisko położonych obszarów.
  5. Po wprowadzeniu światłowodów do odpowiednich obszarów mózgu, nałóż niewielką ilość kleju tkankowego wokół nich, aby pokryć odsłoniętą tkankę. Następnie kolejno nałóż dodatkowy klej i trochę cementu dentystycznego. Po zestaleniu się cementu dentystycznego ostrożnie zwolnij uchwyt (patrz Rysunek 2H, ~5 min).
  6. Przed każdą nową implantacją optrody należy przeprowadzić ponowną kalibrację, która polega na powtórzeniu kroku 2.4 (patrz Rysunek 2I).
    UWAGA: Przy każdej implantacji ustaw optrodę w bregmie jako punkt "zerowy".
  7. Po wszczepieniu wszystkich optrodów wywierć otwory za punktem lambda dla "Ground" i powyżej kory nowej dla "EEG" za pomocą mikrowiertła (~1 min).
    UWAGA: Rozmiar wywierconego otworu (~1,1 mm) musi być dopasowany do średnicy.
  8. Włóż czaszkowe do otworu nad korą i za punktem lambda (patrz Rysunek 2J, ~5 min).
    UWAGA: czaszkowe służą odpowiednio do zapisu EEG i uziemienia.
  9. Uporządkuj druty wolframowe i druty emaliowane tak, aby były umieszczone nad obszarem implantacji i nie były odsłonięte na zewnątrz czaszki. Zabezpiecz pozycję złącza żeńskiego za pomocą uchwytu (patrz Rysunek 2K, ~2 min).
  10. Wypełnij miejsce implantacji cementem dentystycznym, aby zapewnić stabilne połączenie między elektrodą a czaszką. Enkapsuluj wewnętrzne przewody, pozostawiając otwory wprowadzające złącza żeńskiego odsłonięte do podłączenia do sceny czołowej (patrz Rysunek 2L, ~6 min).
  11. Po stwardnieniu cementu dentystycznego nałóż jod na skórę na całym obwodzie odsłoniętej skóry głowy, a następnie umieść zwierzę na podkładce rozgrzewającej (~1 min).
    UWAGA: Upewnij się, że zwierzę nie jest pozostawione bez opieki, dopóki nie odzyska wystarczającej przytomności, aby utrzymać pozycję leżącą mostka. Sterylne warunki powinny być utrzymywane przez cały czas trwania operacji.
  12. Podawaj antybiotyki i leki przeciwbólowe, aby wspomóc rekonwalescencję pooperacyjną.
    UWAGA: Zwierzęta, które przeszły operację, nie są ponownie wprowadzane do towarzystwa innych zwierząt, dopóki w pełni nie wyzdrowieją. Zwierzętom podawano dootrzewnowe wstrzyknięcia sodu ceftriaksonu (180 mg/kg) oraz podskórne wstrzyknięcia karprofenu (5 mg/kg), a żel lidokainy nakładano na rany chirurgiczne codziennie przez 3 dni. Zwierzęta muszą przeżyć przez wyznaczony okres, aby ukończyć testy behawioralne. Następnie zostaną poddani eutanazji przy użyciu 4%-5% izofluranu, a następnie perfuzji i przecięciu tkanek w celu oceny infekcji wirusowej i miejsc implantacji elektrod.

3. Protokół rejestracji mózgu in vivo

  1. Przed przeprowadzeniem rejestracji sygnału i testów behawioralnych (test w otwartym polu)15, upewnij się, że mysz przechodzi 3-dniowy okres delikatnego obchodzenia się z nią, aby zaaklimatyzować się w środowisku.
    UWAGA: W tym badaniu myszy umieszczono na otwartym polu (42 cm × 42 cm), aby mogły się swobodnie poruszać, co pozwoliło nam obserwować ich zachowanie napadowe.
  2. Po znieczuleniu myszy izofluranem (2%-4%), przed włożeniem sceny czołowej należy połączyć światłowody sekwencyjnie w kolejności miejsca nagrywania.
  3. Ustaw impuls świetlny 635 nm z 10% cyklem pracy przy 20 Hz. Ustaw stymulację świetlną na 10 s (200 impulsów) podczas nagrywania. Ustaw intensywność na końcówkach światłowodu na 3 mW.
  4. Użyj systemu fotometrii światłowodowej, aby zarejestrować okres testowania behawioralnego sygnałów Gcamp6m z częstotliwością próbkowania 30 Hz przez kanał LED 470 nm.
  5. Jednocześnie rejestruj sygnały wapniowe, LFP i EEG pod wpływem stymulacji optogenetycznej, wraz z odpowiadającymi im wynikami behawioralnymi (patrz Rysunek 3).
  6. Zastosuj znakowanie synchronizacji sygnału logiki tranzystor-tranzystor (TTL), aby zapewnić spójność czasową rejestrowanych danych.

4. Przetwarzanie danych

  1. Załaduj dane fotometryczne do oprogramowania MATLAB. Następnie użyj niestandardowego kodowania (plik uzupełniający 1), aby odtrendować sygnał wapniowy.
  2. Zdefiniuj zmiany intensywności fluorescencji za pomocą równania (1):
    ΔF/F = (Ft - F0)/ F0 (1)
    Gdzie Ft oznacza wartości fluorescencji sygnału wapnia w czasie rzeczywistym, a F0 oznacza uśrednioną podstawową intensywność fluorescencji przed zdarzeniem.
  3. Zaimportuj dane elektrofizjologiczne, próbkowaną częstotliwość 1000 Hz, do MATLAB (plik uzupełniający 2).
  4. Koordynuj wyświetlanie sygnalizacji wapniowej i danych elektrofizjologicznych zgodnie ze zsynchronizowanymi markerami.

Wyniki

Połączyliśmy optogenetykę z wieloregionowym zapisem elektrofizjologicznym i obrazowaniem wapnia, aby obserwować aktywność neuronalną w różnych obszarach mózgu podczas napadów wywołanych optogenetycznie. W tym celu do klasycznego miejsca epileptogennego, kory piriformowej (ROI 1)17, u gryzoni wstrzyknięto wirusa towarzyszącego adenowirusom (AAV) wykazującego ekspresję ChrimsonR pod kontrolą promotora CaMKIIα (AAV-CaMKIIα-ChrimsonR-mcherry)16. Dodatkowo AAV-hsyn-Gcamp6m18 wstrzyknięto do trzech obszarów (ROI 1-3, jak pokazano na Rysunku 3A). Następnie w tych regionach zaimplantowano wykonane na zamówienie optrody, a w przeciwległej części czaszki elektrody EEG (Rysunek 3B).

Po 4 tygodniach odnotowano wysoką ekspresję ChrimsonR i Gcamp6m w docelowych obszarach mózgu (Rycyna 3C). U myszy wystąpiły uogólnione zachowania drgawkowe po krótkiej, 10-s fotostymulacji z częstotliwością 20 Hz w celu aktywacji neuronów ChrimsonR-dodatnich. Aktywność wapniową oraz sygnały LFP z obszarów ROI u swobodnie poruszających się myszy zarejestrowano, stosując jednoczesną wielkowłóknistą fotometrię i techniki elektrofizjologiczne (Rycina 3D). Krótka stymulacja optogenetyczna wywołała w tych obszarach silne wyładowania następcze oraz znaczące wzrosty aktywności Ca2+ (Rycina 3E). W obszarze optostymulacji zaobserwowano odpowiedź o częstotliwości 30 Hz, indukowaną aktywacją białek optogenetycznych za pomocą niebieskiej diody LED przy częstotliwości próbkowania 30 Hz. W kanałach rejestrujących nie stwierdzono zakłóceń sieciowych o częstotliwości 50 Hz. Wyniki te wykazały niezawodną rejestrację zsynchronizowanych odpowiedzi elektrofizjologicznych i sygnałów wapniowych w wielu obszarach podczas stymulacji optogenetycznej.

Schemat połączenia wolframu i włókna optycznego; kontrola jakości luminescencji i metoda przewodności elektrycznej.
Rysunek 1: Schemat konstrukcyjny elastycznej optrody. (A) Przygotowanie wolframowych drutów w kształcie litery „L” oraz włókien optycznych. (B) Włókna optyczne i druty wolframowe zostały rozmieszczone na taśmie klejącej. (C) Włókno optyczne i drut wolframowy zostały sklejone za pomocą kleju. (D,E) Druty wolframowe zostały przylutowane do złącza. (F) Śruby zostały przylutowane do złącza, a następnie złącze zostało zamknięte w kapsułce za pomocą kleju na gorąco. (G) Przeprowadzono kontrolę jakości montażu optrody. G oznacza otwór dla elektrody uziemiającej; R oznacza otwór dla elektrody odniesienia. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Ustawienie chirurgiczne gryzonia do stereotaksycznego EEG, implant G/R; zaznaczone współrzędne mózgu: bregma, lambda.
Rysunek 2: Schemat operacji implantacji. (A) Myszy unieruchomiono w aparacie stereotaksycznym. (B) Usunięto skórę głowy i odpowiednio odsłonięto czaszkę. (C) Szklaną rurkę do iniekcji podłączono do pompy. (D) Głowę myszy ustawiono w pozycji poziomej. (E,F) Wywiercono otwory i wstrzyknięto wirusa. (G) Optrodę uchwycono za pomocą uchwytu. (H) Optrodę zaimplantowano w odpowiednim obszarze i przymocowano cementem stomatologicznym. (I) Ponowne ustawienie pozycji zero przed każdą implantacją. (J) Elektrody EEG zaimplantowano po implantacji optrody. G/R: elektrodę masy i elektrodę referencyjną zwarto w miejscach pinów. (K) Przewody ułożono w odpowiedniej kolejności i zamocowano złącze. (L) Urządzenie elektrodowe owinięto i przymocowano cementem stomatologicznym. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Schemat układu doświadczalnego do pomiaru aktywności neuronalnej za pomocą obrazowania Ca²⁺, EEG i LFP.
Rycina 3: Synchroniczna rejestracja elektrofizjologiczna i wapniowa in vivo. (A) Projekt doświadczalny dla iniekcji wirusowych. (B) Schemat doświadczalny implantacji optrody. (C) Obrazy konfokalne pokazujące ekspresję wirusa w obszarach docelowych. Pasek skali = 200 µm. (D) Schemat stymulacji optogenetycznej oraz synchronicznej rejestracji elektrofizjologicznej i wapniowej w stanie swobodnego poruszania się. (E) Reprezentatywne przebiegi sygnałów wapniowych (góra), LFP (środek), EEG (dół) oraz odpowiadające im spektrogramy mocy. Czerwona linia: 10 s światła. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Plik uzupełniający 1: Pliki kodowe dla sygnału wapniowego. Aby pobrać ten plik, kliknij tutaj.

Plik uzupełniający 2: Pliki kodowania dla sygnału LFP. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

W tym przypadku zastosowaliśmy samodzielnie wykonane urządzenie optrodowe do rejestrowania sygnałów neuronowych in vivo w wielu regionach. Potwierdzono wykonalność tego systemu do jednoczesnej stymulacji optogenetycznej, rejestracji sygnału wapniowego i zapisu elektrofizjologicznego. Opisana w niniejszym dokumencie metoda przygotowania elektrod jest wydajna i opłacalna. Zgodnie z eksperymentalnym planem mogliśmy rejestrować sygnały z odpowiednich obszarów mózgu. Strategiczne rozmieszczenie optrod pozwala na potencjalne wydobycie obfitych informacji z wielu regionów mózgu. Integracja paradygmatów detekcji multimodalnej daje możliwość przeanalizowania skomplikowanych obwodów neuronowych, wyjaśniając relacje między regionami mózgu.

W reprezentatywnych danych niniejszego badania zarejestrowano jednocześnie sygnały wapniowe i sygnały elektrofizjologiczne z neuronów o szerokim spektrum działania całego lokalnego obszaru mózgu. Po postępach w technologii budowy zwierząt transgenicznych19,20, połączenie myszy Cre i myszy FlpO z ekspresją wirusa Gcamp pozwala na rejestrowanie aktywności neuronalnej z określonych neuronów. W związku z tym metoda ta pozwala nam zdekodować odpowiedzi określonych neuronów w różnych regionach mózgu dzięki tym zintegrowanym podejściom. Dodatkowo, różnorodne metody analityczne będą korzystne w analizie sygnałów elektrofizjologicznych i wapniowych zebranych z wielu obszarów mózgu. Na przykład analiza koherencji i analiza przyczynowości Grangera mogą być wykorzystane do uzyskania nowych teoretycznych cech komunikacyjnych między różnymi regionami mózgu 21,22,23. Poza tym postępy w technikach śledzenia obwodów pomagają w rozwikłaniu strukturalnych połączeń między regionami mózgu24. Te zintegrowane technologie poprawiły zrozumienie powiązanych reakcji w różnych obszarach mózgu i zrewolucjonizowały zrozumienie połączeń i interakcji w obwodach i sieciach.

W niniejszej pracy zastosowaliśmy optogenetyczne modelowanie padaczki z rozpalaniem. Optogenetyka oferuje nie tylko wyższą rozdzielczość czasową, ale także zwiększoną specyficzność komórkową w porównaniu ze stymulacją elektryczną w modelu padaczki z rozpalaniem25,26. Dodatkowo umożliwia dostarczanie światła i zapis wapnia przez ten sam światłowód. Wieloregionalne detekcje aktywności i modulacje optogenetyczne uzupełnią metody interwencji w padaczce w pętli zamkniętej, umożliwiając interwencje regulacyjne w wielu regionach mózgu poprzez modulację hamującą, wzmacniając w ten sposób działanie przeciwpadaczkowe27,28. Ważne jest również, aby urządzenia te były łączone z innymi istniejącymi technologiami neuromodulacji w celu wykrywania i interwencji w pętli zamkniętej bóluprzewlekłego 29,30. Poza tym podejście to może obejmować inne zaburzenia neurologiczne, takie jak zaburzenia snu31 i choroba Alzheimera, gdzie zjawiska takie jak oscylacje 40 Hz i przetwarzanie informacji po bodźcach sensorycznych wymagają wyjaśnienia poprzez wieloregionalne zapisy in vivo 32. Dlatego umiejętne zastosowanie tego wieloaspektowego podejścia pogłębi nasze zrozumienie interakcji między wieloma regionami i dostarczy cennych informacji na temat precyzyjnych terapii w różnych chorobach.

Ta metoda wykrywania optrody ma swoje ograniczenia, które mogą zostać ulepszone w przyszłych badaniach. Podczas gdy sygnały LFP były łatwo pozyskiwane, wykrywanie aktywności szczytowej pozostawało wyzwaniem przy użyciu obecnej metody33. Naszym celem jest zastąpienie drutu wolframowego wielokanałowymi elektrodami elastycznymi. Należy dokładnie rozważyć grubość włókna i bezpieczeństwo kleju klejowego.

Oświadczenia

Autorzy deklarują, że nie mają żadnych sprzecznych interesów finansowych do ujawnienia.

Podziękowania

To badanie było wspierane przez Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (31871085), Fundację Nauk Przyrodniczych w Szanghaju (21ZR1407300), Shanghai Municipal Science and Technology Major Project (2018SHZDZX01), ZJ Lab oraz Shanghai Center for Brain Science and Brain-Inspired Technology.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Adapter 8-32PlexonNa zamówienie niestandardowePodłącz złącze żeńskie i stację czołową
AAV-CaMKIIα-ChrimsonR-mcherryTaitool BioscienceS0371-94 x 1012 VG/mL 
AAV-hsyn-Gcamp6mTaitool BioscienceS0471-94 x 1012 VG/mL 
DAPISigma 236276Titered 1:500
Cement dentystycznyNew Century Dental430205
System zapisów elektrofizjologicznychPlexonOmniplex
Drut emaliowanyNie dotyczyNiestandardowe zamówienieŚrednica = 0,2 mm
Złączeżeńskie Nie dotyczyZamówienie niestandardowePodziałka 1,25 mm
KlejLoctite45282
LaserChangchun Nowe Gałęzie PrzemysłuBH81563635 nm 
MATLABMathWorksR2021b
MicrodrillRWD78001
Wielokanałowa fotometria światłowodowaThinkerTechFPS-SS-MC-LED
ŚwiatłowódXi'an BogaoL-200UMWybierz odpowiednią długość włókna na podstawie głębokości docelowych obszarów mózgu.
Drut wolframowy powlekany PFAA-M System795500Goły 0,002"; Powlekany 0,0040 "
miernik mocyThorlabsPM100D
Stereotaxic FxrameRWD68807
Klej tkankowy3M1469SB

Bibliografia

  1. Devinsky, O., et al. Epilepsy. Nat Rev Dis Primers. 4, 18024(2018).
  2. Piper, R. J., et al. Towards network-guided neuromodulation for epilepsy. Brain. 145 (10), 3347-3362 (2022).
  3. Bertram, E. H. Neuronal circuits in epilepsy: Do they matter. Exp Neurol. 244, 67-74 (2013).
  4. Goodman, A. M., Szaflarski, J. P. Recent advances in neuroimaging of epilepsy. Neurotherapeutics. 18 (2), 811-826 (2021).
  5. Caciagli, L., Bernhardt, B. C., Hong, S. J., Bernasconi, A., Bernasconi, N. Functional network alterations and their structural substrate in drug-resistant epilepsy. Front Neurosci. 8, 411(2014).
  6. Dai, Y., et al. In vivo microelectrode arrays for detecting multi-region epileptic activities in the hippocampus in the latent period of rat model of temporal lobe epilepsy. Micromachines (Basel). 12 (6), 659(2021).
  7. Staba, R. J., Stead, M., Worrell, G. A. Electrophysiological biomarkers of epilepsy. Neurotherapeutics. 11 (2), 334-346 (2014).
  8. Grienberger, C., Giovannucci, A., Zeiger, W., Portera-Cailliau, C. Two-photon calcium imaging of neuronal activity. Nat Rev Methods Primers. 2 (1), 67(2022).
  9. Akerboom, J., et al. Optimization of a gcamp calcium indicator for neural activity imaging. J Neurosci. 32 (40), 13819-13840 (2012).
  10. Zhang, Y., et al. Fast and sensitive gcamp calcium indicators for imaging neural populations. Nature. 615 (7954), 884-891 (2023).
  11. Wu, Z., Lin, D., Li, Y. Pushing the frontiers: Tools for monitoring neurotransmitters and neuromodulators. Nat Rev Neurosci. 23 (5), 257-274 (2022).
  12. Vierock, J., et al. Bipoles is an optogenetic tool developed for bidirectional dual-color control of neurons. Nat Commun. 12 (1), 4527(2021).
  13. Luo, W., et al. Acquiring new memories in neocortex of hippocampal-lesioned mice. Nat Commun. 13 (1), 1601(2022).
  14. Armstrong, C., Krook-Magnuson, E., Oijala, M., Soltesz, I. Closed-loop optogenetic intervention in mice. Nat Protoc. 8 (8), 1475-1493 (2013).
  15. Kraeuter, A. K., Guest, P. C., Sarnyai, Z. The open field test for measuring locomotor activity and anxiety-like behavior. Methods Mol Biol. 1916, 99-103 (2019).
  16. Klapoetke, N. C., et al. Independent optical excitation of distinct neural populations. Nat Methods. 11 (3), 338-346 (2014).
  17. Vismer, M. S., Forcelli, P. A., Skopin, M. D., Gale, K., Koubeissi, M. Z. The piriform, perirhinal, and entorhinal cortex in seizure generation. Front Neural Circuits. 9, 27(2015).
  18. Chen, T. W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
  19. Birling, M. C., Dierich, A., Jacquot, S., Herault, Y., Pavlovic, G. Highly-efficient, fluorescent, locus directed cre and flpo deleter mice on a pure c57bl/6n genetic background. Genesis. 50 (6), 482-489 (2012).
  20. Huang, T., et al. Identifying the pathways required for coping behaviours associated with sustained pain. Nature. 565 (7737), 86-90 (2019).
  21. Likhtik, E., Stujenske, J. M., Topiwala, M. A., Harris, A. Z., Gordon, J. A. Prefrontal entrainment of amygdala activity signals safety in learned fear and innate anxiety. Nat Neurosci. 17 (1), 106-113 (2014).
  22. Tavares, L. C. S., Tort, A. B. L. Hippocampal-prefrontal interactions during spatial decision-making. Hippocampus. 32 (1), 38-54 (2022).
  23. Lu, Y., et al. Optogenetic dissection of ictal propagation in the hippocampal-entorhinal cortex structures. Nat Commun. 7, 10962(2016).
  24. Liu, Q., Wu, Y., Wang, H., Jia, F., Xu, F. Viral tools for neural circuit tracing. Neurosci Bull. 38 (12), 1508-1518 (2022).
  25. Christenson Wick, Z., Krook-Magnuson, E. Specificity, versatility, and continual development: The power of optogenetics for epilepsy research. Front Cell Neurosci. 12, 151(2018).
  26. Paschen, E., et al. Hippocampal low-frequency stimulation prevents seizure generation in a mouse model of mesial temporal lobe epilepsy. Elife. 9, e54518(2020).
  27. Gummadavelli, A., Zaveri, H. P., Spencer, D. D., Gerrard, J. L. Expanding brain-computer interfaces for controlling epilepsy networks: Novel thalamic responsive neurostimulation in refractory epilepsy. Front Neurosci. 12, 474(2018).
  28. Vandekerckhove, B., et al. Technological challenges in the development of optogenetic closed-loop therapy approaches in epilepsy and related network disorders of the brain. Micromachines (Basel). 12 (1), 38(2020).
  29. Li, Z. J., Zhang, L. B., Chen, Y. X., Hu, L. Advancements and challenges in neuromodulation technology: Interdisciplinary opportunities and collaborative endeavors. Sci Bull (Beijing). 68 (18), 1978-1982 (2023).
  30. Zhang, Q., et al. A prototype closed-loop brain-machine interface for the study and treatment of pain. Nat Biomed Eng. 7 (4), 533-545 (2023).
  31. Varela, C., Wilson, M. A. Mpfc spindle cycles organize sparse thalamic activation and recently active ca1 cells during non-rem sleep. Elife. 9, e48881(2020).
  32. Adaikkan, C., et al. Gamma entrainment binds higher-order brain regions and offers neuroprotection. Neuron. 102 (5), 929-943.e8 (2019).
  33. Muthmann, J. O., et al. Spike detection for large neural populations using high density multielectrode arrays. Front Neuroinform. 9, 28(2015).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

lokalne potencjały polowerejestracja wieloobszarowastymulacja optogenetycznasygnalizacja wapniowafotometria światłowodowarejestracja EEGanaliza obwodów neuronalnychmodele epilepsji
Zintegrowana metoda tworzenia elastycznych i wygodnych optymór elektrofizjologicznych do wieloregionalnego zapisu in vivo
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.