Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Generowanie i kokultura mysich pierwotnych mikrogleju i neuronów korowych

4.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/67078

⸱

26 lipca 2024

 ,  , 
1Department of Biochemistry, Microbiology & Immunology, University of Saskatchewan

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół opisuje kokulturę mikrogleju i neuronów utworzoną z pierwotnych komórek nerwowych wyizolowanych z embrionalnych zarodków myszy w 15-16 dniach embrionalnych oraz pierwotnego mikrogleju generowanego z mózgów nowonarodzonych myszy w 1-2 dniach po urodzeniu.

Streszczenie

Mikroglej to rezydujące w tkankach makrofagi ośrodkowego układu nerwowego (OUN), pełniące liczne funkcje wspierające zdrowie neuronów i homeostazę OUN. Są główną populacją komórek odpornościowych związanych z aktywnością choroby OUN, przyjmując reaktywne fenotypy, które potencjalnie przyczyniają się do uszkodzenia neuronów podczas przewlekłych chorób neurodegeneracyjnych, takich jak stwardnienie rozsiane (SM). Odrębne mechanizmy, za pomocą których mikroglej reguluje funkcje neuronów i przetrwanie podczas zdrowia i choroby, pozostają ograniczone ze względu na wyzwania związane z rozwiązaniem złożonych interakcji in vivo między mikroglejem, neuronami i innymi czynnikami środowiskowymi OUN. W związku z tym podejście in vitro polegające na jednoczesnej hodowli mikrogleju i neuronów pozostaje cennym narzędziem do badania interakcji mikrogleju z neuronami. Tutaj przedstawiamy protokół generowania i wspólnej hodowli pierwotnego mikrogleju i neuronów od myszy. W szczególności mikroglej wyizolowano po 9-10 dniach in vitro z mieszanej kultury gleju utworzonej z homogenatów mózgu pochodzących od noworodków myszy między 0-2 dniami po urodzeniu. Komórki neuronalne wyizolowano z kory mózgowej zarodków myszy między 16. a 18. dniem embrionalnym. Po 4-5 dniach in vitro komórki neuronalne wysiewano na 96-dołkowych płytkach, a następnie dodawano mikroglej w celu utworzenia kokultury. Staranny czas ma kluczowe znaczenie dla tego protokołu, ponieważ oba typy komórek muszą osiągnąć dojrzałość eksperymentalną, aby ustanowić kokulturę. Ogólnie rzecz biorąc, ta kokultura może być przydatna do badania interakcji mikrogleju i neuronów i może zapewnić wiele odczytów, w tym mikroskopię immunofluorescencyjną, obrazowanie na żywo, a także testy RNA i białek.

Wprowadzenie

Mikroglej to makrofagi rezydujące w tkankach, które ułatwiają nadzór immunologiczny i homeostazę w ośrodkowym układzie nerwowym (OUN)1,2,3. Pochodzą one z erytromieloidalnych komórek progenitorowych woreczka żółtkowego, które kolonizują mózg podczas rozwoju embrionalnego4,5,6 i są utrzymywane przez cały okres życia organizmu poprzez samoodnowę, która obejmuje proliferację i apoptozę7. W stanie stacjonarnym spoczynkowe mikroglej ma rozgałęzioną morfologię i angażuje się w nadzór nad tkankami8,9,10.

Mikroglej wykazuje ekspresję licznych receptorów na powierzchni komórek, co umożliwia im szybkie reagowanie na zmiany w OUN 11,12 oraz promowanie reakcji zapalnych w przypadku infekcji lub uszkodzenia tkanek12,13,14, a także podczas chorób neurodegeneracyjnych9,15, takie jak stwardnienie rozsiane (SM)16,17. Mikroglej wyraża również receptory dla różnych neuroprzekaźników i neuropeptydów18,19,20, co sugeruje, że mogą również reagować i regulować aktywność neuronalną21,22. Rzeczywiście, mikroglej i neurony oddziałują na siebie w różnych formach komunikacji dwukierunkowej8,23, takich jak bezpośrednie interakcje, w których pośredniczą białka błonowe lub pośrednie interakcje za pośrednictwem czynników rozpuszczalnych lub komórek pośrednich23,24.

Na przykład, różne neuroprzekaźniki wydzielane przez neurony mogą modulować neuroprotekcyjne lub zapalne działanie mikrogleju25,26,27. Dodatkowo, bezpośrednie interakcje między neuronami a mikroglejem pomagają utrzymać mikroglej w stanie homeostatycznym28. I odwrotnie, bezpośrednie interakcje mikrogleju z neuronami mogą kształtować obwody neuronalne29 i wpływać na sygnalizację neuronalną30,31,32. Ponieważ zakłócenia tych interakcji wywołują nadpobudliwość neuronów30 i reaktywność mikrogleju33,34, rozregulowane interakcje mikrogleju i neuronów są uważane za czynnik przyczyniający się do chorób neurologicznych33,35. Rzeczywiście, psychotyczne23,26 i choroby neurodegeneracyjne zostały opisane jako wykazujące dysfunkcyjne interakcje mikrogleju i neuronów33. Chociaż obserwacje te podkreślają znaczenie komunikacji mikroglej-neuronalnej w OUN, konkretne mechanizmy regulujące te interakcje regulujące funkcje mikrogleju i neuronów w zdrowiu i chorobie są stosunkowo nieznane.

W tak złożonym środowisku, jak OUN, wiele czynników środowiskowych może wpływać na interakcje mikrogleju z neuronami, co ogranicza możliwość badania przejściowych interakcji komórkowych in vivo. W tym miejscu przedstawiamy system kohodowli mikrogleju i neuronów in vitro, który można wykorzystać do badania bezpośrednich interakcji komórkowych między mikroglejem a neuronami. Protokół ten opisuje wytwarzanie pierwotnego mikrogleju i neuronów z kory nowonarodzonych myszy odpowiednio między dniami po urodzeniu 0-2 i embrionalnymi myszami 16-18. Neurony i mikroglej są następnie hodowane wspólnie na 96-dołkowych płytkach w celu przeprowadzenia eksperymentów o wysokiej przepustowości. Wcześniej zastosowaliśmy to podejście, aby wykazać, że fagocytoza mikrogleju chroni neurony przed utlenioną śmiercią komórkową za pośrednictwem fosfatydylocholiny37, co sugeruje, że ta metoda może pomóc w zrozumieniu roli mikrogleju w kontekście neurodegeneracji i stwardnienia rozsianego. Podobnie, kokultury mikrogleju i neuronów mogą być również przydatne do badania wpływu przesłuchów mikrogleju i neuronów w innych kontekstach, takich jak infekcje wirusowe38 lub uszkodzenie i naprawa neuronów39. Ogólnie rzecz biorąc, systemy kohodowli mikrogleju i neuronów in vitro umożliwiają naukowcom badanie interakcji mikrogleju i neuronów w kontrolowanym i manipulowanym środowisku, co uzupełnia modele in vivo.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie zwierzęta użyte w tym badaniu były trzymane i traktowane za zgodą Uniwersyteckiego Komitetu Opieki nad Zwierzętami (UACC) Uniwersytetu Saskatchewan i Kanadyjskiej Rady ds. Opieki nad Zwierzętami (CCAC). W tym badaniu wykorzystano w tym badaniu samce i samice myszy CD1 w dniach pourodzeniowych 0-2 oraz zarodki embrionalne 16-18 dni (E16-18) od ciężarnych myszy CD1. Szczegółowe informacje na temat odczynników i używanego sprzętu są wymienione w Tabeli materiałów.

1. Pierwotna hodowla mikrogleju

UWAGA: Kluczowe jest, aby mieszany glej i hodowle neuronów były tak dobrane, aby mikroglej był dojrzały i gotowy do zbioru w ciągu 2 dni po umieszczeniu neuronów na 96-dołkowej płytce.

  1. preparat
    1. Wstępnie podgrzej kompletną pożywkę do hodowli gleju, która zawiera zmodyfikowaną pożywkę Eagle (DMEM) firmy Dulbecco o wysokiej zawartości glukozy uzupełnioną 10% inaktywowaną termicznie płodową surowicą bydlęcą, 50 U/ml penicyliny/streptomycyny z 2,92 mg/ml L-glutaminy, 1 mM pirogronianu sodu, 1x aminokwasy endogenne i 20 mM HEPES w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.
    2. Dodać 5 ml bromowodorku poli-L-ornityny (PO) o stężeniu 10 μg/ml do każdej kolby T-75. Delikatnie obracać kolbą, aby upewnić się, że PO całkowicie zakrywa dno kolby. Inkubować w temperaturze 37 °C w inkubatorze o stężeniu 5%CO2 przez co najmniej 1 h.
      UWAGA: Ten etap powlekania jest wymagany, aby ułatwić przyleganie komórek do kolb T-75.
  2. Izolacja mózgów od nowonarodzonych myszy P0-P2
    UWAGA: Wysterylizuj wszystkie narzędzia do preparowania i utrzymuj sterylność odczynników. Upewnij się, że przez cały czas przestrzegasz technik aseptycznych.
    1. Przed rozpoczęciem sekcji spryskaj blat 70% etanolem lub sprayem dezynfekującym w miejscu, w którym będzie miała miejsce sekcja. Ustaw mikroskop preparacyjny i umieść szalkę Petriego pod mikroskopem. Wlej 20 ml pożywki L-15 Leibovitz na szalkę Petriego. Pokrywę szalki Petriego należy założyć, gdy mikroskop nie jest używany, aby zmniejszyć zanieczyszczenie.
    2. Połóż kilka warstw ręcznika papierowego i dokładnie spryskaj ręczniki papierowe 70% etanolem. Przygotuj narzędzia do preparowania (nożyczki do preparowania, parę mikrokleszczy i kleszczyki do tkanek), dokładnie spryskując je 70% etanolem i kładąc narzędzia na ręcznikach papierowych.
    3. Przenieś mysz 0-2 dni po porodzie na ręczniki papierowe i dokładnie spryskaj mysz 70% etanolem. Odetnij głowę myszy za pomocą nożyczek preparacyjnych (zgodnie z instytucjonalnie zatwierdzonymi protokołami).
    4. Delikatnie trzymając głowę, wykonaj nacięcie w linii środkowej czaszki, zaczynając od szyi do nosa. Oderwij czaszkę za pomocą kleszczy tkankowych, aby odsłonić mózg.
    5. Za pomocą kleszczy tkankowych delikatnie zgarnij mózg, wkładając kleszcze pod mózg i podnieś mózg z głowy. Natychmiast umieść mózg na szalce Petriego zawierającej 20 ml pożywki L-15 Leibovitza.
    6. Pod mikroskopem preparacyjnym ostrożnie usuń pień mózgu i opony mózgowe za pomocą pary mikrokleszczy. Zbierz mózgi do stożkowej probówki o pojemności 50 ml zawierającej 5 ml pożywki L-15 firmy Leibovitz.
  3. Dysocjacja mózgu, wysiew i utrzymanie mieszanej kultury gleju
    UWAGA: Wszystkie kolejne kroki należy wykonać w komorze bezpieczeństwa biologicznego.
    1. Zmiel mózgi na około 1 mm2 kawałki za pomocą sterylnego jednorazowego ostrza skalpela. Ostrożnie przenieś zmielone mózgi do nowej sterylnej probówki o pojemności 50 ml.
    2. Do zmielonych mózgów dodać końcowe stężenie 0,25% trypsyny i inkubować tkankę w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C przez 20 minut. Co 2-3 minuty mieszaj roztwór, delikatnie odwracając rurkę, aby wspomóc dysocjację tkanek.
    3. Z inkubatora o stężeniu 5% CO2 przenieść kolby T-75 zawierające 5 ml PO do komory bezpieczeństwa biologicznego. Wyrzucić PO i przepłukać kolby 3 razy sterylnym 1x roztworem buforu fosforanowego (PBS). Upewnij się, że kolby zostały dokładnie wypłukane, ponieważ nadmiar PO jest toksyczny dla komórek.
    4. Przetrawioną tkankę przenieść z łaźni wodnej o temperaturze 37 °C do komory bezpieczeństwa biologicznego. Dodaj 5 ml kompletnej pożywki do hodowli gleju, aby zneutralizować trypsynę. Delikatnie wymieszać zawiesinę tkankową za pomocą pipety o pojemności 10 ml.
    5. Umieść sterylne sitko z nylonową siatką o grubości 70 μm na sterylnej stożkowej probówce o pojemności 50 ml i zwilż siatkę, wlewając około 5 ml L-15. Ostrożnie zdekantować zawiesinę komórek przez sitko do komórek. Wyjąć tłok ze sterylnej strzykawki o pojemności 1 ml, zmielić tkankę na siatkę za pomocą tłoka, aby pozbyć się grudek tkanek i wytworzyć homogenizowaną zawiesinę komórkową.
    6. Okresowo wlewaj około 5 ml podłoża L-15 firmy Leibovitz do siatki nylonowej o grubości 70 μm i kontynuuj mielenie tkanki na siatce za pomocą tłoka strzykawki o pojemności 1 ml. Gdy na siatce pozostaje niewiele widocznej tkanki lub nie ma jej wcale, wyrzuć siatkę i odłóż zawiesinę komórek na bok.
    7. Wymieszać zawiesinę komórkową, delikatnie pipetując w górę i w dół. Do każdej kolby dodać równe objętości zawiesiny komórkowej zawierającej 1-2 mózgi z pożywką do hodowli gleju do końcowej objętości 15 ml.
    8. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C w inkubatorze o stężeniu 5% CO2 przez noc. Następnego dnia umyj kolby dwukrotnie sterylnym 1x PBS, aby usunąć nieprzyłączone komórki i zanieczyszczenia.
    9. Dodać do kultury 15 ml świeżej, kompletnej pożywki do hodowli gleju i inkubować w temperaturze 37 °C w inkubatorze o stężeniu 5% CO2 . Po 3 dniach zmień połowę pożywki na 10 ml świeżej pożywki do hodowli gleju uzupełnionej 40 ng/ml czynnika stymulującego tworzenie kolonii makrofagów (MCSF).
      UWAGA: Następnie połowę pożywki zastępuje się 10 ml świeżej pożywki do hodowli gleju uzupełnionej 40 ng/ml MCSF co 3 dni. Kultura jest utrzymywana przez 8-10 dni przed zbiorem mikrogleju.

2. Pierwotna hodowla neuronów

  1. preparat
    1. Rozmrozić B-27 plus suplement z B-27 plus system hodowli neuronów. Wstępnie ogrzane podłoże neurobaseal plus z systemu hodowli neuronów B-27 plus, 1x Zbilansowany roztwór soli Hanka (HBSS) i inaktywowana termicznie płodowa surowica bydlęca (FBS) w temperaturze 37 °C w łaźni wodnej.
    2. Pokryć kolby T-25 5 ml 10 μg/ml PO i inkubować kolby przez co najmniej 1 godzinę w temperaturze 37 °C. Przygotować narzędzia i materiały do sekcji.
      UWAGA: Ten etap powlekania ułatwia przyleganie komórek do kolb T-25.
  2. Izolacja mózgu z zarodków myszy E16-E18
    UWAGA: Wysterylizuj wszystkie narzędzia do preparowania i utrzymuj sterylność odczynników. Upewnij się, że przez cały czas przestrzegasz technik aseptycznych.
    1. Przed rozpoczęciem sekcji spryskaj blat 70% etanolem lub sprayem dezynfekującym w miejscu, w którym będzie miała miejsce sekcja. Ustaw mikroskop preparacyjny i umieść szalkę Petriego pod mikroskopem. Wlej 20 ml 1x HBSS na szalkę Petriego. Pokrywę szalki Petriego należy założyć, gdy mikroskop nie jest używany, aby zmniejszyć zanieczyszczenie.
    2. Połóż kilka warstw ręcznika papierowego i dokładnie spryskaj ręczniki papierowe 70% etanolem. Przygotuj narzędzia do preparowania (nożyczki sprężynowe, parę mikrokleszczy i kleszczyki do tkanek), dokładnie spryskując je 70% etanolem i kładąc narzędzia na ręcznikach papierowych.
    3. Znieczulić ciężarną mysz między 16 a 18 dniem ciąży za pomocą izofluranu i poddać mysz eutanazji przez zwichnięcie szyjki macicy (zgodnie z instytucjonalnie zatwierdzonymi protokołami).
    4. Połóż mysz na plecach na kawałku ręcznika papierowego nasączonego 70% etanolem. Zdezynfekuj okolice brzucha 70% etanolem. Podnieś skórę dolnej części brzucha za pomocą kleszczy tkankowych i wykonaj nacięcie w kształcie litery V od tego miejsca do dolnej klatki piersiowej za pomocą nożyczek preparacyjnych.
    5. Chwyć rogi macicy zawierające zarodki za pomocą kleszczyków tkankowych i delikatnie usuń zarodki z jamy brzusznej. Krótko zdezynfekuj rogi macicy zawierające zarodki 70% etanolem.
    6. Wypreparuj jeden zarodek z jego pojedynczego woreczka na raz. Za pomocą nożyczek sprężynowych wykonaj nacięcie w linii środkowej na szczycie czaszki, zaczynając od tyłu szyi do nosa. Następnie unieś czaszkę z dala od miejsca nacięcia, aby odsłonić mózg. Delikatnie zgarnij mózg kleszczami tkankowymi i przenieś mózg na 10 cm szalkę Petriego zawierającą 15 ml 1x HBSS.
    7. Pod mikroskopem preparacyjnym ostrożnie usuń pień mózgu i opony mózgowe po obu stronach kory mózgowej za pomocą pary mikrokleszczy. Przenieś korę mózgową do stożkowej probówki o pojemności 50 ml zawierającej 10 ml 1x HBSS i umieść na lodzie.
  3. Dysocjacja mózgu i wysiewanie neuronów korowych w hodowli komórkowej
    UWAGA: Wszystkie kolejne kroki należy wykonać w komorze bezpieczeństwa biologicznego.
    1. Zmiel mózgi na około 1 mm2 kawałki w stożkowej probówce o pojemności 50 ml ze sterylnym jednorazowym ostrzem skalpela. Przenieś zmielone mózgi do nowej sterylnej stożkowej probówki o pojemności 50 ml.
    2. Dodaj trypsynę do probówki o końcowym stężeniu 0,25%. Zanurz probówkę w gorącej łaźni wodnej o temperaturze 35-38 °C na 15 minut i delikatnie mieszaj probówkę w celu homogenizacji tkanki co 2-3 minuty.
    3. Wyjmij rurkę z gorącej kąpieli wodnej. Delikatnie pipetuj zawiesinę tkankową w górę iw dół, aby jeszcze bardziej dysocjować komórki, a następnie dodaj 0,5 ml inaktywowanego termicznie FBS do homogenizowanej zawiesiny, aby zneutralizować aktywność trypsyny. Unikaj pęcherzyków powietrza, aby zminimalizować toksyczność dla komórek neuronalnych.
    4. Umieść sterylne sitko do komórek z nylonowej siatki o wielkości 70 μm na sterylnej stożkowej probówce o pojemności 50 ml i zwilż siatkę, dodając około 5 ml pożywki neuropodstawnej. Przefiltruj zawiesinę komórek przez sitko z siatki nylonowej o średnicy 70 μm. Za pomocą tłoka strzykawki o pojemności 1 ml delikatnie zmielić tkankę na sitko do komórek. Okresowo wlewaj około 5 ml 1x HBSS, kontynuując mielenie, aby umyć sitko do komórek.
    5. Odwirować stożkową probówkę o masie 300 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. W tym czasie rozcieńczyć suplement B-27 plus w pożywce neurobasel plus do 1x końcowego stężenia, aby użyć jako kompletnej pożywki neurobazalnej.
    6. Wyrzucić PO do kolb T-25 i przepłukać kolby trzykrotnie 5 ml 1x PBS.
    7. Ostrożnie zdekantować w celu usunięcia supernatantu i ponownego zawieszenia osadu komórkowego, delikatnie pipetując w górę iw dół 2-3 ml kompletnego podłoża neuropodstawnego. Określ stężenie komórek i całkowitą liczbę komórek za pomocą hemocytometru i błękitu trypanowego. Spodziewaj się do 1,0 x 107 komórek na zarodek.
    8. Umieścić komórki w kolbach T-25 pokrytych PO około 2,0 x 107 komórek na kolbę w 5 ml kompletnego podłoża neuropodstawowego. Inkubować hodowlę komórkową w temperaturze 37 °C w inkubatorze o stężeniu 5% CO2 .
    9. Wykonuj połówkową wymianę pożywki co 2-3 dni, zastępując 2,5 ml pożywki z kolby hodowlanej świeżo przygotowanym kompletnym podłożem nerwowo-podstawnym.

3. Współkultura pierwotnych neuronów i mikrogleju

UWAGA: Wszystkie kolejne kroki należy wykonać w sterylnej komorze bezpieczeństwa biologicznego.

  1. Wysiewanie neuronów w 96-dołkowych płytkach
    1. Dodać 100 μl 10 μg/ml PO do studzienki i inkubować kolby przez co najmniej 1 godzinę w temperaturze 37 °C w celu pokrycia studzienek PO. Umyj płytkę 1x PBS 3 razy przed wysiewem komórek i odessaj pozostały płyn po ostatnim myciu.
    2. Neurony wyhodowane w kolbach T-25 są zbierane do wspólnej hodowli po 2-5 dniach w hodowli. Zastąp pożywkę 5 ml 1x roztworu Versene z 0,25% trypsyną i 1 mg/ml DNazy I, aby odłączyć neurony od kolby. Umieść kolby w inkubatorze na 5-6 minut w celu roztrawienia i delikatnie obracaj kolbę co 2-3 minuty, aby ułatwić oddzielenie komórek.
    3. Wyjąć kolbę z inkubatora i sprawdzić, czy komórki są oderwane pod mikroskopem. Dodaj 0,5 ml inaktywowanego termicznie FBS, aby zneutralizować trypsynę i DNazę I. Przenieś komórki do stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Przemyj kolbę 5 ml kompletnego podłoża neurobazalnego raz, aby zmaksymalizować zebrane neurony. Zbierz wszystkie komórki w tej samej stożkowej probówce o pojemności 15 ml.
    4. Odwirować zawiesinę komórkową o sile 300 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant i delikatnie zawiesić osad komórkowy w 2-3 ml kompletnego podłoża nerwowo-podstawowego.
    5. Policz komórki za pomocą hemocytometru i dodaj kompletne podłoże neuropodstawne, aby osiągnąć końcowe stężenie 7,5 x 105 neuronów / ml. Zasiać 100 μl zawiesiny komórkowej do każdego dołka w 96-dołkowej płytce pokrytej PO, aby uzyskać 7,5 x 104 neuronów / dołek. Oczekuje się, że wydajność wyniesie 5-6 milionów neuronów na kolbę.
    6. Inkubuj neurony na 96-dołkowej płytce przez noc. Następnego dnia dodać 100 μl kompletnych pożywek neurobazalnych do każdego dołka.
      UWAGA: Gdy neurony wykazują odpowiedni wzrost procesu neurytowego (około 3-4 dnia po wysianiu na 96-dołkowych płytkach), są gotowe do kohodowli z mikroglejem.
  2. Izolacja i kokultura mikrogleju i neuronów
    1. Między 8-10 dniami mieszanej hodowli gleju należy zebrać mikroglej, delikatnie myjąc kolby T-75 pożywką do hodowli gleju w każdej kolbie za pomocą pipety o pojemności 10 ml i przenieść komórki i pożywkę do sterylnej stożkowej probówki o pojemności 50 ml. Ponownie umyć kolby 10 ml świeżej pożywki do hodowli gleju w celu odłączenia dodatkowego mikrogleju od kolb i zebrania pożywki. Oczekuje się wydajności 7,5 x 105 mikrogleju z kolby.
    2. Do każdej kolby dodać 20 ml świeżej pożywki do hodowli gleju uzupełnionej 20 ng/ml MCSF. Mikroglej można zbierać jeszcze raz lub dwa razy, jeśli zachowana jest mieszana kultura gleju.
    3. Odwirować zbiór komórek przy stężeniu 300 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Ostrożnie usunąć supernatant i delikatnie zawiesić osad w 2 ml kompletnego podłoża nerwowo-podstawowego.
    4. Policz komórki za pomocą hemocytometru i błękitu trypanowego. Dodać kompletne podłoże neurobazalne do końcowego stężenia 2,5 x 105 komórek/ml.
    5. Z 96-dołkowej płytki hodowli neuronalnej usuń 100 μl pożywki neuropodstawowej i dodaj 100 μl zawiesiny komórek 2,5 x 105 komórek/ml do wysiewu 2,5 x 104 mikrogleju na dołek 7,5 x 104 neuronów. Inkubować kulturę przez noc w temperaturze 37 °C w inkubatorze o stężeniu 5% CO2 , aby umożliwić osiedlenie się mikrogleju. Kokultura może być teraz wykorzystywana do dalszych eksperymentów.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Schemat blokowy przedstawiający kluczowe etapy hodowli mieszanej gleju w celu pozyskania mikrogleju znajduje się na Rysunku 1A. Ogólnie, w 1. dniu spodziewane jest wystąpienie nielicznych komórek oraz nadmiaru debris komórkowego (Rysunek 1B). Do 4. dnia powinna zostać zaobserwowana zwiększona liczba komórek, zwłaszcza w wyniku generowania adherentnych astrocytów, co objawia się ich wydłużoną morfologią (Rysunek 1C). Nieliczne komórk...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W artykule opisano protokół izolacji i hodowli pierwotnych neuronów myszy i pierwotnego mikrogleju, które są następnie wykorzystywane do ustanowienia kokultury mikrogleju i neuronów, którą można wykorzystać do badania, w jaki sposób interakcje mikrogleju i neuronów regulują ich zdrowie i funkcję komórkową. To stosunkowo proste i przystępne podejście może dostarczyć krytycznych informacji na temat mechanizmów i funkcjonalnych wyników interakcji neuronów mikrogleju w OUN.

Aby osiągnąć optymalną ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Podziękowania

JP dziękuje za wsparcie finansowe ze strony Kanadyjskiej Rady ds. Badań Nauk Przyrodniczych i Inżynierii oraz University of Saskatchewan College of Medicine. YD dziękuje za wsparcie finansowe ze strony University of Saskatchewan College of Medicine Startup Fund, Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada Discovery Grant (RGPIN-2023-03659), MS Canada Catalyst Grant (1019973), Saskatchewan Health Research Foundation Establishment Grant (6368) oraz Brain Canada Foundation Future Leaders in Canadian Brain Research Grant. Rysunki 1A, Rysunki 2A i Rysunki 3A zostały utworzone za pomocą BioRender.com.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Szalka Petriego 10 cm Rybacy 07-202-011Sterylny
1x VerseneGibco15040-066
B-27 Plus System do hodowli neuronów Gibco 
Mikroskop preparacyjnyVWR
DNase IRoche11284932001
Dulbecco" s Zmodyfikowana pożywka Eagle (DMEM)Gibco11960-044
Surowica bydlęca ThermoFisher Sci12483-020
HBSS (10x)Gibco14065-056
HemacytometrHausser Scientific1475
HEPES ThermoFisher Sci15630080
Leibovitz' s L-15 Średni (1x)Fisher Scientific 
Czynnik stymulujący tworzenie kolonii makrofagów Peprotech315-02
Kleszcze mikrokleszoweRWDF11020-11Autoklawowane/sterylne
aminokwasy endogenneCytivaSH3023801
PBS (10x)ThermoFisher SciAM9625
Penicylina Streptomycyna Glutamina (100x)Gibco103780-16
Bromowodorek poli-L-ornityny SigmaP3655-100MG
Pirogronian sodu (100 mM)Gibco11360-070
Nożyczki sprężynoweRWDS11008-42Autoklawowane/sterylne
Ostrze chirurgiczneFeather08-916-5DSterylne
kolby T-25Kolby Fisher10-126-9
T-75 Fisher13-680-65
Kleszczyki do tkanekCodman30-4218Autoklawowane/sterylne
nożyczki do tkanekRWDS12052-10Autoklawowane/sterylne
Trypan Blue Thermofisher Sci 15250-061
Trypsyna (2,5%)ThermoFisher Sci15090046
Szerokokątny mikroskop immunofluorescencyjnyZeiss
A365340121083027

Bibliografia

  1. Yin, J., Valin, K. L., Dixon, M. L., Leavenworth, J. W. The role of microglia and macrophages in CNS homeostasis, autoimmunity, and cancer. J Immunol Res. 2017, 1-12 (2017).
  2. Colonna, M., Butovsky, O. Microglia function in the central nervous system during health and neurodegeneration. Annu Rev Immunol. 35 (1), 441-468 (2017).
  3. Ginhoux, F., Prinz, M. Origin of microglia: Current concepts and past controversies. Cold Spring Harb Perspect Biol. 7 (8), a020537(2015).
  4. Dermitzakis, I., et al. Origin and emergence of microglia in the CNS-an interesting (hi)story of an eccentric cell. Curr Issues Mol Biol. 45 (3), 2609-2628 (2023).
  5. Ransohoff, R. M., Cardona, A. E. The myeloid cells of the central nervous system parenchyma. Nature. 468 (7321), 253-262 (2010).
  6. Ginhoux, F., et al. Fate mapping analysis reveals that adult microglia derive from primitive macrophages. Science. 330 (6005), 841-845 (2010).
  7. Askew, K., et al. Coupled proliferation and apoptosis maintain the rapid turnover of microglia in the adult brain. Cell Rep. 18 (2), 391-405 (2017).
  8. Vidal-Itriago, A., et al. Microglia morphophysiological diversity and its implications for the CNS. Front Immunol. 13, 997786(2022).
  9. Wendimu, M. Y., Hooks, S. B. Microglia phenotypes in aging and neurodegenerative diseases. Cells. 11 (13), 2091(2022).
  10. Hanisch, U. K., Kettenmann, H. Microglia: Active sensor and versatile effector cells in the normal and pathologic brain. Nat Neurosci. 10 (11), 1387-1394 (2007).
  11. Colonna, M., Butovsky, O. Microglia function in the central nervous system during health and neurodegeneration. Annu Rev Immunol. 35 (1), 441-468 (2017).
  12. Zhao, J. F., et al. Research progress on the role of microglia membrane proteins or receptors in neuroinflammation and degeneration. Front Cell Neurosci. 16, 831977(2022).
  13. Yang, I., Han, S. J., Kaur, G., Crane, C., Parsa, A. T. The role of microglia in central nervous system immunity and glioma immunology. J Clin Neurosci. 17 (1), 6-10 (2010).
  14. Jurga, A. M., Paleczna, M., Kuter, K. Z. Overview of general and discriminating markers of differential microglia phenotypes. Front Cell Neurosci. 14, 198(2020).
  15. Doens, D., Fernández, P. L. Microglia receptors and their implications in the response to amyloid β for Alzheimer's disease pathogenesis. J Neuroinflammation. 11 (1), 48(2014).
  16. Block, M. L., Zecca, L., Hong, J. S. Microglia-mediated neurotoxicity: Uncovering the molecular mechanisms. Nat Rev Neurosci. 8 (1), 57-69 (2007).
  17. Fischer, M. T., et al. NADPH oxidase expression in active multiple sclerosis lesions in relation to oxidative tissue damage and mitochondrial injury. Brain. 135 (3), 886-899 (2012).
  18. Marinelli, S., Basilico, B., Marrone, M. C., Ragozzino, D. Microglia-neuron crosstalk: Signaling mechanism and control of synaptic transmission. Semin Cell Dev Biol. 94, 138-151 (2019).
  19. Pocock, J. M., Kettenmann, H. Neurotransmitter receptors on microglia. Trends Neurosci. 30 (10), 527-535 (2007).
  20. Carniglia, L., et al. Neuropeptides and microglial activation in inflammation, pain, and neurodegenerative diseases. Mediators Inflamm. 2017, 5048616(2017).
  21. Zhao, S., Umpierre, A. D., Wu, L. J. Tuning neural circuits and behaviors by microglia in the adult brain. Trends Neurosci. 47 (3), 181-194 (2024).
  22. Kettenmann, H., Kirchhoff, F., Verkhratsky, A. Microglia: New roles for the synaptic stripper. Neuron. 77 (1), 10-18 (2013).
  23. Haidar, M. A., et al. Crosstalk between microglia and neurons in neurotrauma: An overview of the underlying mechanisms. Curr Neuropharmacol. 20 (11), 2050-2065 (2022).
  24. Cserép, C., Pósfai, B., Dénes, Á Shaping neuronal fate: Functional heterogeneity of direct microglia-neuron interactions. Neuron. 109 (2), 222-240 (2021).
  25. Pocock, J. M., Kettenmann, H. Neurotransmitter receptors on microglia. Trends Neurosci. 30 (10), 527-535 (2007).
  26. Eyo, U. B., Wu, L. J. Bidirectional microglia-neuron communication in the healthy brain. Neural Plast. 2013, 456857(2013).
  27. Strosznajder, J. B., Czapski, G. A. Glutamate and GABA in microglia-neuron cross-talk in Alzheimer's disease. Int J Mol Sci. 22 (21), 11677(2021).
  28. Lyons, A., et al. CD200 ligand-receptor interaction modulates microglial activation in vivo and in vitro A role for IL-4. J Neurosci. 27 (31), 8309-8313 (2007).
  29. Wake, H., Moorhouse, A. J., Miyamoto, A., Nabekura, J. Microglia: Actively surveying and shaping neuronal circuit structure and function. Trends Neurosci. 36 (4), 209-217 (2013).
  30. Merlini, M., et al. Microglial Gi-dependent dynamics regulate brain network hyperexcitability. Nat Neurosci. 24 (1), 19-23 (2021).
  31. Chen, Z., et al. Microglial displacement of inhibitory synapses provides neuroprotection in the adult brain. Nat Commun. 5 (1), 4486(2014).
  32. Cantaut-Belarif, Y., et al. Microglia control the glycinergic but not the GABAergic synapses via prostaglandin E2 in the spinal cord. J Cell Biol. 216 (9), 2979-2989 (2017).
  33. Szepesi, Z., Manouchehrian, O., Bachiller, S., Deierborg, T. Bidirectional microglia-neuron communication in health and disease. Front Cell Neurosci. 12, 323(2018).
  34. Chamera, K., Trojan, E., Szuster-Głuszczak, M., Basta-Kaim, A. The potential role of dysfunctions in neuron-microglia communication in the pathogenesis of brain disorders. Curr Neuropharmacol. 18 (5), 408-430 (2020).
  35. Gao, C., Jiang, J., Tan, Y., Chen, S. Microglia in neurodegenerative diseases: Mechanism and potential therapeutic targets. Signal Transduct Target Ther. 8 (1), 359(2023).
  36. Brisch, R., et al. The role of microglia in neuropsychiatric disorders and suicide. Eur Arch Psychiatry Clin Neurosci. 272 (6), 929-945 (2022).
  37. Dong, Y., et al. Oxidized phosphatidylcholines found in multiple sclerosis lesions mediate neurodegeneration and are neutralized by microglia. Nat Neurosci. 24 (4), 489-503 (2021).
  38. Alvarez-Carbonell, D., et al. Cross-talk between microglia and neurons regulates HIV latency. PLoS Pathog. 15 (12), e1008249(2019).
  39. Lorenzen, K., et al. Microglia induce neurogenic protein expression in primary cortical cells by stimulating PI3K/AKT intracellular signaling in vitro. Mol Biol Rep. 48 (1), 563-584 (2021).
  40. Güler, B. E., Krzysko, J., Wolfrum, U. Isolation and culturing of primary mouse astrocytes for the analysis of focal adhesion dynamics. STAR Protoc. 2 (4), 100954(2021).
  41. Tomassoni-Ardori, F., Hong, Z., Fulgenzi, G., Tessarollo, L. Generation of functional mouse hippocampal neurons. Bio Protoc. 10 (15), e3702(2020).
  42. Viviani, B. Preparation and coculture of neurons and glial cells. Curr Protoc Cell Biol. Chapter 2 (Unit 2.7), (2006).
  43. Roqué, P. J., Costa, L. G. Co-culture of neurons and microglia. Curr Protoc Toxicol. 74, 11.24.1-11.24.17 (2017).
  44. Goshi, N., Morgan, R. K., Lein, P. J., Seker, E. A primary neural cell culture model to study neuron, astrocyte, and microglia interactions in neuroinflammation. J Neuroinflammation. 17 (1), 155(2020).
  45. Carroll, J. A., Foliaki, S. T., Haigh, C. L. A 3D cell culture approach for studying neuroinflammation. J Neurosci Methods. 358, 109201(2021).
  46. Baxter, P. S., et al. Microglial identity and inflammatory responses are controlled by the combined effects of neurons and astrocytes. Cell Rep. 34 (12), 108882(2021).
  47. Luchena, C., et al. A neuron, microglia, and astrocyte triple co-culture model to study Alzheimer's disease. Front Aging Neurosci. 14, 844534(2022).
  48. Park, J., et al. A 3D human triculture system modeling neurodegeneration and neuroinflammation in Alzheimer's disease. Nat Neurosci. 21 (7), 941-951 (2018).
  49. Vahsen, B. F., et al. Human iPSC co-culture model to investigate the interaction between microglia and motor neurons. Sci Rep. 12 (1), 12606(2022).
  50. Giacomelli, E., et al. Human stem cell models of neurodegeneration: from basic science of amyotrophic lateral sclerosis to clinical translation. Cell Stem Cell. 29 (1), 11-35 (2022).
  51. Yong, V. W. Microglia in multiple sclerosis: protectors turn destroyers. Neuron. 110 (21), 3534-3548 (2022).
  52. Kamma, E., Lasisi, W., Libner, C., Ng, H. S., Plemel, J. R. Central nervous system macrophages in progressive multiple sclerosis: relationship to neurodegeneration and therapeutics. J Neuroinflammation. 19 (1), 45(2022).
  53. Dong, Y., Lozinski, B. M., Silva, C., Yong, V. W. Studying the microglia response to oxidized phosphatidylcholine in primary mouse neuron culture and mouse spinal cord. STAR Protoc. 2 (4), 100853(2021).
  54. Anderson, S. R., et al. Neuronal apoptosis drives remodeling states of microglia and shifts in survival pathway dependence. eLife. 11, e76564(2022).
  55. Harry, G. J., McPherson, C. A. Microglia: Neuroprotective and neurodestructive properties. Handbook of Neurotoxicity. , 109-132 (2014).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

Współhodowla mikrogleju i neuronówhodowla mieszana glejuizolacja homogenatu mózgumikroskopia immunofluorescencyjnaobrazowanie żywych komórekanalizy RNAanalizy białekinterakcje neuronów z mikroglejem
Generowanie i kokultura mysich pierwotnych mikrogleju i neuronów korowych
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.