Artykuł metodologiczny

Zrozumienie rozwoju szlaków kompensacyjnych u zmutowanego pasożyta malarii zawierającego hipomorficzny allel kinaz roślinopodobnych

1.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/67079

⸱

22 listopada 2024

 ,  ,  ,  , 
1Cellular and Molecular Parasitology Laboratory, School of Life Sciences, Jawaharlal Nehru University, 2Laboratory of Malaria and Vector Research and National Institutes of Allergy and Infectious Diseases, National Institutes of Health

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Genetyka chemiczna polega na zastąpieniu reszty strażnika aminokwasem zawierającym inny łańcuch boczny w docelowym locus. W tym przypadku wygenerowaliśmy zmutowanego pasożyta zawierającego hipomorficzny allel cdpk1 i zidentyfikowaliśmy szlaki kompensacyjne przyjęte przez pasożyta na tle mutacji.

Streszczenie

Jednym z mechanizmów osłabiania działania leków przez pasożyta malarii jest zmiana jego transkryptomu. Efekt ten jest bardziej wyraźny w przypadku genów docelowych należących do rodziny wielogenowej. Kinazy białkowe Plasmodium falciparum należące do rodziny CDPK są niezbędne do rozwoju krwi. W związku z tym CDPK są uważane za dobre cele dla rozwoju związków przeciwmalarycznych. Podejście oparte na genetyce chemicznej było historycznie stosowane do wyjaśnienia funkcji kinaz białkowych u wyższych eukariontów. Wymaga to zastąpienia reszty strażnika innym aminokwasem o innym łańcuchu bocznym poprzez manipulację genetyczną. Substytucja aminokwasów w pozycji strażnika moduluje aktywność kinazy białkowej i zmienia jej podatność na określoną klasę związków znanych jako inhibitory kinaz uderzeniowych (BKI), które pomagają w funkcjonalnej identyfikacji docelowego genu. W tym miejscu wykorzystaliśmy podejście genetyki chemicznej, aby zrozumieć mechanizmy kompensacyjne wyewoluowane przez zmutowanego pasożyta zawierającego hipomorficzny allel cdpk1. Ogólnie rzecz biorąc, nasze podejście pomaga w identyfikacji szlaków kompensacyjnych, które mogą być jednocześnie ukierunkowane w celu zapobiegania rozwojowi lekooporności na poszczególne kinazy.

Wprowadzenie

Malaria jest jedną z głównych chorób zakaźnych, która jest odpowiedzialna za miliony zgonów każdego roku, szczególnie u dzieci poniżej 5 roku życia1. Nie ma klinicznie dostępnej szczepionki przeciwko malarii. Co więcej, Plasmodium falciparum, najbardziej śmiercionośny pasożyt malarii u ludzi, jest znany z tego, że nabył oporność na lek pierwszej linii o nazwie artemizynina2,3,4,5. Istnieje pilna potrzeba zidentyfikowania nowych celów leków i nowatorskich strategii, które można szybko wdrożyć, aby uniknąć rozprzestrzeniania się oporności na artemizyninę na całym świecie. Lepsze zrozumienie mechanizmu działania leków i molekularnych podstaw szlaków kompensacyjnych może pomóc w opracowaniu lepszych strategii zapobiegania rozwojowi oporności na leki.

Kinazy białkowe należące do rodziny kinaz białkowych zależnych od wapnia (CDPKs) są kluczowe na wielu etapach rozwoju pasożyta w fazie erytrocytowej, płciowej i pre-erytrocytarnej6. Podczas replikacji bezpłciowej P. falciparum, CDPK5 jest znany z tego, że odgrywa kluczową rolę w wychodzeniu merozoitów z dojrzałych schizonts7. Warunkowa delecja CDPK5 nie pozwala schizontom na uwalnianie merozoitów do krwiobiegu, co prowadzi do śmierci pasożyta. Molekularny mechanizm wydostania się pasożyta za pośrednictwem CDPK5 nie jest w pełni zrozumiały i uważa się, że obejmuje kinazę białkową G (PKG) jako regulator wyższego szczebla7,8. CDPK7 jest niezbędny do dojrzewania pasożytów w stadium pierścieniowym do trofozoitu9. CDPK4 to kolejny członek rodziny CDPK, który ma kluczowe znaczenie dla rozwoju etapów płciowych u komarów. Bierze udział w wielu etapach podczas procesu egzflagacji i dlatego ma kluczowe znaczenie dla tworzenia wolnych, ruchliwych, męskich gamet10,11,12,13. CDPK1 fosforyluje składniki kompleksu błony wewnętrznej i rhoptryi14,15. Co więcej, warunkowa delecja CDPK1 powoduje hipofosforylację białek biorących udział w inwazji RBC16. Wykazano, że CDPK1 reguluje wydzielanie organelli wierzchołkowych podczas procesu inwazji17. CDPK1 pomaga również w wydostawaniu się merozoitów z zakażonych RBC poprzez fosforylację proteazy SERA518. Fosforylowany CDPK1 jest preferencyjnie zlokalizowany na wierzchołkowym końcu merozoitu, gdzie może wchodzić w interakcje z innymi białkami pasożytniczymi wymaganymi w procesie inwazji19,20. CDPK1 bierze również udział w tworzeniu męskich i żeńskich gamet, co jest krytycznym etapem dla przenoszenia malarii i rozwoju płciowego pasożyta u komarów21.

Podejście genetyki chemicznej było historycznie używane do identyfikacji funkcjonalnych ról kinaz ssaków22,23. Podejście to wykorzystuje podstawienie reszty w pozycji strażnika aminokwasem o innym łańcuchu bocznym. Zmiana reszty strażnika moduluje rozmiar sąsiedniej kieszeni ATP, co z kolei zmienia dostępność związków chemicznych zwanych inhibitorami kinaz uderzeniowych (BKI) w kierunku zmutowanego enzymu w porównaniu z typem dzikim. Zastąpienie nieporęcznej reszty na stanowisku strażnika mniejszą resztą umożliwia dostęp do BKI, podczas gdy odwrotne podstawienie sprawia, że kinaza staje się oporna na BKI. W niektórych przypadkach substytucja reszty strażnika wiąże się ze spadkiem aktywności kinazy docelowego enzymu, co sprawia, że modyfikacja jest nietolerancyjna dla badań funkcjonalnych24,25. Negatywny wpływ substytucji gatekeepera na aktywność enzymu można odwrócić poprzez generowanie mutacji supresorowej w drugim miejscu w nietolerancyjnej kinase25. Do zbadania funkcji kinaz białkowych Apicomplexanu wykorzystano podejście oparte na genetyce chemicznej. CDPK4 typu dzikiego zawierający mniejszą resztę strażnika był selektywnie hamowany przez inhibitory kinaz uderzeniowych BKI-1 i 1294, co prowadziło do zablokowania męskiej gametogenezy i rozwoju oocyst11,12. Zastąpienie małej reszty strażnika w CDPK4 dużą resztą metioniny doprowadziło do zmniejszenia inhibicji za pośrednictwem BKI w egflagelacji11. Wykazano, że CDPK1 Toxoplasma gondii, pasożyta Apicomplexan blisko spokrewnionego z pasożytem malarii, jest zaangażowany w ruchliwość i inwazję komórek gospodarza przez tachyzoity26,27. Mniejsza kieszeń strażnika TgCDPK1 typu dzikiego została wykorzystana do zaprojektowania specyficznych inhibitorów, które zmniejszały patogenezę choroby w modelach zwierzęcych28,29. Zaangażowanie P. Falciparum Kinaza białkowa G (PKG) w późnym rozwoju schizogonii i tworzeniu gamet została wykazana poprzez hamowanie aktywności enzymu za pomocą specyficznych inhibitorów farmakologicznych30,31. Zastąpienie treoniny na pozycji strażnika glutaminą (T618Q) znacznie zmniejszyło wrażliwość zmutowanego enzymu na inhibitory, co spowodowało prawidłową gametogenezę i progresję schizonta do pierścienia30,31.

Większość poprzednich badań wykorzystywała podejście genetyki chemicznej do funkcjonalnej charakterystyki docelowych kinaz11,12,22,23,26,30,31 Jednak przyjęliśmy to podejście, aby zrozumieć rozwój mechanizmów kompensacyjnych u pasożytów, które są nosicielami hipomorficznego allelu kinazy białkowej. Wcześniej wykazaliśmy, że zastąpienie reszty strażnika typu dzikiego w CDPK1 metioniną (T145M) powoduje ~ 47% spadek potencjału transfosforylacji zmutowanego enzymu 32. Zmutowany pasożyt zawierający hipomorficzny allel cdpk1 (cdpk1t145m) jest wstępnie przystosowany do zmniejszonej aktywności CDPK1 poprzez transkrypcyjne przeprogramowanie innych członków rodziny CDPK. Uważamy, że strategia ta może być ogólnie stosowana do wyjaśnienia mechanizmów kompensacyjnych w zmutowanych pasożytach zawierających hipomorficzne allele niezbędnych kinaz białkowych. Inne kinazy, które częściowo kompensują funkcję kinazy docelowej, mogą być jednocześnie hamowane wraz z kinazą docelową, aby zapobiec rozwojowi oporności na leki przeciwko pojedynczym kinazom. Może to służyć jako lepsza strategia kontroli malarii.

Protokół

P. Szczep pasożyta falciparum (NF54) uzyskano od Alvaro Molina Cruz21,32,33. Ludzkie krwinki czerwone O+ użyte do hodowli pasożytów uzyskano z Rotary Blood Center w New Delhi w Indiach. Plazmidy pL6eGFP i pUF1 uzyskano od Jose-Juana Lopeza-Rubio. DSM267 uzyskano od Margaret A. Phillips i Pradipsinh K. Rathod. WR99210 dostarczyła firma Jacobus Pharmaceutical Company.

1. Budowa plazmidu do ekspresji rekombinowanego CDPK1 w Escherichia coli

  1. Zaprojektuj parę starterów oligonukleotydowych w celu amplifikacji kompletnego CDS genu cdpk1 (nr dostępu do PlasmoDB. PF3D7_0217500) za pomocą oprogramowania do analizy podkładu.
    1. Amplifikować cały CDS za pomocą polimerazy DNA ze specyficzną dla genu parą oligonukleotydów: Pk1fpgex i Pk1rpgex (patrz Tabela 1) przy użyciu cDNA przygotowanego z Plasmodium falciparum jako matrycy w objętości reakcji 20 μL. Ustawić warunki amplifikacji PCR w następujący sposób: Początkowa denaturacja w temperaturze 98 °C przez 2 minuty, (Denaturacja w temperaturze 98 °C przez 30 s, Wyżarzanie w temperaturze 52 °C przez 20 s, Wydłużenie w temperaturze 62 °C przez 20 s) x 36, Końcowe wydłużenie w temperaturze 62°C przez 10 min. Produkt PCR należy przechowywać w temperaturze 4 °C do czasu dalszego użycia.
  2. Trawić 1 μg amplifikowanego produktu PCR i 1 μg plazmidu ekspresyjnego pGEX4T1 za pomocą endonukleaz restrykcyjnych BamHI (20 000 U/ml) i NotI (20 000 U/ml) przez 3-4 godziny w temperaturze 37 °C w całkowitej objętości reakcji wynoszącej 30 μL.
  3. Aby oczyścić podwójnie strawiony produkt PCR i plazmid, należy użyć zestawu do czyszczenia PCR opartego na kolumnie i postępować zgodnie z instrukcjami producenta.
  4. Związać 100 ng podwójnie strawionego, oczyszczonego plazmidu pGEX4T1 z insertem w stosunku molowym wektora do wstawienia 1:5 przy użyciu 1 μl ligazy DNA T4 w całkowitej objętości reakcji 10 μL. Inkubować reakcję ligacji w temperaturze 16 °C przez noc.
  5. Przekształć E. Coli DH5α kompetentne komórki z ligowaną mieszaniną zgodnie z protokołem producenta i płytką na płytkach agarowych LB zawierających ampicylinę (100 μg/ml).
  6. Przebadaj cztery klony bakteryjne uzyskane w wyniku transformacji na obecność rekombinowanego plazmidu poprzez oczyszczenie plazmidu za pomocą mini zestawu do oczyszczania plazmidu zgodnie z instrukcjami producenta. Potwierdź rekombinowany plazmid przez podwójne trawienie restrykcyjne przy użyciu BamHI i NotI, jak opisano powyżej w kroku 1.3.
  7. Dalej zweryfikuj klony z dodatnim wynikiem trawienia restrykcyjnego pod kątem prawidłowej sekwencji za pomocą sekwencjonowania DNA Sangera. Przekształć E. Coli Kompetentne komórki BLR(DE3) pLysS ze zweryfikowanym sekwencyjnie konstruktem plazmidu do ekspresji białka CDPK1.

2. Ekspresja i oczyszczanie rekombinowanego białka CDPK1 w E. coli

  1. Ekspresja rekombinowanego CDPK1
    1. Zaszczepić pojedynczy klon E. Coli Szczep pLysS BLR(DE3) zawierający zweryfikowany sekwencyjnie konstrukt plazmidu w 10 ml pożywki LB zawierającej ampicylinę (100 μg/ml). Inkubować kulturę przez noc w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem przy 200–250 obr./min.
    2. Zaszczepić kulturę wtórną 1% kultury pierwotnej i pozwolić komórkom bakteryjnym wyrosnąć do fazy środkowej logarytmu w temperaturze 37 °C. Gdy gęstość optyczna (OD) hodowli wtórnej osiągnie 0,7–0,9 przy długości fali 600 nm, należy wywołać ekspresję rekombinowanego CDPK1 o pełnej długości przez dodanie 1 mM ß-D-1-tiogalaktopiranozydu izopropylu (IPTG) i inkubować przez 10–12 godzin w temperaturze 24 °C.
    3. Po inkubacji zbierz E. komórek coli przez odwirowanie w stężeniu 5 000 x g przez 10 min. Zdekantować supernatant i zatrzymać osad komórkowy.
    4. Przygotować bufor do lizy o następującym składzie: 1 mM ditiotreitol (DTT), 0,1 mg/ml lizozymu, 1 mM EDTA, 1 mM fluorku fenylometylosulfonylu (PMSF) i 1x koktajl inhibitora proteazy w soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS).
    5. Ponownie zawiesić osad komórkowy w 10-krotności objętości masy osadu bufora do lizy. Sonikuj zawiesinę komórek przez 15 minut w odstępach 9 s On, 15 s Off, aby zapobiec miejscowemu ogrzewaniu, które może prowadzić do denaturacji białek.
    6. Odwirować lizat przy 17 000 x g przez 1 godzinę i inkubować klarowny supernatant z kulkami glutationu przez noc w temperaturze 4 °C. Postępować zgodnie z poniższym protokołem, aby uzyskać oczyszczone rekombinowane białko CDPK1.
  2. Chromatografia powinowactwa z użyciem kulek glutationowych do oczyszczania CDPK1 oznaczonego GST
    1. Pobrać 500 μl całkowicie zawieszonych kulek glutationu na 250 ml kultury bakteryjnej i odwirować przy 500 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Ostrożnie zdekantować sklarowany sklarant.
    2. Przemyć kulki 5 ml buforu wiążącego (140 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 1,8 mM KH2PO4, pH 7,3) i odwrócić do wymieszania.
    3. Wirować przy 500 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C i usunąć supernatant. Powtórz mycie i odwirowanie 3x-4x.
    4. Dodać kulki do lizatu komórek bakteryjnych i inkubować przez 12 godzin w temperaturze 4 °C, lekko wstrząsając (20-30 obr./min).
    5. Wirować przy 500 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C i usunąć supernatant. Supernatant można zapisać w celu oszacowania ilości rekombinowanego CDPK1, który pozostaje niezwiązany.
    6. Umyj kulki związane z CDPK1 co najmniej 5-6 razy za pomocą PBS zawierającego 1 mM DTT, a następnie przemyj 50 mM Tris, 100 mM NaCl, 1 mM DTT, pH 7,5.
    7. Najpierw eluować związane białko 2x za pomocą 250 μl buforu elucyjnego 1 (EB1), a następnie 2x za pomocą 250 μl buforu elucyjnego 2 (EB2). Skład EB1 i EB2 to odpowiednio 10 mM zredukowany glutation w 50 mM Tris, 100 mM NaCl, pH 7,5 i 20 mM zredukowany glutation w 50 mM Tris, 100 mM NaCl i pH 7,5.
    8. Inkubować kulki związane z CDPK1 w elucyjnych 1 i 2 w temperaturze pokojowej (RT) przez 5-10 minut, stosując delikatne mieszanie lub obracanie od końca do końca.
    9. Wirować przy 500 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C i ostrożnie przenieść supernatant zawierający eluowane rekombinowane białko CDPK1 do oddzielnej probówki.
    10. Powtórz kroki 2.2.8 i 2.2.9, aby uzyskać 2 eluty, z których każdy zawiera EB1 i EB2.

3. Mutageneza ukierunkowana na wytwarzanie rekombinowanych zmutowanych białek strażnika CDPK1

  1. Użyj plazmidu pGEX4T1 zawierającego gen cdpk1 o zweryfikowanej sekwencji. Preferujemy użycie tego samego plazmidu, który został użyty do transformacji szczepu pLysS E. coli BLR(DE3).
  2. Zaprojektuj startery, aby wprowadzić mutację strażnika w sekwencji genu cdpk1 typu dzikiego. Reszta strażnika typu dzikiego (T145) jest kodowana przez kodon ACC w genie cdpk1. Zastąp strażnika treoniny małymi (seryna, T145S) i nieporęcznymi (metionina, T145M) pozostałościami strażnika, które są kodowane odpowiednio przez kodony AGC i ATG.
  3. Postępuj zgodnie z poniższymi wskazówkami, aby zaprojektować startery do przodu i do tyłu dla mutagenezy ukierunkowanej na miejsce.
    1. Upewnij się, że oba podkłady są względem siebie komplementarne. Zachowaj 15-20 nukleotydów o niezmodyfikowanej sekwencji po obu stronach mutacji. Upewnij się, że Tm wynosi od 50 °C do 55 °C dla sekwencji, z wyłączeniem miejsca zmutowanego.
  4. Użyj zestawu mutagenezy skierowanej na witrynę, aby wygenerować zmutowane konstrukcje strażnika cdpk1. Postępuj zgodnie z instrukcjami producenta, aby wprowadzić pożądaną mutację. Startery stosowane w mutagenezie ukierunkowanej są wymienione w Tabeli 1.
  5. Potraktuj mieszaninę reakcyjną 0,5 μl enzymu DpnI (20 000 U/ml) w celu wytrawienia macierzystego, metylowanego plazmidu. Mieszaninę reakcyjną inkubować w temperaturze 37 °C przez 3 godziny. Przekształcić kompetentne komórki E. coli DH5α za pomocą mieszaniny reakcyjnej poddanej działaniu DpnI.
  6. Przeprowadź badania przesiewowe czterech klonów konstruktów plazmidu T145M i T145S, aby zweryfikować wprowadzenie pożądanej mutacji w sekwencji genu cdpk1 poprzez sekwencjonowanie DNA.
  7. Przekształć zweryfikowane sekwencyjnie plazmidy w szczepie pLysS E. coli BLR(DE3) w celu ekspresji rekombinowanych białek CDPK1 T145M/S, jak opisano w kroku 1.5.
  8. Przeprowadzić ekspresję i oczyszczenie zmutowanych białek strażnika CDPK1 zgodnie z krokami opisanymi w sekcji 2 dla białka CDPK1 typu dzikiego.

4. Test aktywności kinazy in vitro CDPK1

UWAGA: Aktywność kinazy rekombinowanego CDPK1 typu dzikiego i zmutowanych białek strażnika jest oceniana za pomocą półsyntetycznego podejścia do znakowania epitopów, jak opisano przez Allena i wsp.34.

  1. Inkubować 50 ng rekombinowanego białka w buforze zawierającym 50 mM Tris, 50 mM MgCl2, 1x koktajl inhibitorów fosforanów z 2 μg zasadowego białka mieliny (MBP) jako egzogennego substratu CDPK1 w całkowitej mieszaninie reakcyjnej 50 μL.
  2. W zależności od warunków wymagających obecności lub braku wapnia, dodać odpowiednio CaCl2 lub EGTA, aby uzyskać końcowe stężenie 2,5 mM każdy w buforze do testu kinazy. Dodać ATPγS do końcowego stężenia 100 μM do buforu, aby użyć go jako źródła przenoszącej się końcowej grupy fosforanowej.
  3. Mieszaninę reakcyjną inkubować w temperaturze 30 °C w łaźni wodnej przez 1 godzinę, a następnie zakończyć reakcję przez dodanie 5 mM EGTA. Dodać 5 μl 50 mM mezylanu p-nitrobenzylu (PNBM) do mieszaniny reakcyjnej i pozostawić do inkubacji w temperaturze 20 °C w łaźni wodnej przez 2 godziny w celu alkilacji fosforylowanych reszt seryny i treoniny w transfosforylacji MBP i autofosforylacji CDPK1.
  4. Do całkowitej ilości 55 μl mieszaniny reakcyjnej dodać 19 μl 4x buforu próbki SDS i ogrzewać w temperaturze 95 °C przez 5 minut.

5. Analiza Western blot w celu wykrycia tiofosforylowanych produktów testu kinazy in vitro

  1. Przygotuj 12% żel SDS-PAGE i załaduj 15 μl każdej próbki. Oddzielić mieszaninę reakcyjną, aby uwidocznić autofosforylowany CDPK1 i transfosforylowany MBP.
  2. Przenieś oddzielone białka z żelu SDS-PAGE do membrany PVDF za pomocą metody mokrego transferu32.
  3. Zablokuj niespecyficzne miejsca na membranie PVDF, inkubując ją z 5% odtłuszczonym mlekiem w soli fizjologicznej buforowanej Tris (20 mM Tris-HCL, pH 7,5, 150 mM NaCl) zawierającej 0,05% Tween 20 przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
  4. Inkubować błonę PVDF z pierwszorzędowym przeciwciałem królika przeciwko alkilowanym tiofosforylowanym adduktom w rozcieńczeniu 1:2,500 przez noc w temperaturze 4 °C w buforze blokującym.
  5. Po całonocnej inkubacji przemyj blot 3x solą fizjologiczną buforowaną Tris z 0,05% Tween 20 przez 10 minut każdy.
  6. Dalej inkubować blot z kozim przeciwciałem drugorzędowym przeciwko królikom w buforze blokującym w rozcieńczeniu 1:5 000 przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej, a następnie przemyć solą fizjologiczną buforowaną Tris zawierającą 0,05% Tween 20.
  7. Nałożyć blot na podłoże chemiluminescencyjne mieszając równą proporcję roztworu A i roztworu B zgodnie z instrukcją producenta i naświetlić na kliszy rentgenowskiej w ciemnym pomieszczeniu w celu uzyskania sygnałów autofosforylacji CDPK1 i transfosforylacji MBP.

6. Klonowanie sekwencji przewodnika do kierowania locus cdpk1 w celu wprowadzenia podstawiania gatekeepera

UWAGA: Sekwencja przewodnia 20 nukleotydów została wybrana przez ręczne selekcjonowanie i sklonowana w plazmidzie pL6eGFP w miejscu BtgZI, wykonując następujące kroki.

  1. Trawienie pL6eGFP za pomocą enzymu BtgZI
    1. Trawić 1 μg plazmidu pL6eGFP 35 z 1 μl enzymu BtgZI (5 000 jednostek/ml) przez 4 godziny w temperaturze 60 °C w mieszaninie reakcyjnej o objętości 20 μl, zgodnie z protokołem producenta enzymu dotyczącym warunków reakcji.
    2. Po 4 godzinnym okresie inkubacji przepuścić strawiony plazmid na 1% żelu agarozowym i wyciąć kawałek żelu (~ 9,8 kb) zawierający strawiony plazmid. Oczyść strawiony plazmid za pomocą kolumnowego zestawu do ekstrakcji żelu zgodnie z instrukcjami producenta.
  2. Wyżarzanie oligonukleotydów
    1. Rozpuść oligonukleotydy (Ck1GUIDEFWD i Ck1GUIDEREV) w wodzie wolnej od DNaz/RNaz w celu przygotowania roztworu podstawowego o stężeniu 100 μM.
    2. Połącz 20 μM każdego oligonukleotydu w roztworze zawierającym 10 mM Tris (pH 8,0), 50 mM NaCl i 1 mM EDTA. Inkubować mieszaninę w temperaturze 95 °C w suchej łaźni przez 5 minut i pozostawić reakcję do ochłodzenia do temperatury pokojowej. Zwykle potrzeba 1 godziny, aby temperatura mieszaniny reakcyjnej osiągnęła RT.
    3. Rozcieńczyć wyżarzane oligonukleotydy do 0,5 μM w Tris pH 8,0, otrzymując całkowitą objętość mieszaniny reakcyjnej wynoszącą 100 μl.
  3. Reakcja w fuzji
    1. Połącz 1,5 μl rozcieńczonych oligonukleotydów ze 100 ng linearyzowanego plazmidu trawionego przez BtgZI w 5-krotnym premiksie enzymatycznym In-Fusion w całkowitej objętości reakcji 10 μl, aby wygenerować przewodnik CDPK1 zawierający plazmid pL6CK1G.
    2. Inkubować reakcję przez 15 minut w temperaturze 50 °C. Przechowywać reakcję w temperaturze 4 °C do czasu przejścia do przemiany E. coli.
      UWAGA: W przypadku długotrwałego przechowywania mieszanina reakcyjna może być przechowywana w temperaturze -20 °C.
  4. Transformacja E. Coli Znakomite kompetentne komórki
    1. Dodać 2,5 μl mieszaniny reakcyjnej do E. Coli Stellar kompetentne komórki i kontynuuj proces transformacji zgodnie z protokołem producenta.
    2. Przekształcone kompetentne komórki ułożyć na płytce LB ampicyliny (100 μg/ml) i pozwolić przekształconym bakteriom rosnąć w temperaturze 37 °C przez noc.
    3. Wybierz przekształcone kolonie i wyekstrahuj plazmid za pomocą dostępnego na rynku zestawu do minipreparacji plazmidu. Postępuj zgodnie z instrukcjami producenta dotyczącymi oczyszczania plazmidu. Zweryfikuj wprowadzenie przewodnika do plazmidu poprzez sekwencjonowanie DNA Sangera.

7. Klonowanie ramienia homologicznego do naprawy locus cdpk1 ograniczonego endonukleazą Cas9

UWAGA: Ramię homologiczne składające się z SNP, które mają być wprowadzone do docelowego locus, jest komercyjnie syntetyzowane. Zwykle bierzemy ramię homologii o długości 400-1000 pz. Ramię homologiczne zawiera ciche mutacje w regionie przewodnika RNA i PAM, aby zapobiec ponownemu przecięciu zmodyfikowanego locus po włączeniu pożądanych SNP. Ramię homologiczne (odpowiadające nukleotydom od 133 do 553 CDPK1), zawierające mutację strażnika Met lub Ser i mutacje ciche, jest otoczone przez miejsca restrykcyjne AflII i SpeI.

  1. Podwójne trawienie 1 μg pL6CK1G i plazmidu zawierającego ramię homologiczne przy użyciu po 0,5 μl enzymów restrykcyjnych AflII (20 000 U/ml) i SpeI (20 000 U/ml) przez 4 godziny w temperaturze 37 °C w mieszaninie reakcyjnej o objętości 20 μL.
  2. Przeprowadzić pełną reakcję podwójnie strawionych plazmidów na 1,5 % żelu agarozowym i oczyścić prążki odpowiadające ramieniu homologii i szkieletowi plazmidowemu pL6CK1 za pomocą zestawu do ekstrakcji żelu zgodnie z instrukcjami producenta.
  3. Zligować przetrawione ramię homologii za pomocą 100 ng plazmidu pL6CK1 w stosunku wektora do insercji 1:5 w całkowitej objętości reakcji 10 μl przy użyciu ligazy DNA T4. Reakcję ligacji inkubować przez noc w temperaturze 16 °C. Przekształcić kompetentne komórki E. coli DH5α za pomocą kompletnej mieszaniny ligacji zgodnie z instrukcjami producenta.
  4. Umieść transformowane komórki na płytkach agarowych LB zawierających ampicylinę (100 μg/ml) w celu wybrania dodatnich transformantów. Wybierz pojedyncze kolonie z płytki ampicyliny LB i oczyść plazmid za pomocą zestawu do ekstrakcji plazmidu.
  5. Potwierdzić klon pod kątem obecności ramienia homologicznego poprzez trawienie oczyszczonego plazmidu enzymami AflII i SpeI przy użyciu tych samych warunków trawienia, jak opisano w kroku 7.3. Potwierdź klony z dodatnim wynikiem podwójnego trawienia przez sekwencjonowanie DNA Sangera w celu walidacji pełnej sekwencji ramienia homologicznego.

8. Oczyszczanie plazmidów pL6CK1Met, pL6CK1Ser i pUF1 do transfekcji pasożytów malarii

  1. Ustawić 5 ml kultur pierwotnych zweryfikowanych sekwencyjnie klonów pL6CK1Met, pL6CK1Ser i pUF1 w pożywkach LB zawierających ampicylinę (100 μg/ml) i inkubować przez 10 godzin. Przenieść kulturę pierwotną do kultury wtórnej w stosunku 1:1000 i inkubować przez dodatkowe 12 godzin.
  2. Osadzać kulturę bakteryjną przez odwirowanie przy 5000 x g przez 10 minut w butelce wirówki.
  3. Wyizoluj plazmidy za pomocą zestawu do oczyszczania plazmidu zgodnie z protokołem producenta. Rozpuść plazmidowe DNA w wodzie wolnej od DNazy/RNazy w celu bezpośredniej transfekcji pasożyta.

9. Hodowla in vitro Plasmodium falciparum i synchronizacja sorbitolu do transfekcji

UWAGA: Hodowla in vitro P. falciparum w ludzkich krwinkach czerwonych (RBC) jest przeprowadzana zgodnie z metodą opisaną przez Tragera i Jensena36.

  1. Propagacja szczepu NF54 P. falciparum poprzez hodowlę w ludzkich krwinkach czerwonych O+ przy hematokrycie 2% w kompletnej pożywce RPMI (cRPMI) zawierającej RPMI 1640 uzupełnioną L-glutaminą, 25 mM HEPES, 25 mM wodorowęglanu sodu i 50 μg/ml hipoksantyny. Uzupełnić pożywkę 0,5 % AlbuMAX II i 10 μg/ml gentamycyny i utrzymywać kulturę w temperaturze 37 °C w atmosferze 5%O2, 5% CO2 i 90% N2.
  2. W celu synchronizacji sorbitolu w celu uzyskania pasożyta w stadium pierścieniowym, pasożyty asynchroniczne należy osadzać w stożkowej probówce o pojemności 50 ml przez odwirowanie przy 2,300 x g przez 3 minuty w temperaturze pokojowej. Odrzucić supernatant.
  3. Inkubować pasożytowane erytrocyty z 9 objętościami 5% sorbitolu przez 10 minut w temperaturze 37 °C. Po inkubacji osadzać erytrocyty przez odwirowanie przy 2 300 x g przez 3 minuty i wyrzucić sorbitol.
  4. Umyj pasożyty potraktowane sorbitolem niepełnym RPMI, iRPMI (pożywki RPMI bez albumaksu i wodorowęglanu sodu), a następnie inkubuj je w cRPMI. Użyj pasożytów w stadium pierścieniowym w następnym cyklu do transfekcji plazmidu.

10. Transfekcja pasożyta w stadium pierścieniowym plazmidami pL6CK1Met, pL6CK1Ser i pUF1

UWAGA: Następujące kroki są stosowane do bezpośredniej transfekcji pasożytów w stadium pierścieniowym z plazmidowym DNA.

  1. Przygotuj 2x bufor cytomiksu37 rozpuszczając w 30 ml wody, 240 mM KCl, 0,3 mM CaCl2, 4 mM EGTA, 10 mM MgCl2, 20 mM K2HPO4/KH2PO4 i 50 mM HEPES. Dostosuj pH do 7,6. Dostosuj końcową objętość do 50 ml. Filtr Wysterylizuj bufor za pomocą filtra strzykawkowego 0,22 μm. Następnie rozcieńczyć 2x bufor cytomix sterylną wodą, aby uzyskać 1x bufor cytomix.
  2. W sterylnej stożkowej probówce o pojemności 15 ml dodaj 100 μl upakowanych pasożytniczych krwinek czerwonych w stadium pierścieniowym i przemyj je 2x 5 ml 1x buforu cytomix. Przemywania należy przeprowadzić przez odwirowanie przy 994 x g przez 3 minuty w temperaturze pokojowej
  3. Po przemyciu usunąć bufor i dodać 50 μg każdego plazmidu (pL6CK1Met/pUF1 do generowania mutacji T145M i pL6CK1Ser/pUF1 do generowania mutacji T145S) do upakowanych pasożytniczych krwinek czerwonych. Następnie dodaj 2x bufor zgodnie z objętością plazmidu i dostosuj objętość do 400 μL z 1x stężeniem buforu.
  4. Przenieść 400 μl powyższego roztworu do kuwet o średnicy 0,2 cm dla każdej transfekcji. Elektroporować przy użyciu następujących warunków: 0,31 kV, 950 μF i rezystancji ustawionej na nieskończoność.
  5. Po elektroporacji usunąć transfekowane pasożyty z kuwety, wymieszać je z cRPMI i przenieść do kolby T25 o całkowitej objętości 15 ml. Inkubować pasożyty przez 2 godziny w warunkach wymienionych w kroku 9.1.
  6. Po inkubacji przenieść transfekowane pasożyty do stożkowej probówki o pojemności 50 ml i odwirować przy 994 x g przez 3 min. Usunąć supernatant i umyć pasożyty 10 ml niepełnego RPMI. Hoduj je świeżym cRPMI przez 2 dni, uzupełniając pożywkę po 24 godzinach.
  7. Po 48 godzinach wyjmij cRPMI z każdej kolby i ponownie zawieś kulturę w cRPMI zawierającą 2 nM WR99210 i 150 nM DSM26738. Następnie przenieś kulturę do kolby T75, dodając 400 μl świeżych krwinek czerwonych. Codziennie uzupełniaj pożywkę cRPMI zawierającym WR99210 i DSM267 przez 7 dni. Następnie dodawaj cRPMI zawierające oba leki co drugi dzień do 14 dnia po transfekcji.
  8. W dniu 14 należy podać 200 μl transfekowanej kultury w 1,5 ml probówki do mikrowirówki (MCT) w celu przygotowania szkiełka. Granulować komórki przez odwirowanie przy 500 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Odessać supernatant i przenieść komórki na szkiełko. Wykonaj rozmaz za pomocą innego szkiełka, umieszczając je pod kątem 45°.
  9. Zamocuj szkiełko w metanolu i przygotuj plamę Giemsa, rozcieńczając ją w stosunku 1:10 w ultraczystej wodzie. Następnie zabarwić szkiełko, całkowicie zanurzając je w bejcy Giemsa na 20 minut. Umyj szkiełko pod bieżącą wodą i dokładnie wysusz. Następnie obserwuj szkiełko pod mikroskopem świetlnym w 100-krotnym powiększeniu, nakładając olejek immersyjny.
  10. Po wizualizacji pasożytów należy codziennie uzupełniać pożywkę i pozwolić im rosnąć przez 2-3 dni. Następnie usuń pasożyty, aby zweryfikować pożądaną modyfikację w docelowej sekwencji genu w docelowym locus.
    UWAGA: Jeśli pasożyty nie są widoczne w 14 dniu, uzupełnij pożywkę (zawierającą oba leki) po 4 dniach. Zmniejsz ilość pasożyta o 30% i dodaj świeżą krew, aby utrzymać 2% hematokrytu co 7 dni, aż pasożyty pojawią się ponownie.

11. Weryfikacja PCR transgenicznego pasożyta z pożądaną modyfikacją locus cdpk1

  1. Po 2-3 dniach rozwoju pasożyta wyjmij 500 μl kultury i przenieś ją do 1,5 ml MCT.
  2. Granulować komórki przez odwirowanie przy 2 400 x g przez 5 minut. Następnie lizuj erytrocyty przez leczenie saponinami.
    1. W celu leczenia saponinami dodać 10 μl 10% roztworu saponin do 1 ml zawieszonego osadu pasożyta i utrzymywać w temperaturze 4 °C przez 5 minut. Odwirować komórki w temperaturze 2 400 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C i odrzucić supernatant. Powtarzaj ten krok, aż zaczerwienienie całkowicie zniknie i uzyskasz czarną osadę pasożytów.
  3. Przemyć osad pasożyta 1 ml 1x PBS przez odwirowanie w stężeniu 2 400 x g przez 5 minut. Następnie ponownie zawiesić osad w 50 μl wody wolnej od DNaz/RNaz. Podgrzewać zawieszony osad pasożyta w temperaturze 95 °C przez 5 minut, a następnie odwirować w temperaturze 16 200 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Przenieść supernatant zawierający DNA pasożyta do świeżej probówki.
  4. Wykorzystaj powyższy materiał genetyczny do amplifikacji genu o pełnej długości metodą PCR, wykorzystując zestaw starterów ck1f1 i ck1r3wt (patrz Tabela 1), w szczególności celując w region poza ramieniem homologii, jak opisano powyżej w kroku 1.2. Zsekwencjonuj region homologii zawierający mutację T145M za pomocą startera ck1f1.

12. Ograniczanie rozcieńczenia w celu uzyskania klonalnych transgenicznych pasożytów

  1. Po weryfikacji sekwencji należy rozcieńczyć transfekowaną kulturę pasożyta, aby osiągnąć końcowe stężenie 1 pasożyta na 200 μl. Następnie dodać 100 μl rozcieńczonej kultury do studzienek 96-dołkowej płytki do hodowli tkankowej. Wykonaj następujące kroki (12.2-12.4), aby uzyskać 1 pasożyta/200 μL.
  2. Przygotuj 10 ml pasożytniczych krwinek czerwonych z 2% hematokrytem. Oszacuj procentową zawartość pasożytniczą kultury za pomocą opisanej powyżej metody barwienia Giemsa. Następnie policz całkowitą liczbę erytrocytów w kulturze rozcieńczonej w stosunku 1:100 za pomocą hemocytometru.
    Całkowita liczba krwinek czerwonych/ml = średnia liczba zliczonych krwinek czerwonych x współczynnik rozcieńczenia x 104
    Liczba pasożytniczych erytrocytów/ml = (procent parazytemii x całkowita liczba erytrocytów/ml)/100
  3. Przygotować rozcieńczenie pasożytniczych krwinek czerwonych w stosunku 1:10 000, seryjnie rozcieńczając początkową kulturę 2x (każde rozcieńczenie 1:100).
  4. Dodaj odpowiednią objętość (w mikrolitrach) z rozcieńczonej kultury, aby uzyskać łącznie 50 pasożytów w 10 ml pożywki, zapewniając 2% hematokrytu. Następnie dodaj 100 μl pożywki zawierającej 50 pasożytów do każdego dołka 96-dołkowej płytki. Umieścić płytkę w hermetycznym secadorze przepłukanym zmieszanym gazem (skład opisany powyżej w kroku 9.1) i inkubować w temperaturze 37 °C. Wymieniać podłoże co 2 dni.
  5. Zastępuj pożywkę cRPMI zawierającą 2% hematokrytu co 7dni aż do pojawienia się pasożytów.
    1. Przechyl 96-dołkową płytkę pod kątem 45° i pozwól RBC się uspokoić. Za pomocą pipety serologicznej ostrożnie usuń pożywkę z każdej studzienki i obserwuj zmianę koloru na żółty w studzienkach zawierających pasożyty, kontrastujący z różowym kolorem pożywki w studzienkach wolnych od pasożytów. Ta zmiana koloru następuje, ponieważ pasożyty zakwaszają pożywkę.
  6. Po zaobserwowaniu zmiany koloru wyjmij niewielką ilość kultury z dołka wykazującego zmianę koloru i przygotuj rozmaz na szkiełku, oznaczając go liczbą odpowiadającą położeniu studzienki. Zabarwić szkiełko barwnikiem Giemsa i obserwować go pod mikroskopem, jak opisano powyżej.
  7. Przenieść zawartość studzienki do kolby T25, w której pod mikroskopem zaobserwowano pasożyty. Pozwól pasożytom rosnąć w kolbie T25 przez 4-5 dni i uzupełniaj pożywkę co drugi dzień.
  8. Gdy parazytemia osiągnie 2-3%, należy pobrać 500 μl kultury pasożytów. Następnie należy dokonać lizy saponiny w erytrocytach i przystąpić do ekstrakcji materiału genetycznego pasożyta metodą opisaną w punkcie 11.
  9. Aby potwierdzić powstawanie klonalnych pasożytów transgenicznych, należy przeprowadzić reakcję PCR, jak opisano powyżej w kroku 1.1.1 i wysłać produkt PCR do sekwencjonowania DNA, aby potwierdzić wprowadzenie pożądanych SNP do locus docelowego.

13. Analiza transkrypcji za pomocą Real-Time PCR

  1. Oczyszczanie i synchronizacja pasożytów z perkolu/sorbitolu
    1. Przygotuj gradient Percoll/Sorbitol 39,40, kolejno nakładając warstwy po 3 ml po 70%, a następnie 40% roztwory perkolu/sorbitolu w stożkowej probówce o pojemności 15 ml.
    2. Delikatnie ułóż 1-2 ml kultury pasożytów zawierającej głównie pasożyta w stadium schizonta WT i CDPK1 T145M na wierzchu gradientu.
    3. Odwirować gradient przy 2 300 x g przez 15 minut w temperaturze pokojowej, używając przyspieszenia ustawionego na 4 cale wirówki w wahadłowym wirniku kubełkowym.
    4. Zebrać środkowy pierścień zawierający stadia trofozoitu i schizonta pasożyta z granicy faz gradientu w świeżej stożkowej probówce o pojemności 50 ml.
    5. Umyj pasożyty, dodając równą objętość 9:1 (cRPMI: 10xPBS), a następnie odwiruj przy 994 x g przez 3 minuty w celu osadzenia pasożytów.
    6. Ponownie przemyć osad roztworem 19:1 (cRPMI:10xPBS), a następnie odwirować przy 994 x g przez 3 min.
    7. Dodać każdą osadkę pasożyta do oddzielnych kolb zawierających cRPMI z 2% hematokrytem (wstępnie inkubowaną w temperaturze 37 °C). Inkubować kolby przez 4 godziny w warunkach opisanych powyżej w kroku 9.1, aby umożliwić inwazję merozoitów ze wzbogaconych schizontów do świeżych erytrocytów.
    8. Po 4 godzinach potraktuj pasożyty sorbitolem, jak opisano powyżej w krokach 9.2-9.4, aby uzyskać wysoce zsynchronizowane pasożyty w fazie pierścieniowej 0 - 4 godzin.
    9. Inkubować zsynchronizowane pasożyty przez 44 godziny po leczeniu sorbitolem, aby uzyskać 44 - 48 h stadium schizonta pasożyta.
  2. Izolacja RNA z schizontów pasożytów T145M WT i CDPK1
    1. Zbierz pasożyty WT i CDPK1 T145M po 44-48 godzinach od inwazji. Przemyć granulki pasożyta 1x PBS przy 994 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
    2. Ponownie zawiesić granulki pasożyta w 1 ml 1x PBS i potraktować je saponiną w celu lizy otaczających erytrocytów, jak opisano w kroku 11.2.1.
    3. Zawiesić osad pasożyta w 1 ml odczynnika do ekstrakcji RNA i przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu dalszego przetwarzania.
    4. Rozmrozić zamrożony osad w temperaturze 15-30 °C w celu całkowitej dysocjacji kompleksów nukleoproteinowych.
    5. Dodać 200 μl chloroformu na ml odczynnika do ekstrakcji RNA i energicznie wstrząsać probówkami ręcznie przez 15 s. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 2-3 minuty.
    6. Odwirować mieszaninę przy sile 16 200 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C. RNA pozostanie wyłącznie w bezbarwnej górnej górnej warstwie wodnej. Wyizoluj RNA za pomocą zestawu zgodnie z instrukcjami producenta.
  3. synteza cDNA z RNA pasożyta WT i CDPK1 T145M
    1. Próbki zawierające RNA należy poddać działaniu zestawu do usuwania DNA, postępując zgodnie z instrukcjami producenta dotyczącymi usuwania zanieczyszczającego DNA.
    2. Zsyntetyzuj cDNA z wyizolowanych próbek RNA za pomocą zestawu do syntezy cDNA zgodnie z protokołem producenta. Do procesu odwrotnej transkrypcji używamy losowych starterów heksamerowych zamiast starterów oligo-dT.
    3. Należy zapewnić kontrole NO-RT (reakcje zapoczątkowane bez dodawania enzymu odwrotnej transkryptazy) dla każdej próbki RNA używanej do przygotowania cDNA, aby wykluczyć przenoszenie zanieczyszczenia genomowego DNA z oczyszczonego RNA podczas przygotowywania cDNA.
    4. Przetestuj cDNA poprzez amplifikację dowolnego segmentu genu zawierającego pośrednią sekwencję intronową, taką jak gen cdpk1 o pełnej długości, aby wykluczyć zanieczyszczenie genomowego DNA. Użyj warunku PCR zgodnie z opisem w kroku 1.1.1.
  4. Analiza ekspresji transkryptu pasożyta WT i CDPK1 T145M
    1. Użyj cDNA przygotowanego z pasożytów WT i CDPK1 T145M, aby przeprowadzić analizę ekspresji transkryptu 11 różnych genów za pomocą PCR w czasie rzeczywistym. 11 docelowych genów obejmuje 7 członków rodziny CDPK i 4 kinazy biorące udział w inwazji erytrocytów (patrz Tabela 2 dla genów i odpowiadających im starterów stosowanych do PCR w czasie rzeczywistym).
    2. Projektuj podkłady za pomocą oprogramowania do syntezy podkładów. Amplifikuj około 120 pz każdego wybranego genu za pomocą specyficznych dla genu starterów o podobnych temperaturach topnienia.
    3. Amplifikować geny docelowe za pomocą mieszanki wstępnej i uruchomić płytkę w systemie PCR w czasie rzeczywistym, stosując następujące parametry cykliczne: początkowa denaturacja w temperaturze 95 °C przez 3 minuty, a następnie 40 cykli denaturacji w temperaturze 95 °C przez 10 s, wyżarzanie w temperaturze 52 °C przez 20 s i przedłużenie w temperaturze 62 °C przez 30 s.
    4. Normalizuj poziom ekspresji każdego genu za pomocą dwóch genów porządkowania, dehydrogenazy gliceraldehydo-3-fosforanowej (GAPDH) i ligazy tRNA treoniny (ThrRS)32. Oblicz względną ekspresję każdej kinazy docelowej w pasożytzie CDPK1 T145M w porównaniu z kontrolą WT.
    5. Wykonaj analizę statystyczną za pomocą pakietu analizy statystycznej R. Alternatywnie użyj dowolnego innego oprogramowania analitycznego.
      UWAGA: Globalne metody transkryptomiczne, takie jak RNA-Seq lub mikromacierz, są lepszymi podejściami do uzyskania szerszego spojrzenia na przeprogramowanie transkryptomu u zmutowanych pasożytów w porównaniu z WT.

Wyniki

Rekombinowane białko CDPK1 typu WT jest wyrażane jako białko fuzyjne z N-końcowym znacznikiem Glutathione S-transferase (GST) i oczyszczane za pomocą chromatografii powinowactwa GST. Oczyszczone białko CDPK1 wykryto metodą Western blot przy użyciu przeciwciał anty-CDPK1 i anty-GST (Rycina 1). Pozostałość treoninowa gatekeepera (T145) w CDPK1 WT została zastąpiona Met oraz Ser za pomocą mutagenezy celowanej w celu wygenerowania rekombinowanych białek mutantów CDPK1T145M i CDPK1T145S (Rycina 2). Przeprowadzono test kinazowy in vitro, aby ocenić aktywność kinazy wszystkich rekombinowanych białek CDPK1. Aktywność kinazy badano przy użyciu półsyntetycznego podejścia z tagowaniem epitopowym34 poprzez wykrywanie grupy tiofosforanowego estru za pomocą specyficznego przeciwciała w formacie Western blot (Rycina 3). Wpływ substytucji gatekeepera na aktywność autofosforylacji CDPK1 oraz transfosforylację MBP, wykorzystanego jako egzogenny substrat CDPK1, oceniono poprzez kwantyfikację intensywności odpowiednich prążków autofosforylacji i transfosforylacji. Mutant CDPK1 z metioniną w pozycji gatekeepera zachował ~ 53% aktywności transfosforylacji, podczas gdy obecność seryny w pozycji gatekeepera doprowadziła do całkowitego zniesienia transfosforylacji substratu (Rycina 3). SNP prowadzące do substytucji gatekeepera z Thr na Met (T145M) wprowadzono do endogennego locus cdpk1 za pomocą CRISPR-Cas9 z wykorzystaniem systemu dwuplazmidowego (Rycina 4 i Rycina 5). Nie udało się wygenerować mutantów pasożytów z substytucją T145S, co prawdopodobnie wynika z letalnego efektu seryny gatekeepera na aktywność CDPK1. Mutanty pasożytów CDPK1T145M podklonowano metodą rozcieńczeń ograniczających, a substytucję gatekeepera potwierdzono za pomocą sekwencjonowania metodą Sangera, aby zweryfikować powstanie mutanta pasożyta CDPK1T145M. Poziomy transkrypcji 11 różnych kinaz, w tym 7 członków rodziny CDPK i 4 innych kinaz zaangażowanych w późny rozwój schizogoniczny pasożyta, przetestowano za pomocą real-time PCR (Rycina 6). Poziomy ekspresji 11 różnych kinaz porównano pomiędzy mutantem CDPK1T145M a pasożytami typu dzikiego (WT), normalizując je do genów housekeepingowych. Ekspresja transkrypcyjna członków rodziny CDPK była zmieniona w mutancie CDPK1T145M w porównaniu z pasożytem WT (Rycina 6). Transkrypty wykazujące wyższą ekspresję w mutancie CDPK1T145M mogą kompensować funkcję CDPK1 w mutantcie pasożyta CDPK1T145M.

figure-results-1
Rycina 1: Charakterystyka pełnowymiarowego rekombinowanego PfCDPK1 typu dzikiego (WT). Pełnowymiarowe białko WT CDPK1 połączone z N-końcowym znacznikiem GST (transferaza S-glutationianu) zostało oczyszczone metodą chromatografii powinowactwa i rozdzielone w 10% SDS-PAGE. Białko CDPK1 migrowało zgodnie z przewidywaną masą cząsteczkową wynoszącą ~ 87 kDa, co przedstawiono na żelu poliakrylamidowym barwionym Coomassie Brilliant Blue R-250. Rekombinowane białko rozdzielone w SDS-PAGE przeniesiono na membranę PVDF i poddano analizie Western blot z użyciem przeciwciał przeciwko CDPK1 oraz przeciwciał przeciwko GST. Prążek odpowiadający pełnowymiarowemu rekombinowanemu CDPK1 w SDS-PAGE został wykryty przy użyciu obu przeciwciał, co potwierdziło tożsamość białka. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

figure-results-2
Rysunek 2: Charakterystyka oczyszczonych rekombinowanych białek mutantów gatekeeper CDPK1. (A) Dopasowanie pierwotnej sekwencji aminokwasowej TgCDPK1 i PfCDPK1 (numer dostępu Plasmodb PF3D7_0217500). Treonina w pozycji 145 PfCDPK1 odpowiada glicynie 128, pozycji gatekeeper w TgCDPK1 (zaznaczonej na czerwono). (B) Schematyczne przedstawienie reszty gatekeeper Thr (zaznaczonej na czerwono) kodowanej przez triplet kodon ACC (czarne koło) w CDPK1 typu dzikiego (WT). Podstawienie reszty gatekeeper za pomocą mutogenezy celowanej w celu wytworzenia rekombinowanych białek mutantów CDPK1 z Met (zaznaczoną na żółto) w CDPKT145M oraz Ser (zaznaczoną na niebiesko) w CDPKT145S. (C) Profil SDS-PAGE rekombinowanych białek CDPK1 typu dzikiego i mutantów. Rekombinowane białka WT i mutanty gatekeeper zostały oczyszczone za pomocą chromatografii powinowactwa GST i rozdzielone metodą SDS-PAGE. Wszystkie białka rekombinowane są zgodne z oczekiwaną masą cząsteczkową ~87 kDa. M – drabinka mas cząsteczkowych. (D) Charakterystyka rekombinowanych białek CDPK1 typu dzikiego i mutantów za pomocą Western blottingu. Rekombinowane białka CDPK1 typu dzikiego i mutanty gatekeeper zostały rozdzielone metodą SDS-PAGE i przeniesione na membranę PVDF do analizy Western blotting. Prążki odpowiadające pełnowymiarowym rekombinowanym białkom CDPK1 typu dzikiego i mutantów w SDS-PAGE zostały wykryte za pomocą przeciwciał przeciwko CDPK1 i GST, co potwierdziło tożsamość wszystkich białek rekombinowanych. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rycina 3Substytucja pozostałego w pozycji gatekeepera w CDPK1 prowadzi do spadku aktywności kinazy enzymów zmutowanych. (A) Schematyczne przedstawienie półsyntetycznego podejścia do znakowania epitopów w celu wykrywania aktywności kinazy białka CDPK1. Przedstawiono tutaj wyłącznie aktywność transfosforylacji. Białko CDPK1 tiofosforyluje egzogenny substrat (S, zielony kwadrat) w obecności ATPγS (żółty trójkąt wypełniony), źródło przenoszalnej terminalnej grupy tiofosforanowej). Pozostałość tiofosforylowana zostajey alkilowana poprzez traktowanie mesylanem p-nitrobenzylowym (PNBM), co prowadzi do powstania estru tiofosforanu, który następnie jest wykrywany za pomocą przeciwciała specyficznie rozpoznającego alkilowany addukt tiofosforanu. (B) In vitro do oceny wpływu substytucji aminokwasu gatekeepera na potencjał autofosforylacji i transfosforylacji rekombinowanych białek mutantów CDPK1 wykorzystano test aktywności kinazy z zastosowaniem półsyntetycznego podejścia do znakowania epitopowego. Wszystkie białka rekombinowane wykazują wapniozależną aktywność kinazy. Autofosforylacja CDPK1 oraz transfosforylacja egzogennego substratu, jakim jest podstawowe białko mieliny (MBP), były widoczne wyłącznie w obecności chlorku wapnia (CaCl2)2+), natomiast w obecności EGTA, specyficznego chelatora Ca, nie wykryto fosforylacji2+ jony. Mutanty gatekeepera wykazują obniżoną aktywność autofosforylacji, podczas gdy transfosforylacja MBP została całkowicie zniesiona w przypadku CDPK1T145S. CDPK1T145M zachowuje potencjał transfosforylacji (~ 53 %), jak zgłoszono wcześniej32. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rysunek 4: Konstrukcja plazmidów do wprowadzania SNP w pozycji gatekeeper w locus cdpk1 przy użyciu CRISPR-Cas9. Sekwencja naprowadzająca składająca się z 20 nukleotydów, odpowiadająca pozycji od 432 do 451 bp, została sklonowana w miejscu restrykcyjnym BtgZI w plazmidzie pL6eGFP w celu wygenerowania pL6CK1G. Ramie homologii (421 bp) zawierające pożądane SNP (T145M lub T145S, odpowiadający kodon zaznaczony na zielono) wraz z mutacjami osłonowymi (zaznaczonymi na czerwono) zostało sklonowane w pL6CK1G pomiędzy miejscami restrykcyjnymi AflII i SpeI w celu wygenerowania odpowiednio pL6CK1GT145M i pL6CK1GT145S. Mutacje osłonowe zapobiegają ponownemu przecięciu zmodyfikowanego locus po dokonaniu pożądanej edycji. Endonukleaza Cas9 zakodowana w drugim plazmidzie, pUF1, jest kierowana do miejsca docelowego w locus cdpk1 za pomocą gRNA ekspresowanego z plazmidu pL6CK1GT145M/S. Cas9 wprowadza pęknięcie dwuniciowe w miejscu docelowym po stronie 5' sekwencji PAM. Pęknięcie dwuniciowe jest naprawiane z wykorzystaniem ramienia homologii w plazmidzie pL6CK1GT145M/S. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

figure-results-5
Rysunek 5: Schematyczne przedstawienie transfekcji P. falciparum plazmidami CRISPR w celu wprowadzenia mutacji gatekeeper (T145M) w locus cdpk1. i) Asynchroniczna hodowla P. falciparum jest poddawana działaniu sorbitolu w celu uzyskania zsynchronizowanych pasożytów w stadium pierścienia. ii) Zsynchronizowane pasożyty w stadium pierścienia przenosi się do kuwety do elektroporacji wraz z plazmidami pL6CK1GT145M/S i pUF1 resuspendowanymi w roztworze buforowym. iii) Pasożyty są elektroporowane przy 310 voltach, 950 µF i nieskończonej rezystancji. iv) Po transfekcji pasożyty przenosi się do kolby T25 zawierającej świeże, kompletne podłoże RPMI (cRPMI) i inkubuje przez 48 h. Po 48 h transfekowane pasożyty przenosi się na cRPMI uzupełnione lekami WR99210 i DSM267 i namnaża w kolbie T75. v) W 14. dniu przygotowuje się szkiełka i barwi je barwnikiem Giemsy. vi) Następnie rozmaz krwi ogląda się pod mikroskopem świetlnym w celu oceny obecności zarażonych RBC. vii) Po wizualizacji pozwala się pasożytom rosnąć w obecności leków. Następnie pasożyty są przetwarzane w celu uzyskania matrycy do PCR i sekwencjonowania DNA dla weryfikacji pożądanej modyfikacji docelowego locus cdpk1. viii) Po weryfikacji uzyskuje się klonalne pasożyty transgeniczne poprzez przeprowadzenie rozcieńczeń ograniczających na płytce 96-dołkowej. ix) Klonalne pasożyty transgeniczne z pozytywnych dołków przenosi się do kolb T25 i pozwala im rosnąć. x) Klonalne pasożyty transgeniczne są dalej walidowane za pomocą PCR oraz potwierdzenia obecności pożądanych SNP w pozycji gatekeeper poprzez sekwencjonowanie DNA i analizę chromatogramu. Rysunek zmodyfikowano na podstawie32. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

figure-results-6
Rycina 6: Schematyczne przedstawienie etapów analizy transkrypcji genów docelowych za pomocą PCR w czasie rzeczywistym (RT-PCR). i) Kulturę P. falciparum z przewagą pasożytów w dojrzałym stadium schizontów uzyskuje się poprzez traktowanie sorbitolem w tym samym cyklu. ii) Pasożyty są ostrożnie nakładane na gradient 70/40 Percoll/sorbitol w 15 mL probówce stożkowej w celu wzbogacenia frakcji dojrzałych schizontów. iii) Czarny pierścień na granicy faz 40 % i 70 % Percoll/sorbitol jest przenoszony do nowej probówki 50 mL, przetwarzany i resuspenderowany w cRPMI. Pasożyty wzbogacone w stadium schizontów są inkubowane ze świeżymi RBCs, uprzednio inkubowanymi w 37 °C, w celu inwazji. iv) Pasożyty są hodowane przez 4 h, a następnie traktowane 5 % sorbitolem, aby uzyskać silnie zsynchronizowane pasożyty w stadium pierścienia (0-4 h). v) Pasożyty są dalej hodowane przez dodatkowe 44 h po traktowaniu sorbitolem, aby uzyskać silnie zsynchronizowane pasożyty w stadium schizontów (44-48 h). vi) Zsynchronizowane pasożyty są traktowane saponiną w celu uwolnienia ich z RBCs, a następnie przechowywane w odczynniku do ekstrakcji RNA. Całkowite RNA jest izolowane z resuspenderowanych pasożytów po ekstrakcji RNA. vii) Z wyizolowanego RNA przygotowywane jest cDNA. viii) Eksperyment PCR w czasie rzeczywistym jest przeprowadzany z matrycą cDNA w celu amplifikacji genów docelowych przy użyciu starterów specyficznych dla genów. Płytka jest analizowana w systemie PCR w czasie rzeczywistym. ix) Dane dotyczące ekspresji transkrypcyjnej są analizowane za pomocą oprogramowania analitycznego. Wykres przedstawia różnicowe poziomy ekspresji transkrypcyjnej 11 kinaz w pasożytach CDPK1 T145M w porównaniu z typem dzikim (WT). Rycina zmodyfikowana na podstawie32. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Nazwa genuSekwencja startera
Pk1fpgexATGCGCGGATCCATGGGGTGTTCACAAAGTTCAAACG
Pk1rpgexATGCGCGCGCGGCCGCTTATGAAGATTTATTATCACAAATTTTGTGCATC
Ck1T145SGTTTGATGTTTTTGAAGATAAGAAATATTTTTATTTAGTAAGCGAATTTTATGAAGGTGGGGAA
Ck1T145S_antysensownyTTCCCCACCTTCATAAAATTCGCTTACTAAATAAAAATATTTCTTATCTTCAAAAACATCAAAC
CK1T145MGTTTGATGTTTTTGAAGATAAGAAATATTTTTATTTAGTAATGGAATTTTATGAAGGTGGGGAA
Ck1T145M_antysensownyTTCCCCACCTTCATAAAATTCCATTACTAAATAAAAATATTTCTTATCTTCAAAAACATCAAAC
Ck1GUIDEFWDTAAGTATATAATATTAACCGAATTTTATGAAGGTGGTTTTAGAGCTAGAA
Ck1PRZEWODNIKREWTTCTAGCTCTAAAACCACCTTCATAAAATTCGGTTAATATTATATACTTA
ck1f1 ATTTTCTTTTCTGAACGTGTAACATG
ck1r3wtTGCATCTCTTAATCTCTCCTCACTG

Tabela 1: Lista starterów użytych w badaniu.

Nazwa genuStarter przedniStarter odwrotny
CDPK1 (PF3D7_0217500)GGAAGAATTAGCAAATTTATTTGGTTTGACATCATGTTAACGAATTCATCAAAGTCAATCATGT
CDPK2 (PF3D7_0610600)GGAACAGGAGAATTTACAACGACTGTATACATAATAACACCACTAGACCAG
CDPK3 (PF3D7_0310100)CACGAAATATTGAGCATGGTAAAGAAGGCAGCGTCCATTGTAAG
ACATCTTTTTATTAAATC
CDPK4 (PF3D7_0717500)ATACTTCTCTCAGGGTGCCCCTTATCACTAATTTTTTT
GAATTGTGGTAAATCG
CDPK5 (PF3D7_1337800)GGAGGTCGAAGATATGGATACGAATAGTATCGGCTAACGTACTCTTTGTCG
CDPK6 (PF3D7_1122800)CCTCCCGTAGATAAGAATATATTATCTATCGATCTGCTTCAATAAATCCCAATACATTTGC
CDPK7 (PF3D7_1123100)AGTCCTAAAAAAGATATA
TAAAGAACTAGGTAGTAG		TTTAAAAATAATCTTTCTCCCCACAACCC
PKA (PF3D7_0934800)   AATCATCCATTTTGTGTAAATTTACATGGCTTTTGTTTCTTCTTAAA
AATGTAAAAAATTCTCC
PKG (PF3D7_1436600)   AAAGGGAATGAAAGAAATAAAAAGAAGGCCATATCAATATCTTCTGAAAGCTTTTCCC
PKB (PF3D7_1246900)   CACAATAGAAGAAATGATGTTCTTTTTTACGGAGAGCGCAATTAGCCATATTG
PI3K (PF3D7_0515300)  CCCCTTCAATTTGTTTGTGAAACAGATCACATTTGTTATACTT
ATTATCATCACATTTGTT
GAPDH (PF3D7_1462800)GGAAGGAAAGATATCGAAGTAGGGGTTACCTCACATGG
ThrRS (PF3D7_1126000)CTTGGGAACTGCAGAGTAGAATTTTAAAAATCCTCCGAACAATTTTTCTAAACTAC 

Tabela 2: Lista genów docelowych (numer identyfikacyjny PlasmoDB) wraz z sekwencjami starterów użytych do analizy real-time PCR.

Dyskusja

Wytwarzanie zmutowanego pasożyta transgenicznego zawierającego hipomorficzny allel cdpk1 opiera się na danych dotyczących aktywności kinazy in vitro z rekombinowanymi enzymami. Lepiej jest wygenerować jak najwięcej zmutowanych rekombinowanych białek z różnymi resztami strażnika. Ponieważ genom P. falciparum jest wysoce bogaty w AT, ekspresja rekombinowanych białek w E. Bakterie coli mogą wymagać optymalizacji kodonów. Pomoże to w kompleksowej ocenie substytucji strażnika w odniesieniu do aktywności kinazy zmutowanego enzymu. Substytucja strażnika, która powoduje zmniejszenie potencjału transfosforylacji, jest wybierana w celu wytworzenia transgenicznego pasożyta wymiany allelicznej. Równolegle substytucja strażnika, która całkowicie znosi aktywność transfosforylacyjną kinazy, powinna być traktowana jako kontrola ujemna. Kolejną ważną kwestią przy generowaniu pasożyta wymiany alleli jest wprowadzenie mutacji synonimicznej wraz z mutacją testową i kontrolą negatywną. Wytwarzanie pasożyta zawierającego synonimiczną mutację w locus cdpk1 służy jako ważna kontrola wewnętrzna w celu wykluczenia ewentualnych błędów technicznych podczas wprowadzania mutacji testowej. Co więcej, transgeniczny pasożyt przenoszący mutację synonimiczną może być stosowany jako kontrola we wszystkich badaniach porównawczych zamiast pasożyta WT.

Zastosowaliśmy system dwuplazmidowy do generowania zmutowanego pasożytastrażnika 32,35. Jednak skuteczność wprowadzenia SNP do locus docelowego można zwiększyć poprzez zastosowanie systemu z jednym plazmidem zamiast systemu z dwoma plazmidami41. W systemie z pojedynczym plazmidem wszystkie krytyczne elementy, które są wymagane do edycji genów za pośrednictwem CRISPR-Cas9, są włączone do jednego plazmidu zamiast dwóch. Pojedynczy plazmid koduje endonukleazę Cas9, transkrybuje sgRNA składające się z tracrRNA i przewodnika RNA oraz zawiera ramię homologiczne do naprawy pęknięcia dwuniciowego wprowadzonego przez endonukleazę Cas9 w miejscu docelowym. W układzie dwuplazmidowym pasożyty są współtransfekowane z obydwoma plazmidami. Ponieważ liczba pasożytów otrzymujących oba plazmidy jednocześnie w systemie dwuplazmidowym będzie niska w porównaniu z systemem z jednym plazmidem, wydajność edycji genów za pośrednictwem CRISPR jest niższa w systemie dwuplazmidowym w porównaniu z systemem z jednym plazmidem. Alternatywnie, można również zastosować strategię ratowania samobójstw42, w której ramię homologii jest dostarczane jako fragment liniowy lub w plazmidzie bez markera selekcji leku (plazmid ratunkowy). Endonukleaza Cas9 i przewodnik kodujący sgRNA RNA są dostarczane w plazmidzie zawierającym kasetę wyboru leku (plazmid samobójczy). Ponieważ fragment liniowy lub plazmid bez kasety wyboru leku jest bardziej narażony na utratę podczas replikacji pasożyta, pęknięcie dwuniciowe wprowadzone przez endonukleazę Cas9 w locus docelowym musi być łatwo naprawione przy użyciu ramienia homologicznego, które może być dostępne przez ograniczony czas. Ta strategia ma pewne zalety w porównaniu z systemem dwuplazmidowym, ponieważ jest bardziej wydajna i nie ma potrzeby subklonowania ramienia homologii w innym plazmidzie. Inne warianty edycji genu CRISPR-Cas9 mogą być również brane pod uwagę przy wprowadzaniu SNP w docelowym locus43.

Ręcznie wybraliśmy region przewodni do wprowadzenia podstawiania T145M w locus cdpk1 . Odpowiednią sekwencję prowadzącą do wprowadzenia dwuniciowego łamania w locus docelowym można wybrać za pomocą różnych ogólnodostępnych programów online, takich jak Chopchop44, CRISPOR45, CCTop46, Cas-OFFinder47. Oprogramowanie to, oprócz zapewnienia wydajności każdej sekwencji prowadzącej, zapewnia również wyniki poza celem i swoistości, co zwiększa wskaźnik sukcesu eksperymentu edycji genów za pośrednictwem CRISPR-Cas9.

Dostępne są różne metody transfekcji pasożytów malarii. Używamy pasożytów w stadium pierścieniowym do eksperymentów transfekcji48,49, jednak wstępne ładowanie erytrocytów plazmidami jest również z powodzeniem stosowane w badaniach transfekcji pasożytów50. W tej metodzie erytrocyty są transfekowane plazmidami pod określonym zestawem parametrów za pomocą elektroporacji, a następnie wykorzystywane do infekcji oczyszczonymi pasożytami w późnym stadium. Pasożyty atakują erytrocyty, które są wstępnie załadowane plazmidami. Podczas ich wzrostu w erytrocytach wstępnie załadowanych plazmidami, pasożyt pobiera plazmidowe DNA poprzez nieznany mechanizm50. Istnieje inna metoda, którą można zastosować do transfekcji pasożytów, która wymaga bardzo dojrzałych, oczyszczonych pasożytów w stadium schizonta do bezpośredniej transfekcji plazmidami. Przyrządem używanym do transfekcji oczyszczonych schizontów jest 4D-nucleofector51. Wybór metody transfekcji różni się w zależności od różnych grup badawczych w zależności od dostępnych zasobów i wskaźnika sukcesu. Dobrym pomysłem jest sprawdzenie, które z trzech metod sprawdzają się w grupie i zastosowanie jej w kolejnych eksperymentach transfekcyjnych. Dwie metody mogą być stosowane kolejno, aby jeszcze bardziej zwiększyć wydajność transfekcji. Na przykład, pierwszy etap transfekcji może wykorzystywać pasożyty w stadium pierścieniowym, a następnie dodawać świeże krwinki czerwone wstępnie załadowane plazmidami.

Wybraliśmy tylko kilka genów do analizy transkryptu u CDPK1T145M pasożytów w porównaniu z kontrolą na podstawie wcześniejszej literatury lub obecności członków rodziny CDPK. Jednak, aby uzyskać kompleksowy wgląd w globalne przeprogramowanie transkrypcji w transgenicznym pasożytze zawierającym hipomorficzny allel CDPK1 , można zastosować takie podejścia, jak RNA-Seq lub mikromacierz.

Metoda zastosowana w tym badaniu może być zastosowana do innych kinaz pasożyta malarii w celu zrozumienia rozwoju mechanizmów kompensacyjnych pod presją leków. Informacje uzyskane za pomocą tej techniki mogą być przydatne w strategicznym wdrażaniu leków skojarzonych w celu uniknięcia rozwoju i rozprzestrzeniania się oporności na leki. Celowanie w dwie lub wiele kinaz, które wykazują funkcjonalną komplementację, jest lepszą strategią niż celowanie w pojedyncze kinazy w celu kontroli i eliminacji malarii.

Oświadczenia

Autorzy nie pozostają w konflikcie interesów.

Podziękowania

Dziękujemy za wsparcie i udogodnienia dostępne za pośrednictwem Centralnego Ośrodka Instrumentacji, Szkoły Nauk Przyrodniczych, JNU. Podziękowania za wsparcie finansowe ze strony Katedry Biotechnologii (BT/PR28256/MED/29/1313/2018) dla AB są również mile widziane. Dziękujemy Jose-Juanowi Lopezowi-Rubio za dostarczenie plazmidów pL6eGFP i pUF1. Agencja finansująca nie odgrywa żadnej roli w przygotowaniu i podjęciu decyzji o publikacji pracy. MS jest stypendystą JRF-SRF Fellowship przyznawanego przez Radę ds. Badań Naukowych i Przemysłowych.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
1x koktajl inhibitorów fosforanówSigma-Aldrich04906 845001
AflIINEBR0520S
Albumax II Gibco11021-037
Przeciwciało anty-GSTThermoFisher ScientificG7781
Anti-Mouse HRPSigma-AldrichA4416
Anti-Rabbit HRPSigma-AldrichA6154
BamHINEBR3136S
BtgZ1NEBR0703S
WirówkaThermoFisher Wirówka ScientificSorvall legend micro 17R
(do granulowania komórek bakteryjnych)Wirówka ThermoFisher ScientificSorvall ST 8R
(do granulowania/przetwarzania pasożytów)ThermoFisherScientific Sorvall ST 8R (rotor TX-400)
DpnINEBRO1765
D-Sorbitol Sigma-AldrichS1876
E. coli BLR(DE3) pLysS kompetentne komórkiSigma-Aldrich69956
E. coli DH5a Kompetentne komórkiTakara Bio9057
Kuwety do elektroporacji, odstęp 0,2 cmElektroporator Bio1652086
RadGenePulser Xcell
femtoLUCENTTM PLUS HRP odczynnik chemiluminescencyjnyG-Bioscience7860-003
GentamycynaThermoFisher Scientific15750078
Giemsa StainHimediaS011-100ML
Glutation Sepharose 4BGE Healthcare17075601
HEPES, Wolny kwasMerck391338
HipoksantynaMerck4010CBC
Zestaw do klonowania HD w fuzjiTakara Bio1711641A
iQ SYBR Green SupermixBioRad1708880EDU
MBP, defosforylowany  Merck13-110
NotINEBR3189S
Nucleobond Xtra Maxi EF   Takara Bio740424
NucleoSpin Żel i mini zestaw do czyszczenia PCRTakara Bio740609
PercollGE Healthcare17-0891-01
mesylan p-nitrobenzylu (PNBM)AbcamAb138910
Primestar Max Polimeraza DNATakara BioR045A
Koktajl inhibitorów proteazyRoche
Zestaw do miniprzygotowania Qiaprep Spin Qiagen27106
QuikChange II XL zestaw do mutagenezy ukierunkowanejAgilent200521
RNeasy Mini zestawQiagen74104
RPMI-1640ThermoFisher Scientific31800-105
SaponinaSigma-Aldrich47036
Wodorowęglan soduSigma-AldrichS5761
SpeI-HFNEBR3133S
SuperScript III Zestaw do syntezy pierwszej niciThermoFisher Scientific18080-051
Ligaza DNA T4ThermoFisher Scientific15224017
Przeciwciało estru tiofosforanowegoAbcamAb92570
11836170001

Bibliografia

  1. World Health Organization. World Malaria Report 2023. , World Health Organization. Geneva. (2023).
  2. Rosenthal, P. J., Asua, V., Conrad, M. D. Emergence, transmission dynamics and mechanisms of artemisinin partial resistance in malaria parasites in Africa. Nat Rev Microbiol. 22 (6), 373-384 (2024).
  3. Rosenthal, P. J., et al. The emergence of artemisinin partial resistance in Africa: how do we respond. Lancet Infect Dis. S1473-3099 (24), 00141-00145 (2024).
  4. Woodrow, C. J., White, N. J. The clinical impact of artemisinin resistance in Southeast Asia and the potential for future spread. FEMS Microbiol Rev. 41 (1), 34-48 (2017).
  5. Amaratunga, C., Witkowski, B., Khim, N., Menard, D., Fairhurst, R. M. Artemisinin resistance in Plasmodium falciparum. Lancet Infect Dis. 14 (6), 449-450 (2014).
  6. Sharma, M., et al. CDPKs: The critical decoders of calcium signal at various stages of malaria parasite development. Comput Struct Biotechnol J. 19, 5092-5107 (2021).
  7. Dvorin, J. D., et al. A plant-like kinase in Plasmodium falciparum regulates parasite egress from erythrocytes. Science. 328 (5980), 910-912 (2010).
  8. Absalon, S., et al. Calcium-dependent protein kinase 5 is required for release of Egress-specific organelles in Plasmodium falciparum. mBio. 9 (1), e00130-e00218 (2018).
  9. Kumar, P., et al. Regulation of Plasmodium falciparum development by calcium-dependent protein kinase 7 (PfCDPK7). J Biol Chem. 289 (29), 20386-20395 (2014).
  10. Kumar, S., et al. Plasmodium falciparum calcium-dependent protein kinase 4 is critical for male gametogenesis and transmission to the mosquito vector. mBio. 12 (6), e0257521(2021).
  11. Ojo, K. K., et al. A specific inhibitor of PfCDPK4 blocks malaria transmission: chemical-genetic validation. J Infect Dis. 209 (2), 275-284 (2014).
  12. Ojo, K. K., et al. Transmission of malaria to mosquitoes blocked by bumped kinase inhibitors. J Clin Inves. 122 (6), 2301-2305 (2012).
  13. Fang, H., et al. Multiple short windows of calcium-dependent protein kinase 4 activity coordinate distinct cell cycle events during Plasmodium gametogenesis. Elife. 6, e26524(2017).
  14. Green, J. L., et al. The motor complex of Plasmodium falciparum: phosphorylation by a calcium-dependent protein kinase. J Biol Chem. 283 (45), 30980-30989 (2008).
  15. Ekka, R., Gupta, A., Bhatnagar, S., Malhotra, P., Sharma, P. Phosphorylation of Rhoptry protein RhopH3 is critical for host cell invasion by the malaria parasite. mBio. 11 (5), e00166-e00220 (2020).
  16. Kumar, S., et al. PfCDPK1 mediated signaling in erythrocytic stages of Plasmodium falciparum. Nat Commun. 8 (1), 63(2017).
  17. Bansal, A., et al. Characterization of Plasmodium falciparum calcium-dependent protein kinase 1 (PfCDPK1) and its role in microneme secretion during erythrocyte invasion. J Biol Chem. 288 (3), 1590-1602 (2013).
  18. Iyer, G. R., et al. Calcium-dependent phosphorylation of Plasmodium falciparum serine repeat antigen 5 triggers merozoite egress. J Biol Chem. 293 (25), 9736-9746 (2018).
  19. Alam, M. M., et al. Phosphoproteomics reveals malaria parasite Protein Kinase G as a signalling hub regulating egress and invasion. Nat Commun. 6, 7285(2015).
  20. More, K. R., et al. Phosphorylation-dependent assembly of a 14-3-3 mediated signaling complex during red blood cell invasion by Plasmodium falciparum merozoites. mBio. 11 (4), e01287-e01320 (2020).
  21. Bansal, A., et al. PfCDPK1 is critical for malaria parasite gametogenesis and mosquito infection. Proc Natl Acad Sci U S A. 115 (4), 774-779 (2018).
  22. Hengeveld, R. C., et al. Development of a chemical genetic approach for human aurora B kinase identifies novel substrates of the chromosomal passenger complex. Mol Cell Proteomics. 11 (5), 47-59 (2012).
  23. Bishop, A. C., et al. Design of allele-specific inhibitors to probe protein kinase signaling. Curr Biol. 8 (5), 257-266 (1998).
  24. Alaimo, P. J., Knight, Z. A., Shokat, K. M. Targeting the gatekeeper residue in phosphoinositide 3-kinases. Bioorg Med Chem. 13 (8), 2825-2836 (2005).
  25. Zhang, C., et al. A second-site suppressor strategy for chemical genetic analysis of diverse protein kinases. Nat Methods. 2 (6), 435-441 (2005).
  26. Ojo, K. K., et al. Toxoplasma gondii calcium-dependent protein kinase 1 is a target for selective kinase inhibitors. Nat Struct Mol Biol. 17 (5), 602-607 (2010).
  27. Lourido, S., et al. Calcium-dependent protein kinase 1 is an essential regulator of exocytosis in Toxoplasma. Nature. 465 (7296), 359-362 (2010).
  28. Rutaganira, F. U., et al. Inhibition of calcium dependent protein kinase 1 (CDPK1) by Pyrazolopyrimidine analogs decreases establishment and reoccurrence of central nervous system disease by Toxoplasma gondii. J Med Chem. 60 (24), 9976-9989 (2017).
  29. Lourido, S., et al. Optimizing small molecule inhibitors of calcium-dependent protein kinase 1 to prevent infection by Toxoplasma gondii. J Med Chem. 56 (7), 3068-3077 (2013).
  30. McRobert, L., et al. Gametogenesis in malaria parasites is mediated by the cGMP-dependent protein kinase. PLoS Biol. 6 (6), e139(2008).
  31. Taylor, H. M., et al. The malaria parasite cyclic GMP-dependent protein kinase plays a central role in blood-stage schizogony. Eukaryot Cell. 9 (1), 37-45 (2010).
  32. Bansal, A., et al. Reduced activity of mutant calcium-dependent protein kinase 1 is compensated in Plasmodium falciparum through the action of protein kinase G. mBio. 7 (6), e02011-e02016 (2016).
  33. Bansal, A., Molina-Cruz, A., Brzostowski, J., Mu, J., Miller, L. H. Plasmodium falciparum calcium-dependent protein kinase 2 is critical for male gametocyte exflagellation but not essential for asexual proliferation. mBio. 8 (5), e01656-e01717 (2017).
  34. Allen, J. J., et al. A semisynthetic epitope for kinase substrates. Nat Methods. 4 (6), 511-516 (2007).
  35. Ghorbal, M., et al. Genome editing in the human malaria parasite Plasmodium falciparum using the CRISPR-Cas9 system. Nat Biotechnol. 32 (8), 819-821 (2014).
  36. Trager, W., Jensen, J. B. Human malaria parasites in continuous culture. Science. 193 (4254), 673-675 (1976).
  37. van den Hoff, M. J., Moorman, A. F., Lamers, W. H. Electroporation in 'intracellular' buffer increases cell survival. Nucleic Acids Res. 20 (11), 2902(1992).
  38. Coteron, J. M., et al. Structure-guided lead optimization of triazolopyrimidine-ring substituents identifies potent Plasmodium falciparum dihydroorotate dehydrogenase inhibitors with clinical candidate potential. J Med Chem. 54 (15), 5540-5561 (2011).
  39. Krugliak, M., Ginsburg, H. The evolution of the new permeability pathways in Plasmodium falciparum--infected erythrocytes--a kinetic analysis. Exp Parasitol. 114 (4), 253-258 (2006).
  40. Ginsburg, H., Landau, I., Baccam, D., Mazier, D. Fractionation of mouse malarious blood according to parasite developmental stage, using a Percoll-sorbitol gradient. Ann Parasitol Hum Comp. 62 (5), 418-425 (1987).
  41. Zhang, W. W., Lypaczewski, P., Matlashewski, G. Optimized CRISPR-Cas9 genome editing for Leishmania and its use to target a multigene family, induce chromosomal translocation, and study DNA break repair mechanisms. mSphere. 2 (1), e00340-e00416 (2017).
  42. Lu, J., et al. A redesigned CRISPR/Cas9 system for marker-free genome editing in Plasmodium falciparum. Parasit Vectors. 9, 198(2016).
  43. Sharma, M., Bansal, A. CRISPR: a revolutionary tool for genome engineering in the protozoan parasites. , Genome Engineering via CRISPR-Cas9 System, Academic Press. (2020).
  44. Montague, T. G., Cruz, J. M., Gagnon, J. A., Church, G. M., Valen, E. CHOPCHOP: a CRISPR/Cas9 and TALEN web tool for genome editing. Nucleic Acids Res. 42 (Web Server issue), W401-W407 (2014).
  45. Haeussler, M., et al. Evaluation of off-target and on-target scoring algorithms and integration into the guide RNA selection tool CRISPOR. Genome Biol. 17, 148(2016).
  46. Stemmer, M., Thumberger, T., Del Sol Keyer, M., Wittbrodt, J., Mateo, J. L. CCTop: An intuitive, flexible and reliable CRISPR/Cas9 target prediction tool. PLoS One. 10 (4), e0124633(2015).
  47. Bae, S., Park, J., Kim, J. S. Cas-OFFinder: a fast and versatile algorithm that searches for potential off-target sites of Cas9 RNA-guided endonucleases. Bioinformatics. 30 (10), 1473-1475 (2014).
  48. Wu, Y., Sifri, C. D., Lei, H. H., Su, X. Z., Wellems, T. E. Transfection of Plasmodium falciparum within human red blood cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (4), 973-977 (1995).
  49. Fidock, D. A., Wellems, T. E. Transformation with human dihydrofolate reductase renders malaria parasites insensitive to WR99210 but does not affect the intrinsic activity of proguanil. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (20), 10931-10936 (1997).
  50. Deitsch, K., Driskill, C., Wellems, T. Transformation of malaria parasites by the spontaneous uptake and expression of DNA from human erythrocytes. Nucleic Acids Res. 29 (3), 850-853 (2001).
  51. Moon, R. W., et al. Adaptation of the genetically tractable malaria pathogen Plasmodium knowlesi to continuous culture in human erythrocytes. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (2), 531-536 (2013).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Kinazy białkowerodzina CDPKgenetyka chemicznaedycja CRISPR-Cas9oporność na lekiinhibicja kinazyprzeprogramowanie transkrypcyjne
Zrozumienie rozwoju szlaków kompensacyjnych u zmutowanego pasożyta malarii zawierającego hipomorficzny allel kinaz roślinopodobnych
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.