Genetyka chemiczna polega na zastąpieniu reszty strażnika aminokwasem zawierającym inny łańcuch boczny w docelowym locus. W tym przypadku wygenerowaliśmy zmutowanego pasożyta zawierającego hipomorficzny allel cdpk1 i zidentyfikowaliśmy szlaki kompensacyjne przyjęte przez pasożyta na tle mutacji.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Zrozumienie rozwoju szlaków kompensacyjnych u zmutowanego pasożyta malarii zawierającego hipomorficzny allel kinaz roślinopodobnych
* These authors contributed equally
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Jednym z mechanizmów osłabiania działania leków przez pasożyta malarii jest zmiana jego transkryptomu. Efekt ten jest bardziej wyraźny w przypadku genów docelowych należących do rodziny wielogenowej. Kinazy białkowe Plasmodium falciparum należące do rodziny CDPK są niezbędne do rozwoju krwi. W związku z tym CDPK są uważane za dobre cele dla rozwoju związków przeciwmalarycznych. Podejście oparte na genetyce chemicznej było historycznie stosowane do wyjaśnienia funkcji kinaz białkowych u wyższych eukariontów. Wymaga to zastąpienia reszty strażnika innym aminokwasem o innym łańcuchu bocznym poprzez manipulację genetyczną. Substytucja aminokwasów w pozycji strażnika moduluje aktywność kinazy białkowej i zmienia jej podatność na określoną klasę związków znanych jako inhibitory kinaz uderzeniowych (BKI), które pomagają w funkcjonalnej identyfikacji docelowego genu. W tym miejscu wykorzystaliśmy podejście genetyki chemicznej, aby zrozumieć mechanizmy kompensacyjne wyewoluowane przez zmutowanego pasożyta zawierającego hipomorficzny allel cdpk1. Ogólnie rzecz biorąc, nasze podejście pomaga w identyfikacji szlaków kompensacyjnych, które mogą być jednocześnie ukierunkowane w celu zapobiegania rozwojowi lekooporności na poszczególne kinazy.
Wprowadzenie
Malaria jest jedną z głównych chorób zakaźnych, która jest odpowiedzialna za miliony zgonów każdego roku, szczególnie u dzieci poniżej 5 roku życia1. Nie ma klinicznie dostępnej szczepionki przeciwko malarii. Co więcej, Plasmodium falciparum, najbardziej śmiercionośny pasożyt malarii u ludzi, jest znany z tego, że nabył oporność na lek pierwszej linii o nazwie artemizynina2,3,4,5. Istnieje pilna potrzeba zidentyfikowania nowych celów leków i nowatorskich strategii, które można szybko wdrożyć, aby uniknąć rozp....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
P. Szczep pasożyta falciparum (NF54) uzyskano od Alvaro Molina Cruz21,32,33. Ludzkie krwinki czerwone O+ użyte do hodowli pasożytów uzyskano z Rotary Blood Center w New Delhi w Indiach. Plazmidy pL6eGFP i pUF1 uzyskano od Jose-Juana Lopeza-Rubio. DSM267 uzyskano od Margaret A. Phillips i Pradipsinh K. Rathod. WR99210 dostarczyła firma Jacobus Pharmaceutical Company.
1. Budowa plazmidu do ekspresji rekombinowanego CDPK1 w Escherichia coli
- Zaprojektuj parę starterów o....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Rekombinowane białko CDPK1 typu WT jest wyrażane jako białko fuzyjne z N-końcowym znacznikiem Glutathione S-transferase (GST) i oczyszczane za pomocą chromatografii powinowactwa GST. Oczyszczone białko CDPK1 wykryto metodą Western blot przy użyciu przeciwciał anty-CDPK1 i anty-GST (Rycina 1). Pozostałość treoninowa gatekeepera (T145) w CDPK1 WT została zastąpiona Met oraz Ser za pomocą mutagenezy celowanej w celu wygenerowania rekombinowanych białek mutantów CDPK1T145M i CDPK1T145S (
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Wytwarzanie zmutowanego pasożyta transgenicznego zawierającego hipomorficzny allel cdpk1 opiera się na danych dotyczących aktywności kinazy in vitro z rekombinowanymi enzymami. Lepiej jest wygenerować jak najwięcej zmutowanych rekombinowanych białek z różnymi resztami strażnika. Ponieważ genom P. falciparum jest wysoce bogaty w AT, ekspresja rekombinowanych białek w E. Bakterie coli mogą wymagać optymalizacji kodonów. Pomoże to w kompleksowej ocenie substytucji strażnika w odn.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie pozostają w konflikcie interesów.
Podziękowania
Dziękujemy za wsparcie i udogodnienia dostępne za pośrednictwem Centralnego Ośrodka Instrumentacji, Szkoły Nauk Przyrodniczych, JNU. Podziękowania za wsparcie finansowe ze strony Katedry Biotechnologii (BT/PR28256/MED/29/1313/2018) dla AB są również mile widziane. Dziękujemy Jose-Juanowi Lopezowi-Rubio za dostarczenie plazmidów pL6eGFP i pUF1. Agencja finansująca nie odgrywa żadnej roli w przygotowaniu i podjęciu decyzji o publikacji pracy. MS jest stypendystą JRF-SRF Fellowship przyznawanego przez Radę ds. Badań Naukowych i Przemysłowych.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 1x koktajl inhibitorów fosforanów | Sigma-Aldrich | 04906 845001 | |
| AflII | NEB | R0520S | |
| Albumax II | Gibco | 11021-037 | |
| Przeciwciało anty-GST | ThermoFisher Scientific | G7781 | |
| Anti-Mouse HRP | Sigma-Aldrich | A4416 | |
| Anti-Rabbit HRP | Sigma-Aldrich | A6154 | |
| BamHI | NEB | R3136S | |
| BtgZ1 | NEB | R0703S | |
| Wirówka | ThermoFisher Wirówka Scientific | Sorvall legend micro 17R | |
| (do granulowania komórek bakteryjnych) | Wirówka ThermoFisher Scientific | Sorvall ST 8R | |
| (do granulowania/przetwarzania pasożytów) | ThermoFisher | Scientific Sorvall ST 8R (rotor TX-400) | |
| DpnI | NEB | RO1765 | |
| D-Sorbitol | Sigma-Aldrich | S1876 | |
| E. coli BLR(DE3) pLysS kompetentne komórki | Sigma-Aldrich | 69956 | |
| E. coli DH5a Kompetentne komórki | Takara Bio | 9057 | |
| Kuwety do elektroporacji, odstęp 0,2 cm | Elektroporator Bio | 1652086 | |
| Rad | GenePulser Xcell | ||
| femtoLUCENTTM PLUS HRP odczynnik chemiluminescencyjny | G-Bioscience | 7860-003 | |
| Gentamycyna | ThermoFisher Scientific | 15750078 | |
| Giemsa Stain | Himedia | S011-100ML | |
| Glutation Sepharose 4B | GE Healthcare | 17075601 | |
| HEPES, Wolny kwas | Merck | 391338 | |
| Hipoksantyna | Merck | 4010CBC | |
| Zestaw do klonowania HD w fuzji | Takara Bio | 1711641A | |
| iQ SYBR Green Supermix | BioRad | 1708880EDU | |
| MBP, defosforylowany | Merck | 13-110 | |
| NotI | NEB | R3189S | |
| Nucleobond Xtra Maxi EF | Takara Bio | 740424 | |
| NucleoSpin Żel i mini zestaw do czyszczenia PCR | Takara Bio | 740609 | |
| Percoll | GE Healthcare | 17-0891-01 | |
| mesylan p-nitrobenzylu (PNBM) | Abcam | Ab138910 | |
| Primestar Max Polimeraza DNA | Takara Bio | R045A | |
| Koktajl inhibitorów proteazy | Roche | ||
| Zestaw do miniprzygotowania Qiaprep Spin | Qiagen | 27106 | |
| QuikChange II XL zestaw do mutagenezy ukierunkowanej | Agilent | 200521 | |
| RNeasy Mini zestaw | Qiagen | 74104 | |
| RPMI-1640 | ThermoFisher Scientific | 31800-105 | |
| Saponina | Sigma-Aldrich | 47036 | |
| Wodorowęglan sodu | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| SpeI-HF | NEB | R3133S | |
| SuperScript III Zestaw do syntezy pierwszej nici | ThermoFisher Scientific | 18080-051 | |
| Ligaza DNA T4 | ThermoFisher Scientific | 15224017 | |
| Przeciwciało estru tiofosforanowego | Abcam | Ab92570 |
Bibliografia
- World Health Organization. World Malaria Report 2023. , World Health Organization. Geneva. (2023).
- Rosenthal, P. J., Asua, V., Conrad, M. D. Emergence, transmission dynamics and mechanisms of artemisinin partial resistance in malaria parasites in Africa. Nat Rev Microbiol. 22 (6), 373-384 (202....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
