Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Model in vitro integrujący sztywność i przepływ podłoża w celu zbadania odpowiedzi komórek śródbłonka

1.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/67081

⸱

19 lipca 2024

 ,  ,  ,  , 
1Chemical Engineering Department, Northeastern University, 2Bioengineering Department, Northeastern University, 3Laboratoire de BioMécanique et BioIngénierie (BMBI), UMR CNRS, Sorbonne Universités, Université de Technologie of Compiègne (UTC), 4Harvard John A. Paulson School of Engineering and Applied Sciences, Harvard University, 5Neuroscience Department, Albert Einstein College of Medicine

W tym artykule

Podsumowanie

Zsyntetyzowaliśmy i scharakteryzowaliśmy przestrajalny substrat na bazie żelatyny do hodowli komórek śródbłonka naczyń krwionośnych (EC) w odpowiednich warunkach przepływu naczyniowego. Ta biomimetyczna powierzchnia odtwarza zarówno warunki fizjologiczne, jak i patologiczne, umożliwiając badanie sił mechanicznych wpływających na zachowanie EC i pogłębiając naszą wiedzę na temat zdrowia naczyń krwionośnych i mechanizmów chorobowych.

Streszczenie

Prezentujemy innowacyjny model in vitro, którego celem jest zbadanie łącznego wpływu sztywności tkanki i naprężeń ścinających na funkcję komórek śródbłonka (EC), które są kluczowe dla zrozumienia zdrowia naczyń krwionośnych i wystąpienia chorób takich jak miażdżyca. Tradycyjnie, badania dotyczyły wpływu naprężeń ścinających i sztywności podłoża na EC, niezależnie. Jednak ten zintegrowany system łączy te czynniki, aby zapewnić bardziej precyzyjną symulację środowiska mechanicznego układu krwionośnego. Celem jest zbadanie mechanotransdukcji EC na różnych poziomach sztywności tkanek i warunkach przepływu przy użyciu ludzkich EC. Szczegółowo opisujemy protokół syntezy hydrożeli metakrylanu żelatyny (GelMA) o regulowanej sztywności i zasiewania ich EC w celu uzyskania konfluencji. Dodatkowo opisujemy projekt i montaż ekonomicznej komory przepływowej, uzupełnionej symulacjami obliczeniowej dynamiki płynów, w celu wygenerowania fizjologicznych warunków przepływu charakteryzujących się przepływem laminarnym i odpowiednimi poziomami naprężeń ścinających. Protokół obejmuje również znakowanie fluorescencyjne dla mikroskopii konfokalnej, umożliwiając ocenę odpowiedzi EC zarówno na podatność tkanek, jak i warunki przepływu. Poddając hodowane EC wielu zintegrowanym bodźcom mechanicznym, model ten umożliwia kompleksowe badania nad tym, w jaki sposób czynniki takie jak nadciśnienie i starzenie się mogą wpływać na funkcjonowanie EC i choroby naczyniowe, w których pośredniczy EC. Wnioski uzyskane dzięki tym badaniom będą miały zasadnicze znaczenie dla wyjaśnienia mechanizmów leżących u podstaw chorób naczyniowych oraz dla opracowania skutecznych strategii leczenia.

Wprowadzenie

Śródbłonek, wyściełający wewnętrzną powierzchnię naczyń krwionośnych, odgrywa kluczową rolę w utrzymaniu zdrowia naczyń krwionośnych. Komórki śródbłonka (EC) odgrywają kluczową rolę w regulacji różnych funkcji sercowo-naczyniowych, w tym kontroli tonu naczyń krwionośnych, selektywnej przepuszczalności, hemostazy i mechanotransdukcji1,2. Badania mocno powiązały dysfunkcję EC z pierwszorzędną rolą w rozwoju miażdżycy. Warto zauważyć, że EC napotykają różne siły mechaniczne na powierzchniach międzyfazowych, gdzie oddziałują z przepływem krwi i leżącymi pod nią tkankami naczyń krwionośnych3,4. W kilku badaniach powiązano dysfunkcję EC z nieprawidłowymi zmianami czynników mechanicznych w środowisku naczyniowym, takich jak naprężenie ścinające płynu spowodowane przepływem krwi i sztywnością tkanek5,6,7.

Jednakże, wcześniejsze badania nie poświęciły zbyt wiele uwagi zrozumieniu łącznego wpływu sztywności tkanki i naprężenia ścinającego na funkcję EC. Aby zwiększyć zdolność do przełożenia wyników badań na skuteczne metody leczenia miażdżycy i innych chorób sercowo-naczyniowych, konieczne jest ulepszenie modeli komórkowych stosowanych w tej dziedzinie. Znaczący postęp osiągnięto w humanizacji modeli komórkowych poprzez zastosowanie ludzkich EC i poddanie ich naprężeniom ścinającym lub substratom o różnych poziomach sztywności8,9,10. Jednak przyjęcie i udoskonalenie modeli komórkowych, które integrują środowiska dynamicznego przepływu z podłożami EC o regulowanych właściwościach sztywności, postępuje powoli. Wyzwanie polega na opracowaniu niepęczniejących substratów EC, aby zapobiec zmianom parametrów przepływu w kanale przepływowym, a jednocześnie ułatwić uprawę nienaruszonych i dobrze przylegających monowarstw EC. Model in vitro zdolny do pokonania tych przeszkód może ułatwić skuteczniejsze badania nad tym, w jaki sposób nadciśnienie, starzenie się i warunki przepływu wpływają na mechanotransdukcję EC, zdrowie naczyń krwionośnych i ostatecznie na rozwój miażdżycy. Opracowano różne metody wywierania naprężeń ścinających na komórki przy jednoczesnej kontroli sztywności podłoża, w tym obracające się płyty i urządzenia mikroprzepływowe. W metodzie płyty obrotowej komórki są umieszczane między dwiema płytami, a naprężenie ścinające jest przykładane poprzez ruch obrotowy płyt. Ta metoda jest mniej skomplikowana i zapewnia szybki model; Cierpi jednak z powodu przestrzennej zmienności naprężeń ścinających, z zerowym naprężeniem ścinającym w środku i maksymalnym naprężeniem ścinającym na obrzeżach11.

Z drugiej strony, urządzenia mikroprzepływowe reprezentują nową generację narzędzi z możliwością kontrolowania sztywności podłoża i warunków przepływu. Systemy te nadają się do naśladowania mikrokrążeń w warunkach przepływu laminarnego. Jednak badanie miażdżycy za pomocą takich urządzeń jest niepraktyczne, ponieważ miażdżyca występuje w dużych naczyniach o zaburzonym przepływie11. Niniejszy artykuł ma na celu wniesienie wkładu w krytyczną dziedzinę badawczą, jaką są badania EC, poprzez przedstawienie opłacalnego systemu zdolnego do badania wpływu różnych poziomów sztywności w podłożach EC w różnych warunkach przepływu. System integruje podłoża o różnej sztywności, aby naśladować patologiczne i fizjologiczne naczynia krwionośne. Protokół ten przedstawia metodę tworzenia hydrożeli na bazie żelatyny o poziomach pęcznienia i sztywności 5 kPa i 10 kPa, reprezentujących odpowiednio sztywność fizjologiczną i patologiczną. Dodatkowo szczegółowo opisano konstrukcję komory przepływowej z równoległą płytą, która jest w stanie zintegrować te podłoża. Obliczeniowa dynamika płynów (CFD) została wykorzystana do oceny naprężeń ścinających i warunków przepływu. Opisano przygotowanie hydrożeli do hodowli EC oraz przeprowadzenie 6-godzinnego eksperymentu przepływowego, a następnie omówiono poeksperymentowe barwienie immunologiczne.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Synteza GelMA

  1. Przygotować 0,2 M roztwór bezwodnego węglanu sodu i 0,2 M roztwór wodorowęglanu sodu.
  2. Zmieszać 46 ml roztworu wodorowęglanu sodu z 15 ml roztworu węglanu sodu i dodać 139 ml wody dejonizowanej (DI). Dostosuj pH do 9,5, używając 0,1 M NaOH i HCl, jeśli to konieczne.
  3. Dodać 10 g żelatyny typu A, 300 zakwitów ze skóry świni do 100 ml buforu węglanowo-wodorowęglanowego o stężeniu 10% w/v.
  4. Rozpuścić żelatynę w łaźni wodnej o temperaturze 55 °C, mieszając roztwór z prędkością 700 obr./min za pomocą mieszadła magnetycznego. Po całkowitym rozpuszczeniu dostosować pH roztworu żelatyny do 9,5 za pomocą 0,1 M NaOH.
  5. Aby rozpocząć metakrylację, należy dodać kroplami 938 μl bezwodnika metakrylowego (MAH) do roztworu. Popraw początkowy rozkład MAH w roztworze żelatyny, wstrzykując go w różnych miejscach, w tym na różnych głębokościach i odległościach promieniowych od środka.
  6. Owiń naczynie reakcyjne folią aluminiową, aby zapobiec ekspozycji na światło. Utrzymać temperaturę 55 °C i mieszać roztwór z prędkością 500 obr./min przez 1 godzinę, aby zakończyć reakcję (Rysunek 1A)12.
    UWAGA: Reakcja zatrzymuje się przy pH poniżej 7,4.
  7. Przygotować jedną zlewkę o pojemności 2 l zawierającą 1,8 l acetonu i jedną zlewkę o pojemności 0,6 l zawierającą 0,3 l acetonu.
  8. Powstały roztwór GelMA dodawać kroplami do zlewki o pojemności 2 l, mieszając z prędkością 200 obr./min, aby wywołać wytrącanie13. Aby zmaksymalizować zbieranie wytrąconego produktu, umieść pręt lub szpatułkę ze stali nierdzewnej jako miejsce zarodkowania w celu łatwiejszego przenoszenia.
  9. Przenieść produkt z większej zlewki do mniejszej i pozostawić na 10 minut przed przejściem do etapu suszenia. Wytrącony GelMA powinien pojawić się jako białe włókna.
  10. Zebrać produkt na papier chłonny, wysuszyć w piecu próżniowym w temperaturze pokojowej (RT) i przechowywać w temperaturze -20 °C do dalszego użycia.
    UWAGA: Dodatkowe szczegóły dotyczące charakterystyki chemicznej produktu za pomocą magnetycznego rezonansu jądrowego protonów (1H NMR) można znaleźć we wcześniej opublikowanym work8.

2. Zasolenie szkła

UWAGA: Dołączanie hydrożeli do szkiełek zapewnia płaską i równą powierzchnię, ułatwiając obsługę i zapewniając stabilność przy naprężeniach ścinających wynikających z przepływu. Funkcjonalizacja szkła metakrylanem 3-(trimetoksysililo)propylu jest niezbędna do poprawy właściwości powierzchni i umożliwienia kowalencyjnego przyłączania hydrożeli podczas procesu polimeryzacji.

  1. Precyzyjnie pokrój zwykłe szkiełka mikroskopowe (o grubości 1 mm) na kawałki podobne do ostatecznych wymiarów hydrożelu za pomocą noża do szkła. Umyj wycięte szkiełka mydłem, aby usunąć zanieczyszczenia powierzchniowe i zanieczyszczenia, które mogłyby utrudniać obróbkę szklanej powierzchni.
    UWAGA: W razie potrzeby sonikować szkiełka podstawowe przez 5 minut w etanolu, a następnie wysuszyć na powietrzu.
  2. Przygotować 0,5% roztwór metakrylanu 3-(trimetoksysililo)propylu w absolutnym etanolu. Przygotuj 10% lodowaty roztwór kwasu octowego w wodzie DI. Wymieszać roztwory, aby uzyskać końcowe stężenie 3% lodowatego kwasu octowego.
    UWAGA: Lodowaty roztwór kwasu octowego można przygotowywać w dużych ilościach i przechowywać.
  3. Uporządkuj szkiełka w szklanym pojemniku, aby upewnić się, że szklane powierzchnie nie są zasłonięte. Wlej powstały roztwór na szkiełka podstawowe i trzymaj je przez około 5 minut na kołysce z prędkością 80 obr./min, aby reakcja się zakończyła. Upewnij się, że obie strony szkiełek są zmodyfikowane poprzez usunięcie wszelkich uwięzionych pęcherzyków powietrza.
  4. Po zakończeniu reakcji odessać roztwór i umyć szkiełka alkoholem etylowym 2x. Wysuszyć szkiełka na powietrzu i przechowywać je w ciemności w temperaturze RT.
    UWAGA: W tych warunkach szkiełka zachowują swoją modyfikację przez 1 miesiąc.

3. Przygotowanie hydrożelu

  1. Wytwarzaj hydrożele przy użyciu metody polimeryzacji wolnorodnikowej indukowanej przez redoks.
    1. Zmontuj dwuczęściowe formy z politetrafluoroetylenu (PTFE) o odpowiedniej głębokości i otwieranych oknach 10 mm2, aby ukształtować końcowe podłoże. Uwzględnij 25% skurcz wysokości hydrożelu po polimeryzacji podczas procesu projektowania. Upewnij się, że formy są płaskie i mocno zamocowane na dolnej i górnej płycie, aby zapobiec wyciekom.
      UWAGA: Zaprojektowane wymiary formy są celowo o 10% większe niż zamierzony rozmiar hydrożelu. Taka konstrukcja służy wielu celom: zapobiega uszkodzeniom boków po oddzieleniu pleśni, zwiększa równość powierzchni hydrożelu poprzez wypychanie zanieczyszczeń lub pęcherzyków na boki oraz kompensuje przewidywany 25% skurcz po zrównoważeniu z powodu efektu synerezy, w którym silnie usieciowane hydrożele odpychają wodę po równowadze, powodując skurcz. Wielkość skurczu jest określona w protocol8.
    2. Aby zapewnić hydrożelom równą powierzchnię i stałą wysokość, należy zawiesić zmodyfikowane szkiełka szklane na górnej płycie formy, pozostawiając wąski otwór do wstrzykiwania roztworu polimeru. Użyj szkła nakrywkowego, aby zawiesić zmodyfikowane szkiełka podstawowe (Rysunek 1B).
    3. Aby stworzyć szkło nakrywkowe, wytnij zwykłe mikroskopijne szkło o 20% większe niż forma. Przymocuj dwie przekładki do krótszych boków. Oblicz grubość przekładki w następujący sposób:
      Grubość przekładki = 1,33 x końcowa grubość żelu + 1 (grubość modyfikowanego szkła) - głębokość formy
    4. Nałóż cienką warstwę smaru uszczelniającego kompatybilnego z komórkami na dłuższe boki szkła nakrywkowego, na tej samej powierzchni, na której przymocowane są przekładki.
    5. Przymocuj zmodyfikowany szkiełko do szkła nakrywkowego między dwoma przekładkami.
    6. Umieść szkło nakrywkowe na formie tak, aby przekładki przylegały do formy, a zmodyfikowane szkło rozciągało się do formy. Taki układ zapewnia prześwit 1,33 końcowej wysokości hydrożelu między zmodyfikowanym szkłem a dnem formy.
    7. Rozpuścić GelMA w wodzie DI o stężeniu 4% i 10% w/v dla hydrożeli o natężeniu odpowiednio 5 kPa i 10 kPa i umieścić w łaźni wodnej o temperaturze 45 °C.
      UWAGA: GelMA jest polimerem termoczułym i utrzymywanie temperatury roztworu na poziomie 45 °C zapobiega krzepnięciu przed polimeryzacją i zmniejsza lepkość roztworu, co ma kluczowe znaczenie przy wytwarzaniu płaskich hydrożeli.
    8. Dodać TEMED (24 mM dla hydrożelu 5 kPa, 6,25 mM dla hydrożelu 10 kPa) do roztworu polimeru i dokładnie wymieszać.
      UWAGA: Sam TEMED nie inicjuje polimeryzacji, więc przed kontynuowaniem upewnij się, że formy, pipety i roztwory są przygotowane.
    9. Dodać APS (24 mM dla hydrożelu 5 kPa, 24,5 mM dla hydrożelu 10 kPa) do roztworu GelMA i dokładnie wymieszać.
      UWAGA: Dodanie APS inicjuje polimeryzację, a hydrożele mogą tworzyć się szybko, co wymaga natychmiastowego działania, aby zapobiec wadliwym hydrożelom. Więcej szczegółów na temat pomiarów sztywności można znaleźć we wcześniej opublikowanym work8.
    10. Ostrożnie odpipetować powstały roztwór do otworu między zawieszonym szkiełkiem podstawowym a formą w temperaturze pokojowej i pozwolić mu na usieciowanie. Siła kapilarna napędza roztwór polimeru do formy. Należy unikać dodawania pęcherzyków powietrza do żeli i przerwać pipetowanie, gdy w końcówce pipety pozostanie niewielka ilość roztworu.
      UWAGA: Podczas polimeryzacji grupy metakrylanowe GelMA reagują z pozostałościami metakrylanu na zmodyfikowanych szkiełkach, powodując chemiczne przyłączenie hydrożelu do szkła.
    11. Po 15 minutach reakcja jest zakończona. Odłącz podłoże od formy za pomocą ostrego przedmiotu, takiego jak igła, i odsuń podłoże od szkła nakrywkowego, aby je oddzielić.
    12. Przenieść hydrożele do 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) na 100 mm szalce Petriego uszczelnionej folią z tworzywa sztucznego i zrównoważyć w temperaturze 37 °C w celu usunięcia pozostałych reagentów i produktów ubocznych.
    13. Ponieważ hydrożel jest nieco większy niż ostateczne wymiary, przyciąć nadmiar żelu po bokach, aby dopasować go do wymiarów wymaganych dla okna komory przepływowej.
    14. Użyj komory przepływowej, aby sprawdzić wymiary hydrożelu. Upewnij się, że hydrożel jest prawidłowo dopasowany do komory przepływowej bez przerw między hydrożelem a formą lub jakichkolwiek wad, które mogłyby wpłynąć na wzorce przepływu. Jeśli występują nieprawidłowości kształtu, które mogą wpływać na wzór przepływu w komorze przepływowej, prowadząc do niekorzystnego zachowania komórek, zachowaj hydrożel na warunki statyczne.
    15. Przenieść cztery hydrożele na szalkę Petriego zawierającą 1x PBS w celu sterylizacji.
  2. Wysterylizuj hydrożel zgodnie z poniższym opisem, używając 70% etanolu.
    1. Przygotuj 25%, 50% i 70% roztwory alkoholu do stopniowego odwadniania hydrożelu.
      UWAGA: Jeśli nie zostanie przeprowadzone stopniowe odwodnienie, sztywniejsze hydrożele mogą kurczyć się i pękać, podczas gdy na powierzchni bardziej miękkich hydrożeli mogą tworzyć się zmarszczki.
    2. Odessać 1x roztwór PBS z szalki Petriego zawierającej hydrożele. Dodać 25% roztwór etanolu do każdej szalki Petriego, aby zanurzyć hydrożele o natężeniu 5 kPa i 10 kPa na 15 minut.
    3. Odessać 25% roztwór alkoholu. Dodać 50% roztwór alkoholu do każdej szalki Petriego, aby zanurzyć hydrożele o natężeniu 5 kPa i 10 kPa na 15 minut.
    4. Odessać 50% roztwór alkoholu. Dodać 70% roztwór alkoholu do każdej szalki Petriego, zanurzając hydrożele o natężeniu 5 kPa i 10 kPa na 5 minut. Umieść szalkę Petriego na shakerze z prędkością 100 obr./min.
    5. Hydrożele o ciśnieniu 5 kPa pozostawić zanurzone na 40 minut, a hydrożele o natężeniu 10 kPa na 20 minut
      UWAGA: Zaobserwowano, że hydrożele o natężeniu 5 kPa są bardziej podatne na zanieczyszczenie w porównaniu z hydrożelami o natężeniu 10 kPa.
    6. Przenieść próbki na płytkę 6-dołkową w komorze bezpieczeństwa biologicznego i umyć hydrożele 2x-3x za pomocą sterylnego PBS.

4. Hydrożele powlekające

  1. Przygotuj roztwór żelatyny o stężeniu 60 μg/ml, rozpuszczając 3 mg żelatyny w 50 ml sterylnego PBS (1x z solą magnezu i wapnia). Podgrzewać roztwór w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C przez 30 minut lub do momentu, gdy cała żelatyna całkowicie się rozpuści.
  2. Sterylnie przefiltrować roztwór powlekający za pomocą filtra strzykawkowego 0,2 μm. Odessać 1x roztwór PBS z każdej płytki dołka i dodać roztwór żelatyny do każdej studzienki, zapewniając całkowite pokrycie każdego hydrożelu. Aby zminimalizować ryzyko zanieczyszczenia, do roztworu powlekającego dodać 40 jednostek/ml penicyliny i 10 μg/ml streptomycyny.
  3. Inkubować każdą płytkę dołka w inkubatorze o temperaturze 37 °C, 5% CO2 przez 45 minut. Przemyć hydrożele 1x roztworem PBS.
  4. Odessać PBS i dodać pożywkę do hodowli komórkowych.
  5. Nie dłużej niż dwa dni należy przechowywać hydrożele w pożywkach do hodowli komórkowych i inkubować je w inkubatorze o temperaturze 37 °C, 5% CO2 do momentu wysiewu komórek.
    UWAGA: Pomimo doskonałych właściwości przyczepiania komórek fibronektyny, istnieje obawa o jej stosowanie ze względu na EC deponujące endogenną fibronektynę w stanach miażdżycowych, co może prowadzić do odpowiedzi prozapalnej. Aby uniknąć chemicznie stymulowanych odpowiedzi komórkowych, powstrzymujemy się od stosowania fibronektyny. Ponadto Orr i wsp. wykazali, że powłoka fibronektyny, w porównaniu z powłoką kolagenu I, zwiększa regulację genów miażdżycowych. W szczególności zaobserwowali zwiększone poziomy ekspresji cząsteczki adhezji międzykomórkowej 1 (ICAM-1), cząsteczki adhezji komórek naczyniowych 1 (VCAM-1) i czynnika jądrowego-κB (NF-κB)14.

5. Wysiewanie komórek na podłożach

  1. Przygotuj zawiesinę komórek zgodnie z dostępnymi protokołami odłączania i policz komórki za pomocą hemocytometru8.
  2. Dokładnie odessać pożywkę z hydrożeli. Dodaj 50 000 komórek/cm2 do każdej próbki. Dodaj odpowiednią objętość zawiesiny komórek do każdej próbki, aby zapobiec przepełnieniu komórek.
    UWAGA: Sztywniejsze podłoża są bardziej hydrofobowe; Dlatego zminimalizuj czas między krokami, aby poprawić zwilżalność i dyspersję zawiesiny komórek na powierzchni podłoża.
  3. Inkubować hydrożele nasienne komórkami w inkubatorze o temperaturze 37 °C, 5% CO2 przez 2 godziny. Dodać pożywkę do hodowli komórkowych do próbek, gdy komórki zostaną przyłączone do żeli.

6. Produkcja komory przepływowej

UWAGA: Podejście do projektowania komory przepływowej jest opłacalne i wymaga minimalnej wiedzy specjalistycznej w zakresie produkcji i użytkowania.

  1. Użyj poli(metakrylanu metylu) do produkcji komory, aby wizualnie ocenić jakość przepływu, integralność hydrożelu pod wpływem naprężeń ścinających oraz potencjalne badania biomarkerów w czasie rzeczywistym podczas eksperymentów przepływowych. Projekt studzienki został stworzony przy użyciu oprogramowania do projektowania wspomaganego komputerowo (CAD). Komora przepływowa została zgłoszona do opatentowania, a szczegóły dotyczące tego urządzenia nie mogą być ujawnione w niniejszym protokole.
  2. Obliczeniowa ocena warunków przepływu w komorze przepływowej
    1. Zmontuj poszczególne elementy zaprojektowanej studzienki przepływowej (. SLDPRT), aby utworzyć ostateczną konfigurację komory.
    2. Narysuj linię wzdłuż linii środkowej przepływu stycznego do powierzchni hydrożelu, aby przeanalizować naprężenie ścinające. Zamknij otwory wlotowe i wylotowe, aby zdefiniować zamkniętą objętość regulacyjną.
    3. Otwórz aplikację Flow Simulation z zakładki Dodatki w oprogramowaniu CAD. Na karcie Symulacja przepływu otwórz funkcję Kreator, aby wprowadzić właściwości. Określ układ jednostek ciśnienia i dostosuj ciśnienie oraz jednostki naprężenia do dyn/cm2.
    4. Sprawdź przepływ płynu i grawitację w cechach fizycznych. Ustaw grawitację na -9,8 w składowej Z; Składowe X i Y powinny mieć wartość zero.
    5. Wybierz opcję Wewnętrzna dla typu analizy w obszarze Obsługa geometrii. Wybierz Woda jako domyślny płyn.
      UWAGA: Załóżmy, że podłoże zachowuje się jak woda.
    6. Wybierz Laminarny i Turbulentny jako typ przepływu. Zdefiniuj ścianę jako ścianę adiabatyczną i wprowadź chropowatość powierzchni w polu Stan ściany.
    7. Ustaw temperaturę na 37.5 °C (310.65 K) w warunkach początkowych. Zdefiniuj domenę obliczeniową w projektach symulacji przepływu, upewniając się, że obejmuje ona całą objętość kontrolną.
    8. Wybierz wszystkie ściany współpracujące z płynem, aby zdefiniować poddomenę płynu. W polu Warunek brzegowy oznacz wewnętrzną powierzchnię pokrywy wlotu jako przepływ objętościowy na wlocie i określ natężenie przepływu (Q) oraz przepływ równomierny. Następnie przypisz wewnętrzną powierzchnię uszczelnienia pokrywy wylotowej jako ciśnienie statyczne.
    9. Określ globalny rozmiar siatki na podstawie dostępnych zasobów obliczeniowych. Naciśnij przycisk Uruchom, aby rozpocząć symulację.
    10. Po zakończeniu przejrzyj żądane wyniki, w tym wykresy naprężeń ścinających i symulacje przepływu.
    11. Powtórz kroki od 6.2.8 do 6.2.10 z różnymi natężeniami przepływu, aby obliczyć przyłożone naprężenie ścinające przy różnych prędkościach. Użyj analizy regresji, aby ustalić zależność natężenia przepływu od naprężenia ścinającego.
    12. Oceń tolerancję systemu na zmiany wymiarów hydrożelu, aby zwiększyć realizm symulacji.

7. Uruchom równomierny przepływ laminarny

  1. Po wyhodowaniu komórek na hydrożelach o natężeniu 5 kPa i 10 kPa należy zapewnić konfluencję monowarstwy komórek w inkubatorze o temperaturze 37 °C i 5% CO2 . Należy uzyskać monowarstwę komórek na każdym hydrożelu.
  2. Sterylizuj autoklawowalne elementy systemu komór z przepływem równoległym (ze stali nierdzewnej, szpatułka, kleszcze, uszczelka i zbiornik pożywki) w 30-minutowym cyklu autoklawu grawitacyjnego. Wysterylizuj inne części (elementy akrylowe i uszczelniacz/przepustnice zbiorników) za pomocą ekspozycji na światło UV.
  3. Zamontuj urządzenie z komorą przepływową w szafie bezpieczeństwa biologicznego. Zabezpiecz próbki hydrożelu w urządzeniu, zapewniając jednorodność. Należy użyć wypełniacza o takiej samej wielkości jak hydrożele, jeśli dostępna jest niewystarczająca liczba próbek do przepływu.
  4. Wstępnie zwilż wewnętrzną powierzchnię komory i powierzchnie hydrożelowe, aby zminimalizować tworzenie się pęcherzyków i zapobiec wysychaniu komórek podczas montażu.
  5. Dodaj wystarczającą ilość mediów do zbiornika wlotowego, umożliwiając przepływ 20%-30% mediów do zbiornika wylotowego po montażu. Uszczelnić szczelnie zbiornik wlotowy za pomocą przepustnicy/uszczelniacza.
    UWAGA: Wzrost ciśnienia w zbiorniku wlotowym napędza przepływ, a wszelkie wycieki powietrza zmieniają natężenie przepływu. Sprawdź, czy nie ma wad uszczelniacza, jeśli w zewnętrznej rurce tworzą się bąbelki.
  6. Ustaw przepustnicę wylotową na ciśnienie atmosferyczne, aby ustalić różnicę ciśnień. Umieścić urządzenie i zbiorniki w inkubatorze o temperaturze 37 °C, 5% CO2 . Podłącz rurkę urządzenia do pompy perystaltycznej umieszczonej na zewnątrz inkubatora (Rysunek 1C).
  7. Włącz pompę, aby rozpocząć aplikację 3,6 dyn/cm2. Stopniowo zwiększaj natężenie przepływu o 2 ml/min (np. osiągnąć 85 ml/min z 65 ml/min po 10 minutach), aż do zastosowania około 8 dyn/cm2.
  8. Dalsze zwiększanie natężenia przepływu o 2,5 ml/min aż do osiągnięcia 12 dyn/cm2 naprężenia ścinającego.
    UWAGA: Daj komórkom czas na przystosowanie się do warunków dynamicznych, ponieważ szybki wzrost natężenia przepływu może oderwać ogniwa i uszkodzić monowarstwę.
  9. Po 6 godzinach zatrzymaj przepływ, wyjmij urządzenie z inkubatora i zdemontuj komorę przepływową. Następnie przenieś próbki hydrożelu na płytkę sześciodołkową.
  10. Umyj próbki lodowatym PBS i albo utrwal komórki do barwienia immunologicznego, albo poddaj je lizie w celu izolacji białka.

8. Układ barwienia immunologicznego do mikroskopii konfokalnej z dużym powiększeniem

UWAGA: Aby zwiększyć efektywność badań, opracowano metodę barwienia immunologicznego małych porcji hydrożeli, umożliwiając badanie wielu celów biologicznych w jednej próbce.

  1. Przygotuj stemple do biopsji lub preferowane narzędzia tnące o średnicy 3 lub 4 mm.
  2. Użyj pudełka na końcówki do pipet jako komory do barwienia. Nawilż komorę, aby kontrolować parowanie roztworu barwiącego podczas przedłużonej inkubacji, umieszczając mokry ręcznik papierowy na dnie pudełka z końcówkami do pipet.
  3. Zmniejsz zużycie przeciwciał, tworząc małe pule roztworów dla poszczególnych próbek. Przykryj stojak na pudełka na końcówki przezroczystą folią, delikatnie dociskając folię do otworów stojaka opuszkiem palca, aby uzyskać wgłębienia. Wypełnij wgłębienia 70 μl PBS.
  4. Przenieś pojedynczy hydrożel na pustą szalkę Petriego i pokrój go za pomocą stempla do biopsji lub preferowanego narzędzia tnącego. Użyj mikroskopu, aby wyciąć reprezentatywny obszar próbki. Wytnij pełny cylinder żelowy, aby uniknąć problemów z mikroskopią konfokalną.
  5. Umieść pocięte próbki hydrożelu w wgłębieniach utworzonych w kroku 8.3. Wykonaj barwienie zgodnie ze standardowym protokołem15. Po ostatnim praniu barwiącym należy uzyskać arkusz kauczuku silikonowego o grubości odpowiadającej grubości hydrożelu.
    UWAGA: Najlepiej użyć arkusza z jedną lepką stroną, aby uzyskać lepsze uszczelnienie. W tym badaniu włókna aktyny barwiono przy użyciu fluorescencyjnego przeciwciała drugorzędowego sprzężonego z falloidyną w rozcieńczeniu 1:20.
  6. Pokrój arkusz gumy na kwadraty o wymiarach 15 mm x 15 mm. Przebij otwór o średnicy 6 mm za pomocą dziurkacza do biopsji lub preferowanego narzędzia tnącego.
  7. Utwórz pojemnik na próbkę, przymocowując gumę do szkiełka nakrywkowego do mikroskopii (nr 1.5). Dodać 10 μl mokrego podłoża montażowego do wgłębień, gdy próbka jest jeszcze obecna i inkubować ją w ciemności przez 10-15 min.
    UWAGA: W tym badaniu podłoże montażowe zawierało 0,9 μg / ml 4',6-diamidino-2-fenyloindolu (DAPI) w celu skrócenia protokołu barwienia.
  8. Wyjąć próbkę z komory barwienia i umieścić ją w pojemniku utworzonym w kroku 8.7. Nałóż 1-2 μl podłoża montażowego na próbkę.
    UWAGA: Ilość nośników montażowych wpływa na jakość obrazu przy dużych powiększeniach. Nadmierna lub niewystarczająca ilość nośników montażowych może pogorszyć klarowność obrazu.
  9. Umieść kolejne szkiełko nakrywkowe na górze i delikatnie dociśnij, aby upewnić się, że próbka styka się ze szkłem. Przechowywać próbki w temperaturze 4 °C w ciemności do czasu obrazowania mikroskopowego.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Rycina 1 przedstawia schemat eksperymentalny, zarysowując proces syntezy GelMA poprzez reakcję metakrylowania. Otrzymany produkt został następnie wykorzystany do wytworzenia podłoża hydrożelowego, na którym zasiano EC. Następnie komórki wprowadzono do komory przepływowej w celu przeprowadzenia 6 h eksperymentu przepływowego przy wartości 12 dyne/cm2.

1W celu oceny przebiegu reakcji metakryloylacji wykorzystano spektroskopię H NMR. (

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Układ naczyniowy jest dynamicznym środowiskiem, w którym różne siły znacząco wpływają na zachowanie komórek. Badanie zdarzeń biologicznych w chorobach sercowo-naczyniowych bez uwzględnienia tych sił byłoby niedokładne. Dlatego kluczowe znaczenie mają modele komórkowe zdolne do naśladowania mechanicznego środowiska naczyniowego. Naukowcy poczynili już znaczne postępy w podkreślaniu wpływu tych sił na zachowanie komórek11. Jednak, aby zrozumieć zachowanie komórek zarówno w warunkach patologicznych, ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że zostało złożone tymczasowe zgłoszenie patentowe (nr 63/634,853) pod tytułem Komora przepływowa z mechanicznie przestrajalnym substratem i że nie istnieją żadne inne konkurencyjne interesy.

Podziękowania

Autorzy wyrażają swoją wdzięczność Robertowi Eganowi za pomoc w budowie komory przepływowej. Autorzy dziękują Lucasowi McCauleyowi za jego pomoc podczas eksperymentów. Ponadto chcieliby podziękować Instytutowi Obrazowania Chemicznego Systemów Żywych (CILS) Uniwersytetu Północno-Wschodniego, które przyznały dostęp do mikroskopów konfokalnych. Autorzy doceniają wsparcie finansowe udzielone przez National Institutes of Health (NIH 1R01EB027705 przyznane SB) i National Science Foundation (NSF CAREER Awards: DMR 1847843 do SB i CMMI 1846962 do EE).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Metakrylan (trimetoksysililo)propylu, tetrametyloetylenodiamina (TEMED)Invitrogen15524-010Hydrożel Produkcja
3-(trimetoksysililo)metakrylanu propyluSigma-Aldrich440159Zasolenie szkła
',6-diamidino-2-fenyloindol (DAPI)Nośniki montażowe Vector LaboratoriesH-1200Barwienie immunologiczne
AcetonThermo Fisher ScientificsA18-4GelMA Synteza
Alexa Fluor 555 Falloidyna Technologia sygnalizacji komórkowej8953SBarwienie immunologiczne
Nadsiarczan amonu (APS)Bio-Rad1610700Hydrożel Produkcja
Przezroczysty, odporny na zarysowania i promieniowanie UV odlewany arkusz akrylowy (45/64 '')McMaster-CARR8560K165produkcji komory przepływowej
Carl Zeiss Meditex AGBarwienie
immunologiczne Zeiss LSM 800Covidien Monoject Rigid Pack 60 ml strzykawki bez igiełFisher   22-031-375EC Flow Experiment
 American Type Culture Collection (ATCC)PCS-100-041Etanol do hodowli komórkowych
200 ProofDecon Labs2701Zasolenie szkła
Żelatyna typu A (300 kwitnienia) ze skóry świniSigma-AldrichG1890GelMA Synteza
Lodowaty kwas octowyThermo Fisher Scientifics9526-33Zasolenie szkła
Silikon wysokotemperaturowy o wysokiej czystości Arkusz gumowyMcMaster-Carr87315K74Produkcja komory przepływowej
Ludzkie komórki śródbłonka żyły pępowinowej (HUVEC)Kolekcja kultur typu amerykańskiego (ATCC)PSC-100-010Hodowla komórkowa
maszynowe M3x30mm Śruba z okrągłym z gniazdem sześciokątnym 304 mocujące ze stali nierdzewnej 20 sztukUxcellB07Q5RM2TPProdukcja
komory przepływowejNapęd cyfrowy Masterflex L/S z funkcją Easy-Load® 3 Głowica pompy do przewodów precyzyjnych; Eksperyment przepływu 115/230 VACVWR#MFLX77921-65 
Przewody pompy precyzyjnej Masterflex L/S, Puri-Flex, L/S 25; Eksperyment25 stóp VWR#MFLX96419-25 
Bezwodnik metakrylowy (MAH)Sigma-Aldrich276685GelMA Synteza
paraformaldehyduThermo Fisher Scientifics043368.9MHodowla komórkowa
soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS)Gibco14080-055Ogólny
wodorowęglan soduFisher ChemicalS233-3Synteza GelMA
Węglan soduFisher ChemicalS263-500Synteza GelMA
Wersja edukacyjna
SOLIDWORKS Student Edition, 2023SolidWorksN/AFlow Chamber Design
Vascular Basal MediumType Culture Collection (ATCC)PCS-100-030 Hodowlakomórkowa
4 Mikroskop konfokalny do Zestaw do wzrostu z przepływem SOLIDWORKS Wersja edukacyjna American

Bibliografia

  1. Deanfield, J. E., Halcox, J. P., Rabelink, T. J. Endothelial function and dysfunction. Circulation. 115 (10), 1285-1295 (2007).
  2. Suowen, X., et al. Endothelial dysfunction in atherosclerotic cardiovascular diseases and beyond: From mechanism to oharmacotherapies. Pharmacol Rev. 73 (3), 924(2021).
  3. Jansen, K. A., Atherton, P., Ballestrem, C. Mechanotransduction at the cell-matrix interface. Sem Cel Dev Biol. 71, 75-83 (2017).
  4. Tarbell, J. M., Pahakis, M. Y. Mechanotransduction and the glycocalyx. J Int Med. 259 (4), 339-350 (2006).
  5. Topper, J. N., Cai, J., Falb, D., Gimbrone, M. A. Identification of vascular endothelial genes differentially responsive to fluid mechanical stimuli: cyclooxygenase-2, manganese superoxide dismutase, and endothelial cell nitric oxide synthase are selectively up-regulated by steady laminar shear stress. Proc Natl Acad Sci. 93 (19), 10417-10422 (1996).
  6. Mitchell, G. F., et al. Arterial stiffness and cardiovascular events. Circulation. 121 (4), 505-511 (2010).
  7. Bonetti, P. O., Lerman, L. O., Lerman, A. Endothelial dysfunction. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 23 (2), 168-175 (2003).
  8. Hamrangsekachaee, M., et al. Endothelial glycocalyx sensitivity to chemical and mechanical sub-endothelial substrate properties. Front Bioeng Biotechnol. 11, 1250348(2023).
  9. Mensah, S. A., et al. Flow-regulated endothelial glycocalyx determines metastatic cancer cell activity. FASEB J. 34 (5), 6166-6184 (2020).
  10. Russell-Puleri, S., et al. Fluid shear stress induces upregulation of COX-2 and PGI2 release in endothelial cells via a pathway involving PECAM-1, PI3K, FAK, and p38. Am J Physiol-Heart Cir Physiol. 312 (3), H485-H500 (2016).
  11. Hamrangsekachaee, M., Wen, K., Bencherif, S. A., Ebong, E. E. Atherosclerosis and endothelial mechanotransduction: current knowledge and models for future research. Am J Physiol-Cell Physiol. 324 (2), C488-C504 (2022).
  12. Zhu, M., et al. Gelatin methacryloyl and its hydrogels with an exceptional degree of controllability and batch-to-batch consistency. Sci Rep. 9 (1), 6863(2019).
  13. Kim, J., Bencherif, S. A., Li, W. A., Mooney, D. J. Cell-friendly inverse opal-like hydrogels for a spatially separated co-culture system. Macromol Rapid Comm. 35 (18), 1578-1586 (2014).
  14. Orr, A. W., et al. The subendothelial extracellular matrix modulates NF-kappaB activation by flow: a potential role in atherosclerosis. J Cell Biol. 169 (1), 191-202 (2005).
  15. Hamrangsekachaee, M., Baumann, H. J., Pukale, D. D., Shriver, L. P., Leipzig, N. D. Investigating mechanisms of subcutaneous preconditioning incubation for neural stem cell embedded hydrogels. ACS Appl Bio Mater. 5 (5), 2176-2184 (2022).
  16. Rezaeeyazdi, M., Colombani, T., Memic, A., Bencherif, S. A. Injectable hyaluronic acid-co-gelatin cryogels for tissue-engineering applications. Materials. 11 (8), 1374(2018).
  17. Belvitch, P., Htwe, Y. M., Brown, M. E., Dudek, S. Cortical actin dynamics in endothelial permeability. Curr Top Membr. 82, 141-195 (2018).
  18. Krishnamoorthy, S., Noorani, B., Xu, C. Effects of encapsulated cells on the physical-mechanical properties and microstructure of gelatin methacrylate hydrogels. Int J Mol Sci. 20 (20), 5061(2019).
  19. Jin, Q., et al. Bioprinting small-diameter vascular vessel with endothelium and smooth muscle by the approach of two-step crosslinking process. Biotechnol Bioeng. 119 (6), 1673-1684 (2022).
  20. Villard, P., et al. Autoclavable and injectable cryogels for biomedical applications. Adv Healthcare Mater. 8 (17), 1900679(2019).
  21. Bencherif, S. A., et al. Influence of cross-linker chemistry on release kinetics of PEG-co-PGA hydrogels. J Biomed Mater Res A. 90 (1), 142-153 (2009).
  22. Rogers, Z. J., Zeevi, M. P., Koppes, R., Bencherif, S. A. Electroconductive hydrogels for tissue engineering: Current status and future perspectives. Bioelectricity. 2 (3), 279-292 (2020).
  23. James, B. D., Allen, J. B. Vascular endothelial cell behavior in complex mechanical microenvironments. ACS Biomater Sci Eng. 4 (11), 3818-3842 (2018).
  24. Yeh, Y. T., et al. Matrix stiffness regulates endothelial cell proliferation through septin 9. PLoS One. 7 (10), e4688(2012).
  25. Fioretta, E. S., Fledderus, J. O., Baaijens, F. P. T., Bouten, C. V. C. Influence of substrate stiffness on circulating progenitor cell fate. J Biomech. 45 (5), 736-744 (2012).
  26. Geemen, D. v, et al. F-Actin-anchored focal adhesions distinguish endothelial phenotypes of human arteries and veins. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 34 (9), 2059-2067 (2014).
  27. Dessalles, C. A., Leclech, C., Castagnino, A., Barakat, A. I. Integration of substrate- and flow-derived stresses in endothelial cell mechanobiology. Comm Biol. 4 (1), 764(2021).
  28. Estrada, R., Giridharan, G. A., Nguyen, M. D., Prabhu, S. D., Sethu, P. Microfluidic endothelial cell culture model to replicate disturbed flow conditions seen in atherosclerosis susceptible regions. Biomicrofluidics. 5 (3), 32006(2011).
  29. Inglebert, M., et al. The effect of shear stress reduction on endothelial cells: A microfluidic study of the actin cytoskeleton. Biomicrofluidics. 14 (2), 024115(2020).
  30. Noria, S., et al. Assembly and reorientation of stress fibers drives morphological changes to endothelial cells exposed to shear stress. Am J Pathol. 164 (4), 1211-1223 (2004).
  31. Amer, M., Shi, L., Wolfenson, H. The 'Yin and Yang' of cancer cell growth and mechanosensing. Cancers (Basel). 13 (19), 4754(2021).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

Komórki śródbłonkanaprężenie ścinającehydrożele GelMAkomora przepływowaprzepływ laminarnymikroskopia konfokalnamechanotransdukcjachoroby naczyniowe
Model in vitro integrujący sztywność i przepływ podłoża w celu zbadania odpowiedzi komórek śródbłonka
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.