Artykuł metodologiczny

Ustalenie mysiego modelu cienkiego endometrium

2.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/67084

⸱

1 listopada 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Shenzhen Key Laboratory of Reproductive Immunology for Peri-implantation, Shenzhen Zhongshan Institute for Reproductive Medicine and Genetics, Shenzhen Zhongshan Obstetrics and Gynecology Hospital (formerly Shenzhen Zhongshan Urology Hospital), 2Guangdong Engineering Technology Research Center of Reproductive Immunology for Peri-Implantation, 3School of Biomedical Engineering, Shenzhen Campus of Sun Yat-sen University

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Ten artykuł opisuje szczegółowy protokół wytwarzania niezawodnego i powtarzalnego cienkiego endometrium o bardzo niskiej śmiertelności i minimalnych zrostach wewnątrzmacicznych poprzez wstrzyknięcie 95% etanolu do macicy myszy w ciągu 1-3 minut.

Streszczenie

Cienkie endometrium (TE) jest powszechnie uznawane za krytyczną przyczynę niepłodności. Jednak patogeneza TE pozostaje niejasna i nadal pilnie potrzebne są zadowalające opcje leczenia. Opracowano kilka zwierzęcych modeli TE, ale model mysi obejmujący operację jamy brzusznej i wstrzyknięcie 95% etanolu stanowi ogromne wyzwanie ze względu na wysoką śmiertelność i ryzyko zrostów wewnątrzmacicznych, jeśli nie zostanie wykonany prawidłowo. W tym miejscu opisujemy szczegółowy protokół, który wytwarza niezawodny i powtarzalny TE o bardzo niskiej śmiertelności i minimalnych zrostach wewnątrzmacicznych poprzez wstrzyknięcie 95% etanolu do macicy myszy przy różnym czasie infuzji. Wyniki wykazały, że u wszystkich myszy pomyślnie rozwinął się TE z czasem infuzji w zakresie 1-3 minut, charakteryzującym się typowym zmniejszeniem grubości endometrium i liczby gruczołów, a także nadmiernym zwłóknieniem endometrium. Odkrycia te sugerują, że ten mysi model nadaje się do badania cienkiego endometrium i może służyć jako platforma do opracowywania przyszłych metod leczenia TE.

Wprowadzenie

Cienkie endometrium (TE) to poważna choroba w położnictwie i ginekologii, która często dotyka kobiety w wieku rozrodczym. TE rozpoznaje się, gdy grubość endometrium wynosi mniej niż 7 mm w badaniu ultrasonograficznym, towarzyszy mu normalna jama macicy i jest ściśle związana z niepowodzeniem ciąży1,2. Szacuje się, że około 1,5%-9,1% kobiet poddawanych leczeniu zapłodnieniem in vitro (IVF) doświadczy TE, co sprawia, że jest to coraz większe wyzwanie w medycynie reprodukcyjnej3,4,5. Najczęstsze przyczyny TE to nieprawidłowa naprawa endometrium po chirurgicznym oddzieleniu zrostów wewnątrzmacicznych (IUA) i łyżeczkowanie, którym często towarzyszy zaburzona dystrybucja naczyń krwionośnych i rzadkie gruczoły6,7,8. Do tej pory mechanizmy komórkowe i molekularne leżące u podstaw TE pozostają niejasne. Odzyskanie endometrium u pacjentek z TE jest czasochłonne, chociaż leczenie estrogenami i terapia aspiryną w niskich dawkach były badane jako potencjalne interwencje9. Dlatego dogłębne badanie patogenezy TE jest najbardziej bezpośrednim podejściem do sprostania wyzwaniom związanym z tym schorzeniem. Jednak badania nad patogenezą TE opierają się na modelach zwierzęcych, co sprawia, że wybór odpowiedniego modelu ma kluczowe znaczenie.

Większość badań histopatologicznych cienkiego endometrium (TE) wykazała, że upośledzona proliferacja komórek nabłonkowych i makrofagów, zmniejszona ekspresja receptorów hormonów steroidowych w jajnikach, nadmierne odkładanie się macierzy zewnątrzkomórkowej i starzenie się komórek są najważniejszymi cechami patologicznymi TE6,9,10. Obecnie opracowano różne modele szczurów naśladujące TE, w tym modele wywołane przez drapanie11,12,13, ischemia14, uraz termiczny15 i uraz chemiczny16,17,18,19. Model szczurzy jest wywoływany przez drapanie endometrium igłą lub cewnikiem, co często skutkuje zrostami wewnątrzmacicznymi (IUA), a nie TE11,12,20,21,22. Opisano również model TE wywołany niedokrwieniem u szczurów, w którym niedokrwienie endometrium uzyskuje się poprzez wykonanie obustronnego podwiązania tętnicy macicznej, co prowadzi do zmniejszenia grubości endometrium. Jednak ta metoda jest czasochłonna, wymaga trzech miesięcy i nie jest powszechnie stosowana do badań14. W modelu wywołanym urazem termicznym sztuczna rurka do inseminacji jest używana do wtłaczania wody podgrzanej o temperaturze 85 °C do jednej strony rogu macicy przez zbieg dwóch stron, co czyni go bardziej złożonym niż inne metody15. Model indukowany chemicznie polega na wstrzyknięciu 95% etanolu do odsłoniętego rogu macicy w celu uszkodzenia całego endometrium. Model ten oferuje zalety niskich kosztów i krótkiego okresu eksperymentalnego do badania mechanizmów patologicznych i leczenia TE, ale jest stosowany głównie u szczurów, a nie u myszy16,17,23. Chociaż istnieją różne modele zwierzęce, zwłaszcza modele szczurów, każdy z nich ma swoje ograniczenia. Mogą symulować tylko niektóre aspekty TE, a niewiele modeli mysich ściśle odwzorowuje charakterystykę choroby TE, a jednocześnie jest wygodnych i wszechstronnych w badaniach.

W tym kontekście, opracowaliśmy nowatorski model cienkiego endometrium (TE), wprowadzając 95% etanolu do jamy macicy przy użyciu podejścia gradientu czasowego ze zmodyfikowaną metodą24 (Rysunek 1). Wyniki wykazały, że u wszystkich myszy pomyślnie rozwinął się TE, gdy czas infuzji wahał się od 1 do 3 minut, wykazując typowe cechy, takie jak zmniejszona grubość endometrium, zmniejszenie gruczołu i zwiększone zwłóknienie endometrium. Odkrycia te sugerują, że nasz mysi model jest odpowiednim narzędziem do badania TE i może służyć jako platforma do opracowywania przyszłych metod leczenia TE.

Protokół

To badanie zostało zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania Szpitala Położniczo-Ginekologicznego Shenzhen Zhongshan (dawniej Szpitala Urologicznego Shenzhen Zhongshan), gdzie przeprowadzono wszystkie eksperymenty na zwierzętach. W badaniu wykorzystano samice myszy C57BL/6 (wiek 6-8 tygodni, waga 18-20 g). Wszystkie zwierzęta trzymano w specyficznym środowisku wolnym od patogenów (SPF) w tym samym pomieszczeniu i aklimatyzowano przez tydzień przed eksperymentami w pomieszczeniu bez określonych patogenów w temperaturze (22 ± 1) °C w 12-godzinnym cyklu światła/ciemności. Zapewniono im swobodny dostęp do żywności i wody. Szczegółowe informacje na temat odczynników i sprzętu użytego w tym badaniu są wymienione w Tabeli Materiałów.

1. Identyfikacja rui

UWAGA: Faza rui u myszy jest porównywalna do późnej fazy lutealnej u ludzi, z dość grubą wyściółką endometrium w tym czasie. Wybór myszy w rui do indukcji modelu zapewnia, że są one w stosunkowo stałym stanie fizjologicznym. Dodatkowo wyniki ścieńczenia endometrium są bardziej wyraźne, gdy grubość endometrium jest stosunkowo gruba. Szczegółowe informacje na temat tej procedury można znaleźć w poprzednio opublikowanych raportach25,26.

  1. Przygotuj 20 μl soli fizjologicznej za pomocą pipety. Chwytając za uszy myszy po obu stronach i mocując ogonek myszy, delikatnie włóż końcówkę pipety do otworu pochwy na głębokość około 2 mm. Wlej 20 μl soli fizjologicznej do pochwy i delikatnie spłukuj przez 5 cykli.
  2. Odjąć sól fizjologiczną i przenieść ją równomiernie na czyste szkiełko. Pozwól mu odparować i wyschnąć naturalnie w temperaturze pokojowej.
  3. Nałóż 30 μl etanolu na każde szkiełko, aby utrwalić komórki. Pozostawić etanol do odparowania przez 5 minut, aż szkiełko wyschnie.
  4. Nanieść 50 μl roztworu barwiącego fioletu krystalicznego na każde szkiełko i barwić komórki w temperaturze pokojowej przez 10 minut.
  5. Opłucz każde szkiełko wodą dejonizowaną, aby usunąć nadmiar barwnika i zmniejszyć niespecyficzne przebarwienia.
  6. Obserwuj morfologię komórek i określ proporcje typów komórek pod mikroskopem.
  7. Obserwuj cykle rujowe myszy dwa razy z rzędu, aby zapewnić stabilność. Do eksperymentu wybierz myszy w trzeciej rui.
    UWAGA: Cykl rujowy u myszy trwa zwykle 4-5 dni i jest podzielony na cztery etapy: proestrus, estrus, metestrus i diestrus. Proestrus trwa około 24 godzin i charakteryzuje się okrągłymi lub owalnymi jądrzastymi komórkami nabłonkowymi (Ryc. 2A). Ruja trwa od 12 godzin do 48 godzin i charakteryzuje się głównie jądrzastymi zrogowaciałymi komórkami nabłonkowymi (Ryc. 2B). Metestrus trwa do 24 godzin i charakteryzuje się mieszanką bezjądrzastych zrogowaciałych komórek nabłonkowych i neutrofili (Ryc. 3C). Diestrus trwa od 48 godzin do 72 godzin i charakteryzuje się kombinacją neutrofili, jądrzastych komórek nabłonkowych i kilku jądrzastych komórek rogowacących (Ryc. 2D).

2. Projektowanie grupowe

UWAGA: Aby ocenić wpływ różnych czasów infuzji 95% etanolu na stabilność modelu TE, ustalono sześć grup leczenia. Jedna grupa przeszła pozorowaną operację bez podawania etanolu, aby służyć jako kontrola efektów zabiegowych. Myszy z TE wywołanym etanolem zostały losowo podzielone na pięć grup leczonych na podstawie czasu infuzji (n = 5 na grupę) w następujący sposób:

  1. Grupa 1-minutowa: Wstrzyknąć etanol do jamy macicy na 1 minutę.
  2. Grupa 2-minutowa: Wstrzyknąć etanol do jamy macicy na 2 minuty.
  3. Grupa 3-minutowa: Wstrzyknąć etanol do jamy macicy na 3 minuty.
  4. Grupa 4-minutowa: Wstrzyknąć etanol do jamy macicy na 4 minuty.
  5. Grupa 5-minutowa: Wstrzyknąć etanol do jamy macicy na 5 minut.

3. Indukcja modelu TE u myszy

  1. Znieczulenie myszy za pomocą urządzenia do znieczulania z 5% izofluranem i 100% tlenem przez 3 minuty (zgodnie z instytucjonalnie zatwierdzonym protokołem). Utrzymuj znieczulenie na poziomie 1%-3% izofluranu za pomocą stożka nosowego. Nałóż maść weterynaryjną na oczy myszy, aby zapobiec wysuszeniu podczas znieczulenia. Monitoruj częstość oddechów za pomocą szczypania palca u nogi przez cały zabieg.
  2. Użyj taśmy medycznej, aby zabezpieczyć kończyny myszy i utrzymuj je w pozycji leżącej na stole operacyjnym nagrzanym kocem elektronicznym. Delikatnie pociągnij lekko za język myszy, aby zapobiec niedrożności dróg oddechowych.
    UWAGA: Utrzymywanie myszy w cieple podczas operacji pomaga utrzymać funkcje odpornościowe i krążenie krwi oraz zapobiega krzepnięciu. Dodatkowo wyciągnięcie języków myszy zapewnia udrożnienie dróg oddechowych, aby uniknąć uduszenia się podczas znieczulenia.
  3. Nałóż krem do depilacji zwierzęcej na dolną część brzucha myszy na 3 minuty. Usuń włosy czystymi chusteczkami. Zdezynfekuj obszar 75% etanolem i jodoforem.
  4. Wykonaj 1 cm nacięcie w jamie brzusznej, 1 cm od ujścia cewki moczowej. Użyj sterylnych nożyczek i kleszczy, aby przedłużyć nacięcie aż do jamy otrzewnej.
  5. Delikatnie odsuń wnętrzności na bok za pomocą sterylnych kleszczy, aby zlokalizować macicę i odsłonić prawy róg macicy. Zastosuj klamry hemostatyczne na bliższym końcu w pobliżu szyjki macicy i na dystalnym końcu w pobliżu jajnika.
    UWAGA: Zaciśnięcie obu końców rogu macicy zapewnia brak wycieku podczas wstrzykiwania etanolu, zapobiegając uszkodzeniu szyjki macicy, pochwy i jajnika.
  6. Wkraść około 50 μl 95% etanolu27 do jamy macicy za pomocą strzykawki 25 G, z igłą ułożoną równolegle do kierunku rogu macicy. Włóż igłę do jamy macicy pod kątem 30 stopni. Utrzymywać strzykawkę przez 1 minutę, 2 minuty, 3 minuty, 4 minuty lub 5 minut, w zależności od przypadku. Pobrać etanol i przepłukać jamę macicy sterylnym roztworem soli fizjologicznej 5 razy, aby usunąć pozostały etanol. Podobnie, wkraść równą objętość sterylnego soli fizjologicznej do lewego rogu macicy jako kontrolę, postępując zgodnie z tymi samymi procedurami.
    UWAGA: Upewnij się, że igła strzykawki jest równoległa do kierunku rogu macicy. Należy unikać wkładania igły pod zbyt dużym kątem, aby uniemożliwić jej przejście przez cały róg macicy. Wycofać etanol tak całkowicie, jak to możliwe, aby uniknąć trwałych uszkodzeń i niestabilności eksperymentalnej.
  7. Usuń zaciski i przywróć macicę i wnętrzności do ich pierwotnej pozycji.
  8. Zszyj otrzewną wchłanialnymi szwami chirurgicznymi z poliglikolidu 5-0, a następnie zszyj naskórek niewchłanialnymi szwami chirurgicznymi z polipropylenu 5-0.
  9. Zdezynfekuj nacięcie 75% etanolem i jodoforem, a następnie wróć do klatki zwierząt. Po operacji uważnie obserwuj, czy tętno myszy stopniowo i stabilnie wzrasta, aż mysz w pełni wyzdrowieje i będzie mogła normalnie się poruszać (Rysunek 3A-H).
    UWAGA: Doustny lek przeciwbólowy (3,2 mg/ml paracetamolu w wodzie do picia) podawano w dniu poprzedzającym operację i kontynuowano przez pozostałą część badania.
  10. Obserwuj myszy o 9:00 i 15:00 każdego dnia i dezynfekuj nacięcie jodoforem, aby upewnić się, że są w dobrym stanie.

4. Pobieranie próbek

  1. Poddaj myszy eutanazji przez zwichnięcie kręgosłupa szyjnego w głębokim znieczuleniu 7 dni po leczeniu 95% etanolem (zgodnie z instytucjonalnie zatwierdzonym protokołem).
  2. Przetnij szwy, aby odsłonić macicę za pomocą nożyczek chirurgicznych.
  3. Ostrożnie i powoli usuń całą macicę za pomocą kleszczy chirurgicznych. Odłącz macicę od otaczających wnętrzności.
  4. Natychmiast usuń oba rogi macicy i podziel każdy róg na 3-4 małe segmenty.
  5. Dodaj 1 ml 4% paraformaldehydu do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml za pomocą pipety. Zachowaj tkankę macicy w 4% paraformaldehydzie przez 24 godziny w celu utrwalenia.

5. Odwodnienie tkanek

UWAGA: Odwodnienie tkanek odbywa się za pomocą automatycznego procesora tkanek (zobacz Tabelę Materiałów).

  1. Umieść próbki utrwalone formaliną w kasetach na tkanki.
  2. Przenieś kasety tkankowe przez serię rosnących stężeń etanolu, aby odwodnić tkankę w następujący sposób: 70% etanolu przez 1 godzinę, 85% etanolu przez 1 godzinę, 95% etanolu dwa razy (po 1 godzinie) i 100% etanolu dwa razy (po 1 godzinie).
  3. Zastąp etanol 100% ksylenem (135 minut przy pierwszym zanurzeniu, 20 minut przy każdym kolejnym zanurzeniu dwukrotnie), aby upewnić się, że parafina wniknie w tkankę.
  4. Zanurzyć kasety z tkankami w parafinie w inkubatorze w temperaturze 60-65 °C (3 razy po 140 minut każda) i utrzymywać kasety w cieple aż do ich zatopienia.

6. Osadzanie parafiny

UWAGA: Wykonaj te kroki za pomocą modułowego centrum osadzania tkanek (zobacz Tabelę Materiałów).

  1. Napełnij formę woskową stopionym woskiem parafinowym podgrzanym do 55 °C.
  2. Użyj podgrzanych kleszczyków, aby szybko przenieść infiltrowane segmenty z kasety do zatapiania do formy woskowej, upewniając się, że przekrój każdego segmentu spoczywa równolegle do podstawy formy.
  3. Po prawidłowym ustawieniu segmentów umieść spód kasety do zatapiania na wierzchu formy histologicznej.
  4. Umieścić formę bezpośrednio na płycie chłodzącej ustawionej na 4 °C na co najmniej 20 minut, aby parafina mogła zastygnąć.
  5. Po zestaleniu się wosku wyjmij próbkę z formy i użyj trymera do parafiny, aby przyciąć nadmiar wosku wokół niej.

7. Cięcie parafiny

  1. Przygotować łaźnię wodną o temperaturze 42 °C. Przed cięciem umieścić bloki parafiny na zimnym talerzu, aby mogły ostygnąć i łatwiej było je przycinać.
  2. Zawiesić próbkę zatopioną w parafinie na obrotowym mikrotomie powierzchnią tkanki skierowaną do góry.
  3. Ciąć 20 μm na raz, aby usunąć nadmiar parafiny pokrywającej tkankę, aż do osiągnięcia pożądanej płaszczyzny tkanki.
  4. Wycinaj jednorazowo odcinki o grubości 4 μm.
  5. Przenieść wstęgę z podziałem parafiny do łaźni wodnej o temperaturze 42 °C na 2 minuty.
  6. Podnieś skrawki z powierzchni wody i po rozłożeniu umieść je na szkiełku mikroskopowym.
  7. Suszyć szkiełka w inkubatorze w temperaturze 60 °C przez 30 minut.

8. Barwienie hematoksyliną i eozyną

UWAGA: Barwienie Hematoksyliną i Eozyną odbywa się za pomocą automatycznej maszyny do barwienia szkiełek (patrz Tabela Materiałów).

  1. Przygotuj wszystkie odczynniki z wyprzedzeniem przed rozpoczęciem procedury barwienia.
  2. Namocz szkiełka w 100% ksylenie odpowiednio przez 10 minut, 5 minut i 3 minuty.
  3. Uwodnić szkiełka w zmniejszającej się serii etanolu w wodzie dejonizowanej w następujący sposób: 100% etanolu, 95% etanolu (dwukrotnie) i 80% etanolu przez 2 minuty każda.
  4. Opłucz szkiełka w wodzie dejonizowanej.
  5. Szkiełka należy barwić w roztworze hematoksyliny przez 10 minut. Płukać szkiełka w wodzie dejonizowanej przez 1 minutę lub do momentu, gdy woda przestanie być fioletowa.
  6. Zanurz szkiełka w 0,5% kwaśnym roztworze do różnicowania etanolu dwukrotnie na 3-5 s za każdym razem. Opłucz szkiełka w wodzie dejonizowanej przez 1 min.
  7. Umieść szkiełka w buforze do niebieszczenia (1% roztwór amoniaku) na 1 minutę. Płucz szkiełka w wodzie dejonizowanej przez 1 minutę.
  8. Odwodnić szkiełka 80% etanolem, a następnie zanurzyć je w roztworze roboczym eozyny-Y na 10 sekund.
  9. Przenieś szkiełka do 95% etanolu i płucz dwukrotnie przez 10 sekund każde. Następnie przenieś szkiełka do absolutnego etanolu i odwadniaj je dwukrotnie przez 10 sekund każde.
  10. Zanurz szkiełka w 100% ksylenie, aby oczyścić tkankę dwukrotnie, na 2 minuty każde.
  11. Umieść szkiełko nakrywkowe na chusteczce i uszczelnij je naturalną żywicą.

9. Barwienie Massona

  1. Odparafinować tkankę, mocząc szkiełka w 100% ksylenie odpowiednio przez 10 minut, 5 minut i 3 minuty.
  2. Po odparafinowaniu namocz szkiełka w malejącej serii etanolu w wodzie dejonizowanej: 100% etanolu, 95% etanolu (dwukrotnie) i 80% etanolu, na 2 minuty każda.
  3. Opłucz szkiełka w wodzie dejonizowanej.
  4. Zabarwić szkiełka w roztworze żelaza hematoksyliny Weigerta przez 5 minut, a następnie umyć szkiełka w wodzie dejonizowanej przez 30 sekund.
  5. Różnicować kolory barwionych struktur tkankowych, inkubując szkiełka w 1% alkoholu kwasu solnego przez 15 s.
  6. Płucz szkiełka w wodzie dejonizowanej przez 30 s.
  7. Inkubuj tkankę w roztworze do barwienia przez 3-5 minut.
  8. Płucz szkiełka w wodzie dejonizowanej przez 30 s.
  9. Umieść szkiełka w roztworze fuksyny kwasu ponceau na 5-10 min.
    UWAGA: Wymieszaj wodę dejonizowaną i roztwór słabego kwasu w stosunku 2:1, aby przygotować roztwór roboczy słabego kwasu.
  10. Płukać szkiełka roztworem roboczym słabego kwasu przez 30 s.
  11. Różnicować tkankę w roztworze kwasu fosfomolibdenowego przez 1-2 minuty, a następnie płukać skrawki roztworem roboczym słabego kwasu przez 30 sekund.
  12. Wybarwieć skrawki tkanki roztworem błękitu anilinowego przez 1-2 minuty.
  13. Szybko odwodnij skrawki tkanki w 95% etanolu przez 2-3 s, a następnie 100% etanolu dwa razy przez 5-10 s każdy. Wyczyść szkiełka w ksylenie dwukrotnie, po 1-2 minuty każde.
  14. Umieść szkiełko nakrywkowe na chusteczce i uszczelnij je naturalną żywicą.
  15. Odcedź nadmiar żywicy i pozostaw szkiełka do wyschnięcia.

10. Obrazowanie i analiza

  1. Przechwytywanie obrazów przekrojów za pomocą systemu skanera slajdów.
    UWAGA: Użyj obiektywu 4x lub 10x, aby uzyskać przegląd sekcji; Aby uzyskać bardziej szczegółowe obrazy, użyj obiektywów od 20x do 100x.
  2. Wykonaj analizę ilościową grubości endometrium, liczby gruczołów i stopnia zwłóknienia tkanek za pomocą platformy do analizy obrazu HALO.
    UWAGA: Średnią grubość uzyskuje się poprzez pomiar pionowej odległości od jamy macicy do mięśniówki macicy w 5 losowo wybranych polach widzenia.

11. Analizy statystyczne

  1. Przeprowadzanie analiz statystycznych przy użyciu oprogramowania SPSS w wersji 23.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA).
  2. Oceń istotność statystyczną różnic eksperymentalnych między grupą kontrolną a grupą modelową, wykonując najpierw test rozkładu normalnego.
  3. Przedstaw dane, które mają rozkład normalny jako średnia ± SEM.
  4. Analizuj dane z różnych grup leczenia za pomocą jednokierunkowej analizy ANOVA. Dostosuj do wielokrotnych porównań liczby badanych alleli w każdym locus przy użyciu metody Bonferroniego. Uznajmy, że wartość P <0,05 jest statystycznie istotna.

Wyniki

Kluczowymi cechami cienkiego endometrium (TE) są zmniejszona grubość endometrium i gęstość gruczołowa, wraz ze zwiększonym zwłóknieniem endometrium. Metoda ta z powodzeniem odtworzyła te cechy u myszy modelowych. Analiza danych wykazała istotny spadek grubości endometrium w grupie 1-minutowej (222,3 μm ± 13,96 μm vs. 359,2 μm ± 12,41 μm, P < 0,05), grupie 2-minutowej (168,7 μm ± 17,57 μm vs. 359,2 μm ± 12,41 μm, P < 0,05) oraz 3-minutowej (131,8 μm ± 3 μm vs. 359,2 μm ± 12,41 μm, P < 0,05) w porównaniu z grupą kontrolną. Nie zaobserwowano jednak istotnej różnicy w grubości endometrium między grupami 2-minutowymi i 3-minutowymi (168,7 μm ± 17,57 μm vs. 131,8 μm ± 3 μm, P > 0,05) (Rysunek 3A,B).

Liczba gruczołów endometrialnych została znacznie zmniejszona w grupie 1-minutowej (4,4 ± 2,38 vs. 24,4 ± 1,6, P < 0,05), grupie 2-minutowej (0,8 ± 0,49 vs. 24,4 ± 1,6, P < 0,05) i grupie 3-minutowej (4,4 ± 3,20 vs. 24,4 ± 1,6, P < 0,05) w porównaniu do grupy kontrolnej (Rysunek 3A, Nie zaobserwowano jednak istotnej różnicy w liczbie gruczołów endometrialnych między grupami 1-minutowymi, 2-minutowymi i 3-minutowymi.

Ponieważ TE wystąpiło po leczeniu 95% etanolem przez 7 dni, postawiono hipotezę, że grubość endometrium może być związana z czasem trwania infuzji. Aby to zbadać, dwie dodatkowe grupy były leczone 95% etanolem odpowiednio przez 4 minuty i 5 minut. Co ciekawe, wyniki wykazały silne zrosty macicy, gdy wydłużał się czas infuzji. (Ryc. 4), przy czym jama macicy stawała się prawie niewidoczna. Ponadto nie zaobserwowano żadnych gruczołów endometrialnych w macicy myszy przy wydłużonym czasie infuzji (Ryc. 4).

Ponadto, poziom zwłóknienia endometrium wzrastał wraz z czasem trwania 95% infuzji etanolu, co potwierdza barwienie Massona, wskazujące na nadmierne zwłóknienie uszkodzonego endometrium (Rysunek 5A,B).

figure-results-1
Rysunek 1: Schemat blokowy ustanowienia modelu myszy TE. Cała procedura obejmuje następujące kroki: Po pierwsze, myszom pozwolono zaaklimatyzować się przez 1 tydzień przed eksperymentem. Następnie monitorowano dwa cykle rujowe. Myszy w trzeciej rui zostały następnie wybrane do założenia modelu poprzez wstrzyknięcie 95% etanolu do jamy macicy. Siedem dni po wstrzyknięciu etanolu myszy zostały złożone w ofierze, a rogi macicy zostały pobrane do dalszego barwienia HE i analizy barwienia Massona. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Identyfikacja rui u myszy. (A) Proestrus charakteryzuje się przewagą jądrzastych komórek nabłonkowych (strzałka). (B) Ruja charakteryzuje się przewagą bezjądrzastych zrogowaciałych komórek nabłonkowych (gwiazdek). (C) Metestrus charakteryzuje się połączeniem bezjądrzastych zrogowaciałych komórek nabłonkowych i neutrofili (trójkąt). (D) Diestrus charakteryzuje się kombinacją neutrofili, jądrzastych komórek nabłonkowych i niewielkiej liczby bezjądrzastych komórek zrogowaciałych. Powiększenie obiektywu 20x. Podziałka = 50 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3: Procedura indukcji TE przez 95% infuzję etanolu. (A) Myszy są znieczulane za pomocą urządzenia do znieczulania. (B) Włosy na brzuchu są usuwane. (C) Nacięcie o długości 1 cm wykonuje się w odległości 1 cm od ujścia cewki moczowej. (D) Macica jest zlokalizowana, a jedna strona rogu macicy jest odsłonięta. (E) Klamry hemostatyczne są nakładane po obu stronach rogu macicy. (F) 95% etanolu wkrapla się do rogu macicy, a następnie przepłukuje sterylnym roztworem soli fizjologicznej. (G) Zaciski są usuwane, a macica jest umieszczana z powrotem. (H) Nacięcie jest zszyte. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rysunek 4: Obserwacja morfologii endometrium u myszy za pomocą barwienia HE pod mikroskopią. (A) Zbadano morfologię endometrium po stronie uszkodzonej i kontrolnej. Do macicy po prawej stronie wstrzyknięto 95% etanolu, podczas gdy do macicy po lewej stronie wstrzyknięto sterylną sól fizjologiczną jako kontrolę. Podziałka = 200 μm. (B) Porównanie grubości endometrium w grupie Con, 1 min, 2 min i 3 min. (C) Porównanie liczby gruczołów w błonie śluzowej macicy w grupie Con, 1 min, 2 min, 3 min, 4 min i 5 min. Oszustwo, kontrola; **P < 0,01, ****P < 0,0001 z jednokierunkową ANOVA. Dane są przedstawiane jako średnia ± błąd standardowy średniej. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-5
Rysunek 5: Zwłóknienie endometrium w endometrium myszy. (A) Barwienie trichromem Massona wykorzystano do oceny zwłóknienia endometrium, gdzie kolor niebieski wskazuje na rozmieszczenie włókien kolagenowych, we wskazanych grupach leczenia. Podziałka = 200 μm. (B) Podsumowujący wykres słupkowy przedstawia poziom zwłóknienia kolagenu wśród różnych grup. **P < 0,01, ***P < 0,001, ****P < 0,0001 z jednokierunkową ANOVA. Dane są przedstawiane jako średnia ± błąd standardowy średniej. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

TE charakteryzuje się niewystarczającą proliferacją komórek i dysfunkcjonalnymi komórkami, ściśle związanymi z niepłodnością, nawracającymi poronieniami i nieprawidłowościami łożyska 2,3. Niestety, obecnie nie ma skutecznej terapii TE. Modele zwierzęce odgrywają kluczową rolę w badaniu tego schorzenia. W latach 2014-2024 szczury wykorzystano jako organizmy modelowe w 16,4% z 208 000 badań (34 200 badań), a myszy w 22,7% (47 300 badań). Coraz częstsze wykorzystanie myszy w eksperymentach można przypisać ich przewadze nad innymi modelami, w szczególności ich potencjałowi w badaniach nad regeneracją 28,29,30. Biorąc pod uwagę znaczenie spójności modelu, rośnie zapotrzebowanie na bardziej kompatybilne narzędzia do prowadzenia badań z wykorzystaniem myszy jako modeli31.

Powszechne metody indukowania modeli TE, jak opisano w poprzednich badaniach, obejmują drapanie11,12, niedokrwienie14, uraz wywołany termicznie15 i uraz wywołany chemikaliami 16,17,23. Aby ułatwić wykorzystanie modeli zwierzęcych w badaniach TE i położyć podwaliny pod skuteczne leczenie, Gao i wsp.24 najpierw ustalili model TE u szczurów SD, wstrzykując absolutny etanol na 5 minut w celu uszkodzenia endometrium. Chociaż metoda ta ogranicza wzrost endometrium, często prowadzi do poważnych zrostów w jamie brzusznej, przy wskaźniku przeżycia wynoszącym zaledwie 70%.

Wcześniej 95% etanol był stosowany głównie u szczurów ze względu na łatwość aplikacji, ale ta metoda wygenerowała niewiele modeli mysich do badań TE. Po obserwacjach klinicznych, kompleksowym przeglądzie literatury, eksperymentach wstępnych, wielokrotnych dyskusjach i analizach opracowano ulepszoną metodę z krótszym czasem infuzji macicy. Wykwalifikowane techniki pozwalają na wstrzyknięcie 95% etanolu do jamy macicy w celu stworzenia modelu TE o różnym czasie infuzji.

Model mysi przedstawiony w tym badaniu opiera się na zasadach modelu24 Gao. Wprowadzono jednak kilka modyfikacji, w tym skrócenie czasu infuzji etanolu i zwiększenie częstotliwości spłukiwania solą fizjologiczną. W tym modelu macice myszy zostały odsłonięte poprzez rozwarstwienie jamy brzusznej, a 95% etanolu wstrzyknięto po jednej stronie rogów macicy na różne czasy: 1 min, 2 min, 3 min, 4 min i 5 min. Dzięki precyzyjnej kontroli czasu infuzji etanolu i ustandaryzowanej procedurze, uzyskano stabilne dane w eksperymentach na myszach, co zminimalizowało odchylenia wynikające z indywidualnych różnic między myszami.

Wyniki histologiczne wykazują wyraźne zmiany w grubości endometrium, liczbie gruczołów endometrialnych i zwłóknieniu endometrium w różnym stopniu wśród myszy TE, potwierdzając wiarygodność modelu ustalonego w tym badaniu 3,6,9. Warto zauważyć, że gdy czas infuzji etanolu przekraczał 4 minuty lub 5 minut, obserwowano ciężkie zrosty wewnątrzmaciczne (IUA). Odkrycia te sugerują, że mysi model TE można skutecznie ustalić po 1-3 minutach infuzji 95% etanolu, podczas gdy czas infuzji przekraczający 3 minuty może wywołać ciężką wkładkę wewnątrzmaciczną.

Do tej pory opracowano kilka modeli zwierzęcych do badania TE, w tym modele drapania, niedokrwienia, indukowane termicznie i chemicznie. Model wywołany drapaniem, choć łatwiejszy do wykonania, często prowadzi do zrostów wewnątrzmacicznych (IUA), a nie TE. Model TE wywołany niedokrwieniem wymaga znacznie dłuższego czasu trwania niż model indukowany chemicznie, a metoda indukowana termicznie jest bardziej złożona i trudniejsza do wykonania w porównaniu z indukcją chemiczną. Chociaż model indukowany chemikaliami jest efektywny czasowo i stabilny, ma potencjalne ograniczenia, takie jak uraz zwierząt i ryzyko infekcji lub śmierci z powodu niewłaściwej techniki. Problemy te można złagodzić dzięki starannemu szkoleniu i doświadczeniu.

Podsumowując, wyniki pokazują, że mysi model TE można skutecznie ustalić, wstrzykując 95% etanolu do jamy macicy na 1-3 minuty. Podejście to stanowi obiecującą metodę badania mechanizmów patologicznych i procesów naprawczych TE oraz opracowywania skutecznych metod leczenia pacjentów z tym schorzeniem.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Serdecznie dziękujemy anonimowym recenzentom za ich ważne i pomocne komentarze. Prace te były wspierane przez Shenzhen Science and Technology Project (No. JCYJ20220818103207016) oraz Fundacja Podstawowych i Stosowanych Badań Podstawowych i Stosowanych w Guangdong (nr 2024A1515010478).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Aparat anestezjologicznyRWD Life ScienceR530Mobilny aparat do znieczulenia wziewnego dla małych zwierząt
0,9% soli fizjologicznejHubei Kelun Pharmaceutical C230817A210 mL, zastrzyk medyczny
75% etanolLIRCON6303060031500 mL, odczynnik dezynfekujący
95% etanoluGuangzhou Chemical Reagent Factory64-17-5500 mL, odczynnik chemiczny
Szwy wchłanialneJinhuan MedicalCR537Grubość: 5-0; Długość: 90 cm
Wodny roztwór amoniakuMilliporeSigma1336-21-61000 mL, odczynnik chemiczny
Automatyczny procesor tkanekLeicaTP1020100 pudełek do zatapiania może być przetwarzanych jednorazowo
Myszy C57BL/6 Centrum Zwierząt Doświadczalnych Południowego Uniwersytetu Medycznego 
Eosin-YBASOBA40241000 mL, służy do barwienia skrawków parafiny, skrawków zamrożonych itp
HaematoxylinBASOBA40411000 mL, służy do barwienia skrawków parafinowych, skrawków zamrożonych itp
Platforma analizy obrazu HALOLaboratoriaUrządzenie charakteryzuje się łatwością obsługi i skalowalnością, potężnymi możliwościami analitycznymi i najszybszym przetwarzaniem prędkość
Zaciski hemostatyczneHUAYON18-50211,8 cm długości całkowitej ze szczęką 0,7 cm
Kleszcze hemostatyczneHUAYON18-502010 cm długości całkowitej
Mikrotom rotacyjny HistoCoreLeica149BIO000C1Grubość plastra waha się od 1 do 60 μ m
IndorphorADF1005500 mL, odczynnik dezynfekujący
IsofluraneRWD Life ScienceR510-22-10100 mL, składnik aktywny 100% izofluranu
Barwienie trichromowe MassonaSOLARBIOG13407 × 100 mL na 100 testów
Szkiełko mikroskopoweGene TechGT100511Długość: 75 cm; Szerokość: 25 cm
Modułowe Centrum Osadzania TkanekLeicaEG1150 CInstrument zawiera zimny stolik i podgrzewany moduł dystrybucji parafiny, co zapewnia elastyczność podczas prac związanych z zatapianiem
Żywica naturalnaSAKURA4770Folia pokryta żywicą, Nadaje się do barwienia histologicznego
Olympus SLIDEVIEW VS200PANOVUEVS200Przyrząd rejestruje wysokiej jakości wirtualne obrazy slajdów i umożliwia zaawansowaną ilościową analizę obrazu 
Roztwór utrwalający paraformaldehydServicebioG1011500 mL, uniwersalny utrwalacz tkankowy (neutralny)
Kleszcze chirurgiczneHUAYON18-13002,2 mm proste, 12,5 cm szerokości
Nożyczki chirurgiczneHUAYON18-011010 cm, nożyczki chirurgiczne ze stali nierdzewnej
StrzykawkaUprzejmie600170311 mL, jednorazowa sterylna strzykawka z igłą
Tkanka kasetyCITOTEST80106-1100-16Biały; szczeliny przepływowe; 0-częściowa zintegrowana pokrywa; obszary etykietowania znajdują się z trzech stron
Tissue-Tek Prisma PlusSAKURADRS-Prisma-P-JCSWydajność przetwarzania wynosi jednorazowo 60 szkiełek
XyleneGuangdong Guanghua Sci-Tech1330-20-71000 mL, rozpuszczalnik organiczny
Indica

Bibliografia

  1. Mahajan, N., Sharma, S. The endometrium in assisted reproductive technology: How thin is thin. J Hum Reprod Sci. 9 (1), 3-8 (2016).
  2. Liu, X., et al. Thin endometrium is associated with the risk of hypertensive disorders of pregnancy in fresh IVF/ICSI embryo transfer cycles: A retrospective cohort study of 9,266 singleton births. Reprod Biol Endocrinol. 19 (1), 55(2021).
  3. Liu, K. E., Hartman, M., Hartman, A. Management of thin endometrium in assisted reproduction: A clinical practice guideline from the Canadian Fertility and Andrology Society. Reprod Biomed Online. 39 (1), 49-62 (2019).
  4. Wang, Y., Tang, Z., Teng, X. New advances in the treatment of thin endometrium. Front Endocrinol (Lausanne). 15, 1269382(2024).
  5. Saad-Naguib, M. H., Kenfack, Y., Sherman, L. S., Chafitz, O. B., Morelli, S. S. Impaired receptivity of thin endometrium: Therapeutic potential of mesenchymal stem cells. Front Endocrinol (Lausanne). 14, 1268990(2023).
  6. Lv, H., et al. Deciphering the endometrial niche of human thin endometrium at single-cell resolution. Proc Natl Acad Sci U S A. 119 (8), e2115912119(2022).
  7. Gharibeh, N., et al. Cell-based therapy in thin endometrium and Asherman syndrome. Stem Cell Res Ther. 13 (1), 33(2022).
  8. Lei, L., et al. Angiogenic microspheres for the treatment of a thin endometrium. ACS Biomater Sci Eng. 7 (10), 4914-4920 (2021).
  9. Maekawa, R., et al. Thin endometrium transcriptome analysis reveals a potential mechanism of implantation failure. Reprod Med Biol. 16 (2), 206-227 (2017).
  10. Xu, L., Fan, Y., Wang, J., Shi, R. Dysfunctional intercellular communication and metabolic signaling pathways in thin endometrium. Front Physiol. 13, 1050690(2022).
  11. Hu, J., Song, K., Zhang, J., Zhang, Y., Tan, B. Z. Effects of menstrual blood-derived stem cells on endometrial injury repair. Mol Med Rep. 19 (2), 813-820 (2019).
  12. Kim, Y. Y., et al. Efficient production of murine uterine damage model. Tissue Eng Regen Med. 16 (2), 119-129 (2019).
  13. Chen, K., et al. A novel method to repair thin endometrium and restore fertility based on menstruation-derived stem cell. Reprod Sci. 31 (6), 1662-1673 (2024).
  14. Hu, J., Yuan, R. Decreased expression of C-kit and telomerase in a rat model of chronic endometrial ischemia. Med Sci Monit. 17 (4), Br103-Br109 (2011).
  15. Wang, G., Ren, C., Jiang, J. Effects of bone marrow mesenchymal stem cells on repair and receptivity of damaged endometrium in rats. J Obstet Gynaecol Res. 47 (9), 3223-3231 (2021).
  16. Lin, J., et al. Microenvironment-protected exosome-hydrogel for facilitating endometrial regeneration, fertility restoration, and live birth of offspring. Small. 17 (11), e2007235(2021).
  17. López-Martínez, S., et al. Bioengineered endometrial hydrogels with growth factors promote tissue regeneration and restore fertility in murine models. Acta Biomater. 135, 113-125 (2021).
  18. Haghighi, L., et al. Angiogenic lipid-based drug delivery system (phytosolve) for treatment of a thin endometrium in animal model. Tissue Cell. 90, 102481(2024).
  19. Saleem Raheem, S., Falah Hasan, H., Hashim Abid Ali, A., Mansour Jasim, A. Effectiveness of histopathological changes of induced thin layer endometrium by pentoxifylline and pentoxifylline-loaded poly lactic-co-glycolic acid on female rats. Arch Razi Inst. 78 (6), 1762-1770 (2023).
  20. Feng, Q., et al. Establishment of an animal model of intrauterine adhesions after surgical abortion and curettage in pregnant rats. Ann Transl Med. 8 (4), 56(2020).
  21. Bazoobandi, S., et al. Induction of Asherman's syndrome in rabbit. J Reprod Infertil. 17 (1), 10-16 (2016).
  22. Bai, X., et al. Therapeutic effect of human amniotic epithelial cells in rat models of intrauterine adhesions. Cell Transplant. 29, 963689720908495(2020).
  23. Liu, J., et al. The effects and mechanisms of GM-CSF on endometrial regeneration. Cytokine. 125, 154850(2020).
  24. Yan-Ping, L. Establishment and identification of rat thin endometrium model. Life Sci Res. , https://api.semanticscholar.org/CorpusID:88150888 (2011).
  25. Cora, M. C., Kooistra, L., Travlos, G. Vaginal cytology of the laboratory rat and mouse: Review and criteria for the staging of the estrous cycle using stained vaginal smears. Toxicol Pathol. 43 (6), 776-793 (2015).
  26. Quignon, C. Collection and analysis of vaginal smears to assess reproductive stage in mice. Curr Protoc. 3 (9), e887(2023).
  27. Yi, K. W., et al. marrow-derived cells or C-X-C motif chemokine 12 (CXCL12) treatment improve thin endometrium in a mouse model. Biol Reprod. 100 (1), 61-70 (2019).
  28. Nakada, Y., et al. Hypoxia induces heart regeneration in adult mice. Nature. 541 (7636), 222-227 (2017).
  29. Mylonas, K. J., et al. Cellular senescence inhibits renal regeneration after injury in mice, with senolytic treatment promoting repair. Sci Transl Med. 13 (594), eabb0203(2021).
  30. Mckellar, D. W., et al. Large-scale integration of single-cell transcriptomic data captures transitional progenitor states in mouse skeletal muscle regeneration. Commun Biol. 4 (1), 1280(2021).
  31. Elzat, E. Y., et al. Establishing a mouse contusion spinal cord injury model based on a minimally invasive technique. J Vis Exp. 187, e64538(2022).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

W knienie b ony luzowej macicywstrzykni cie do rogu macicyinfuzja etanolugrubo b ony luzowej macicyzrosty macicznechirurgia zwierz cazatapianie w parafiniemodel niep odno ci

Powiązane artykuły