Tutaj opisujemy metody tatuowania dorosłej Xenopus laevis (afrykańskiej żaby szponiastej) za pomocą obrotowej maszynki do tatuażu. Prawidłowe tatuowanie skutkuje ciemnymi, łatwymi do odczytania cyframi, które utrzymują się przez kilka miesięcy i sprawiają, że zwierzęta są łatwe do odróżnienia do celów badawczych i ewidencyjnych.
Artykuł metodologiczny
Metody tatuowania Xenopus laevis za pomocą rotacyjnej maszynki do tatuażu
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Modele zwierzęce poszerzają zakres badań biomedycznych, pogłębiając nasze zrozumienie biologii rozwojowej, molekularnej i komórkowej oraz umożliwiając badaczom modelowanie chorób ludzkich. Rejestrowanie i śledzenie poszczególnych zwierząt pozwala naukowcom zmniejszyć liczbę zwierząt potrzebnych do badań i udoskonalić praktyki w celu poprawy dobrostanu zwierząt. Istnieje kilka dobrze udokumentowanych metod znakowania i śledzenia ssaków, w tym nakłuwanie uszu i kolczyki. Metody znakowania gatunków wodnych są jednak ograniczone, a istniejące zasoby są przestarzałe, nieskuteczne lub zbyt kosztowne. W tym manuskrypcie przedstawiamy metody i najlepsze praktyki znakowania Xenopus laevis za pomocą rotacyjnej maszynki do tatuażu. Prawidłowe tatuowanie skutkuje wysokiej jakości tatuażami, dzięki czemu osoby są łatwo rozpoznawalne dla badaczy i stanowią minimalne zagrożenie dla zdrowia zwierząt. Zwracamy również uwagę na przyczyny złej jakości tatuaży, które mogą skutkować szybkim blaknięciem tatuaży i wyrządzaniem niepotrzebnych szkód zwierzętom. Takie podejście pozwala naukowcom i weterynarzom znakować, umożliwiając im śledzenie replik biologicznych i linii transgenicznych oraz prowadzenie dokładnych zapisów zdrowia zwierząt.
Wprowadzenie
Modele zwierzęce są użytecznymi narzędziami do badania pytań dotyczących ludzkiego zdrowia. W praktyce badania biomedyczne z wykorzystaniem modeli zwierzęcych wymagają starannej organizacji i utrzymania zdrowej kolonii zwierzęcej. Najlepsze praktyki w zakresie etycznego obchodzenia się ze zwierzętami i hodowli mają na celu zmniejszenie liczby zwierząt potrzebnych do eksperymentów i udoskonalenie praktyk w celu zapewnienia dobrostanu zwierząt1. Rodzaj żab szponiastych, w tym Xenopus laevis (X. laevis; Afrykańska żaba szponiasta) i Xenopus tropicalis (X. tropicalis; Żaba szponiasta) były używane w badaniach biomedycznych od 1930 roku, kiedy X. laevis były używane przez południowoafrykańskich lekarzy do przeprowadzania pierwszych testów ciążowych2. Podczas gdy nowoczesne testy ciążowe nie wymagają już żab, rola badań nad projektem Xenopus nadal istnieje. Zalety stosowania Xenopus do badań biomedycznych obejmują dobrze opisane genomy3, całoroczną indukowaną owulację dużych lęgów jaj4 oraz zewnętrznie złożone jaja podatne na zapłodnienie in vitro. Te cechy sprawiają, że są one użyteczne dla embriologii i rozwoju kręgowców5,6,7, podstawowa biologia molekularna i komórkowa7,8,9,10, oraz do modelowania chorób ludzkich7,11,12,13.
Niezawodne metody śledzenia poszczególnych zwierząt Xenopus są niezbędne do rejestrowania biologicznych powtórzeń oraz poprawy rygoru i odtwarzalności w badaniach. Ponieważ Xenopus są często trzymane w grupach, znakowanie zwierząt pozwala badaczom łatwo śledzić poszczególne zwierzęta4. Prowadzenie dokładnego rejestru zwierząt może zaoszczędzić czas i zasoby oraz poprawić możliwość śledzenia stanu zdrowia zwierząt. Na przykład, indywidualna identyfikacja zwierząt może usprawnić procesy organizacyjne związane z generowaniem transgenicznych linii Xenopus, ponieważ wymaga to wielu pokoleń żab o określonych genotypach weryfikowanych przez sekwencjonowanie14, co wymaga organizacji i indywidualnej identyfikacji zwierząt. Jest to szczególnie prawdziwe, gdy mutacjom tym brakuje łatwo dostrzegalnych dorosłych fenotypów. Podobnie, wykorzystanie oocytów i zarodków Xenopus do badania podstawowej biologii komórkowej i rozwojowej przynosi korzyści ze śledzenia poszczególnych zwierząt. Po wywołaniu owulacji zwierzęta muszą odpoczywać przez co najmniej 3 miesiące, aby zapobiec komplikacjom zdrowotnym, takim jak zespół hiperowulacji15. Indywidualne metody identyfikacji zapewniają, że zwierzęta nie są nakłaniane do zbyt częstej owulacji.
Znakowanie i śledzenie zwierząt umożliwia również personelowi laboratoryjnemu śledzenie problemów zdrowotnych zwierząt. Zachorowanie zwierząt o tym samym genotypie może wskazywać na nadmierny chów wsobny lub nieprzewidziane problemy zdrowotne związane z transgenem. Podobnie, zwierzęta, które zachorowały po niedawnej owulacji, mogą wskazywać na problemy z odczynnikami, materiałami lub technikami. Śledzenie zwierząt i ich zdrowia umożliwia personelowi laboratoryjnemu i weterynarzom monitorowanie w przypadku ponownego pojawienia się problemów i podejmowanie środków zapobiegawczych w celu zapobiegania chorobom w przyszłości. U ssaków istnieje wiele metod identyfikacji. Trwałe metody dla myszy obejmują nakłuwanie uszu, kolczyki, tatuowanie i podskórne mikroczipy16. Mogą one wyraźnie i niezawodnie rozróżniać zwierzęta w obrębie kolonii lub klatki i mogą być łatwo podawane przez personel laboratoryjny. Metody takie jak nakłuwanie uszu są minimalnie inwazyjne, wymagają tylko jednego specjalistycznego sprzętu i sprawdzają się u zwierząt w większości wieku. Chociaż systemy te są proste i przydatne dla myszy, ich zastosowanie u żab stanowi wyjątkowy zestaw wyzwań. Żaby i inne nie mają małżowiny usznej (zewnętrznej struktury ucha). Niektórzy badacze dołączyli znaczniki do szczęki, palca u nogi lub kończyny tylnej zwierzęcia17,18. Takie podejście skutkowało różnymi problemami: znaczniki szczęk powodowały irytację, a wzburzone żaby próbowały ściągać znaczniki przednimi kończynami17. Kolczyki na palcach przebijały taśmę między palcami, utrudniając poruszanie się i niosąc ze sobą ryzyko zgubienia. W związku z tym wymagają własnych metod identyfikacji. Historycznie rzecz biorąc, obcinanie palców u nóg było również używane do oznaczania17,19. Palec u nogi jest przycinany ostrymi nożyczkami, a zwierzę można zidentyfikować po długości palców u przednich i tylnych łap lub po kącie, pod jakim palec odrósł (u salamander). Jednak ta metoda stwarza obawy etyczne, że obcinanie palców u nóg może upośledzać ruchy zwierzęcia17. Ponadto może to spowodować krwawienie i wprowadzić ryzyko infekcji. Innym ustalonym systemem znakowania są autoprzeszczepy skóry, w których skóra jest pobierana z jednej części żaby i chirurgicznie dołączana do innej części. Na przykład, opisana jest metoda oznaczania grzbietu lub ramienia żaby za pomocą jasnego przeszczepu skóry z jej klatki piersiowej20. Przeszczepy skóry wiążą się również z ograniczeniami i ryzykiem: procedura jest inwazyjna i wprowadza ryzyko zakażenia Aeromonas hydrophila lub czerwonej nogi, potencjalnie śmiertelnej dolegliwości; całkowite wygojenie autoprzeszczepu trwa do 6 tygodni; A przy opisanych metodach, tylko 6 żab może być trzymanych razem ze względu na ograniczoną liczbę miejsc do umieszczenia autograft20.
Mniej inwazyjne metody znakowania obejmują szklane koraliki i chipy transponderów17,19. W metodzie szklanych koralików szklane koraliki są nawleczone na mały szew i wszyte w skórę żaby. Zapewnia to większą zmienność niż autoprzeszczepy skóry, z co najmniej 60 charakterystycznymi kombinacjami kolorów. Istnieje jednak ryzyko, że szew może wypaść i spowodować utratę koralików. Alternatywnie, transponder mikroczipowy może być wszczepiony pod skórę w grzbietowym woreczku limfatycznym żaby. Jest to uważane za najbardziej trwałą metodę znakowania i umożliwia indywidualną identyfikację i skatalogowanie potencjalnie nieskończonej liczby zwierząt. Jest to jednak również najdroższa metoda, ponieważ pojedyncze mikroczipy są drogie, a znakowanie dużej kolonii byłoby kosztowne. Mikroczipy wymagają również specjalnego skanera do odczytu19. Jednym z powszechnych podejść do identyfikacji Xenopus jest odwoływanie się do naturalnego ubarwienia i wzorów zwierząt. Działa to szczególnie dobrze w przypadku żab, takich jak X. laevis, które mają wyraźne wzory, które utrzymują się przez całe dorosłe życie. Jednak te wzorce mogą się zmieniać w czasie pod wpływem stresu, a kolorystyka może wyglądać inaczej, gdy żaby są przenoszone między przezroczystymi i przyciemnionymi pojemnikami15. Dodatkowo, ta metoda identyfikacji jest mniej przydatna dla X. tropicalis, który ma mniej wyraźne wzorce znakowania w porównaniu do X. laevis, lub dla zwierząt albinosów, które nie mają oznaczeń kolorystycznych21. Nawet w przypadku gatunków z wyraźnymi oznaczeniami personel laboratoryjny może inaczej interpretować rozmieszczenie i rozmiar oznaczeń, co może powodować błędy w identyfikacji. Z tego powodu fotografowanie zwierząt jest najbardziej wiarygodne w połączeniu z dodatkową metodą identyfikacji. Dlatego staramy się znakować i identyfikować zwierzęta Xenopus za pomocą techniki, która jest łatwo rozpoznawalna, trwała i minimalnie inwazyjna.
Istnieje ograniczona ilość opublikowanych zasobów opisujących metody tatuowania. Tatuowanie zostało opisane wraz z innymi technikami brandingowymi, w tym markami ciepła, markami azotanu srebra i markami zamrażającymi17. W tym samym zasobie tatuowanie wykonywano poprzez rysowanie cyfr za pomocą igły podskórnej 27G, a proces ten nie powodował infekcji, w przeciwieństwie do innych technik znakowania, które wykorzystywały drut w kształcie cyfry lub innego znaku. W innym źródle do oznaczania żab użyto elektrycznej maszyny do tatuażu (opisanej jako wibrująca igła), ale niewiele szczegółów na temat tej techniki17,19. Autorzy ostrzegają, że naruszając ochronną warstwę śluzu żaby, procedura ta zwiększa ryzyko czerwonej nogi. Chociaż nie ma metody znakowania lub identyfikacji, która byłaby zarówno całkowicie nieinwazyjna (jak zdjęcia), jak i trwała (taka jak mikroczipy), tatuaż stanowi skuteczny kompromis. Tatuowanie jest stosunkowo proste w porównaniu z innymi technikami, takimi jak autoprzeszczepy skóry. Dodatkowe korzyści to mniejsza krzywa uczenia się i stosunkowo niedrogi sprzęt. Tatuowanie wodnych wiąże się z pewnymi wyzwaniami, które mogą onieśmielać badaczy i utrudniać skuteczne znakowanie zwierząt. Niniejszy artykuł ma na celu dostarczenie naukowcom dobrze udokumentowanych metod tatuowania dorosłych Xenopus za pomocą rotacyjnej maszynki do tatuażu.
Protokół
Wszystkie opisane procedury dla zwierząt zostały zatwierdzone przez Instytucjonalną Komisję ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt w Dartmouth College.
1. Konfiguracja sprzętu
UWAGA: Dołączony jest przepływ pracy dla procedury i przykładowa konfiguracja stanowiska (Rysunek 1).
- Podłącz pistolet do tatuażu i pedał nożny do zasilania. Umieść pedał nożny pod powierzchnią roboczą .
- Montaż pistoletu do tatuażu
- Za pomocą klucza imbusowego lub śrubokręta imbusowego poluzuj w uchwycie (Rysunek 2A, otoczony na czerwono).
- Włóż plastikową końcówkę do końca do uchwytu. Dokręć, aby utrzymać ją na miejscu.
- Włóż metalową rurkę z tyłu uchwytu (Rysunek 2A). Zostanie to dostosowane, więc włóż go do połowy jego długości. Dokręć, aby utrzymać ją na miejscu.
- Wbij igłę do tatuażu przez tylną część uchwytu tak, aby wygodnie leżała w plastikowej końcówce z przodu uchwytu (Rysunek 2B).
- Wsuń tylną część igły i metalową rurkę przez rurkę clamp. Wyreguluj metalową rurkę tak, aby igła wygodnie przylegała do plastikowej końcówki (Rysunek 2B). Ręcznie dokręć rurkę clamp, aż rurka nie będzie w stanie się poruszać (Rysunek 2C).
- Zdejmij O-ring i zaczep igłę na ramieniu wirnika; wymień O-ring, aby zamocować igłę na miejscu (Rysunek 2C).
- Ustaw napięcie w zasilaczu tak, aby była wystarczająca moc, aby przebić skórę, ale nie tak mocna, aby trudno było ją kontrolować. Po podłączeniu i podłączeniu zasilacza naciśnij pedał nożny, aby upewnić się, że maszyna działa. Należy uważać, aby nie kierować igły na siebie ani na inny personel.
UWAGA: Maszynka do tatuażu używana w tym protokole działa najlepiej w zakresie od 6,0 do 9,0 V, ale może się to różnić w zależności od maszynki do tatuażu i napięcia zasilania i powinno być określone empirycznie. - Napełnij nakrętkę probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml lub dołączonego plastikowego kałamarza czarnym tuszem do tatuażu do około trzech czwartych pojemności.
2. Znieczulenie
- Przygotuj znieczulenie w zbiorniku wystarczająco dużym, aby zanurzyć jedną dorosłą samicę żaby X. laevis.
- Używając wody bezpiecznej dla żab (bez chloru), dodaj trikainę do końcowego stężenia 1,5 g/l i wodorowęglan sodu do końcowego stężenia 3,5 g/l. Wymieszaj do rozpuszczenia. pH tego roztworu wynosi 7,15,
UWAGA: Trikaina jest substancją drażniącą.
- Używając wody bezpiecznej dla żab (bez chloru), dodaj trikainę do końcowego stężenia 1,5 g/l i wodorowęglan sodu do końcowego stężenia 3,5 g/l. Wymieszaj do rozpuszczenia. pH tego roztworu wynosi 7,15,
- Zanurz jedną żabę w zbiorniku anestezjologicznym. Upewnij się, że żaba pozostaje zanurzona w roztworze tricainy, dopóki nie zostanie znieczulona (7-8 min).
- Aby sprawdzić, czy żaba jest w pełni znieczulona, podnieś ją, przytrzymaj do góry nogami i mocno ściśnij jedną stopę. Jeśli żaba nie drgnie ani nie reaguje, można ją wytatuować.
- Jeśli znieczulenie żab stale trwa dłużej niż 10 minut, należy przygotować świeży roztwór trikainy zbuforowany wodorowęglanem sodu.
UWAGA: Żaby nie powinny spędzać więcej niż 30 minut w roztworze tricainy15.
3. Tatuowanie
UWAGA: Przed wytatuowaniem żywego zwierzęcia warto poćwiczyć na kawałku owocu o mocnej skórce (takim jak cytryna lub banan).
- Przed wykonaniem tatuażu przygotuj zbiornik regeneracyjny dla żab. Napełnij zbiornik 10-15 litrami świeżej, bezpiecznej dla żab wody i dodaj wyspę styropianową. Zapewni to powierzchnię, na której żaba może się obudzić bez utonięcia.
UWAGA: Wyspę styropianową można wykonać za pomocą pokrywy styropianowego pojemnika do transportu umieszczonego w torbie zapinanej na zamek. - Połóż znieczuloną żabę na plecach na suchym ręczniku papierowym lub papierze stołowym (Rysunek 3A). Używaj niebielonych (brązowych) ręczników papierowych do wszystkich prac z udziałem żab.
- Za pomocą suchej, niestrzępiącej się chusteczki zetrzyj wodę i śluz z klatki piersiowej żaby.
- Znajdź palcami mostek na środku klatki piersiowej żaby i używając ręki niedominującej, przytrzymaj napiętą skórę.
- Oznaczanie żaby
- Trzymaj zmontowany pistolet do tatuażu pionowo w stosunku do powierzchni roboczej i zanurz igłę w tuszu ( Rysunek 3B).
- Trzymając zmontowany pistolet do tatuażu w pozycji pionowej, dociśnij końcówkę igły do skóry żaby przed naciśnięciem pedału nożnego. Narysuj linie na skórze żaby, wywierając równomierny nacisk.
UWAGA: Niewielkie krwawienie lub zaczerwienienie jest normalne, podobnie jak niewielkie złuszczanie się skóry. - Jeśli igła zaczepi się o skórę żaby, usuń nadmiar atramentu lub skóry z igły za pomocą ściereczki. Nadmiar tuszu jest normalny podczas tatuowania.
- Jeśli klatka piersiowa żaby jest pokryta zbyt dużą ilością atramentu, aby wyraźnie zobaczyć oznaczany obszar (Rysunek 3C), usuń nadmiar atramentu wodą bezpieczną dla żab i przetrzyj (Rysunek 3C'). Następnie odprowadzić wilgoć suchą chusteczką i kontynuować farbowanie.
UWAGA: Przed wykonaniem tatuażu można przygotować butelkę z wodą bezpieczną dla żab .
- Kontynuuj malowanie w tym samym obszarze, aż po wytarciu nadmiaru atramentu pozostaną ciemne, czytelne cyfry (Rysunek 3D). Zamiast rysować całe oznaczenie lub numer za jednym pociągnięciem, wielokrotnie wykonuj mniejsze pociągnięcia, zwłaszcza w przypadku krzywych.
4. Odzyskiwanie
- Zwilż ręcznik papierowy wodą bezpieczną dla żab i połóż go płasko na styropianowej wyspie (Rysunek 4A).
- Powrót żab do stojących zbiorników
- Połóż żabę brzuchem do dołu na ręczniku skierowanym w stronę wody (Rysunek 4B). Złóż połowę ręcznika papierowego na tylną połowę żaby i za pomocą złożonych rąk zwilż górną część żaby. Gdy żaba wynurzy się ze znieczulenia (około 1 godziny po wykonaniu tatuażu), samodzielnie wejdzie do wody i będzie normalnie pływać.
- Żaby należy zwrócić do długoterminowego mieszkania po 24 godzinach, gdy tatuaż całkowicie się zagoi.
5. Czyszczenie i konserwacja sprzętu
UWAGA: Chociaż igły mogą być ponownie użyte do wielu żab podczas tego samego posiedzenia, najlepszą praktyką jest wymiana lub sterylizacja igieł między żabami tatuującymi.
- Ponowne użycie i autoklawowanie igieł do tatuażu
- Opłucz igły w 100% izopropanolu i wodzie dejonizowanej, aby poluzować tusz i zeskrobać pozostały atrament, który się nie rozpuścił.
- Po wyszorowaniu umieść igły w metalowym etui do autoklawowania lub owiń je folią aluminiową i autoklaw na 30 minut w suchym cyklu.
- Jeśli na kawałkach maszynki do tatuażu lub innego sprzętu znajduje się tusz, przetrzyj go 100% etanolem i ręcznikiem papierowym.
- Roztwór znieczulający ma końcowe stężenie trikainy około 0,5%. Zutylizować go zgodnie z instytucjonalnymi wytycznymi dotyczącymi gospodarowania odpadami niebezpiecznymi.
- Przechowywanie i konserwacja sprzętu
- Jeśli to możliwe, przechowuj maszynkę do tatuażu w suchym pomieszczeniu. Nadmiar wilgoci uszkodzi elementy elektryczne i skróci żywotność maszyny.
- Aby utrzymać maszynkę do tatuażu w dobrym stanie, sprawdź łożysko na wirniku (Rysunek 2C), aby upewnić się, że nie poluzował się pod wpływem wibracji22. Można go dokręcić kluczem imbusowym lub śrubokrętem imbusowym.
- Mniej więcej raz w miesiącu smaruj łożysko na ramieniu wirnika za pomocą gęstego smaru22.
- W niektórych maszynkach do tatuażu ramię wirnika może się zaciąć i nie będzie wibrować. Aby to skorygować, przekręć ramię wirnika lub ściśnij sprężynę tak, aby igła znalazła się w opuszczonej pozycji (Rysunek 2C).
Wyniki
Wysokiej jakości tatuaże charakteryzują się ciemnymi, czytelnymi liniami na piersi żaby i mogą być wyraźnie rozróżnione z odległości kilku stóp (Rysunek 5A). Zasadniczo większe numery i oznaczenia są lepsze pod kątem czytelności, jednak dłuższe nazwy i liczby mogą zostać wykonane w mniejszym rozmiarze, aby swobodnie zmieścić się na piersi żaby. Trwałość tatuażu jest trudniejsza do oceny, ale wysokiej jakości tatuaże u żab powinny pozostać ciemne i czytelne przez co najmniej 3-6 miesięcy (Rysunek 5D-D'). Po wyblaknięciu tatuażu można go odświeżyć, stosując tę samą technikę.
Błędna technika nie wyrządzi zwierzętom krzywdy, ale może skutkować tatuażami, które szybko blakną (Rysunek 5B), co prowadzi do konieczności częstszych korekt. Zbyt intensywne tatuowanie może spowodować krwawienie i zaczerwienienie, a umieszczenie żaby w niewłaściwej pozycji podczas rekonwalescencji może doprowadzić do niezamierzonego utonięcia.
Jakość tatuaży oraz skuteczność techniki mogą zostać ocenione w miesiącach następujących po tatuowaniu (Rysunek 5E). Jeśli po okresie rekonwalescencji na skórze żaby nadal znajduje się tusz, tatuaż uznaje się za udany.
Rycina 1: Schemat procedury i konfiguracja stanowiska pracy. (A) Schemat i harmonogram. (1) Żaby są znieczulane przez 7-8 min w roztworze 1,5 g/L tricaine i 3,5 g/L wodorowęglanu sodu, pH 7,15, rozpuszczonym w wodzie bezpiecznej dla żab. Podczas tatuowania jednej żaby, druga może zostać umieszczona w zbiorniku z znieczuleniem. W roztworze tricaine może znajdować się tylko jedna żaba w danym czasie. (2) Żaby spędzają około 10 min poza wodą podczas tatuowania. Czas ten będzie się różnić w zależności od wielkości tatuażu i doświadczenia personelu laboratoryjnego. (3) Nieprzytomne żaby umieszcza się na styropianie na 30-45 min, aby zapobiec utonięciu, i przykrywa mokrym ręcznikiem papierowym, aby zapobiec ich wysychaniu. (4) Po tatuowaniu żaby spędzają 24 h na rekonwalescencji w świeżej, stojącej wodzie bezpiecznej dla żab. Po wyzdrowieniu żaby mogą wrócić do kolonii. (B) Konfiguracja stanowiska pracy na przykładzie jednego obszaru roboczego. Obszar tatuowania, wyłożony niebielonym ręcznikiem papierowym, znajduje się w centrum blatu. Maszynka do tatuażu i zasilacz znajdują się po lewej stronie ręcznika papierowego. Są one umieszczone po stronie dominującej operatora (operator jest leworęczny). Kałamarz i tusz do tatuażu znajdują się w pobliżu zasilacza, poza obszarem tatuowania. Pedał nożny znajduje się po tej samej stronie co zasilacz. Naciskanie tego pedału steruje ruchem obrotowym. Wycieraczki bezpyłowe i butelka z dozownikiem z wodą bezpieczną dla żab znajdują się po prawej stronie ręcznika papierowego. Są one używane do usuwania nadmiaru tuszu ze skóry żaby podczas tatuowania. Klucz imbusowy służy do dokręcania i luzowania śrub w maszynce do tatuażu. Jest on używany do montażu i demontażu urządzenia. Zbiornik do znieczulania oraz dodatkowe ręczniki papierowe są również przechowywane na blacie podczas tatuowania. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rycina 2: Montaż maszyny do tatuażu. (A) Zdjęcie rozłożonej igły do tatuażu, uchwytu i powiązanych komponentów. Śruby na metalowym uchwycie zostały zaznaczone czerwonym okręgiem. (B) Zdjęcie igły do tatuażu prawidłowo zamontowanej w uchwycie. (C) Zdjęcie igły do tatuażu i uchwytu zamontowanych w maszynie do tatuażu. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rysunek 3: Pozycjonowanie i obrazy referencyjne podczas tatuażu żaby. (A) Zdjęcie żaby leżącej na plecach na ręczniku papierowym. Strzałka wskazuje mostek żaby. (B) Zdjęcie personelu laboratoryjnego nanoszącego tusz na żabę. (C) Zdjęcia numerów podczas nanoszenia tuszu, przed (C) i po (C') zmyciu nadmiaru tuszu. (D) Zdjęcie tatuażu żaby bezpośrednio po naniesieniu tuszu, przed rekonwalescencją. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Rysunek 4: Rekonwalescencja po tatuażu. (A) Wyspa styropianowa. Pokrywa styropianowej lodówki została umieszczona w worku strunowym. (B>) Żaby w pozycji rekonwalescencyjnej po wykonaniu tatuażu. Na wyspach styropianowych zazwyczaj mogą pomieścić się 1 lub 2 żaby. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Rysunek 5: Przykłady reprezentatywnych wyników. (A) Świeży tatuaż 24 h po wykonaniu. (B) Techniki niskiej jakości. W przypadku (B) maszyna do tatuażu nie została prawidłowo złożona, ale wciąż była zdolna do ruchu obrotowego. Zdjęcie wykonano 4 miesiące po tatuażu. W przypadku (B') maszyna do tatuażu nie została złożona prawidłowo i nie była zdolna do ruchu obrotowego. Zdjęcie wykonano 6 miesięcy po tatuażu. (C) Nieprawidłowo złożona maszyna do tatuażu. Metalowa rurka i plastikowa końcówka są nieobecne, a metalny uchwyt nie jest prawidłowo przymocowany do reszty maszyny. Gumka ograniczająca ruch obrotowy (D) Przed (D) i po (D') żaba z tatuażem wykonanym przy zastosowaniu dobrej techniki i prawidłowego ustawienia sprzętu. Zdjęcie (D) wykonano bezpośrednio po tatuażu, a zdjęcie (D') 4 miesiące po tatuażu. (E) Ilościowe dane wyników tatuażu u żab. Spośród tatuażowanych żab, 100% miało widoczne tatuaże bezpośrednio po zabiegu, 100% miało je 24 h po tatuażu, a 91% miało je 4 miesiące po tatuażu. n = 58 żab. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Dyskusja
Tatuowanie ludzi to forma sztuki sięgająca tysięcy lat wstecz i tak długo, jak ludzie tatuują siebie, tatuują lub znakują również zwierzęta23. Sprzęt i techniki znakowania zwierząt, w szczególności ssaków, są dobrze znane, dobrze udokumentowane i szeroko dostępne. Podczas gdy znakowanie zwierząt miało pierwotnie służyć do odróżniania zwierząt gospodarskich i środków odstraszających przed kradzieżą23, jego rola w badaniach biomedycznych stała się równie ważna.
Zaletą tatuowania jest to, że tatuaże goją się w ciągu 24 godzin, a dobre tatuaże utrzymują się przez kilka miesięcy (ryc. 5D'). Tatuowanie zapewnia wiele korzyści w zakresie trzymania i hodowli. Tatuaże pozwalają naukowcom i personelowi weterynaryjnemu łatwo odróżnić poszczególne zwierzęta za pomocą liczb, które są łatwe do zobaczenia i interpretacji, nawet w zbiornikach o ciemniejszych odcieniach19. Procedurę tę można również wykonać na każdej dorosłej żabie, w porównaniu z autoprzeszczepami skóry, które nie są zalecane dla żab powyżej 2 rokużycia 15. Co najważniejsze, tatuowanie pozwala na identyfikację dużej liczby zwierząt, przy czym co najmniej trzy palce wygodnie mieszczą się na klatce piersiowej X. laevis (ryc. 5A).
W porównaniu z przyklejaniem koralików lub zawieszek, tatuowanie nie pozostawia niczego, co mogłoby spaść i powoduje ograniczone podrażnienia17. Ponadto tatuowanie pozwala na większą wszechstronność niż inne techniki brandingowe, które wymagają ukształtowania drutu w markę. Sama procedura jest znacznie mniej uciążliwa niż autoprzeszczepy skóry, ponieważ nie jest usuwana żadna tkanka. Jednak, podobnie jak autoprzeszczepy, tatuaż jest również częściowo inwazyjny i wprowadza niewielkie ryzyko kontuzji lub infekcji. Jest to niezbędna część znakowania każdego zwierzęcia, ale ważne jest, aby naukowcy uważali na nadmierne krwawienie podczas tatuowania i monitorowali zwierzęta pod kątem zakażenia A. hydrophila . Można temu zapobiec, utrzymując czyste miejsce pracy przed, w trakcie i po tatuowaniu oraz upewniając się, że tatuaże całkowicie się zagoiły, zanim zwierzęta wrócą do swojej kolonii. Pisząc i rozwijając ten artykuł, żadna z żab nie została trwale ranna ani nie zmarła w wyniku tatuowania. Ograniczeniem tej procedury jest to, że została ona przetestowana tylko na dorosłych żabach w wieku powyżej 1 roku. Do tej pory żadne żabki nie zostały wytatuowane za pomocą tego protokołu. Ponadto procedura ta nie jest zoptymalizowana pod kątem X. tropicalis, które mają ciemne zabarwienie na klatce piersiowej i sprawiają, że tatuaże są mniej widoczne21. W przyszłości ten protokół tatuowania może zostać zaktualizowany o uwzględnienie rozważań dotyczących X. tropicalis.
Ponieważ siedlisko Xenopus jest wodne4, normalne jest, że te tatuaże blakną z czasem. Konieczność częstego zastępowania tatuaży jest udokumentowana w ludzkich tatuażach warg wewnątrz ust, które blakną szybciej niż tatuaże naskórkowe z powodu ciągłego kontaktu ze śliną i napojami24. Jednak trwałość tatuażu zależy w dużej mierze od techniki tatuowania. Zła technika może wynikać z nieprawidłowo zmontowanej maszynki do tatuażu (Rysunek 4C) lub nieoptymalnych ustawień zasilania. Zbyt niskie napięcie zapobiegnie wbiciu się igły w skórę, powodując powstanie słabych śladów lub linii. Ustawienie zbyt wysokiego napięcia spowoduje niepotrzebną krzywdę dla zwierzęcia. Innym częstym źródłem złego tatuowania jest nieprawidłowe ułożenie igły lub nacisk, gdy personel trzyma pistolet do tatuażu. Tatuowanie ze zbyt małym naciskiem ma taki sam skutek, jak ustawienie zbyt niskiego napięcia i spowoduje powstanie słabego tatuażu, który szybko blaknie (ryc. 5B'). Podczas tatuowania można odnieść wrażenie, że igła ślizga się po skórze żaby, zamiast ją przekłuwać. Tatuowanie ze zbyt dużym naciskiem spowoduje zauważalne lub niekontrolowane krwawienie. Najlepszy tatuaż wykonuje się cierpliwie i metodycznie, tuszując krótkie odcinki i cofając linie z dużym, stałym naciskiem.
Ogólnie rzecz biorąc, korzyści płynące ze znakowania zwierząt poprzez tatuowanie przeważają nad wadami. Indywidualne śledzenie Xenopus w badaniach biomedycznych umożliwia naukowy rygor w śledzeniu replik biologicznych, umożliwia badaczom i personelowi weterynaryjnemu ocenę dobrostanu poszczególnych zwierząt oraz zapewnia odpowiednią częstotliwość owulacji w celu utrzymania długoterminowego stanu zdrowia zwierzęcia. Jeśli chodzi o zasady 3R badań na zwierzętach – udoskonalanie, redukcję i usuwanie – protokół ten jest najbardziej istotny dla udoskonalania i redukcji1. Znakowanie żab ułatwia naukowcom i weterynarzom śledzenie problemów zdrowotnych, a także upewnia się, że żaby mają wystarczająco dużo czasu na odpoczynek między eksperymentami. Udoskonala to proces badawczy poprzez zapewnienie wyższej jakości danych i próbek pobranych od zwierząt, a także udoskonalenie praktyk w zakresie hodowli i opieki nad zwierzętami. Pomaga również poprawić odtwarzalność w eksperymentach. Ponadto znakowanie zwierząt umożliwia ich ponowne wykorzystanie, co zmniejsza całkowitą liczbę wymaganych zwierząt. Żaby, które składają jaja szczególnie wysokiej jakości lub są najbardziej przydatne w innych eksperymentach, mogą być oznaczone i zidentyfikowane jako lepiej nadające się do badań. Jeśli żaby konsekwentnie nie są przydatne do eksperymentów, można je zidentyfikować i usunąć z kolonii, co oszczędza zasoby i miejsce. Celem tego artykułu jest udokumentowanie najlepszych praktyk w tatuowaniu i dostarczenie laboratoriom Xenopus szczegółowego, łatwo dostępnego protokołu tatuowania. Praktyka ta nie jest jeszcze powszechna w dziedzinie Xenopus , częściowo dlatego, że istniejące opublikowane zasoby są ograniczone. Zasób ten umożliwi naukowcom bezpieczne i skuteczne znakowanie zwierząt, usprawnienie prowadzenia dokumentacji dotyczącej dużych kolonii oraz udoskonalenie wykorzystania w badaniach biomedycznych.
Oświadczenia
Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów.
Podziękowania
Dziękujemy Centrum Medycyny Porównawczej i Badań Dartmouth College za codzienną hodowlę zwierząt wykorzystywanych w tym protokole. Dziękujemy również Leah Jacob i Adwaita Bose za ich pomoc w testowaniu protokołu i fotografowaniu zwierząt. Na koniec dziękujemy laboratorium Ann Miller za szkolenie w praktyce tatuowania. Praca ta była wspierana przez grant NIH R00 GM147826 dla J.L.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 3 okrągłe wkładki igłowe | Światowa dostawa tatuażu | 1203RLB | Pakowane sterylne |
| 5-igłowe okrągłe jednorazowe ULTRA | Worldwide Tattoo Supply | HTIPRS5-U | Pakowane sterylne |
| okrągłe wkładki z 5 igłami | Światowa dostawa tatuażu | 1205RLB | Pakowane sterylne |
| okrągłe wkładki z 7 igłami | Worldwide Tattoo Supply | 1207RLB | Pakowane sterylne |
| Clip Cord | Worldwide Tattoo Supply | N/A | |
| Pedał nożny | Worldwide Tattoo Supply | N/A | |
| Inklosss | Worldwide Tattoo Supply | N/A | |
| Kimwipes, delikatne chusteczki do zadań | Fisher Scientific | 06-666A | |
| Połączenie RCA | Worldwide Tattoo Supply | N/A | |
| Scream Ink Pitch Black, 1 uncja | Światowa dostawa tatuażu | SI101 | |
| Wodorowęglan sodu (NaHCO3) | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Uchwyty ze stali nierdzewnej | Światowa dostawa tatuażu | Nie | |
| Stealth 2.0 | Światowa dostawa tatuażu | Nie | |
| Stealth 2.0 Zestaw obrotowych maszynek do tatuażu | Światowa dostawa tatuaży | STEALTH2-SET | |
| Wyspa styropianowa | N/A | N/A | To jest pokrywka styropianowego pojemnika do transportu na zimno |
| Trikaina (metanosiarczan 3-aminobenzonianu etylu) | Sigma-Aldrich | E10521 | UWAGA: DRAŻNIĄCY |
| Niebielone ręczniki papierowe | Grainger | 2U229 | Ręczniki papierowe MUSZĄ być niebielone, wybielacz jest toksyczny dla |
| Napięcie Zasilanie | Na całym świecie Dostawa tatuażu | Nie | |
| dotyczyButelka do mycia (z wodą bezpieczną dla żab) | Fisher Scientific FB0340923T | Woda bezpieczna dla żab jest odchlorowana, pH 7,0-8,5, przewodność 1200-1800 uS | |
| X. laevis dorosła samica | Xenopus1 | N/A | |
| Plastikowa torba z zamkiem błyskawicznym | N/A | /A | Ta torba powinna być wystarczająco duża, aby pomieścić wyspę styropianową |
Bibliografia
- Hubrecht, R. C., Carter, E. The 3Rs and humane experimental technique: Implementing change. Animals (Basel). 9 (10), 754(2019).
- Elkan, E. R. The Xenopus pregnancy test. British Med J. 2, 1253-1256 (1938).
- Vize, P. D., Zorn, A. M. Xenopus genomic data and browser resources. Dev Biol. 426 (2), 194-199 (2017).
- Sive, H. Xenopus: A Laboratory Manual. , Cold Spring Harbor Press. (2023).
- Borodinsky, L. N. Xenopus laevis as a model organism for the study of spinal cord formation, development, function and regeneration. Front Neural Circuits. 11, 90(2017).
- Hoppler, S., Conlon, F. L. Xenopus: Experimental access to cardiovascular development, regeneration discovery, and cardiovascular heart-defect modeling. Cold Spring Harb Perspect Biol. 12 (6), a037200(2020).
- Fisher, M., et al. Xenbase: key features and resources of the Xenopus model organism knowledgebase. Genetics. 224 (1), 018(2023).
- Slater, P. G., Hayrapetian, L., Lowery, L. A. Xenopus laevis as a model system to study cytoskeletal dynamics during axon pathfinding. Genesis. 55 (1-2), 22994(2017).
- Bermudez, J. G., Chen, H., Einstein, L. C., Good, M. C. Probing the biology of cell boundary conditions through confinement of Xenopus cell-free cytoplasmic extracts. Genesis. 55 (1-2), 23013(2017).
- Stooke-Vaughan, G. A., Davidson, L. A., Woolner, S. Xenopus as a model for studies in mechanical stress and cell division. Genesis. 55 (1-2), 23004(2017).
- Blackburn, A. T. M., Miller, R. K. Modeling congenital kidney diseases in Xenopus laevis. Dis Model Mech. 12 (4), 038604(2019).
- Tandon, P., Conlon, F., Furlow, J. D., Horb, M. E. Expanding the genetic toolkit in Xenopus: Approaches and opportunities for human disease modeling. Dev Biol. 426 (2), 325-335 (2017).
- Wheeler, G. N., Brändli, A. W. Simple vertebrate models for chemical genetics and drug discovery screens: Lessons from zebrafish and Xenopus. Dev Dyn. 236 (6), 1287-1308 (2009).
- Carron, M., et al. Evolutionary origin of Hox13-dependent skin appendages in amphibians. Nat Commun. 15 (1), 2328(2024).
- Schultz, T. W., Dawson, D. A. Housing and husbandry of Xenopus for oocyte production. Lab Animal. 32 (2), 34-39 (2003).
- Cadillac, J. Animal identification systems used for mice. , The Jackson Laboratory. (2006).
- Donnelly, M. A., Guyer, C., Juterbock, J. E., Alford, R. A. Techniques for marking amphibians. Meas Monitor Biol Div: Std Meth Amphibians. , Smithsonian Institute Press. 277-284 (1994).
- Hutchens, S. J., Deperno, C. S., Matthews, C. E., Pollock, K. H., Woodward, D. K. Visible implant fluorescent marker: A reliable marking alternative for snakes. Herpetol Rev. 39 (3), 301-303 (2008).
- Hoogstraten-Miller, S., Dunham, D. Practical identification methods for African clawed frogs (Xenopus laevis). Lab Animal. 26 (7), 36-38 (1997).
- Loopstra, J. A., Zwart, P., Verhoeff-de Fremery, R., Vervoordeldonk, F. J. M. Marking of African clawed toads (Xenopus laevis). Improvement of a skin autograft technique. New Dev Biosci: Their Implicat Lab Animal Sci. , 311-316 (1988).
- Rodel, M. Xenopus tropicalis. AmphibiaWeb. , (2001).
- Worldwide Tattoo Supply. Stealth 2 Rotary Tattoo Machine Intro & Maintenance. Worldwide Tattoo Supply. , (2015).
- Khan, S. U., Mufti, O. The hot history and cold future of brands. J Manager Sci. 1 (1), 75-84 (2007).
- Catlett, T. All About Lip Tattoo: what to Expect, Cost, Risks, Touch-ups & More. Healthline. , (2019).
Przedruki i uprawnienia
