NMR 15N Eksperymenty relaksacyjne do badania dynamiki strukturalnej białek z pikosekundy na nanosekundy

Podsumowanie

Spektroskopia magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR) może scharakteryzować dynamikę strukturalną białka w sposób specyficzny dla reszt. Udostępniamy praktyczny protokół do rejestrowania eksperymentów z relaksacją NMR ¹⁵N R₁ i R₂ oraz eksperymentów z heterojądrowym efektem Overhausera (hetNOE) {¹H}-¹⁵N, wrażliwych na skalę czasową od pikosekund do nanosekund.

Streszczenie

Spektroskopia magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR) pozwala badać białka w roztworze i w temperaturach fizjologicznych. Często jako reportery dynamiki strukturalnej białek wykorzystuje się zarówno grupy amidowe szkieletu białkowego, jak i grupy metylowe w łańcuchach bocznych. Badanie dynamiki strukturalnej szkieletu białkowego białek globularnych na próbkach znakowanych ¹⁵N i w pełni protonowanych zwykle działa dobrze w przypadku białek o masie cząsteczkowej do 50 kDa. Gdy stosuje się deuterację łańcucha bocznego w połączeniu ze spektroskopią zoptymalizowaną pod kątem relaksacji poprzecznej (TROSY), limit ten można zwiększyć do 200 kDa dla białek globularnych i do 1 MDa, gdy nacisk jest położony na łańcuchy boczne. Kiedy badane są białka wewnętrznie nieuporządkowane (IDP) lub białka z wewnętrznie nieuporządkowanymi regionami (IDR), te ograniczenia wagowe nie mają zastosowania, ale mogą znacznie wykraczać. Powodem jest to, że IDP lub IDR, charakteryzujące się dużą elastycznością wewnętrzną, są często dynamicznie rozłączane. Różne metody NMR oferują wgląd w dynamikę strukturalną białek w rozdzielczości atomowej w szerokim zakresie skal czasowych, od pikosekund do godzin. Standardowe pomiary relaksacji ¹⁵N obejmują wewnętrzną elastyczność białka i charakteryzują dynamikę szkieletu białka występującą w szybkiej skali czasowej od piko- do nanosekundowej. W tym artykule przedstawiono praktyczny protokół konfiguracji i nagrywania eksperymentów NMR ¹⁵N R₁, R₂ i heterojądrowego efektu Overhausera (hetNOE). Pokazujemy przykładowe dane i wyjaśniamy, jak je interpretować w prosty sposób jakościowo, zanim przejdziemy do bardziej wyrafinowanej analizy.

Wprowadzenie

Funkcja białka jest determinowana nie tylko przez jego trójwymiarową strukturę, ale także przez jego dynamikę strukturalną, obejmującą jego wewnętrzną elastyczność i strukturalne przejścia między różnymi konformacjami, które białko przyjmie. Spektroskopia magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR) może badać dynamikę strukturalną białek w roztworze^1,2,3. Najnowsze osiągnięcia w NMR w stanie stałym wykrywanym przez protony pozwalają również na scharakteryzowanie dynamiki białek w stanie mniej rozpuszczalnym, takim jak np. dwuwarstwowa błona lipidowa^4,5,6. W roztworze NMR można badać dynamikę strukturalną szkieletu białkowego i łańcuchów bocznych białek. W przypadku białka globularnego badanie dynamiki strukturalnej szkieletu białkowego można uzyskać do 50 kDa, gdy białko jest znakowane ^{izotopowo 15}N. W przypadku zastosowania spektroskopii zoptymalizowanej pod kątem łańcucha bocznego i relaksacji poprzecznej (TROSY) limit ten można rozszerzyć do 200 kDa^7,8. Gdy nacisk kładziony jest na dynamikę łańcucha bocznego, zakres dostępnych białek i kompleksów można rozszerzyć do 1 MDa^2,9.

Wymienione ograniczenia wagowe nie dotyczą białek wewnętrznie nieuporządkowanych (IDP), które często wykazują wysoką dynamikę wewnętrzną. Ponad 30% proteomu eukariotycznego składa się z IDP lub regionów wewnętrznie nieuporządkowanych (IDR)^10,11,12,13. Odgrywają one kluczową rolę w wielu procesach komórkowych, takich jak transdukcja i transkrypcja sygnału¹, i często biorą udział w wewnątrzkomórkowej separacji faz^14,15,16,17. IDP nie mają dobrze zdefiniowanej trójwymiarowej (3D) natywnej struktury w warunkach fizjologicznych i mają słabo ukierunkowany lub nierówny krajobraz energetyczny^17,18. Ze względu na niską hydrofobowość i silne odpychanie elektrostatyczne rozłożone na szkielecie IDP lub IDR, brakuje siły napędowej do składania do sztywnej konstrukcji¹⁹. IDP często przyjmują konformację złożoną, gdy są złożone z innymi partnerami wiążącymi^10,20,21. Ponadto modyfikacje potranslacyjne (PTM) rozszerzają możliwości składania IDPs lub IDRs^22,23. Nieprawidłowe fałdowanie IDPs zostało zidentyfikowane jako przyczyna różnych chorób, w tym chorób neurodegeneracyjnych^15,24,25,26.

IDPs i IDR wykazują wysoką elastyczność wewnętrzną^21,27,28. Zespoły konformacyjne przedstawiające zmienność położeń atomowych i kątów dwuściennych zostały wyprowadzone z symulacji dynamiki molekularnej i ograniczeń uzyskanych z danych eksperymentalnych^29,30,31,32. Ze względu na dynamikę i wynikający z niej nieporządek w stanie zamrożenia, rozproszona gęstość elektronów utrudnia ich strukturalne scharakteryzowanie przy użyciu najnowocześniejszych metod biologii strukturalnej, takich jak krio-EM czy krystalografia rentgenowska. Również warunki krystalizacji lub techniki przygotowania próbek do eksperymentów w temperaturach kriogenicznych mogą mieć wpływ na przestrzeń konformacyjną doświadczaną przez IDP. Jednak roztwór NMR działa dobrze w przypadku wysoce dynamicznych białek i dlatego dobrze nadaje się do badania IDPs^{16,20,22,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38}.

Jak wspomniano powyżej, rozwiązanie NMR oferuje różne techniki badania wewnętrznej dynamiki białek w szerokim zakresie skal czasowych (Rysunek 1), głównie w oparciu o relaksację spinu^{31,33,38,39,40,41,Lokal mieszkalny 42}.

Relaksacja spinowa ^{jąder 15}N w grupach amidowych szkieletu białkowego jest indukowana przez zmiany orientacji kąta wiązania 1 ^H-15N spowodowane wewnętrzną dynamiką białka i ruchami zbiorowymi (w tym, gdy to istotne, dyfuzją rotacyjną)^{27,43,44,45,46,47,48,49,50,51}. W skalach czasowych krótszych niż czas korelacji rotacyjnej τ_R (czas, w którym cząsteczka potrzebuje na obrót jednego radiantu, nazywany również całkowitym czasem korelacji wirowania), anizotropia przesunięcia chemicznego (CSA) i sprzężenie dipolowe (D) są aktywne i nie są uśredniane przez dyfuzję rotacyjną białka. Wewnętrzna dynamika szkieletu białkowego, obejmująca zmiany kątów wiązań, reorientacje wiązań i wirowanie rotacyjne, indukuje stochastyczne fluktuacje CSA i dipolarnego tensora sprzężenia, powodując zmianę lokalnego pola magnetycznego, ostatecznie prowadząc do relaksacji spinu NMR^47,48,52,53. Fluktuacje te można opisać za pomocą ogólnej funkcji korelacji. Transformata Fouriera ogólnej funkcji korelacji nazywana jest funkcją gęstości widmowej. W półklasycznej teorii relaksacji pola Redfielda stałe szybkości relaksacji NMR mogą być opisane za pomocą liniowych kombinacji tych funkcji gęstości widmowej⁵⁴.

Eksperymenty relaksacyjne ¹⁵N NMR opracowane na początku lat 90. obejmują ^{eksperymenty z 15}N, R_1ρ i {¹H}-¹⁵N jądrowym efektem Overhausera, wrażliwe na szybką skalę czasową pikosekund (ps) nanosekund (ns), szybsze niż czas korelacji rotacyjnej τ_R białka^45,55,56,57. Aby scharakteryzować dynamikę szkieletu wolniejszą niż czas korelacji rotacyjnej τ_R, eksperymenty tzw. dyspersji relaksacyjnej, R_1ρ, oraz eksperymenty Carra-Purcella-Meibooma-Gilla (CPMG) wrażliwe na mikrosekundy (μs) - milisekundy (ms) dynamika^{44,46,58,59,60,61} są używane. Dynamika wolniejsza niż mikrosekundy może być uchwycona przez transfer nasycenia wymiany chemicznej ¹⁵N (CEST) NMR⁶², spektroskopię wymiany (EXSY, milisekundy na sekundy) lub NMR w czasie rzeczywistym (RT) (sekundy na godziny)^63,64. Efekt PRE (wzmocnienie relaksacji paramagnetycznej) sond paramagnetycznych, a także szczątkowych sprzężeń dipolarnych (RDC), może być wykorzystany do oceny całego zakresu dynamiki ps do ms^65,66,67,68.

Rysunek 1: Skale czasowe dynamiki szkieletu białek i czułe okno czasowe różnych eksperymentów dynamiki NMR. NMR oferuje różnorodne metody charakteryzowania dynamiki szkieletu białek w szerokim zakresie skal czasowych. Różne ruchy doświadczane przez szkielet białkowy są wskazane w odpowiednich skalach czasowych. Czas korelacji rotacyjnej białka, τ_R, to czas, którego białko potrzebuje do całkowitej rotacji (o jeden radiant). Ruchy szybsze niż czas korelacji rotacyjnej białka, τ_R, mogą być związane z wewnętrzną elastycznością białka. Różne eksperymenty NMR i ich czułość na odpowiednie skale czasowe są wskazane poniżej strzałki. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Poniższy protokół opisuje konfigurację eksperymentów relaksacyjnych NMR przez Lakomek et al.⁶⁹ i Stief et al.⁷⁰, przy użyciu schematu wykrywania heterojądrowej pojedynczej koherencji kwantowej (HSQC) o zwiększonej czułości. Przed przystąpieniem do implementacji eksperymentalnej przedstawiono bardzo krótki przegląd eksperymentów z relaksacją spinową NMR i relaksacją NMR. Ze względu na ograniczenia dotyczące rozmiaru oraz w celu zachowania zrozumiałości tego protokołu, przegląd ten musi pozostać uproszczony (a zatem niekompletny).

Relaksacja podłużna lub spinowo-sieciowa, charakteryzująca się czasem T₁ lub stałą szybkości R₁ = 1/ T₁, opisuje powrót namagnesowania do równowagi Boltzmanna. W równowadze namagnesowanie jest ustawione wzdłuż osi zewnętrznego pola magnetycznego, która definiuje oś z ramy laboratoryjnej. Gęstości widmowe przy wysokich (¹H) i małych (¹⁵N) częstotliwościach Larmora (częstotliwości rezonansowe NMR, np. 600 MHz przez ¹godzinę dla magnesu o natężeniu 14,1 Tesli) oraz liniowe kombinacje tych częstotliwości Larmora przyczyniają się do relaksacji ¹⁵N R₁, która charakteryzuje się stałymi szybkości ¹⁵N R₁ mierzonymi w rad·^s-1. Ruchy na skalach czasu są odwrotne do tych częstotliwości Larmora; w ten sposób ruchy w skali czasowej pikosekundy do nanosekundy przyczyniają się do stałej szybkości relaksacji R₁. Dla cząsteczek, które wykazują ogólne wirowanie i w przypadku których można zdefiniować czas korelacji rotacyjnej, krzywa R₁ (T₁) pokazuje maksimum (minimum) dla ωτ_R = 1, z korelacją rotacyjną τ_R i częstotliwością Larmora ω rozważanego spinu. Jeżeli przyczynia się do tego wiele częstotliwości Larmora, to ta o najniższej częstotliwości jest dominującą, np. ω_N w przypadku ¹⁵N R₁. Reżim szybkiego ruchu (ωτ_R znacznie mniejszy niż 1) dotyczy małych cząsteczek, które bardzo szybko opadają, a także do niskich pól magnetycznych i niskiej lepkości. Reżim zwolnionego tempa (ωτ_R znacznie większy niż 1) dotyczy większych cząsteczek, które wolniej opadają oraz silnych pól magnetycznych i wysokiej lepkości.

Kuliste pofałdowane białka wykazują ogólne wirowanie w roztworze i można przypisać czas korelacji rotacyjnej. Jednak koncepcja całkowitego bębnienia nie jest już aktualna dla białek wewnętrznie nieuporządkowanych i często różni się od przypisania pojedynczego czasu korelacji rotacyjnej. W tym przypadku czas wewnętrznej korelacji specyficznej dla pozostałości staje się bardziej krytyczny.

Opisana sekwencja impulsów mierząca ¹⁵współczynników relaksacji N R₁ (Rysunek 2) jest oparta na eksperymencie odczytu HSQC o zwiększonej czułości z detekcją Echo/Anti-Echo dla detekcji kwadraturowej^69,70,71. Krótkie gradienty o zmiennej natężeniu i długości są używane do selekcji spójności i lepszego tłumienia wody⁷⁰. W tym czasie polaryzacja podłużna ¹⁵N ulegnie rozluźnieniu. Dłuższe czasy zaniku prowadzą do zmniejszenia intensywności w powiązanych płaszczyznach 2D tego widma pseudo-3D (punkty danych opóźnienia są rejestrowane w trzecim wymiarze). Element pętli, opisany poniżej, jest wykonywany coraz więcej razy w celu uzyskania dłuższych czasów relaksacji. Ponieważ skorelowana krzyżowo relaksacja między anizotropią przesunięcia chemicznego ¹⁵N (CSA) a sprzężeniem dipolarnym ¹H i ¹⁵N (D) jest również aktywna podczas opóźnienia relaksacji, centralny impuls I-BURP-2 180 ° klasa ⁷², selektywny dla protonów amidowych, jest konieczny do ponownego skoncentrowania wkładu przez skorelowaną krzyżowo relaksację (która, jeśli nie zostanie ponownie skoncentrowana, doprowadziłaby do skośnych i błędnych stałych szybkości ¹⁵N R₁).

Rysunek 2: Schematy sekwencji impulsów NMR do wyznaczania stałych szybkości relaksacji NMR. (A) ¹⁵N R_1ρ, (B) ¹⁵N R₁ i (C) eksperyment hetNOE, wykorzystujący schemat odczytu HSQC o zwiększonej czułości^69,70. Impulsy 90°(x) są wizualizowane przez wąskie prostokąty, a impulsy 180°(x) przez szerokie prostokąty, chyba że wskazano inaczej. Stosuje się następujący cykl fazowy: φ₆ = y, y, -y, -y; φ₇ = y, -y, φ_rec = y, -y, -y, y. Detekcja kwadraturowa uzyskuje się poprzez odwrócenie polaryzacji gradientu G5 i cyklu fazowego φ7 (detekcja echa/anty-echa). (A) ¹⁵N R_1ρ eksperyment: prostokąt reprezentuje blokadę wirową, dla której czas trwania zmienia się, aby uzyskać różne opóźnienia relaksacji. Trójkąty przed i po wirowaniu wskazują adiabatyczne impulsy kształtu, które wyrównują namagnesowanie wzdłuż efektywnej osi pola magnetycznego B_eff. G₁₀ to opcjonalny gradient zapobiegający tłumieniu promieniowania przez namagnesowanie wody w fazie ewolucji. (B) ¹⁵N R₁ eksperyment: Część w nawiasie pokazuje element pętli sekwencji, powtórzony n razy, aby dopasować się do pożądanego opóźnienia relaksacji. (C) Schemat impulsów hetNOE jest podobny do drugiej połowy schematów impulsów R₁ i R_1ρ, a mianowicie czasu ewolucji t₁ i elementu detekcji HSQC. Jednak namagnesowanie ¹⁵N jest wzbudzane bezpośrednio, bez żadnych INEPT. Nasycenie namagnesowania protonów (w celu uzyskania relaksacji krzyżowej między ¹H a ¹⁵N) osiąga się za pomocą ciągu 180 (¹H) impulsów przyłożonych przez co najmniej 5 s. W doświadczeniu referencyjnym stosuje się opóźnienie biegu jałowego o tych samych długościach (w tym przypadku 5 s) bez żadnego ciągu impulsów. G₅ jest opcjonalnym gradientem zapobiegającym tłumieniu promieniowania, a odwrócenie polaryzacji gradientu G4, w połączeniu z fazą φ7 = y, -y, -y, y, osiąga detekcję kwadraturową. Etapy przenoszenia namagnesowania, reprezentowane przez operatorów produktu, są oznaczone kolorem czerwonym. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Stała szybkości relaksacji R₂ opisuje relaksację polaryzacji poprzecznej (w płaszczyźnie xy prostopadłej do zewnętrznego pola magnetycznego) spowodowanej utratą spójności fazowej między spinem, co prowadzi do zaniku wykrywalnego namagnesowania^53,54. Funkcja gęstości widmowej przy wysokich i małych częstotliwościach przyczynia się do R₂, podobnie jak R₁. Jednak największy wkład w R₂ ma gęstość widmowa przy zerowej częstotliwości. Z tego powodu R₂ jest bardzo wrażliwe na wirowanie rotacyjne, opisane czasem korelacji rotacyjnej τ_R, który jest rzędu kilku ns dla małego białka globularnego w temperaturze pokojowej. W związku z tym najbardziej przyczyniają się do tego wolniejsze ruchy kręgosłupa w reżimie od setek ps do niskich ns. Dynamika wymiany szkieletu, która powoduje modulację izotropowej części tensora przesunięcia chemicznego jąder ¹⁵N, w zasadzie dodaje wkład wymiany R_2ex do stałych szybkości R₂^{43,44,49,60,61}. W opisanych eksperymentach wkład R_2ex jest tłumiony przez blokadę spinową, która ponownie skupia dynamikę wolniej niż odwrotna częstotliwość kołowa blokady spinowej. Blokada wirowa to długi impuls o częstotliwości radiowej o częstotliwości ciągłej, który utrzymuje namagnesowanie w jednej linii wzdłuż efektywnej osi pola magnetycznego B_eff (suma wektorowa pola blokady spinowej ω₁ i przesunięcie chemiczne przesunięte w stosunku do częstotliwości nośnej ¹⁵N (patrz poniżej)). Relaksacja namagnesowania ustawionego wzdłuż osi B_{1, eff} nazywana jest relaksacją R_1ρ, która ma składową R₁ i składową R₂. Korzystając ze wzoru (1), R₂ można obliczyć z R_1ρ i R₁^44,73:

(1).

Kąt między osią efektywnego pola magnetycznego B_eff a zewnętrznym polem magnetycznym B₀ wynosi . ω₁ to amplituda RF blokady spinowej, a Ω przesunięcie chemiczne między ¹⁵N przesunięciem chemicznym odpowiedniej reszty a częstotliwością nośną ¹⁵N ^44,73.

Schemat impulsów R_1ρ (Rysunek 2A, ⁷⁰) jest bardzo podobny do schematu ¹⁵N R₁, z wyjątkiem opóźnienia relaksacji. Aby zmierzyć współczynniki relaksacji ¹⁵N R_1ρ, blokada wirowa musi być aktywna po ustawieniu namagnesowania wzdłuż efektywnej osi pola B_eff za pomocą impulsu adiabatycznego o tej samej amplitudzie częstotliwości radiowej (RF) co blokada wirowa. Długość blokady wirowania będzie zmieniana, aby uzyskać różne opóźnienia relaksacji.

Efekt jądrowy Overhausera w stanie ustalonym {¹H}-¹⁵N (^{1 H-15}N NOE), nazwany dalej hetNOE, jest stosunkiem współczynnika relaksacji krzyżowej i ¹⁵N tempa relaksacji podłużnej. Prowadzi to do zmniejszenia polaryzacji w stanie ustalonym na ¹⁵N w wyniku relaksacji krzyżowej z protonem po nasyceniu polaryzacji protonu^{45,53,54,74,75}. Relaksacja krzyżowa zależy od funkcji gęstości widmowej sumy i różnicy częstotliwości ¹H i ¹⁵N Larmor. Dlatego hetNOE jest wrażliwy zarówno na dynamikę szybkich pikosekund (< 100 ps), jak i na dynamikę ps-ns (ze względu na zależność od R₁). Sekwencja⁶⁹ (Rysunek 2C) jest oparta na odczycie HSQC o zwiększonej czułości z gradientami Echo/Anti-Echo do wykrywania kwadraturowego. W celu nasycenia namagnesowania protonów i powstałego hetNOE, równowagowe namagnesowanie protonów jest odwracane, a następnie nasycane przez szybko pulsujące impulsy 180° przez około 5 razy więcej niż ¹⁵ N T₁. W doświadczeniu referencyjnym opóźnienie powrotu jest równe opóźnieniu nasycenia, ale bez ciągu impulsów ¹H 180°. Dodatkowe opóźnienie D1 = 2 s dodaje się dla doświadczenia referencyjnego i doświadczenia z nasyceniem ¹H. Oba eksperymenty są rejestrowane jeden po drugim i różnią się tylko zastosowaniem impulsów ¹H 180° (nasycenie) lub brakiem (odniesienie). Stosunek intensywności widmowych zarejestrowanych w doświadczeniu przy nasyceniu ¹H podzielony przez natężenia doświadczenia referencyjnego (bez ciągu impulsów protonowych 180°) daje wartość {¹H}-¹⁵N NOE (hetNOE).

Poniższy protokół opisuje konfigurację eksperymentów relaksacyjnych NMR przez Lakomek et al.⁶⁹ oraz Stief et al.⁷⁰. Skupiamy się na sekwencjach impulsów NMR przy użyciu schematu detekcji HSQC o zwiększonej czułości. Eksperymenty ¹⁵N R₁ i R_1ρ są implementowane zgodnie ze szczegółowym opisem Stief et al.⁷⁰, a eksperyment hetNOE jest opisany przez Lakomek et al.⁶⁹.

Protokół

1. Przygotowanie próbki NMR

UWAGA: Znakowanie izotopowe białek jest wykonywane dla eksperymentów NMR o wyższych wymiarach i zaawansowanych NMR. Gdy ekspresję białka w E. coli i oczyszczanie białka ustalono przy użyciu pożywek bogatych (np. Luria-Bertani [LB] lub pożywki tryptonowej z ekstraktem drożdżowym 2x [2YT]) z wydajnością kilku miligramów na litr, przygotowanie znakowanej izotopowo próbki NMR jest zwykle stosunkowo proste.

1. Do znakowania izotopów należy użyć pożywki minimalnej M9 do ekspresji genów, gdzie jedynym źródłem azotu jest ¹⁵N chlorek amonu, a jedynym źródłem węgla jest glukoza wzbogacona w ¹³C.
2. W celu oczyszczania białka należy postępować zgodnie ze standardowym protokołem ustalonym w laboratorium dla danego białka.
   UWAGA: Sekcja wyników przedstawia reprezentatywne wyniki dla IDP, monomerycznego białka SNARE Synaptobrevin-2 (1-96). Znakowanie izotopowe NMR Synaptobreviny-2 zostało przeprowadzone zgodnie z opisem w⁷⁰. Do bardzo precyzyjnych pomiarów zaleca się stosowanie niskich stężeń_D2O, poniżej 5%. Dzieje się tak ze względu na efekt izotopu deuteru, który można zaobserwować w eksperymentach z dyspersją relaksacyjną Hahn-Echo ¹⁵N T₂ i przy niskiej częstotliwości ¹⁵N CPMG (nie omówionych tutaj), ale ma tylko minimalny wpływ w eksperymentach ¹⁵N R_1ρ (gdzie jest głównie przeorientowany)⁷⁶.

2. Przygotowania do przeprowadzenia eksperymentów relaksacyjnych NMR na spektrometrze

UWAGA: Opisane eksperymenty relaksacyjne NMR są specyficzne dla spektrometrów Bruker. Zostały one przetestowane na sondach rezonansowych z potrójnym rezonansem 1 H, ¹⁵N i ¹³C w temperaturze pokojowej oraz konsolach Avance III i Avance Neo obsługiwanych przez oprogramowanie Bruker Topsin 3.6 lub nowsze.

1. Postępuj zgodnie ze środkami ostrożności.
   1. Przed przystąpieniem do pracy przy spektrometrze NMR należy przeprowadzić odprawę bezpieczeństwa.
   2. Sprawdź specyfikację mocy sondy zastosowanego spektrometru i wybierz odpowiednią długość i moc impulsu dla każdego impulsu, np. porównując spójność z wpisami w tabeli Topspin "prosol".
2. Zaimportuj sekwencje impulsów.
   1. Programy impulsowe NMR należy pobrać ze strony internetowej wskazanej poniżej lub z rozszerzonego repozytorium Banku Biologicznego Rezonansu Magnetycznego (BMRB) (bmrbig102) do katalogu /opt/topspin4.1.4/exp/stan/nmr/lists/pp/user komputera obsługującego spektrometr NMR. Dostosuj wersję topspin (tutaj: topspin4.1.4 do odpowiedniej wersji zainstalowanej na spektrometrze).
   2. Impulsy w kształcie NMR można pobrać ze strony internetowej wskazanej poniżej lub z rozszerzonego repozytorium Banku Biologicznego Rezonansu Magnetycznego (BMRB) (bmrbig102) do katalogu /opt/topspin4.1.4/exp/stan/nmr/lists/pp/user komputera obsługującego spektrometr NMR. Dostosuj wersję topspin (tutaj: topspin 4.1.4 do odpowiedniej wersji zainstalowanej na spektrometrze).
3. Skalibrować spektrometr i próbkę.
   1. Ustaw żądaną temperaturę. Do kalibracji temperatury należy postępować zgodnie z protokołami obowiązującymi w placówce. Na przykład użyj próbki metanolu-d4 i zinterpretuj zaobserwowaną różnicę przesunięć chemicznych za pomocą termometru NMR (https://chem.ch.huji.ac.il/nmr/software/thermometer.html) aplikacji internetowej); Zobacz także⁷⁷.
   2. Włożyć próbkę (plus dodatkowe 5%_D2Ona blokadę) i odczekać około 10 minut, aby próbka mogła zrównoważyć swoją temperaturę. Zablokuj sygnał deuteru (²H) (polecenie: blokada, wybierz H₂O+D₂O).
   3. Dopasuj i dostrój kanały ¹H, ¹⁵N i ¹³C, np. za pomocą procedury atma lub atmm. Jeśli nie jest zainstalowana żadna jednostka automatycznego dopasowywania i strojenia, ręcznie dopasuj i dostrój sondę za pomocą polecenia wobb.
   4. Wykonaj podkładkowanie dla jednorodnego pola B₀, np. za pomocą procedury topshim tg.
4. Skalibruj długość impulsu 90° (¹H).
   1. Użyj eksperymentu zg. Użyj getprosol, aby zaimportować parametry sondy. Wybierz krótki czas trwania 5 μs dla P1. W razie potrzeby sprawdź i skoryguj określony poziom mocy sondy dla PLW1.
   2. Rozpocznij eksperyment od zg. Przetwarzaj dane za pomocą efp. Dostosuj fazę za pomocą .ph tak, aby linia podstawowa była równa, a sygnał NMR rezonansu wody był w fazie.
   3. Oszacuj impuls 360° (¹H), biorąc zwykły lub przybliżony impuls 90° (¹H) (np. z podanych specyfikacji spektrometru) i mnożąc go przez współczynnik czterokrotny. Uruchom eksperyment i przetwórz go.
      UWAGA: Wybrany czas trwania jest zbyt długi, jeśli sygnał jest dodatni i zbyt krótki, jeśli jest ujemny. Impuls 360° (¹H) będzie przekroczeniem zera.
   4. Dostosuj odpowiednio długość impulsu. Zrób to iteracyjnie, aby znaleźć przecięcie zera. Podziel uzyskaną wartość przez cztery. Będzie to impuls 90° (¹H).
      UWAGA: Alternatywą dla opisanej metody 360° jest procedura pulscal, którą można uruchomić z wiersza poleceń i która umożliwia automatyczną kalibrację impulsów ¹H.
5. Skalibruj częstotliwość nośną O1 do rezonansu wody.
   1. Skopiuj eksperyment zg, wpisując edc w wierszu polecenia do nowego numeru eksperymentu. Wpisz rpar, aby otworzyć zestawy parametrów (rysunek uzupełniający 1A).
   2. Wyszukaj zestaw parametrów ZGPR. Kliknij zestaw parametrów ZGPR (rysunek uzupełniający 1A), kliknij Odczyt, wybierz Wykonaj "getprosol" i kliknij OK (rysunek uzupełniający 1B).
   3. Zmień P1 na skalibrowaną długość impulsu 90° (¹H). Wybierz długość nasycenia D1 = 2 s i moc impulsu PLW9 50 dB. Ustaw wzmocnienie odbiornika (rg) na 16. Alternatywnie, wykonaj regulację wzmocnienia odbiornika, wpisując rga i ustawiając wzmocnienie odbiornika na określoną wartość (ale unikaj "przepełnienia wzmocnienia odbiornika").
   4. Wpisz gs w wierszu polecenia, aby rozpocząć powtarzalne, ciągłe pobieranie. Przejdź do okna akwizycji i zmień O1, aby zmniejszyć obszar FID zdominowany przez sygnał wodny (rysunek uzupełniający 2).
   5. Kliknij poniżej znacznika, aby zmniejszyć O1, i kliknij nad znacznikiem, aby go zwiększyć. Użyj przycisku czułości, aby zmienić rozmiar kroku. Zapisz bieżący O1; Zamknięcie zatrzymuje ponawianą akwizycję (rysunek uzupełniający 2).
6. Skalibruj długość impulsu 90° (¹⁵N).
   1. Skopiuj eksperyment zg do nowego numeru eksperymentu (wpisz edc). Wpisz rpar, aby odczytać ustawiony parametr HSQCFPF3GPPHWG zmienić program impulsowy na ^{eksperyment 1 H-15}N HSQC. Należy użyć opcji Zachowaj parametry P1, O1 i PLW1 (Rysunek uzupełniający 1).
   2. Wpisz getprosol 1H 1H) w μs> <90° (¹H) siła impulsu w db> w wierszu poleceń, aby zaimportować parametry sondy. Ustaw liczbę skanowań (NS) na 8, a fikcyjne skanowania (DS) na 2,
      UWAGA: < > określa tutaj wartości, które należy ustawić. Na przykład: getprosol 1H 8,5 -11,79.
   3. Uruchom pierwszy przyrost eksperymentu, wpisując zg w wierszu polecenia. Skopiuj pierwszy przyrost do nowego numeru eksperymentu z rser 1 . Przetwarzaj dane za pomocą efp i fazuj widmo za pomocą .ph. Użyj pierwszego przyrostu (eksperymentu 1D) eksperymentu, aby wykonać następujące kroki.
      UWAGA: W < > określić wybrany numer dla nowego eksperymentu, np. rser 1 101.
   4. Wpisz amed w wierszu poleceń, aby otworzyć parametry sekwencji impulsów eksperymentu 1D. Kliknij na E w wierszu PULPROG (patrz rysunek uzupełniający 3A), aby otworzyć edytor programów impulsowych.
   5. Aby zapisać sekwencję impulsów pod nową nazwą, należy użyć następującego przepływu pracy: Kliknij Plik (lewy górny róg), Zapisz jako, wprowadź nową nazwę i kliknij przycisk OK. Następnie kliknij przycisk Ustaw PULPROG dla zestawu danych (patrz rysunek uzupełniający 3B) i kliknij przycisk OK.
   6. Zmodyfikować oryginalną sekwencję ^{1 H-15}N HSQC (zapisaną pod nową nazwą, patrz 2.6.4.) poprzez pomnożenie 90° (¹⁵N) po okresie ewolucji t₁ (przed przeniesieniem wstecznym) przez współczynnik 2 (impuls 90° (¹⁵N) wynosi teraz 180° (¹⁵N)). Naciśnij Ctrl S, aby zapisać sekwencję impulsów. Ustaw długość impulsu na 90° (¹⁵N) (P21), aby sygnał NMR pierwszego przyrostu zniknął (przy przekroczeniu zera) (Rysunek uzupełniający 3B).
   7. Otwórz eksperyment ^{1 H-15}N HSQC (eksperyment 2D) i wprowadź skalibrowaną długość impulsu 90° (¹⁵N) (P21). Wpisz getprosol 1H ¹H) długość impulsu w μs> <90° (¹H) siła impulsu w db> 15N ¹⁵N) w μs> <90° (¹⁵N) siła impulsu w db> w wierszu poleceń.
7. Określ szerokości spektralne i przywłaszczenie czasów akwizycji.
   1. W oknie parametrów akwizycji dla eksperymentu ^{1 H-15}N HSQC (wpisz eda w wierszu poleceń) dostosuj szerokość widmową (parametr akwizycji SW) oraz liczbę przyrostów wymiarów w wymiarach bezpośrednich i pośrednich (parametr akwizycji TD).
      1. Wybierz SW, 16 ppm w wymiarze bezpośrednim (¹H) i 30 ppm w wymiarze pośrednim (¹⁵N). Wybierz TD, 2048 w wymiarze bezpośrednim (¹H) i 512 w wymiarze pośrednim (¹⁵N).
   2. Zdobądź ¹eksperyment ^H-15N HSQC.
      1. Sprawdź, czy wykryto wszystkie interesujące sygnały i czy w widmie nie ma artefaktów aliasingu. Zmień O3P, jeśli środek widma nie pasuje do środka rozkładu sygnału białka wzdłuż osi ¹⁵N.
      2. Zwiększ SW, jeśli okno widmowe jest zbyt małe. Zwiększ TD, aby uzyskać wyższą rozdzielczość FID (sprawdź specyfikacje sondy, aby uzyskać maksymalny czas trwania odsprzęgania).
         UWAGA: Jest to ogólna konfiguracja i punkt wyjścia do konfiguracji eksperymentów relaksacyjnych NMR. Zaleca się rejestrowanie ^{doświadczenia 1 H-15}N HSQC na początku i na końcu całego zestawu doświadczeń oraz, w przypadku dłuższych czasów doświadczalnych, również pomiędzy nimi w celu monitorowania integralności próbki.

3. Implementacja eksperymentów relaksacyjnych NMR

UWAGA: Sekwencje impulsów relaksacyjnych NMR (Rysunek 2) są dostępne na https://www.ipb.hhu.de/en/teams/team-lakomek/pulsesequences lub w rozszerzonym repozytorium Banku Biologicznego Rezonansu Magnetycznego (BMRB) (bmrbig102).

1. Przygotuj eksperyment ¹⁵N R_1ρ.
   1. Skopiuj eksperyment HSQC (wpisz edc) do nowego katalogu. Wpisz ased i zmień program impulsowy na eksperyment ¹⁵N R_1ρ, klikając trzy kropki na linii parametru PULPROG w parametrach sekwencji impulsów (ased, patrz rysunek uzupełniający 3A). Kliknij dwukrotnie program impulsowy, kliknij Ustaw PULPROG na zestaw danych (patrz rysunek uzupełniający 3B) i kliknij OK.
      UWAGA: Mogą pojawić się komunikaty o błędach. Zamknij te wiadomości.
   2. Wpisz gpnam w wierszu poleceń, aby wstawić wszystkie brakujące kształty gradientu (gpnam1- gpnam9) zgodnie z opisem w sekwencji impulsów (Rysunek uzupełniający 4).
   3. Wpisz vplist w wierszu poleceń. Kliknij trzy kropki (Rysunek uzupełniający 5A), Plik (lewy górny róg) i Nowy (Rysunek uzupełniający 5B).
   4. Wpisz nazwę nowego fikcyjnego vplist i naciśnij OK. Utwórz fikcyjną vplist (5m, 65m, 25m, 45m, 15m, 55m, 35m, 10m; nowy wiersz dla każdego wpisu vplist). Naciśnij Ctrl S, aby zapisać listę i zamknąć okno vplist (Rysunek uzupełniający 5C).
   5. Kliknij dwukrotnie nazwę nowo utworzonej vplist (Rysunek uzupełniający 5B).
      UWAGA: Jest to konieczne, aby uniknąć błędów kompilacji w sekwencji impulsów. Odpowiednie wpisy vplist zostaną określone poniżej (pkt 3.1.29.).
   6. Wpisz jed, aby otworzyć parametry sekwencji impulsów (rysunek uzupełniający 6). Wprowadź wszystkie brakujące siły i długości gradientu zgodnie z sekwencją impulsów (rysunek uzupełniający 6D).
   7. Wprowadzić dla licznika pętli L₃ (liczba punktów zespolonych w wymiarze pośrednim) 1/2 wpisu ¹⁵N TD w oknie parametrów akwizycji (eda). Wprowadzić dla licznika pętli L₆ liczbę zarejestrowanych punktów danych relaksacji używanych do dopasowania krzywej relaksacji.
      UWAGA: Ta liczba L₆ odpowiada liczbie wpisów vplist, tutaj: 8 (Rysunek uzupełniający 6A).
   8. Ustaw impuls adiabatyczny TanhTan_half.nl, pobrany ze strony internetowej podanej powyżej, jako kształt impulsu ¹⁵N SP8. Ustaw impuls adiabatyczny TanhTan_2nd.nl ze strony internetowej jako kształt impulsu ¹⁵N SP9 (rysunek uzupełniający 6C).
   9. Ustaw wpis P8 na długość adiabatycznego impulsu TanhTan - wystarczająco długą, aby zagwarantować adiabatyczność impulsu; tutaj wybiera się P8 = 3000 μs (rysunek uzupełniający 6C).
   10. Ustaw rozprzęganie ¹⁵N (CPDPRG 3) na schemat odsprzęgania garpa. Stosować dla długości odsprzęgania PCPD3 200 μs (rysunek uzupełniający 6C).
   11. Ustaw opóźnienie odzyskiwania między skanowaniami na co najmniej D1 = 2 s lub więcej.
       UWAGA: Aby uzyskać informacje na temat wyboru odpowiedniego opóźnienia odzyskiwania, zapoznaj się z sekcją Dyskusja.
   12. Ustaw fikcyjne skany (DS) na co najmniej 64 dla końcowego eksperymentu (podczas konfiguracji DS = 4 jest wystarczające ze względu na czas). Jako punkt wyjścia użyj liczby skanów (NS) wynoszącej 4; należy stosować wielokrotności liczby 4, jeśli stosunek sygnału do szumu (SNR) jest zbyt niski (rysunek uzupełniający 6A).
   13. Ustaw O1 na skalibrowaną częstotliwość nośną z kroku 2.5. Ustaw O2P na 176 ppm i skopiuj O3P z eksperymentu ^{1 H-15}N HSQC (rysunek uzupełniający 6A-C).
   14. Ustaw długość impulsu P7 na długość impulsu 90° (¹⁵N) skalibrowaną w kroku 2.6. Skopiuj również poziom mocy impulsu 90° (¹⁵N) z kroku 2.6 do PLW3 i PLW7 (rysunek uzupełniający 6C).
   15. Ustaw długość impulsu P1 i P19 na długość impulsu 90° (¹H) obliczoną w kroku 2.4. (Rysunek uzupełniający 6B).
   16. Ustaw liczbę przyrostów w wymiarze pośrednim TD = l₃ * 2 * l₆ (eda lub wpisz td w wierszu polecenia).
       UWAGA: Wszystkie opisane tutaj parametry sekwencji impulsów są dodatkowo oznaczone w sekwencji impulsów.
   17. Ustaw impuls kształtu SP5 na kształt I-BURP2 (Iburp2.1000). Ustaw długość impulsu P15 na 2000 μs. Otwórz ekran narzędzia kształtu, klikając E obok impulsu kształtu I-BURP2 w oknie parametrów sekwencji impulsów Topspin (ased) (Rysunek uzupełniający 6B).
   18. Zasymuluj impuls kształtu o odpowiedniej długości, klikając przycisk Rozpocznij symulację NMR. Sprawdź ukształtowaną długość impulsu [μs] (= 2000 μs) i kąt obrotu [°] (= 180°) w oknie symulacji. Kliknij Start NMR-SIM (rysunek uzupełniający 7A).
   19. Sprawdź zakres wzbudzenia i wybierz odpowiednią długość impulsu I-BURP2, aby pokryć 1-godzinną dyspersję widmową białka, ale jednocześnie unikaj wzbudzenia wody. Ustawić P15 na ukształtowaną długość impulsu okna symulacji z najlepszą symulacją impulsu IBURP-2 (rysunek uzupełniający 7B).
       UWAGA: Właściwa długość jest wybierana, jeśli I-BURP2 wzbudza (> 95% skuteczności) cały region amidowy. Aby zasymulować impuls I-BURP2 o innej długości, zamknij okno profilu wzbudzenia i edytuj ukształtowaną długość impulsu w oknie symulacji. Kliknij Uruchom NMR-SIM. Impulsy o krótszej długości mają szerszy zakres wzbudzenia w Hz.
   20. Ustaw SPOFFS5, aby zmienić częstotliwość nośną impulsu I-BURP2 i przesuń zakres wzbudzenia w lewo lub w prawo, aby uniknąć dotykania impulsu I-BURP2 i zakłócania namagnesowania wody (rysunek uzupełniający 6B).
   21. Aby określić odpowiedni poziom mocy kształtowanego impulsu, otwórz narzędzie Kształt Brukera, kliknij przycisk Rozpocznij symulację NMR i ustaw długość impulsu I-BURP2 na Długość impulsu kształtowego [μs]. Należy zapamiętać odpowiednią długość miękkiego prostokątnego impulsu 90° (¹H), widoczną w oknie symulacji przy odpowiadającym mu impulsie kwadratowym 90° [μs] (rysunek uzupełniający 7A).
   22. Wpisz calcpowlev. Jako nową długość należy użyć twardego impulsu 90° (¹H) (P1) w mikrosekundach (rysunek uzupełniający 8B) oraz miękkiego impulsu prostokątnego 90° (¹H) odpowiadającego impulsowi I-BURP2 w mikrosekundach (rysunek uzupełniający 8A). Należy pamiętać o różnicy mocy Δ w dB między twardym impulsem 90° (¹H) a miękkim impulsem prostokątnym (rysunek uzupełniający 8C). Skopiuj siłę impulsu twardego impulsu 90° (¹H) w dB do SPW5 i dodaj zapamiętaną różnicę Δ w dB (rysunek uzupełniający 6B).
   23. Aby określić poziom mocy wirowania, należy obliczyć odpowiednią długość impulsu 90° (¹⁵N) wirowania. Użyj wzoru: długość impulsu 90° (¹⁵N) w s = 0,25 / (moc spin-lock w Hz).
   24. Za pomocą calcpowleva obliczyć różnicę mocy Δ w dB między mocą wirowania a twardym impulsem 90° (¹⁵N) (P7). Nowość: Długość impulsu spin-lock 90° (¹⁵N) w μs (rysunek uzupełniający 8A). Odniesienie: długość impulsu twardego 90° (¹⁵N) w μs (rysunek uzupełniający 8B). Skopiuj poziom mocy PLW7 twardego impulsu 90° (¹⁵N) w dB do poziomu mocy blokady obrotowej PLW8 (rysunek uzupełniający 6C) i dodaj obliczoną różnicę mocy Δ w dB (rysunek uzupełniający 8C).
   25. Skopiuj poziom mocy spin-locka PLW8 do poziomów mocy SPW8 i SPW9. (Rysunek uzupełniający 6C).
   26. Aby określić poziom mocy odsprzęgania ¹⁵N, należy użyć kalkulatora do obliczenia różnicy mocy Δ między mocą impulsu odsprzęgającego 90° (¹⁵N) (PCPD3) a impulsem twardym 90° (¹⁵N) (P7). Nowość: PCPD3 w μs (200) (rysunek uzupełniający 8A). Odniesienie: długość impulsu twardego 90° (¹⁵N) w μs (rysunek uzupełniający 8B). Skopiuj poziom mocy PLW7 twardego impulsu 90° (¹⁵N) w dB do poziomu odsprzęgania PLW31 (rysunek uzupełniający 6C) i dodaj Δ w dB (rysunek uzupełniający 8C).
   27. Aby skorzystać z kompensacji temperatury, uwzględnij #define TEMP_COMPENSATION (usuwając średnik w sekwencji impulsów). Ustawić P18 na maksymalny czas trwania blokady wirowej użytej w doświadczeniu ¹⁵N R_1ρ.
       UWAGA: Zaleca się wyłączenie kompensacji temperatury podczas pierwszej próby eksperymentu.
   28. W przypadku próbek znakowanych ¹⁵N ¹³C należy dołączyć #, aby zdefiniować LABEL_CN w programie impulsowym (poprzez usunięcie średnika w sekwencji impulsów). Ustaw P4 na długość impulsu obliczoną za pomocą formuły in⁷⁸. Na przykład odpowiada 23,70 μs przy 600 MHz i 11,85 μs przy 1200 MHz. Wpisz calcpowlev, aby obliczyć różnicę mocy w dB między P4 a twardym impulsem (¹³C). Skopiuj moc impulsu twardego (¹³C) w dB do PLW4 i dodaj Δ w dB. Skopiuj PLW4 do PLW2 (rysunek uzupełniający 6B).
   29. Określ opóźnienia relaksacji dla odpowiedniego próbkowania.
       1. Uruchom pierwsze osiem FID (w przypadku L₆ = 8) i przetwórz je (rser < numer nowego eksperymentu>). Zaznacz wpisy w vplist, w których szczytowa intensywność eksperymentu z najdłuższym opóźnieniem spada do co najmniej 1/e (ok. 37%), ale nie mniej niż 25% w porównaniu z eksperymentem z najkrótszym opóźnieniem (który służy jako odniesienie).
       2. Dostosuj pozostałe wpisy vplist, aby uzyskać równomierne próbkowanie spadków intensywności między FID z najdłuższym opóźnieniem a FID z najkrótszym opóźnieniem. Przeczytaj UWAGA i specyfikacje zasilania sondy.
          UWAGA: Powoli relaksujące się pozostałości zdominują pierwszy FID. Dostosuj pozostałe wpisy vplist, aby uzyskać równomierne próbkowanie spadków intensywności między pierwszym a drugim FID. Nie przekraczaj maksymalnej dozwolonej mocy i długości wirowania sondy (zapoznaj się z instrukcją obsługi i specyfikacją sondy). W przypadku kompensacji temperatury należy sprawdzić P18 (maksymalny czas trwania blokady wirowania), ponieważ zostanie zastosowany całkowity czas trwania blokady wirowania P18, podzielony na opóźnienie relaksacji i kompensację temperatury. Utrzymuje czas (opóźnienie relaksacji) + czas (kompensacja temperatury) = const = P18. W przypadku blokady wirowania 2 kHz wolimy nie przekraczać czasu trwania blokady wirowania większego niż 65 ms, stosując opóźnienie powrotu (D1) wynoszące 2 s. W takim przypadku należy przyjąć kompromis między maksymalnym czasem trwania blokady wirowania a najdłuższym opóźnieniem rozluźnienia na korzyść maksymalnego dozwolonego czasu trwania blokady wirowania. W przypadku dłuższych opóźnień w odzyskiwaniu D1 mogą mieć zastosowanie dłuższe możliwości wirowania. Liczy się ogólne osadzanie mocy w sondzie w czasie. Jeśli wymagane są dłuższe czasy blokady, zwiększaj długość blokady wirowania tylko małymi krokami i obserwuj sygnał blokady. Z reguły dostosuj poziom blokady w górnej jednej trzeciej wyświetlacza zamka. Jeśli poziom blokady zmniejszy się o więcej niż dwa kwadraty podczas wykonywania sekwencji impulsów, oznacza to, że moc blokady wirowania zdeponowana w sondzie jest zbyt duża.
   30. Wpisz rga w wierszu poleceń, aby określić wzmocnienie odbiornika. Aby uzyskać dobry stosunek sygnału do szumu, należy dążyć do wartości wzmocnienia odbiornika (rg) między 128 a 256, co świadczy o dobrym tłumieniu wody.
       UWAGA: Nie można osiągnąć wzmocnienia odbiornika między 128 a 256, co wskazuje na zbyt silny sygnał wody. W takim przypadku moc gradientu i czas trwania są delikatnie regulowane, aż do osiągnięcia wzmocnienia odbiornika. Zobacz także sekcję Dyskusja.
   31. Rozpocznij przebieg testowy eksperymentu ¹⁵N R_1ρ, wpisując zg w wierszu polecenia. Sprawdź, czy sygnał wody jest dobrze stłumiony dla wszystkich opóźnień (od 1 do 8, w przypadku 8 opóźnień w vplist). Sprawdź również przyrost 9, który jest drugim przyrostem schematu wykrywania kwadraturowego (Echo/ Anty-Echo).
2. Przygotuj eksperyment ¹⁵N R₁.
   1. Skopiuj eksperyment ¹⁵N R_1ρ i zmień program impulsów na eksperyment ¹⁵N R₁.
   2. Wpisz vclist, wygeneruj vclist i wprowadź fikcyjny vclist opisany w⁷⁰: 0, 24, 6, 20, 4, 16, 8, 12; nowy wiersz dla każdego wpisu vclist).
   3. Otwórz tyłek. Sprawdź długości i siły nachylenia. Zmień GPZ9 na 14%.
   4. Sprawdź długości impulsów, kształty impulsów i siły impulsów (prawidłowe wartości powinny zostać skopiowane z eksperymentu ¹⁵N R_1ρ).
   5. W przypadku próbek znakowanych ¹⁵N¹³C należy użyć #define LABEL_CN w programie impulsowym.
   6. Aby skorzystać z kompensacji temperatury, należy dołączyć #define TEMP_COMPENSATION.
   7. Uruchomić pierwsze osiem FID (w przypadku L₆ = 8) i przetworzyć je (rser < numer nowego eksperymentu>). Zaznacz wpisy na VCLIST, w których szczytowa intensywność eksperymentu z najdłuższym opóźnieniem spada do co najmniej 1/e (ok. 37%), ale nie mniej niż 25% w porównaniu z eksperymentem z najkrótszym opóźnieniem. Dostosuj pozostałe wpisy vplist, aby uzyskać równomierne próbkowanie spadków intensywności między FID z najdłuższym opóźnieniem a FID z najkrótszym opóźnieniem.
      UWAGA: Tylko liczby parzyste są dozwolone dla wpisów vclist.
3. Skonfiguruj eksperyment {¹H}-¹⁵N NOE.
   1. Skopiuj eksperyment relaksacyjny ¹⁵N R₁ i zmień sekwencję impulsów na schemat impulsów {¹H}-¹⁵N NOE.
   2. Ustaw długość okresu nasycenia za pomocą licznika pętli L₈. Odstęp między impulsami 180° (¹H) wynosi 22 ms⁷⁹ (2* 1 / J_NH). Aby osiągnąć najdokładniejsze wyniki, należy użyć okresu nasycenia około 5-krotności białka ¹⁵N_{T 1} (¹⁵N). Tutaj: 5 s. Odpowiadałoby to L8 = 230,
      UWAGA: Sekcja Dyskusja zawiera dodatkowe porady dotyczące wyboru okresu nasycenia/opóźnienia odzyskiwania.
   3. Zmień długość i siłę gradientów zgodnie z opisem w schemacie impulsów. Użyj kształtów gradientu sinus.20.
   4. Ustaw liczbę przyrostów w wymiarze pośrednim równą TD = l₃ * 2 * 2
   5. W przypadku próbek znakowanych ^{izotopem 15}N¹³C należy użyć #define LABEL_CN i -DLABEL_CN jako ZGOPTNS.
   6. Uruchom schematy impulsów, wpisując zg w wierszu poleceń.

4. Przetwarzanie i analiza zarejestrowanych eksperymentów NMR

UWAGA: Widma zostały zarejestrowane za pomocą systemu Bruker. Przetwarzanie odbywa się przy użyciu systemu operacyjnego Unix lub Linux. Przetwarzanie widm i analizę danych przeprowadzono przy użyciu NMRPipe⁸⁰ i python3. Oprogramowanie NMRPipe można pobrać pod adresem https://www.ibbr.umd.edu/nmrpipe/index.html. Skrypty przetwarzania oparte na NMRPipe można pobrać ze strony internetowej: https://www.ipb.hhu.de/en/teams/team-lakomek/pulsesequences lub z rozszerzonego repozytorium Banku Biologicznego Rezonansu Magnetycznego (BMRB) (bmrbig102). Zaleca się korzystanie z NMRPipe. Jeśli protokół NMRPipe nie jest dostępny lub pożądany, można użyć alternatyw, takich jak CCPN⁸¹ lub SPARKY (SPARKY 3 lub jego następcy NMRFAM-SPARKY⁸² lub POKY⁸³ ).

1. Przetwarzaj i analizuj ^{eksperyment 15}N R₁.
   UWAGA: Następujące polecenia są wykonywane w terminalu uniksowym.
   1. Skopiuj pliki z pobranego katalogu R1_processing do katalogu zawierającego eksperymentalne dane R1 (katalog roboczy).
   2. Spraw, aby pliki były wykonywalne za pomocą polecenia terminala: > chmod u+x *.com
   3. Uruchom > bruker, aby otworzyć narzędzie do konwersji NMRPipe i wygenerować plik fid.com. Kliknij przycisk Odczytaj parametry. Zmień wartość Liczba wymiarów na dwa, jeśli liczone są trzy wymiary, a następnie ponownie kliknij przycisk Odczytaj parametry. Następnie kliknij Wyczyść skrypt, Aktualizuj skrypt i Zapisz skrypt (Rysunek uzupełniający 9).
      UWAGA: Jeśli częstotliwość nośna nie jest prawidłowa, zmień pozycję środkową PPM po kliknięciu przycisku Odczytaj parametry po raz drugi.
   4. Wykonaj > ./fid.com
   5. Przekonwertuj vclist na vplist z wpisami ms: opóźnienie w ms = 40 ms * wpis vclist. Użyj > cp vclist vplist i edytuj vplist.
   6. Użyj > ./split.com, aby podzielić pseudo dane 3D na osiem plików 2D.
   7. Edytuj wartości tauValues (wartości vplist w kolejności vplist) i wartości idxExpmt (kolejność wartości tau względem czasu) w nmrproc.com (Rysunek uzupełniający 10).
   8. Użyj > ./nmrproc.com do przetworzenia surowych danych wszystkich ośmiu widm 2D.
   9. Użyj > nmrDraw, aby narysować widma.
      1. Do wykonania tych kroków należy użyć widma referencyjnego (pierwszy wpis w vplist). Przełącz się na to widmo, zmieniając wymiar z na jeden (lewy górny róg). Dostosuj poziom konturu za pomocą przycisków + i - obok przycisku Współczynnik. Ponownie narysuj widmo za pomocą przycisku Rysuj.
      2. Należy użyć poziomicy konturowej, w której wszystkie interesujące sygnały można rozpoznać tylko po kilku sygnałach pochodzących z szumu (poziom konturu znajduje się na krawędzi poziomu hałasu) (rysunek uzupełniający 11).
   10. Skoryguj fazę widma, wpisz v dla pionowej projekcji sygnału 1D i h dla poziomej projekcji sygnału 1D. Wyreguluj fazę za pomocą P0 i P1 (rysunek uzupełniający 11), zapamiętaj różnicę faz i skoryguj fazę w pliku nmrproc.com (rysunek uzupełniający 10).
       UWAGA: Jeśli widmo jest odwrócone w wymiarze ¹⁵N, usuń -neg w linii: | nmrPipe -fn FT -neg \ (Rysunek uzupełniający 10).
   11. Zamknij nmrDraw i ponownie przetwarzaj za pomocą > nmrproc.com. W przypadku wybierania pików (po prawidłowym określeniu widma w fazach i wyświetleniu widma odniesienia z poziomem konturu, na którym występują wszystkie szczyty), wpisz K (shift + k), naciśnij Wykryj i kliknij Zapisz. (Rysunek uzupełniający 11).
   12. Skopiuj listę szczytów do katalogu roboczego i zmień -assName na ass.com na nazwę listy szczytów (Rysunek uzupełniający 12).
       UWAGA: Przykładowa lista szczytów w odpowiednim formacie jest dostępna pod adresem https://www.ipb.hhu.de/en/teams/team-lakomek/pulsesequences
       oraz w rozszerzonym repozytorium Banku Biologicznego Rezonansu Magnetycznego (BMRB) (bmrbig102).
   13. Wykonaj > ./ass.com, aby przypisać widma. Sprawdź przypisanie sugerowane przez skrypt dla różnych szczytów. Użyj lewego przycisku myszy, aby przypisać, a prawego przycisku myszy, aby cofnąć przypisanie szczytów. Użyj przycisku Dalej, aby przejść do następnego aminokwasu i Poprzedni, aby przejść do poprzedniego aminokwasu (Rysunek uzupełniający 13).
       UWAGA: Poziom konturu można zmienić za pomocą + i - w prawym górnym rogu. Użyj przycisku Rysuj, aby ponownie narysować widmo z nowym poziomem konturu (Rysunek uzupełniający 13).
   14. Po zakończeniu zadania kliknij przycisk Zapisz, a następnie ponownie przycisk Zapisz. Następnie kliknij Zakończ, Anuluj i Wyjdź (Rysunek uzupełniający 13).
   15. Wykonaj > python3 NoneDeleter.py, aby utworzyć plik relax.tab, który zawiera tylko informacje o przypisanych szczytach.
   16. Wykonaj > ./relax.com, aby wygenerować skrypt autofit.com.
   17. Wykonaj > ./autoFit.com, aby wykonać interpolację Fouriera i wygenerować pseudoproporcje różnych czasów opóźnienia dla każdego aminokwasu (generowane są axt.tab i nlin.tab).
   18. Wykonaj > ./model.com, aby wygenerować skrypt modelExp.com na podstawie danych w nlin.tab.
   19. Wykonaj > ./modelExp.com, aby dopasować krzywą ewolucji każdej reszty do nieliniowego modelu optymalizacji metodą najmniejszych kwadratów.
   20. Wykonaj > bash summary.tcl -in relax.tab > t1.tab. Zignoruj potencjalny komunikat o błędzie: Uwaga GDB: Może wystąpić 21 brakujących wartości w pliku tabeli.
   21. Skopiuj t1.tab do nowo utworzonego katalogu R1R2.
2. Przetwarzać i analizować doświadczenie ¹⁵N R_1ρ.
   1. Skopiuj pliki z pobranego katalogu R1rho_processing do katalogu zawierającego eksperymentalne dane R_1ρ (katalog roboczy).
   2. Wykonaj > chmod u+x *.com
   3. Uruchom > bruker, aby otworzyć narzędzie do konwersji NMRPipe i wygenerować plik fid.com. Patrz również przetwarzanie widm ¹⁵N R₁
   .
   4. Wykonaj > ./fid.com
   5. Wykonaj > ./split.com, aby podzielić pseudo dane 3D na osiem plików 2D.
   6. Wykonaj > ./nmrproc.com (wcześniej edytuj wartości tauValues [vplist] i idxExpmt), aby przetworzyć surowe dane wszystkich ośmiu widm 2D (Rysunek uzupełniający 10).
   7. Wykonaj > nmrDraw, aby narysować widma i wybrać szczyty. Do wykonania tych kroków należy użyć widma referencyjnego (pierwszy wpis w vplist). Postępować zgodnie z tą samą procedurą, co w przypadku doświadczenia ¹⁵N R₁.
   8. Skopiuj listę szczytów do katalogu roboczego i zmień -assName na ass.com na nazwę listy szczytów (Rysunek uzupełniający 12).
   9. Wykonać > ./ass.com i postępować zgodnie z tą samą procedurą, co w eksperymencie ¹⁵N R₁.
   10. Wykonaj > python3 NoneDeleter.py, aby utworzyć plik relax.tab, który zawiera tylko informacje o przypisanych szczytach.
   11. Wykonaj > ./relax.com
   12. Wykonaj > ./autoFit.com
   13. Wykonaj > ./model.com
   14. Wykonaj > ./modelExp.com
   15. Wykonaj > bash summary.tcl -in relax.tab > t1rho. tab. Ignoruj potencjalny komunikat o błędzie: Uwaga GDB: Może wystąpić 21 brakujących wartości w pliku tabeli.
   16. Skopiuj następujący nagłówek w pliku t1rho.tab (wartości można uzyskać z pliku fid.com) (Rysunek uzupełniający 14):
       UWAGA 600MHz dla T1rho
       UWAGA -yOBS = 60.818 (wpisz tutaj wartość znalezioną w fid.com)
       UWAGA -yCAR = 119.06 (wpisz tutaj wartość znalezioną w fid.com)
   17. Wykonaj > ./extract_PPM.com aby wygenerować tabelę o nazwie fusionOffset.tab, która zawiera przesunięcie częstotliwości piku ¹⁵N względem częstotliwości nośnej (która będzie potrzebna do obliczenia kąta θ do ekstrakcji danych R₂ z danych R₁ i R_1ρ).
3. Podsumuj dane dotyczące relaksacji.
   1. Skopiuj pliki t1rho.tab i fusionOffset.tab do katalogu R1R2.
   2. Skopiuj skrypt crtR1p.tcl do katalogu R1R2, dostosuj częstotliwość spektrometru i moc blokady obrotów, a następnie wykonaj bash crtR1p.tcl | sort -n > R1R2.tab. (Rysunek uzupełniający 15). Karta R1R2.tab będzie zawierać dopasowane stałe szybkości R_1ρ, kąt theta, stałe szybkości R₂ i stałe szybkości R₁.
4. Przetwarzanie i analiza eksperymentu hetNOE.
   1. Skopiuj pliki z pobranego katalogu NOE_processing do eksperymentalnego katalogu danych NOE (katalogu roboczego).
   2. Wykonaj > chmod u+x *.com
   3. Uruchom > bruker, aby otworzyć narzędzie do konwersji NMRPipe i wygenerować plik fid.com. Kliknij przycisk Odczytaj parametry. Zmień liczbę wymiarów na dwa, jeśli zostały policzone trzy wymiary, a następnie ponownie naciśnij przycisk Odczyt parametrów. Następnie naciśnij Wyczyść skrypt, Aktualizuj skrypt i Zapisz skrypt.
   4. Wykonaj > ./fid.com
   5. Wykonaj > ./split.com (wcześniej należy utworzyć vplist z dwoma wpisami (0, 1))
   6. Wykonaj > ./ft2.com
   7. Wykonaj > nmrDraw, aby narysować widmo i wybrać piki w widmie odniesienia (wymiar z = 1). Wyodrębnij i zapamiętaj szum (naciśnij T = shift + t). Korekcja fazowa i pobieranie pików przebiegają zgodnie z tą samą procedurą, co w eksperymencie ¹⁵N R₁.
   8. Skopiuj listę szczytów do katalogu roboczego i zmień -assName na ass.com na nazwę listy szczytów (Rysunek uzupełniający 12)
   9. Wykonaj > ./ass.com, aby przypisać widma. Postępować zgodnie z tą samą procedurą, która została opisana dla eksperymentu ¹⁵N R₁.
   10. Wykonaj > python3 NoneDeleter.py, aby utworzyć relax.tab.
   11. Wykonaj > ./script.com
   12. Wykonaj > ./autoFit.com
   13. Zmień szum w error_hetnoe.tcl.
   14. Wykonaj > bash error_hetnoe.tcl |sort -n > hetNOE.tab

Wyniki

Poniżej przedstawiono przykładowe dane dotyczące relaksacji NMR zarejestrowane na pęcherzykowym białku SNARE Synaptobrevin-2 (1-96), często nazywanym VAMP2 (białko związane z pęcherzykami 2). Do zapisu danych NMR użyliśmy próbki 171 μM ¹⁵N Synaptobrevin-2 (1-96) (nazwanej dalej Syb-2) w buforze 50 mM MES (pH 6,0) zawierającym 150 mM NaCl, 0,1 mM TCEP i 1 mM EDTA. Wszystkie dane eksperymentalne zarejestrowano w temperaturze 278,15 K przy użyciu objętości 250 μl wypełnionej probówką z próbką NMR o średnicy 3 mm. Doświadczenia przeprowadzono na spektrometrze AVANCE III HD firmy Bruker 600 MHz wyposażonym w kriosondę rezonansową poczwórną Bruker 5 mm QCI ¹H, ¹⁵N, ¹³C, ³¹P.

Rysunek 3 przedstawia specyficzne dla pozostałości stałe szybkości relaksacji ¹⁵N R₁ i R₂ dopasowane do krzywych relaksacji NMR uzyskanych z eksperymentów relaksacyjnych NMR. Na osi y wykreślane są odpowiednie stałe szybkości relaksacji dla poszczególnych reszt wzdłuż sekwencji białka (na osi x). Pokazano również ^{wartości 1 H-15}N heterojądrowego NOE (hetNOE) wyekstrahowane ze stosunków intensywności nasyconych i nienasyconych (referencyjnych) eksperymentów 1 ^H-15N heterojądrowego NMR.

Dane heterojądrowe NOE i stałe szybkości ¹⁵N R₂ są łatwiejsze do interpretacji niż dane ¹⁵N R₁. Dlatego zaczniemy od nich.

Heterojądrowy NOE:
Heterojądrowe {¹H}-¹⁵N NOE są wrażliwe na dynamikę wewnętrzną w szybkiej pikosekundowej skali czasowej (<100 ps, ze względu na zależność od relaksacji krzyżowej), ale także na dynamikę ps - ns (ze względu na zależność od R₁) i mogą przyjmować wartości zwykle od 0 do (nieco mniej niż) 1 dla białek pofałdowanych. Na wyższych polach będą one systematycznie wyższe (ale zawsze niższe niż 1).

Opisują wewnętrzną elastyczność białka. Gdy porównuje się wartości hetNOE przy tych samych natężeniach pola, zachodzi zasada: im mniejsza {¹H}-¹⁵N NOE, tym bardziej dynamiczna jest dana pozostałość. W przypadku IDP obserwuje się zazwyczaj małe specyficzne dla pozostałości {¹H}-¹⁵N NOE, np. rzędu 0,5 i mniejsze przy 600 MHz. Jednak ujemne {¹H}-¹⁵N NOE stwierdza się również dla IDP, nawet do -2 na częstotliwości 500 MHz. Dla monomerycznego Syb-2, {¹H}-¹⁵N NOE mierzony w zakresie 600 MHz między -0,5 dla N-końca i 0,5 dla domeny łącznika C-końcowego. Wartości rosną stopniowo od N- do C-końca, wskazując na stopniowo malejącą elastyczność/rosnącą sztywność (Rysunek 3C).

¹⁵N R₂ stałe szybkości
¹⁵Stałe szybkości N R₂ są wrażliwe na dynamikę ps - ns, która moduluje orientację wektora wiązania N-H poprzez ogólne bębnienie białka, ruch płaszczyzn peptydowych i skręcanie kątów dwuściennych kręgosłupa. W odróżnieniu od wartości {¹H}-¹⁵N NOE i R_1, stałe szybkości ¹⁵N R₂ są zdominowane przez gęstość widmową J(0) związaną z ogólnym (rotacyjnym) wirowaniem białka. Dlatego w przypadku kulistych białek pofałdowanych stałe szybkości ¹⁵N R₂ są skalowane pod względem wielkości zgodnie z ogólnym zawirowaniem i wielkością białka. W przypadku prawdziwych dostawców tożsamości nie można przypisać globalnego czasu korelacji rotacyjnej. Mimo to, czas powolnej korelacji zależny od długości łańcucha może być dopasowany⁸⁴, zgodnie z oczekiwaniami dla polimerów, ale dynamika wewnętrzna specyficzna dla pozostałości ma większy wpływ na stałe szybkości ¹⁵N R₂. W obrębie tego samego białka stałe szybkości ¹⁵N R₂ pozwalają na dyskryminację struktur i regionów niestrukturalnych o różnej ruchliwości wewnętrznej specyficznej dla reszt. Im mniejsza obserwowana stała szybkości ¹⁵N R₂, tym bardziej ruchliwa jest dana pozostałość. Wysokie stałe szybkości ¹⁵N R₂ są charakterystyczne dla drugorzędowych elementów struktury, takich jak α-helisy lub nici β. Niskie stałe szybkości relaksacji R₂ są charakterystyczne dla regionów pętlowych i wewnętrznie nieuporządkowanych. W przypadku monomerycznego Syb-2 (1-96) obserwujemy ogólnie niskie stałe szybkości ¹⁵N R₂ zgodne z jego wewnętrznie nieuporządkowanym charakterem. Sztywność wewnętrzna wzrasta (ruchliwość maleje) od N-końca do domeny łącznika C-końcowego, zanim przejdzie do elastycznego C-końca (Rysunek 3B).

¹⁵N R₁ stałe szybkości
Tempo relaksacji R₁ jest wrażliwe na dynamikę pikosekund (ps) i szybszych nanosekund (ns). Jednak ich bezpośrednia interpretacja dynamiki wewnętrznej jest bardziej złożona niż poprzednie. Istnieje pole T₁ (R₁) minimum (maksimum), gdy T₁ jest wykreślane jako funkcja korelacji rotacyjnej τ_R: T_1min przy τ_{R, min} = 1/ ω. W przypadku szybko wirujących cząsteczek o τ_R < τ_{R, min,} np. małych cząsteczek lub małych białek globularnych, niższe stałe szybkości R₁ wskazują na zwiększoną dynamikę szkieletu białka (tak samo jak dla R₂). W przypadku większych białek, przy τ_R > τ_{R, min,} jest odwrotnie, a wyższe stałe szybkości relaksacji R₁ reprezentują zwiększoną dynamikę (przeciwną do R₂).

Rysunek 3: Dane relaksacyjne NMR. Dane były rejestrowane i oceniane zgodnie z protokołem i przepływem pracy opisanym powyżej. (A) Specyficzne dla reszty stałe szybkości relaksacji ¹⁵N R₁ wzdłuż szkieletu białkowego Syb2 (1-96). (B) ¹⁵N R₂ stałe szybkości relaksacji, obliczone na podstawie danych R_1ρ i R₁ przy użyciu wzoru (1). (C) prędkości transferu hetNOE wzdłuż szkieletu Syb2 (1-96). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek uzupełniający 1: Wczytywanie parametrów NMR. Wyświetlany jest interfejs makra rpar. (A) Przegląd wszystkich zestawów parametrów. Czerwone pole oznacza pasek wyszukiwania. Czerwone cyfry odnoszą się do odpowiednich kroków w protokole. Kliknij dwukrotnie, aby wybrać zestaw parametrów. (B) Przegląd parametrów, które można zaimportować do bieżącego eksperymentu. Opcje wykonania getprosol lub zachowania określonych parametrów bieżącego eksperymentu są oznaczone czerwonymi polami. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek uzupełniający 2: Pozycjonowanie klasy ¹H częstotliwość nośna dla optymalnego tłumienia wody. Wyświetlany jest interfejs makra gs. Podczas gdy eksperyment jest zapętlony, możliwa jest zmiana różnych parametrów eksperymentu. Znacznik może być tutaj wykorzystany do zmiany wybranego parametru podczas akwizycji. Kliknięcie nad znacznikiem podnosi parametr o wartość określoną w polu "czułość". Przełącznik czułości może być używany do regulacji rozmiaru kroku znacznika. Po prawej stronie widoczny jest FID na żywo. W przypadku kalibracji O1 celem jest zminimalizowanie obszaru FID oznaczonego czerwoną ramką, ponieważ FID jest zwykle zdominowany przez sygnał wodny. Zmniejszenie obszaru FID idzie w parze ze zmniejszonym sygnałem wodnym i lepszym tłumieniem wody. Czerwone cyfry odnoszą się do odpowiednich kroków w protokole. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek uzupełniający 3: Bliższe spojrzenie na sekwencję impulsów ^{1 H-15}N HSQC i jej parametry akwizycji. (A) Parametry sekwencji impulsów w eksperymencie ^{1 H-15}N HSQC HSQCFPF3GPPHWG. Kliknij na "E" aby otworzyć okno edytora programu impulsowego w B. (B) Edytor programów impulsowych eksperymentu ^{1 H-15}N HSQC HSQCFPF3GPPHWG. Skomentowana linia (linia 91) z impulsem ¹⁵N 90° pokazuje oryginalną linię dla eksperymentu ^{1 H-15}N HSQC. W linii 92 impuls ¹⁵N 90° jest zmieniany na impuls ¹⁵N 180°. Ta zmiana sprawia, że eksperyment ^{1 H-15}N HSQC jest programem kalibracyjnym impulsu dla kalibracji twardego impulsu 90° ¹⁵N. Aby edytować sekwencje impulsów, najpierw zapisz sekwencję pod nową nazwą. Użyj następującego przepływu pracy: Kliknij Plik, Zapisz jako, wprowadź nową nazwę, kliknij przycisk OK, a następnie kliknij przycisk Ustaw PULPROG na zestaw danych. Czerwone cyfry odnoszą się do odpowiednich kroków w protokole. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek uzupełniający 4: Ustawianie gradientów. Pokazany jest interfejs makra gpnam do zmiany kształtów, długości i mocy gradientu. Aby otworzyć używany interfejs parametrów sekwencji impulsów, należy wprowadzić wszystkie kształty gradientu GPNAM. Czerwone cyfry odnoszą się do odpowiednich kroków w protokole. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek uzupełniający 5: Ustawianie opóźnień relaksacji. Interfejs makra vplist (identyczny z makrem vclist). (A) Interfejs do wyboru vplist. Klikając na trzy kropki, otworzy się interfejs B. (B) Interfejs, aby wybrać vplist za pomocą DoubleClick lub utworzyć nową listę, klikając Plik i Nowy. (C) Interfejs otwiera się poprzez utworzenie nowej listy lub edycję istniejącej listy. Listę można zapisać, klikając Plik i Zapisz. Czerwone cyfry odnoszą się do odpowiednich kroków w protokole. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek uzupełniający 6: Parametry sekwencji impulsów w eksperymencie 15N R1ρ. (A-D) Wszystkie istotne parametry, które muszą zostać zmienione w protokole, są oznaczone czerwonymi polami i powiązanymi krokami. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek uzupełniający 7: Interfejs makra shapetool. I-BURP2 (używany w eksperymentach) jest otwierany jako impuls kształtowy. (A) Parametry wybranego impulsu kształtu. Klikając przycisk Rozpocznij symulację NMR oznaczony czerwonym polem, otworzą się okna parametrów symulacji z parametrami symulacji Długość impulsu kształtowego [μs] (= 2000 μs) i Kąt obrotu [°] (= 180°). Kliknięcie przycisku Start NMR-SIM otwiera okno symulacji (B), które pokazuje szerokość pasma inwersji impulsu I-BURP2. Czerwone cyfry odnoszą się do odpowiednich kroków w protokole. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek uzupełniający 8: Interfejs makra calcpowlev. (A) Okno wprowadzania dla długości impulsu, którego moc ma być obliczona. (B) Okno wejściowe impulsu odniesienia (głównie impulsu twardego 90°). (C) Okno wyników pokazuje różnicę siły impulsu w dB między impulsem o nowej długości impulsu a impulsem o długości impulsu odniesienia. Uwaga: Ta różnica jest ważna tylko wtedy, gdy obie długości impulsów odpowiadają identycznemu impulsowi pod względem kształtu i kąta obrotu. Czerwone cyfry odnoszą się do odpowiednich kroków w protokole. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek uzupełniający 9: Przetwarzanie widm NMR: Interfejs narzędzia do konwersji NMRPipe. Kliknięcie przycisku Czytaj parametry powoduje automatyczne odczytanie parametrów eksperymentu. Skrypt konwersji jest pokazany po prawej stronie. Wszystkie parametry można ustawić indywidualnie. Po zmianie parametrów za pomocą Clear Script zalecana jest aktualizacjaskryptu. Kliknij Zapisz skrypt, aby zapisać skrypt pod fid.com, jak pokazano po prawej stronie. Czerwone cyfry odnoszą się do odpowiednich kroków w protokole. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek uzupełniający 10: Plik nmrproc.com do przetwarzania spektralnego. Wyświetlany jest kod używany w pliku nmrproc.com do przetwarzania nieprzetworzonych danych w formacie NMRPipe. Wpis tauValues i wpis idxExpmt muszą być ustawione przed przetworzeniem. Wartości tau odpowiadają wpisom vplist w ms dla eksperymentu ¹⁵N R_1ρ (wpisy vclist przeliczone w ms dla eksperymentu ¹⁵N R₁). Jeśli chodzi o długość opóźnienia relaksacji, wpisy idxExpmt odpowiadają kolejności wpisów vplist (wpisy vclist dla eksperymentu 15N R1). W skrypcie pozycje do zmiany fazy widma są oznaczone czerwonymi polami. Czerwone cyfry odnoszą się do odpowiednich kroków w protokole. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek uzupełniający 11: Wyświetlanie widm NMR i wybieranie pików. Pokazano przegląd nmrDraw z otwartym spektrum. Użyj + i -, aby zmienić współczynnik, który idzie w parze ze zmianą poziomu konturu. Zmiana wymiaru Z pozwala na przełączanie się między eksperymentem HSQC z różnymi opóźnieniami relaksacji. Użyj opcji Rysuj, aby ponownie narysować widmo ze zmienionymi parametrami. Suwak P0 i suwak P1 umożliwiają zmiany fazy widma. Te zmiany faz nie zostaną zapisane w przetwarzanych danych; Zmiana fazy musi zostać ręcznie wprowadzona do pliku nmrproc.com, a plik nmrproc.com musi zostać ponownie wykonany. Makro Peak Detection umożliwia wybranie pików widma na ustawionym poziomie konturu. Czerwone cyfry odnoszą się do odpowiednich kroków w protokole. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek uzupełniający 12: Półautomatyczne przypisywanie pików NMR za pomocą NMRDraw. Wyświetlany jest kod pliku ass.com, który należy wykonać, aby rozpocząć przypisywanie sygnału NMR. Zmień -assName na szczytową listę wygenerowanych zainteresowań. Ta lista szczytów musi być w tym samym formacie, co dołączona lista szczytów ass.syb2.hn_1200.tab w folderze peaklist (w folderze zip pobranym o https://www.ipb.hhu.de/en/teams/team-lakomek/pulsesequences). Czerwona liczba odnosi się do odpowiedniego kroku w protokole. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek uzupełniający 13: Wizualna inspekcja piku NMR i przypisania. Interfejs makra przyporządkowania jest otwierany przez wykonanie ass.com. Użyj lewego przycisku myszy, aby przypisać szczyty, a prawego przycisku myszy, aby cofnąć przypisanie szczytów. Użyj Dalej, aby przejść do następnego aminokwasu i Poprzedni, aby przejść do poprzedniego aminokwasu. Za pomocą + i - poziom konturu można zmienić za pomocą funkcji Draw, która ponownie rysuje widmo. Korzystanie z przepływu pracy: Zakończ, Zapisz i Zakończ powoduje zapisanie przypisania i zakończenie programu. Czerwone cyfry odnoszą się do odpowiednich kroków w protokole. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek uzupełniający 14: Wyodrębnianie stałych szybkości ¹⁵N R₂ z danych R_1ρ i R₁. Krok 1. Zostanie wyświetlona zawartość pliku t1rho.tab. Kod oznaczony czerwoną ramką należy dodać przed obliczeniem stawek R₂ na podstawie stawek R_1ρ. Czerwona liczba odnosi się do odpowiedniego kroku w protokole. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek uzupełniający 15: Wyodrębnianie stałych szybkości ¹⁵N R₂ z danych R_1ρ i R₁. Krok 2. Zostanie wyświetlona zawartość pliku crtR1p.tcl. Przed wykonaniem wpisy w czerwonym polu muszą zostać zmienione zgodnie z opisem w protokole. Czerwone cyfry odnoszą się do odpowiednich kroków w protokole. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

Protokół ten opisywał konfigurację eksperymentów relaksacyjnych NMR ¹⁵N przez Lakomka i ^wsp.69 oraz Stiefa i wsp.70. Skupiliśmy się na sekwencjach impulsów NMR przy użyciu schematu wykrywania HSQC o zwiększonej czułości. Eksperymenty ¹⁵N R₁ i R_1ρ są realizowane zgodnie ze szczegółowym opisem Stief i wsp.70, a eksperyment hetNOE jest opisany przez Lakomka i wsp.69.

Podczas ustawiania eksperymentów relaksacyjnych NMR, ¹⁵N R_1ρ jest najbardziej krytycznym z nich, ponieważ wybór zbyt długiego maksymalnego okresu relaksacji lub zbyt wysokiej amplitudy RF spin-locka może spowodować uszkodzenie sondy. W przypadku okresu relaksacji pożądane jest pobieranie próbek pełnej krzywej rozpadu równomiernie od intensywności 100% do intensywności 25% (w porównaniu z doświadczeniem referencyjnym). W przypadku powoli rozluźniających się białek, takich jak IDP, o długim ¹⁵N T₂ razy, często nie będzie możliwe pobranie próbki krzywej rozpadu w pełnym zakresie, ponieważ depozycja mocy w sondzie musi być ograniczona.

W przypadku amplitudy częstotliwości radiowej (RF) ¹⁵N teoretycznie im wyższa amplituda RF, ν_spin-lock, tym lepiej, ponieważ można przeorientować więcej procesów wymiany. Z reguły procesy wymiany wolniejsze niż 1 / (2π ν_spin-lock ) mogą być ponownie ukierunkowane. Obowiązują jednak ograniczenia mocy RF. Na przykład w naszej dłoni nie przekroczylibyśmy maksymalnego okresu blokady wirowania wynoszącego 65 ms, gdy zastosowana jest amplituda RF 2 kHz, aby pozostać po bezpiecznej stronie. Jednocześnie amplituda RF z blokadą spinową na spektrometrze 600 MHz powinna być wyższa niż 1 kHz, np. 1,4 kHz przy 600 MHz, co okazało się wystarczające dla małego białka globularnego gb3⁶⁹. Aby pokryć szerokości spektralne i uniknąć efektów rezonansowych przy wyższych natężeniach pola, odpowiednia amplituda RF powinna skalować się wraz z polem magnetycznym, np. 1,5 raza wyższa przy 900 MHz (ν_spin-lock 2 kHz). Musi jednak mieścić się w ograniczeniach sondy. (Zapoznaj się z lokalną listą ograniczeń mocy spektrometru i skontaktuj się z kierownikiem obiektu NMR w celu uzyskania porady.)

Przy wyborze odstępu opóźnień relaksacji między eksperymentem referencyjnym (skrócone opóźnienie) a najdłuższym okresem opóźnienia (określonym przez czynniki omówione powyżej), preferujemy równe odstępy punktów danych opóźnienia relaksacji i wybieramy liczbę 8 (jeśli pozwala na to przydzielony czas pomiaru i sygnał do szumu). Pierwszy przyrost (i kolejne) będzie zdominowany przez najbardziej intensywne (i często najwolniej relaksujące) pozostałości. W związku z tym, w zależności od zakresu dynamicznego białka, sygnały NMR kilku reszt w sekwencji białka mogły już ulec rozpadowi po wybranym maksymalnym okresie relaksacji. Poprzez równomierne rozmieszczenie punktów opóźnienia zapewniamy, że krzywe relaksacji szybko relaksujących się pozostałości zostaną również pokryte przez wystarczającą liczbę punktów danych próbkujących krzywą relaksacji.

Dobry wybór opóźnienia odzyskiwania jest również niezbędny, aby uzyskać dokładne dane dotyczące relaksacji i uniknąć długotrwałego uszkodzenia sondy. Wybieramy opóźnienie powrotu co najmniej D1 = 2 s, aby zapobiec uszkodzeniu sondy. Aby uzyskać dokładne wyniki ^{, należy również}zapewnić białkom 1 H i ¹⁵N polaryzację wzdłużną na powrót do równowagi lub przynajmniej do stabilnego, ustalonego stanu. ¹H T₁ zwykle waha się między 1 s a 4 s przy 600 MHz dla małego lub średniego białka (do 20 kDa); w przypadku większych białek i wyższych pól, ¹H T₁ będzie dalej wzrastać. Dla małego białka globularnego gb3 stwierdziliśmy, że D1 = 3,5 s jest wystarczające dla eksperymentów ¹⁵N R₁ i R_1ρ . Dla małego IDP Syb-2 przedstawionego w tym protokole wykazaliśmy niedawno, że D1 = 2 s było odpowiednie⁷⁰.

¹⁵N hetNOE ma najniższą czułość, ponieważ wzbudzenie rozpoczyna się od ¹⁵N i nie stosuje się ^{1 H-15}N INEPT na początku sekwencji impulsów. Ponadto okres nasycenia ¹H i opóźnienie powrotu ¹⁵N powinny wynosić 5 razy ¹⁵N T₁, aby uzyskać dokładne dane. Podczas gdy dla przedstawionego tutaj IDP Syb-2 wystarczające było 5 s opóźnienia nasycenia/regeneracji plus dodatkowe 2 s opóźnienia odzyskiwania D1 (łącznie 7 s), dla większych białek i/lub białek deuterowanych czas ten może być znacznie dłuższy, np. 10 s lub dłużej. Jeśli jednak dane jakościowe są wystarczająco dobre, można zaakceptować niewielkie systematyczne przesunięcie. W takim przypadku rozsądne wyniki można uzyskać już przy 3 razy ¹⁵N T₁, ponieważ zostanie osiągnięte 95% nasycenia. W takim przypadku wynikowe wartości hetNOE będą wykazywały systematyczne przesunięcie w stosunku do wyższych wartości.

W tym protokole pracowaliśmy z w pełni protonowanym ¹⁵N Syb-2, który jest najbardziej opłacalny. Deuteracja łańcucha bocznego jest zalecana w celu zmniejszenia liczby ścieżek relaksacyjnych i pracy z najbardziej izolowanymi parami spinów amidowych ^{szkieletu 1 H-15}N. Jednak porównując ¹⁵N²H Syb-2 i ¹⁵N syb-2, zauważamy tylko bardzo niewiele różnic między próbkami deuterowanymi i w pełni protonowanymi⁷⁰. Ze względów praktycznych dane dotyczące relaksacji NMR są często rejestrowane na podwójnie lub potrójnie znakowanych próbkach (¹⁵N¹³C lub ²H¹⁵N¹³C). Omówione sekwencje impulsów NMR są zdolne do przegrupowania ewolucji sprzężenia J między ^{jądrami 13}C z ¹H lub ¹⁵N. Oczywiście, również ścieżki relaksacyjne zwiększą się, gdy zostanie wprowadzone znakowanie ¹³C. Jednak w naszych rękach, ze względów praktycznych, wprowadzony błąd, jeśli w ogóle, wynosi mniej niż 5% i może być akceptowalny, gdy potrzebne są tylko dane jakościowe.

Podczas pracy z białkami o różnych rozmiarach do detekcji często pojawia się pytanie, czy wybrać eksperymenty wykrywane przez HSQC o zwiększonej czułości⁷⁰ , czy eksperymenty wykrywane przez TROSY⁶⁹. W przypadku małych białek eksperymenty NMR z detekcją HSQC o zwiększonej czułości oferują dwukrotny wzrost stosunku sygnału do szumu (pod warunkiem, że można uzyskać dobre tłumienie wody). W przypadku większych białek zwyciężą eksperymenty wykryte przez TROSY. Próg rentowności wynosi około 20 kDa dla pofałdowanych białek. W przypadku IDP, dla których można uzyskać niskie stałe szybkości R₂ , które rosną mniej więcej liniowo wraz ze wzrostem długości łańcucha, próg rentowności można przesunąć do wyższych mas cząsteczkowych. Ze względów praktycznych zalecamy wdrożenie zarówno eksperymentów wykrywanych przez HSQC o zwiększonej czułości, jak i wykrywanych przez TROSY w razie wątpliwości. Następnie wybierz ten, który daje najlepszy stosunek sygnału do szumu w pierwszym kroku.

Dyskusja na temat tego, czy wybrać eksperymenty z wykrywaniem HSQC o zwiększonej czułości, czy z detekcją TROSY, ma zastosowanie tylko wtedy, gdy głównym kryterium jest stosunek sygnału do szumu. Gdy wymagana jest najmniejsza szerokość linii i najwyższa rozdzielczość, TROSY zawsze wygrywa. TROSY zawsze oferuje również najlepsze tłumienie wody, ponieważ nie jest wymagana mniejsza liczba impulsów protonów i nie jest wymagane odsprzęganie protonów. W celu szerszego omówienia odsyłamy do wcześniej opublikowanego artykułu⁶⁹ .

Jeszcze jedna uwaga na temat tłumienia wody. Podczas gdy ustawienie wzmocnienia odbiornika (rg) na 16 może być wystarczające w konsolach Bruker Avance NEO, wzmocnienie odbiornika w zakresie 128-256 jest zwykle pożądane w przypadku (starszych) konsol Bruker Avance. Osiągalne rg (określane przez polecenie rga Brukera) jest często uzyskiwane na podstawie intensywności resztkowego sygnału wody do poziomu hałasu. Złe tłumienie wody zawsze wprowadzi dodatkowy szum w widmach. Tak więc, nawet jeśli rg = 16 można osiągnąć na konsoli Bruker Avance NEO, pozostały sygnał wodny może znacznie przyczynić się do poziomu szumów. W związku z tym stosunek sygnału do szumu zostałby zmniejszony. W związku z tym zalecamy dążenie do poziomu rg 128-256. Prezentowane sekwencje impulsów⁷⁰ zostały przetestowane na częstotliwościach 600 MHz i 1200 MHz. Oba natężenia pola działają z tym samym ustawieniem gradientu, jak zapisano w sekwencji impulsów. Polecamy je co najmniej jako dobry punkt wyjścia do dalszej optymalizacji.

Jak wspomniano we wstępie, omawiane eksperymenty relaksacyjne NMR obejmują jedynie zakres czasowy od pikosekund do nanosekund. Aby uzyskać wgląd w dynamikę mikrosekund do milisekund, odnosimy się do eksperymentów dyspersji relaksacyjnej, eksperymentów CPMG i rozszerzenia eksperymentów R_1ρ ze zmieniającymi się amplitudami spin-lock (lub częstotliwościami nośnymi) 44,46,58,59,60,61,85,86 . Dynamika wolniejsza niż mikrosekundy może być uchwycona ¹⁵N CEST (transfer nasycenia wymiany chemicznej) NMR⁶², spektroskopia wymiany (EXSY, milisekundy na sekundy) lub RT (czas rzeczywisty) NMR (sekundy na godziny)^63,64. Efekt PRE (wzmocnienie relaksacji paramagnetycznej) sond paramagnetycznych, a także szczątkowych sprzężeń dipolarnych (RDC), może być wykorzystany do oceny całego zakresu dynamiki ps do ms 65,66,67,68.

Wszystkie te eksperymenty obejmują tylko dynamikę szkieletu. Aby zbadać dynamikę łańcucha bocznego, Kay i współpracownicy przeprowadzili kolejne mnóstwo eksperymentów NMR, dostarczając informacji na temat dynamiki łańcucha bocznego dla białek do 1 MDa ^2,87.

Aby uzyskać bardziej ilościowy wgląd w dynamikę szkieletu białkowego, konieczna jest połączona analiza wszystkich trzech parametrów NMR, ¹⁵N R₁, R₂ i hetNOE - czasami obejmująca nawet dodatkowe parametry, takie jak skorelowane krzyżowo stałe szybkości relaksacji. Opracowano różne zaawansowane metody analizy. Tak zwane podejście bez modelu znalazło szerokie zastosowanie w biomolekularnym NMR 43,88,89,90,91. Również mapowanie gęstości spektralnej może dostarczyć cennych informacji 55,92,93. Chociaż są to potężne metody analizy białek globularnych z dobrze zdefiniowanym czasem korelacji rotacyjnej, ich zastosowanie jest ograniczone w przypadku IDP. Dziedzina zagięta jest niezbędna do zdefiniowania czasu korelacji rotacyjnej³⁹. Można to częściowo obejść, gdy funkcja korelacji C(t) może być modelowana przez sumę funkcji zanikających wykładniczo w przypadku, gdy różne zaangażowane skale czasowe mogą być dobrze oddzielone 23,31,84. W przypadku braku dobrze zdefiniowanego czasu korelacji rotacyjnej alternatywą są alternatywne podejścia obejmujące rozkład czasów korelacji, np. analiza IMPACT⁹⁴ lub analiza DETECTOR^95,96. Co więcej, połączona analiza danych dotyczących relaksacji NMR i symulacji MD jest również obiecująca dla osób wewnętrznie przesiedlonych⁹⁷; Obecnie nadal mamy do czynienia z ograniczeniami w zakresie próbkowania i pola siłowego dla symulacji pełnych atomów większych IDP ^31,98.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Spektrometr HD Bruker 600 MHz AVANCE III	Przeprowadzone eksperymenty z NMR	https://www.bruker.com/en/products-and-solutions/mr/nmr/avance-nmr-spectrometer.html firmy Bruker