Metoda igłowa asymetrycznego obustronnego zwężenia tętnicy szyjnej wspólnej jest proponowana do stworzenia mysiego modelu dla naczyniowego zaburzenia poznawczego i demencji. Skutkuje długoterminowymi wynikami w porównaniu z wcześniej ustalonymi modelami i jest kompatybilny z MRI na żywo. Wizualna reprezentacja przedstawiająca procedurę stanowi wskazówkę do opanowania operacji.
Artykuł metodologiczny
Mysi model naczyniowych zaburzeń poznawczych i otępienia oparty na asymetrycznym obustronnym zwężeniu tętnicy szyjnej wspólnej prowadzonym igłą
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Naczyniowe upośledzenie funkcji poznawczych i demencja (VCID) wynika z naczyniowego uszkodzenia mózgu. Biorąc pod uwagę wysoką częstość występowania VCID, która oczekuje się, że będzie nadal rosła wraz ze starzeniem się populacji, kluczowe znaczenie ma ustanowienie solidnego modelu zwierzęcego dla tej choroby. W pracy przedstawiono nowatorską metodę tworzenia mysiego modelu VCID, który opiera się na asymetrycznym obustronnym zwężeniu tętnicy szyjnej wspólnej, które naśladuje przewlekłą hipoperfuzję mózgową wywołaną miażdżycą tętnic szyjnych.
Krótko mówiąc, wspólne tętnice szyjne (CCA) są podwiązywane do igieł o różnym rozmiarze (32 G dla prawego CCA i 34 G dla lewego CCA) za pomocą jedwabnych szwów 7-0, po czym następuje natychmiastowe usunięcie igły. Pozostałe pierścienie szwowe powodują trwałe zmniejszenie przepływu krwi i długotrwałe upośledzenie funkcji poznawczych związane z uszkodzeniem istoty białej, mikrozawałami i reaktywną glejozą, naśladując w ten sposób patogenezę VCID. Co ważne, w tym modelu igłowym reprezentacje kliniczne nie wracają z czasem, zapewniając wiarygodne długoterminowe upośledzenie funkcji poznawczych. Co więcej, wskaźnik przeżycia 24 tygodnie po operacji wynosił 81,6%, co jest wyższe w porównaniu z innymi ustalonymi modelami VCID z podobnym poziomem zmniejszenia przepływu krwi.
Dodatkowe zalety to niski koszt materiału i kompatybilność z MRI do monitorowania uszkodzeń mózgu u żywych zwierząt, ponieważ nie wszczepia się metalu. Głównym wyzwaniem w stosowaniu igłowego modelu VCID jest wymóg rozwijania zaawansowanych umiejętności chirurgicznych, ponieważ mysie CCA mają średnicę mniejszą niż 0,6 mm i są bardzo delikatne. Wysokiej jakości wizualna reprezentacja operacji pomoże zatem naukowcom opanować tę technikę i pogłębić naszą wiedzę na temat VCID, potencjalnie prowadząc do opracowania nowych metod terapeutycznych w celu zmniejszenia niszczycielskiego spadku funkcji poznawczych związanego z VCID.
Wprowadzenie
Naczyniowe upośledzenie funkcji poznawczych i demencja (VCID) jest drugą najczęstszą przyczyną pogorszenia funkcji poznawczych. Pomimo niezaprzeczalnego postępu, jaki dokonał się w kierunku zrozumienia patogenezy VCID i jej czynników ryzyka, mechanizm tego, jak dysfunkcja nerwowo-naczyniowa przyczynia się do spadku zdolności poznawczych, pozostaje niejasny. Stworzono szereg modeli gryzoni o różnym stopniu złożoności w celu wywołania niedokrwienia mózgu w celu naśladowania klinicznych reprezentacji ludzkiego VCID1. Niektóre z tych modeli opierają się na tworzeniu przejściowej hipoperfuzji mózgowej; jednak większość z nich jest generowana przez indukowanie przewlekłej hipoperfuzji mózgowej, głównego mechanizmu, który prowadzi do VCID u ludzi2.
Przewlekła hipoperfuzja mózgowa może być wprowadzona za pomocą obustronnego zamknięcia tętnicy szyjnej (BCAO), które powoduje ciężkie, ale często śmiertelne skutki, lub obustronnego zwężenia tętnicy szyjnej (BCAS). BCAS jest zwykle wykonywany przy użyciu jednej z dwóch metod: poprzez umieszczenie identycznych mikrocewek wokół obu CCA, co daje symetryczne zwężenie3; lub poprzez wszczepienie zwężacza ameroidowego i mikrocewki wokół odpowiednio lewego i prawego CCA, powodując stopniową okluzję i ~50% zmniejszenie przepływu krwi na lewym i prawym CCA, odpowiednio4. Wadą obu metod jest wysoka śmiertelność, jeśli zwężenie jest zbyt poważne lub jeśli CCA jest niedrożne oraz niezgodność z rezonansem magnetycznym żywych zwierząt ze względu na obecność metalu w organizmie. Ustalono również kilka genetycznych modeli myszy1,5,6,7,8. Dodatkowe opcje obejmują autosomalną dominującą arteriopatię mózgową z zawałami podkorowymi i mysimi modelami leukoencefalopatii9,10. Niemniej jednak żaden z proponowanych modeli nie naśladuje pełnego zakresu uszkodzeń niedokrwiennych, które występują u ludzi, dlatego trwają poszukiwania zaktualizowanych modeli VCID.
Ten artykuł przedstawia nowatorską metodę chirurgiczną wywoływania asymetrycznego obustronnego zwężenia tętnicy szyjnej wspólnej (ABCS) u myszy, gdzie zwężenie CCA jest wykonywane za pomocą szwów jedwabnych i jest kontrolowane przez podwiązanie CCA do igieł o różnych średnicach, a następnie natychmiastowe usunięcie igły11. W rezultacie, pierścienie szwowe o precyzyjnych średnicach są na stałe pozostawiane na CCA, aby zapewnić przewlekłe zwężenie. Zaletą stosowania ABCS w porównaniu z metodą symetryczną jest to, że umiarkowana hipoperfuzja po prawej stronie zapewnia lepsze przeżycie, podczas gdy bardziej wyraźna hipoperfuzja po lewej stronie zapewnia długoterminowe reprezentacje neurologiczne i patologiczne. Ten model igły ma kilka zalet w porównaniu z tradycyjnymi modelami BCAS11, takich jak trwałe wyniki, niższa śmiertelność, bardzo niski koszt, elastyczność i możliwość stosowania specjalnych podejść analitycznych.
Aby rozwinąć te zalety, trzy podwiązania powodują fragment zwężenia CCA, a nie zwężenie punktu ogniskowego, co prowadzi do uporczywej hipoperfuzji, uszkodzenia istoty białej i pogorszenia funkcji poznawczych u ~90% myszy. Śmiertelność myszy igłowych była ~17%, niższa niż w przypadku modelu ameroidowego ogranicznika/mikrocewki Hattoriego4, który ma ~30% śmiertelność w ciągu 16 tygodni w oparciu o nasze doświadczenie. Każdy model BCAS kosztuje zazwyczaj około 100 USD ze względu na drogie mikrocewki lub ograniczniki ameroidowe, podczas gdy model igłowy kosztuje tylko około 1 USD za mysz. Co więcej, rozstaw igieł może być modyfikowany w zależności od specyficznych dla badań wymagań dotyczących ograniczenia przepływu krwi po obu stronach. W wariancie przedstawionym w niniejszej pracy model igłowy naśladuje patofizjologię ciężkiego zwężenia tętnicy szyjnej, spowodowanego jednostronnym trwałym zwężeniem bez okluzji, co jest najczęstszą reprezentacją choroby w clinic11. Co więcej, ograniczniki ameroidowe i mikrocewki, które są stosowane w tradycyjnych modelach BCAS, są wykonane z metalu, który może powodować znaczne artefakty, jeśli zostanie wykonany rezonans magnetyczny in vivo, mimo że metal jest wszczepiany nie do mózgu, ale do klatki piersiowej. Może być trudno przewidzieć, jak dokładnie obecność metalu wpłynie na obrazowanie.
Generalnie, rezonans magnetyczny in vivo, który jest wykonywany po implantacji mikrocewki, jest zazwyczaj prostym obrazowaniem anatomicznym, nieodpowiednim do ilościowej analizy wielokrotnych zniewag, co jest wysoce pożądane w badaniach VCID. Natomiast prezentowany tutaj model igłowy wykorzystuje wyłącznie szwy jedwabne i jest w pełni kompatybilny z każdym rodzajem rezonansu magnetycznego in vivo. Jest to istotne z dwóch powodów: (1) rezonans magnetyczny jest niezwykle czuły na małe uszkodzenia mózgu, mikrokrwawienia lub powierzchowną siderozę12, dlatego jest preferowany w stosunku do innych metod analizy, takich jak tomografia komputerowa (2) rezonans magnetyczny in vivo powinien być preferowany w stosunku do rezonansu magnetycznego ex vivo, ponieważ badania VCID mogą niewątpliwie skorzystać ze śledzenia dynamiki progresji/gojenia się zmian, zwłaszcza w odpowiedzi na proponowane nowatorskie metody leczenia. Ponadto w modelu igłowym można wykonać funkcjonalny (fMRI), aby uzyskać krytyczny wgląd w integralność sprzężenia nerwowo-naczyniowego w odpowiedzi na hipoperfuzję mózgową. Tym samym możliwość zastosowania rezonansu magnetycznego in vivo otwiera drogę do dogłębnej analizy skomplikowanej korelacji między wielkością i lokalizacją zmian a funkcjami poznawczymi, a także sprzężeniem nerwowo-naczyniowym, zwłaszcza w badaniach farmakodynamicznych.
Protokół
Wszystkie protokoły dla zwierząt zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt na Uniwersytecie w Pittsburghu i przeprowadzone zgodnie z Przewodnikiem National Institutes of Health dotyczącym opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych. We wszystkich operacjach przetrwania należy zachować sterylne techniki. W prezentowanych doświadczeniach wykorzystano dwunastotygodniowe samce myszy C57BL/6J o masie ciała 25-30 g.
1. Przygotowanie materiałów i przestrzeni roboczej
- Przygotować fragmenty igły (o długości ~4 mm; 32 G dla prawego CCA i 34 G dla lewego CCA). Lekko stępić ostry koniec igieł, ostrożnie stukając ostrym końcem o twardą powierzchnię i ostrożnie oddzielić igły od plastikowych kawałków za pomocą uchwytu na igły. Wstępnie pocięte jedwabne szwy 7-0 na kawałki o długości 1-2 cm.
- Sterylizuj narzędzia chirurgiczne, fragmenty igieł i szwy w autoklawie lub inną odpowiednią metodą.
2. Przeprowadzanie zabiegu
- Zważ mysz i wywołaj znieczulenie, umieszczając mysz na 2-3 minuty w komorze wentylowanej 3% izofluranem w mieszaninie 25%O2 i 72%N2O.
- Umieść mysz (brzuszną stroną do góry) na poduszce grzewczej pokrytej sterylnym prześcieradłem chirurgicznym, aby utrzymać stałą temperaturę ciała (37 °C) i zabezpiecz maskę na twarz do wentylacji 1% izofluranem w mieszaninie 25%O2 i 74%N2O. Zabezpiecz kończyny myszy taśmą klejącą.
- Ogol sierść na szyi golarką elektryczną. Wyczyść cienkie włosy taśmą klejącą lub odkurzaczem do klawiatury.
- Zdezynfekuj miejsce operowane roztworem betadyny (10% jodu). Dejodowanie skóry za pomocą 70% etanolu. Powtórz dinsinfection 3 razy. Upewnij się, że poziom znieczulenia jest odpowiedni przy braku reakcji na mocne uszczypnięcie palca u nogi (odruch pedałowania).
- Ułóż obszar operacyjny. Następnie wykonaj pionowe nacięcie w linii środkowej wzdłuż tchawicy i oddziel obustronne gruczoły tarczycy za pomocą mikrokleszczyków. Odciągnij skórę i tkankę za pomocą sterylnych małych retraktorów skóry.
- Pod mikroskopem użyj kątowej pęsety, aby ostrożnie odsłonić i tępo wypreparować jeden z CCA z nerwu błędnego i pochewki. Użyj sterylnej wody lub soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS), aby zwilżyć miejsce nacięcia, jeśli CCA ma tendencję do przyklejania się do kleszczy. W razie potrzeby umieść małą plastikową strzykawkę pod szyją, aby podtrzymać postawę.
UWAGA: Zachowaj szczególną ostrożność, aby nie pęknąć CCA. - Nawlecz trzy wstępnie przycięte fragmenty szwu jedwabnego (rozmiar 7-0) pod CCA (w odległości 1 mm od siebie) za pomocą kątowej pęsety.
- Narysuj bardzo luźny podwójny węzeł wokół CCA na jednym z fragmentów szwu.
UWAGA: Zwilżenie pola operacyjnego i szwów sterylną wodą lub PBS może pomóc w zawiązaniu węzła. - Umieść fragment igły (32 G dla prawego CCA i 34 G dla lewego CCA) równolegle do CCA, wewnątrz luźnego węzła (Rysunek 1A). Ostrożnie zaciśnij węzeł pierwotny wokół igły i CCA, aż nie zaobserwuje się przepływu krwi i zabezpiecz go węzłem wtórnym. Natychmiast wyciągnij igłę, aby przywrócić częściowy przepływ krwi i przyciąć końce szwu.
UWAGA: Chirurg musi być bardzo ostrożny przy przycinaniu końców szwów po zakończeniu węzłów. Przecięcie zbyt blisko węzła może spowodować poluzowanie węzła. Dodatkowo bardzo ważne jest, aby obserwować CCA po wyjęciu igły, aby upewnić się, że przepływ krwi jest nadal możliwy za węzłem. Jeśli CCA wygląda bardzo blado po usunięciu igły, oznacza to, że CCA jest nadmiernie ściśnięte.
Powtórz kroki 2.8-2.9 dla 2. i 3. nici szwu na tym samym CCA, w odległości około 1 mm od siebie (Rysunek 1B).
- Powtórzyć kroki 2.6-2.10 z przeciwległym CCA, używając fragmentu igły o stężeniu 32 G.
- Dokładnie sprawdź, czy oba CCA są skutecznie podwiązane: upewnij się, że wszystkie trzy pasma szwów są bezpiecznie zawiązane na miejscu, ale nie są tak ciasne, aby całkowicie zablokować przepływ krwi (sprawdź, czy CCA nie są blade poniżej węzłów). Sprawdź, czy trzy opaski szwów na każdym CCA są oddalone od siebie o około 1 mm.
- Zamknij skórę za pomocą sterylnych szwów monofilamentowych.
- Bezpośrednio po zabiegu należy wstrzyknąć dootrzewnowo 100-150 μl ketoprofenu (1 mg/ml bulionu; 5 mg/kg masy ciała) w celu złagodzenia bólu pooperacyjnego. Powtórzyć to wstrzyknięcie 24 godziny i 48 godzin po zabiegu.
- Umieść mysz na kocu homeotermicznym w temperaturze 37 °C w celu ciągłego monitorowania przez 2 godziny przed powrotem zwierzęcia do obiektu dla zwierząt.
UWAGA: W przypadku procedury pozorowanej kroki 2.7-2.12 należy pominąć.
3. Walidacja modelu
UWAGA: Uszkodzenie mózgu zostało przeanalizowane za pomocą rezonansu magnetycznego in vivo i następnie zweryfikowane za pomocą barwienia Luxol fast blue (LFB) i testów behawioralnych.
- Obrazowanie perfuzji krwi w mózgu.
- Znieczulij mysz za pomocą 1-1,5% izofluranu. Wysterylizuj miejsce operowane roztworem Betadine (10% jodu). Następnie odjoduj skórę za pomocą 70% etanolu.
- Zabezpiecz czaszkę zwierzęcia w ramie stereotaktycznej. Wykonaj nacięcie strzałkowe w linii środkowej skóry głowy od kości czołowej do potylicznej, aby odsłonić czaszkę i oczyść powierzchnię czaszki sterylnym roztworem soli fizjologicznej.
- Umieść naładowaną kamerę urządzenia 10 cm nad czaszką za pomocą dwuwymiarowego systemu plamek laserowych. Umieść uchwyt sondy na miejscu kraniektomii i mocno go zabezpiecz.
- Wykonaj obrazy perfuzji krwi 5 minut przed zabiegiem i bezpośrednio po zwolnieniu igły lub 7, 14, 21, 28, 35 i 42 dni po zabiegu.
- Zamknij skórę za pomocą sterylnych szwów monofilamentowych. Wstrzyknąć 100-150 μl ketoprofenu (1 mg/ml bulionu; 5 mg/kg masy ciała) dootrzewnowo w celu złagodzenia bólu pooperacyjnego. Powtórzyć to wstrzyknięcie po 24 godzinach i 48 godzinach.
- Rezonans magnetyczny in vivo
- Znieczulenie myszy za pomocą 1-1,5% izofluranu, przy ciągłym monitorowaniu oddychania i utrzymywaniu temperatury na poziomie 37 °C ciepłym powietrzem podczas akwizycji obrazu.
- Wykonaj rezonans magnetyczny in vivo przy użyciu skanera 9,4 T, cewki Tx 86 mm i 4-kanałowego zestawu odbiorników mózgu myszy z uruchomionym odpowiednim oprogramowaniem. Po pozycjonowaniu i skanowaniu pilotażowym uzyskaj obrazy T2-zależne (T2WI) za pomocą sekwencji Rapid Acquisition with Relaxation Enhancement (RARE), z następującymi parametrami: Czas echa/Czas powtarzania (TE/TR) = 40/4,000 ms, średnie = matryca 8,256 × 256, 16 warstw o grubości warstwy 0,5 mm, współczynnik RARE = 4 i pole widzenia (FOV) 20 x 20 mm.
- Zbierz dane obrazowania tensora dyfuzji (DTI) przy użyciu sekwencji obrazowania echo planarnego (EPI)-DTI przy użyciu tej samej geometrii i parametrów co T2WI z następującymi wyjątkami: TR/TE = 2,300/22 ms, macierz akwizycji = 128 x 128, 2 segmenty, 5 obrazów A0 i 30 nieliniowych obrazów dyfuzji, Δ/δ = 10/3 ms i wartość b = 1,000 s/mm2.
- Analizuj dane DTI za pomocą oprogramowania DSI Studio (http://dsistudio.labsolver.org/), szukając różnic w parametrach skalarnych dyfuzji (anizotropia frakcyjna (FA), dyfuzyjność średnia (MD), dyfuzyjność osiowa (AD) i dyfuzyjność radialna (RD)). Narysuj obszary zainteresowania (ROI) dla ciała modzelowatego (CC), torebki zewnętrznej (EC), torebki wewnętrznej (IC), fimbrii, spoidła przedniego (AC), cingulum (Cing), hipokampa (hipopotam), kory (C) i prążkowia (Str) z obu półkul.
- Barwienie Luxol fast blue (LFB)
- Przygotuj sekcje mózgu: napraw mózg 4% PFA przez 24 godziny, a następnie zanurz mózg w 30% sacharozy, aż mózg zatonie. Osadź mózg w związku OCT na suchym lodzie. Wytnij wycinek mózgu koronalnego o grubości 20 μm na przesuwanym mikrotomie. Przechowuj plastry mózgu w roztworze do przechowywania (30% glicerol/30% glikolu etylenowego w PBS).
- Zanurz skrawki mózgu w LFB (0,1% roztwór alkoholu), trzymaj w temperaturze 56 °C przez noc i umyj wodą destylowaną.
- Inkubuj skrawki mózgu w 0,05% węglanie litu i odwadniaj za pomocą stopniowanych alkoholi.
- Skrawki barwić 0,5% fioletem krezylowym przez 5 minut, zróżnicowanym 70% etanolem.
- Zamontuj poplamione sekcje mózgu za pomocą podłoża montażowego.
- Ocena funkcji poznawczych za pomocą zmodyfikowanego testu labiryntu wodnego Morrisa
- Napełnij okrągły zbiornik wodą (25 oC, głębokość 33 cm) i zanurz kwadratową platformę z pleksi o wymiarach ~10 x 10 cm2 1,2 cm poniżej poziomu wody, 31 cm od północnej, wschodniej, południowej lub zachodniej krawędzi basenu.
UWAGA: Ta platforma powinna pozostać w tym samym miejscu przez cały czas trwania testów. - Włącz kamerę wideo zamontowaną na suficie. Umieść mysz w zbiorniku (nie upuszczaj na poziomie wody), przodem do ściany i zaczynając od północnego wschodu, południowego wschodu, południowego zachodu lub północnego zachodu. Pozwól myszy pływać maksymalnie przez 90 sekund, aby znaleźć zanurzoną platformę.
- Pozwól myszy pozostać na zanurzonej platformie przez 30 sekund, jeśli platforma zostanie znaleziona. Jeśli platforma nie zostanie znaleziona, umieść tam mysz na 30 sekund.
- Pozwól myszy odpocząć przez 5 minut i powtórz próbę pływania (kroki 3.4.2 - 3.4.3) 2 razy.
- Osusz mysz kawałkiem szmatki i włóż ją z powrotem do klatki pod żarówką grzewczą.
- Powtarzaj trzy próby pływania każdego dnia przez 5 kolejnych dni.
- Korzystając z materiału wideo, oblicz opóźnienie ucieczki (ile czasu zajmuje znalezienie platformy w każdej próbie).
- W ostatnim dniu testów należy zdjąć platformę i nagrać czas, jaki mysz spędza w kwadrancie, w którym wcześniej znajdowała się platforma.
- Napełnij okrągły zbiornik wodą (25 oC, głębokość 33 cm) i zanurz kwadratową platformę z pleksi o wymiarach ~10 x 10 cm2 1,2 cm poniżej poziomu wody, 31 cm od północnej, wschodniej, południowej lub zachodniej krawędzi basenu.
Wyniki
Długotrwała asymetryczna hipoperfuzja mózgowa
Przepływ krwi w CCA mierzono przed i bezpośrednio po zwolnieniu igły z ostatniego (trzeciego) podwiązania, zgodnie z wcześniejszym opisem11. Przepływ krwi został zredukowany o ~70% w lewej CCA i o ~50% w prawej CCA. Perfuzję krwi mózgowej monitorowano dynamicznie za pomocą dwuwymiarowego laserowego obrazowania speklowego. Operacja spowodowała hipoperfuzję mózgową w obu półkulach, przy czym lewa półkula była dotknięta w stopniu bardziej nasilonym (Rycina 2). Hipoperfuzja mózgowa utrzymuje się przez co najmniej 24 tygodnie po operacji11.
Niższa śmiertelność
Wskaźnik przeżywalności samców myszy po 6 tygodniach wyniósł 81,6% (Rysunek 3); myszy były bardziej podatne na śmierć w pierwszym tygodniu po zabiegu.
In vivo Wykrywanie urazów mózgu za pomocą MRI
Obrazy ważone w obrazowaniu T2 ujawniły obszary hipo- lub hiperintensywne w hipokampie (Hippo), torebce zewnętrznej (EC), torebce wewnętrznej (IC), ciele modzelowatym (CC) i prążkowiu (Str) u myszy poddanych operacji ABCS, co wskazuje na uszkodzenie mózgu (Rycina 4A). Uszkodzenia strukturalne zaobserwowano na mapach kolorystycznych z kodowaniem kierunkowym (DEC) obrazowania tensorowego dyfuzji (DTI) u myszy z ABCS w porównaniu z grupą pozorowaną (Rysunek 4B).
Analizy ilościowe wykazały, że u myszy ABCS odnotowano istotnie niższą anizotropię frakcyjną (FA) w lewym hipokampie (Hippo), IC, commissura anterior (AC), cingulum (Cg) oraz w fimbria (Fi) w porównaniu z grupą sham (P < 0,05 względem sham), co wskazuje na uszkodzenie mikrostruktury białej istoty w lewej półkuli (górny lewy panel, Rycina 4C). U myszy ABCS zmniejszona była również FA w prawym Cg i Fi (P < 0,05 względem sham). FA w lewym IC i Fi była istotnie niższa niż w prawym u myszy ABCS (P < 0,05, lewa względem prawej).
Podobnie, w przypadku myszy ABCS odnotowano znacznie niższą dyfuzyjność osiową (AD) w lewym EC, IC, Str oraz Fi w porównaniu z grupą sham, co sugeruje uszkodzenie aksonalne (panel prawy górny, Rysunek 4C (P < 0,05 względem grupy sham)). Tylko lewy Str wykazał obniżenie średniej dyfuzyjności (MD) u myszy ABCS w porównaniu z grupą sham (panel lewy dolny, Rysunek 4C). Różnicę w dyfuzyjności radialnej (RD) zaobserwowano w lewym CC, Str oraz Fi u myszy ABCS (panel prawy dolny, Rysunek 4C), co sugeruje stan zapalny i zwiększoną komórkowość w tych obszarach13.
Asymetryczny uraz mózgu w obu półkulach oraz uszkodzenia obszarów białej istoty w lewej półkuli
Uraz mózgu poddano dodatkowej analizie za pomocą barwienia LFB, stosując procedurę opisaną wcześniej14 (Rysunek 5). Obrazy przy mniejszym powiększeniu wykazały jaśniejsze niebieskie barwienie w EC i Str, co sugeruje demielinizację w tych obszarach. Obrazy o wysokiej rozdzielczości wykazały, że u myszy z grupy sham aksony w EC były dobrze zorganizowane i zmielinizowane, z liniowo zorientowanymi oligodendrocytami; natomiast u myszy ABCS aksony zanikły, a w EC zaobserwowano rozproszone, zabarwione na niebiesko komórki. U myszy z grupy sham w Str widoczne były głęboko zabarwione na niebiesko i dobrze zorganizowane struktury wiązek włókien. Jednak u myszy ABCS wiązki włókien były zabarwione jaśniej i były mniejsze, a ich integralność została naruszona; niektóre wiązki włókien były zapróżniowane. W AC u myszy ABCS wiązki włókien były zdeformowane, a macierz międzywiązkowa była znacznie pogrubiona. Podsumowując, operacja ABCS powoduje demielinizację i uszkodzenie aksonów; uszkodzenia białej istoty występują głównie w lewej półkuli.
Zaburzenia uczenia się i pamięci
Operacja ABCS z użyciem igły spowodowała znaczące zaburzenia uczenia się, na co wskazywał wydłużony czas odnalezienia zatopionej platformy (latencja ucieczki) podczas testu w labiryncie wodnym Morrisa (Rycina 6). Zaburzenia te utrzymywały się przez co najmniej 24 tygodnie po operacji. Istotnie upośledzona była również pamięć, o czym świadczył skrócony czas spędzony w kwadrancie docelowym po usunięciu platformy.
Rysunek 1: Etapy zabiegu z użyciem igły w celu stworzenia ABCS. (A) Lewa CCA zostaje odsłonięta, a trzy jedwabne nici chirurgiczne zostają przełożone pod CCA. Na jednym z fragmentów nici zawiązuje się luźny węzeł, a igłę ustawia się równolegle do CCA. (B) Trzy pętle szwów zostają rozmieszczone w odstępach około 1 mm. Skróty: ABCS = asymetryczne obustronne zwężenie wspólnej tętnicy szyjnej; CCA = wspólna tętnica szyjna. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Rycina 2: Trwała asymetryczna hipoperfuzja mózgowa w modelu ABCS z użyciem igieł. Dynamiczny monitoring przepływu krwi w mózgu po operacji. Trwałą hipoperfuzję mózgową można zaobserwować w obu półkulach, przy czym jest ona bardziej głęboka po stronie lewej. Czarne gwiazdki wskazują obszary hipoperfuzji. Skrót: ABCS = asymetryczna obustronna stenoza tętnic wspólnych szyjnych. Aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny, kliknij tutaj.
Rycina 3Wskaźnik przeżywalności po zabiegu igłowej ABCS. Operacja skutkowała 81,6% przeżywalnością w ciągu 6 tygodni; zgony wystąpiły głównie w pierwszym tygodniu po operacji. Skrót: ABCS = asymetryczne obustronne zwężenie tętnic szyjnych wspólnych. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.
Rycina 4: In vivo detekcja uszkodzenia mózgu w modelu ABCS z użyciem igły za pomocą MRI. (A) Reprezentatywne obrazy T2-zależne z myszy z grupy sham i ABCS. Czerwone groty strzałek wskazują obszary hypo- lub hiperintensywne. (B) Reprezentatywna mapa DEC z badania DTI in vivo 2 tygodnie po operacji ABCS z użyciem igły. Kolory wskazują kierunkowość głównej osi dyfuzji (czerwony = lewo/prawo, zielony = grzbietowo/brzusznie, niebieski = rostralnie/kaudalnie). (C) Analiza ilościowa u myszy z grupy sham i ABCS (jednoczynnikowa ANOVA). * oznacza p < 0.05 ABCS względem sham (półkula lewa). # oznacza p < 0.05 lewa względem prawej. & oznacza p < 0.05 ABCS względem sham (półkula prawa). Dane przedstawiono jako średnia ± SEM; n = 4 dla grupy sham, n = 4 dla myszy ABCS. Skróty: ABCS = asymmetric bilateral common carotid artery stenosis (asymetryczne obustronne zwężenie wspólnej tętnicy szyjnej); Hippo = hippocampus (hipokamp); EC = external capsule (torebka zewnętrzna); IC = internal capsule (torebka wewnętrzna); CC = corpus callosum (ciało modzelowate); Str = striatum (prążkowie); DEC = directionally encoded color (kodowanie kolorystyczne kierunkowe); DTI = diffusion tensor imaging (obrazowanie tensora dyfuzji); FA = fractional anisotropy (anizotropia frakcyjna); MD = mean diffusivity (średnia dyfuzyjność); AD = axial diffusivity (dyfuzyjność osiowa); RD = radial diffusivity (dyfuzyjność radialna). Aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny, kliknij tutaj.
Rycina 5: Reprezentatywne barwienie LFB przekrojów mózgu 6 tygodni po operacji ABCS z użyciem igły. (A) Obrazy przy małym powiększeniu barwienia LFB z grupy myszy pozorowanych i z ABCS. Białe ramki wskazują obszary odpowiadające obrazom o wyższej rozdzielczości w punkcie B. (B) Obrazy o wysokiej rozdzielczości (200x) z lokalizacji EC (panel górny), Str 1 i 2 (panel środkowy) oraz AC (panel dolny). Czarna grot strzałki wskazuje normalny pęczek włókien. Niebieskie groty strzałek wskazują uszkodzony pęczek włókien. Czerwone groty strzałek oznaczają włókna z wakuolami. Paski skali = 1 mm (A), 100 µm (B). Skróty: ABCS = asymetryczna obustronna stenoza wspólnej tętnicy szyjnej; LFB = Luxol fast blue; EC = torebka zewnętrzna; Str = prążkowie; AC = sp anew anadanis (komisura przednia). Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.
Rycina 6: Ocena uczenia się przestrzennego i pamięci w teście wodnego labiryntu. Uczenie się przestrzenne oceniano (A) 3 tygodnie oraz (B) 24 tygodnie po operacji, mierząc czas potrzebny na zlokalizowanie platformy w kolejnych dniach. Pamięć oceniano (C) 4 tygodnie oraz (D) 24 tygodnie po operacji, mierząc czas spędzony w kwadrancie docelowym po usunięciu platformy. Operacja spowodowała długotrwałe zaburzenie funkcji poznawczych. Dane przedstawiono jako średnia ± SEM, *p < 0,05 grupa z igłą versus sham; **p < 0,01 versus sham; dwuczynnikowa ANOVA i test post hoc Neumana-Keulsa. n = 10 dla grup sham, n = 10 dla grup z igłą. Rycina została zmodyfikowana na podstawie pracy Weng et al.11. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.
Dyskusja
Opisano kilka metod indukcji VCID przy użyciu asymetrycznego zwężenia CCA, a wszystkie z nich mają wspólną ważną i krytyczną chirurgiczną izolację schodkową CCA od nerwu błędnego i osłonki oraz odsłonięcie CCA, aby umożliwić jego zwężenie. Chociaż zapewniamy dobrej jakości wskazówki wizualne dotyczące chirurgicznego narażenia CCA przed podwiązaniem, chcielibyśmy również skierować badaczy do obejrzenia dodatkowych filmów na temat izolacji CCA, które są dostępne online w kontekście innych operacji na myszach i szczurach 15,16,17,18. Należy zachować szczególną ostrożność, aby nie ściskać ani nie pękać CCA, ponieważ jest to główna tętnica, która zaopatruje mózg w natlenioną krew.
Kolejnym krytycznym krokiem operacji, który należy opanować, jest narysowanie luźnego węzła i dalsze zaciskanie go wokół CCA za pomocą igły, a następnie usunięcie igły. Zdecydowanie zalecamy przećwiczenie tego kroku z samą igłą przed próbą wykonania go na znieczulonej myszy. Pozwoli to na opanowanie delikatnych ruchów kleszczy i doskonalenie manipulacji szwami bez ryzyka zranienia myszy. Węzeł musi być dobrze zabezpieczony, aby nie rozpadł się podczas wyjmowania igły, wystarczająco ciasny, aby utrzymać igłę, ale wystarczająco luźny, aby umożliwić odsunięcie igły od zawiązanego szwu za pomocą kleszczy.
Co ważne, odkryliśmy, że pojedyncze podwiązanie każdego CCA nie wystarczy, aby niezawodnie zmniejszyć przepływ krwi i utrzymać długotrwałą hipoperfuzję mózgową11. Jednym z potencjalnych wyjaśnień może być to, że pojedyncze podwiązanie powoduje zwężenie punktowe, które prawdopodobnie powoduje miejscowy wzrost ciśnienia, prowadząc do zwiększenia prędkości przepływu krwi w celu skompensowania zmniejszenia przepływu krwi. Zalecamy wykonanie trzech podwiązaniów w odstępie ~1 mm w celu wytworzenia fragmentu zwężenia. Dodatkową korzyścią płynącą z zastosowania trzech podwiązanych węzłów jest to, że węzły służą jako mechanizm zabezpieczający w przypadku, gdy jeden z węzłów poluzuje się podczas dodatkowego usuwania igły. Rzeczywiście, fragment zwężenia spowodowany trzema oddzielnymi ligacjami tego samego CCA zwiększa spójność modelu, prowadząc do trwałej hipoperfuzji mózgowej u około 90% myszy. Co więcej, zwężenie fragmentu naśladuje zwężenie CCA spowodowane miażdżycą u ludzi dokładniej w porównaniu ze zwężeniem punktu ogniskowego, zwiększając w ten sposób znaczenie kliniczne modelu igły.
Zdecydowanie zalecamy natychmiastowe usunięcie igły po zakończeniu pierwszego podwiązania, aby upewnić się, że przepływ krwi CCA został częściowo przywrócony, a dopiero potem przejście do drugiego i trzeciego podwiązania sekwencyjnie. Nie zaleca się kończenia wszystkich trzech podwiązaniów igłą wewnątrz wszystkich trzech węzłów, ponieważ znacznie wydłużyłoby to czas całkowitego zablokowania przepływu krwi. Zazwyczaj nie zalecamy więcej niż 1 minutę całkowitej okluzji CCA przed usunięciem igły. Zalecenie to opiera się na raporcie, w którym myszy nie wykazywały żadnych oznak upośledzenia funkcjonalnego po 3 sesjach 60-sekundowej okluzji obu CCA19. W naszym modelu chirurg pracuje nad jednym CCA na raz, co jest bardziej wyrozumiałe niż okluzja obu CCA jednocześnie, ale nadal zalecamy przestrzeganie tego harmonogramu, aby wykluczyć wszelkie artefakty spowodowane przedłużoną okluzją, a nie przewlekłą hipoperfuzją po obu stronach.
Podczas gdy ten model igieł pozwala na regulację średnic zawiązanych szwów za pomocą igieł o różnych średnicach (w zależności od masy ciała lub specyficznych wymagań ograniczenia przepływu krwi), z naszego doświadczenia wynika, że myszy miały wyższe wskaźniki przeżycia, gdy hipoperfuzja w prawej półkuli była umiarkowana, a nie ciężka. Z drugiej strony, utrzymująca się ciężka hipoperfuzja w lewej półkuli powodowała długotrwałe skutki patologiczne i neurologiczne. Dlatego zalecamy wykonanie asymetrycznego podwiązania przy użyciu grubszej igły do podwiązania prawego CCA (powodującego umiarkowaną hipoperfuzję w prawej półkuli) i cieńszej igły do podwiązania lewej CCA (powodującej ciężką hipoperfuzję w lewej półkuli).
Wreszcie, badacze powinni mieć świadomość, że różne szczepy myszy mogą dawać różne wyniki w wyniku urazu niedokrwiennego lub urazowego, głównie ze względu na różnice w anatomii naczyń mózgowych20,21. Ponieważ wiele badań wymaga obecnie generacji nowych myszy transgenicznych, szczep tła musi być dokładnie rozważony, jeśli operacja BCAO jest wymagana na którymkolwiek etapie projektu eksperymentalnego. Na przykład zarówno szczepy C57BL/6, jak i SV129 są częstym wyborem tła do generowania zwierząt transgenicznych do badań nad udarem mózgu21. Jednak zostało dobrze udokumentowane, że myszy C57BL / 6 są znacznie bardziej wrażliwe na niedokrwienie w porównaniu z innymi testowanymi szczepami, w tym myszami SV12920,21. W rzeczywistości istnieją dowody na to, że efekt szczepu mysiego może być nawet ważniejszy niż efekt techniki użytej do indukcji VCID21. W związku z tym niezwykle ważne staje się utrzymanie spójnego tła myszy we wszystkich eksperymentach, które obejmują wywoływanie niedokrwiennego uszkodzenia mózgu u gryzoni. Co ważne, naukowcy mogą ocenić skuteczność wyniku operacji u żywych zwierząt za pomocą neurologicznych systemów punktacji22 z wynikiem 0,5 jako kryterium włączenia. Uszkodzenie mózgu można dodatkowo potwierdzić za pomocą barwienia immunologicznego Iba1, które jest bardzo wrażliwe na uszkodzenia mózgu nawet po niewielkim ogniskowym urazie.
Podsumowując, ważne jest, aby pamiętać, że VCI jest złożonym terminem, który łączy wiele reprezentacji klinicznych i przyczyn pod jednym parasolem. Dlatego badacze powinni zawsze pamiętać, który model powinien zostać wybrany na podstawie aspektów VCI, które chcieliby zbadać. Nigdy nie może istnieć jeden uniwersalny model dla wszystkich przejawów VCI. Modele zwężeń CCA poważnie ograniczają przepływ krwi z głównych tętnic, naśladując w ten sposób pacjentów ze zwężeniem miażdżycowym. Nowatorska metoda igłowa tworzenia asymetrycznych BCAS u myszy C57BL / 6J jest niezawodną metodą naśladowania VCID, która oferuje kilka zalet w porównaniu z wcześniej zgłaszanymi metodami (szczególnie wysoka elastyczność, niska śmiertelność, długoterminowe wyniki, minimalne koszty i monitorowanie MRI na żywo). Ze względu na swoje zalety w porównaniu z innymi modelami, może być wykorzystany do dalszego pogłębiania naszej wiedzy na temat progresji VCID, a także służyć jako podstawa do badań przesiewowych potencjalnych środków terapeutycznych w celu wyleczenia lub spowolnienia postępu VCID. Podobnie jak w przypadku innych zgłoszonych metod BCAS, model igłowy wymaga zaawansowanych umiejętności chirurgicznych, które można opanować z czasem, wykorzystując tę wizualną demonstrację jako przewodnik.
Oświadczenia
Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.
Podziękowania
Ten projekt był wspierany przez granty National Institutes of Health/NINDS RF1NS117509 (G. Cao) oraz granty VA Merit Review BX003923 i BX006454 (G. Cao).
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 1 ml strzykawka | BD | 309659 | IP wstrzyknięcie ketoprofenu |
| 2,5 mm końcówki zwijacza | Kent Scientific Corporation | SURGI-5016-2 | 2 potrzebne |
| Andis Ion T-Blade Trymer dla zwierząt | Andis | BTF3 | Do golenia futra |
| Roztwór betadyny | Avrio Health Sp. z o.o. | NDC 67618-150-17 | |
| Pleciony jedwabny szew, 5-0 | Teleflex Medical | 106-S | Do szycia skóry |
| Pleciony szew jedwabny, 7-0 | Teleflex Medical | 103-S | Do podwiązywania CCA |
| Camera | Med Associates, Inc | VID-CAM-MONO-7 | Do walidacji modelu |
| Fisherbrand | 12-541-012 | Do walidacji modelu | |
| cresyl fioletowy | Thermo Scientific | C581-25 | Do walidacji modelu |
| Końcówka dozująca, igła, flex, 34 Gauge, 1/4" OAL | Jensen Global | JG34-0.25HPX | Dla lewego CCA |
| DSIStudio | https://dsi-studio.labsolver.org; do analizy danych DTI | ||
| Pęseta Dumont; Wzór #1 | Roboz Surgical Instrument Co | RS-4960 | 2 potrzebne |
| Pęsety Dumont; Wzór # 5, Kąt 45 stopni | Roboz Instrument chirurgiczny Co | RS-5058 | 2 potrzebne |
| Etanol | Fisher Scientific | 64-17-5 | Rozcieńczony do 70% |
| glikolu etylenowego | Thermo Scientific | E178-4 | Do walidacji modelu |
| Igła do oczu, rozmiar # 4; Koło 3/8, krawędź tnąca, długość cięciwy 11 mm | Roboz Instrument chirurgiczny Co | RS-7981-4 | Do szycia skóry |
| E-Z Anestezjologia Klasyczny system | Systemy EZ | EZ-7000 | |
| glicerol | Thermo Scientific | AAA16205AP | Do walidacji modelu |
| Hometermiczny system monitorowania | Bioscience | K 022258 | |
| System obrazowania EVOS FL Auto | Life Technologies | AMAFD2000 | Do walidacji modelu |
| Isoflurane | Covetrus | 11695-6777-2 | |
| Ketoprofen | Zoetis | 5487 | |
| Leica M320 F12 mikroskop kliniczny i chirurgiczny | Leica | M320 F12 | |
| Krem z lidokainą i prylokainą, USP 2.5%/2.5% | Padagis | NDC 0574-2042-30 | Generyczny do kremu EMLA |
| węglan litu | Thermo Scientific | L119-500 | Do walidacji modelu |
| Luxol fast blue | Thermo Scientific | AC212170250 | Do walidacji modelu |
| Preparaty mikroskopowe | Fisherbrand | 12-550-403 | Do walidacji modelu |
| Mikrotom Leica | SM2010R | Do walidacji modelu | |
| Labirynt wodny Morris z ukrytą platformą | Inżynierowie labiryntu | https://maze.conductscience.com/portfolio/morris-water-maze/ | |
| M-Prove Przenośna waga | Sartorius | AY711 | Waga do rezonansu magnetycznego myszy |
| z ParaVision 6.0.1 | Bruker | AV3HD 9.4T | Do walidacji modelu |
| Przepływomierz wielogazowy | Aalborg Instruments | GMR2-010334 | do mieszania gazów o niskim natężeniu przepływu (N2O i O2) |
| Igły do wstrzykiwaczy Nano Ultra Fine - 32G 4mm | BD | 58320883 | Dla odpowiedniego CCA |
| OCT | Thermo Scientific | 23-730-571 | Do walidacji modelu |
| Paraformaldehyd, 4% | Thermo Scientific | J61899. AK | Do walidacji modelu |
| PBS | Thermo Scientific | BP399500 | Do walidacji modelu |
| System PeriCam PSI z uchwytem sondy Aperiflux | Perimed Inc | PeriCam PSI HR | Do walidacji modelu |
| permount | Thermo Scientific | SP15-100 | Do walidacji modelu |
| Kleszcze z okrągłym uchwytem; Mikro szycie z platformą do wiązania; Zakrzywiony | instrument chirurgiczny Roboz Co | RS-5264 | Aby pomóc w cięciu i zszywaniu skóry |
| Lampa grzewcza dla małych zwierząt, 75 W | Morganville Scientific | HL0100 | Do walidacji modelu |
| Małe aplikatory z bawełnianą końcówką Nożyczki | Fisher Scientific | 23-400-118 | |
| - 8mm Cutting Edge | Fine Science Tools | 15024-10 | |
| Uczennica Halsey Uchwyt igły | Narzędzia do nauki precyzyjnej | 91201-13 | Potrzebne 3: 2 do przytrzymywania zwijaczy skóry i 1 do szycia skóry |
| Sacharoza | Thermo Scientific | A15583.36 | Do walidacji modelu |
| Uniwersalny uchwyt sufitowy do kamery | Med Associates, Inc | ENV-598 | Do walidacji modelu |
| kąpiel wodna | VWR | 89032-226 | Do walidacji modelu |
Bibliografia
- Tuo, Q. Z., Zou, J. J., Lei, P. Rodent models of vascular cognitive impairment. J Mol Neurosci. 71 (5), 1-12 (2021).
- Zhou, Z., et al. Deeper cerebral hypoperfusion leads to spatial cognitive impairment in mice. Stroke Vasc Neurol. 7 (6), 527-533 (2022).
- Shibata, M., Ohtani, R., Ihara, M., Tomimoto, H. White matter lesions and glial activation in a novel mouse model of chronic cerebral hypoperfusion. Stroke. 35 (11), 2598-2603 (2004).
- Hattori, Y., et al. A novel mouse model of subcortical infarcts with dementia. J Neurosci. 35 (9), 3915-3928 (2015).
- Janson, J., et al. Increased risk of type 2 diabetes in Alzheimer disease. Diabetes. 53 (2), 474-481 (2004).
- Herzig, M. C., et al. Abeta is targeted to the vasculature in a mouse model of hereditary cerebral hemorrhage with amyloidosis. Nat Neurosci. 7 (9), 954-960 (2004).
- Miao, J., et al. Cerebral microvascular amyloid beta protein deposition induces vascular degeneration and neuroinflammation in transgenic mice expressing human vasculotropic mutant amyloid beta precursor protein. Am J Pathol. 167 (2), 505-515 (2005).
- Moechars, D., et al. Early phenotypic changes in transgenic mice that overexpress different mutants of amyloid precursor protein in brain. J Biol Chem. 274 (10), 6483-6492 (1999).
- Wallays, G., et al. Notch3 Arg170Cys knock-in mice display pathologic and clinical features of the neurovascular disorder cerebral autosomal dominant arteriopathy with subcortical infarcts and leukoencephalopathy. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 31 (12), 2881-2888 (2011).
- Cognat, E., Cleophax, S., Domenga-Denier, V., Joutel, A. Early white matter changes in CADASIL: evidence of segmental intramyelinic oedema in a pre-clinical mouse model. Acta Neuropathol Commun. 2, 49(2014).
- Weng, Z., et al. A novel needle mouse model of vascular cognitive impairment and dementia. J Neurosci. 43 (44), 7351-7360 (2023).
- Biesbroek, J. M., Biessels, G. J. Diagnosing vascular cognitive impairment: Current challenges and future perspectives. Int J Stroke. 18 (1), 36-43 (2023).
- Winklewski, P. J., et al. Understanding the physiopathology behind axial and radial diffusivity changes-what do we know. Front Neurol. 9, 92(2018).
- Jing, Z., et al. Neuronal NAMPT is released after cerebral ischemia and protects against white matter injury. J Cereb Blood Flow Metab. 34 (10), 1613-1621 (2014).
- Yang, S. T., et al. Adult mouse venous hypertension model: common carotid artery to external jugular vein anastomosis. J Vis Exp. (95), e50472(2015).
- Speetzen, L. J., Endres, M., Kunz, A. Bilateral common carotid artery occlusion as an adequate preconditioning stimulus to induce early ischemic tolerance to focal cerebral ischemia. J Vis Exp. (75), e4387(2013).
- Lee, D., et al. A murine model of ischemic retinal injury induced by transient bilateral common carotid artery occlusion. J Vis Exp. (165), (2020).
- Schleimer, K., et al. Training a sophisticated microsurgical technique: interposition of external jugular vein graft in the common carotid artery in rats. J Vis Exp. (69), e4124(2012).
- Speetzen, L. J., Endres, M., Kunz, A. Bilateral common carotid artery occlusion as an adequate preconditioning stimulus to induce early ischemic tolerance to focal cerebral ischemia. J Vis Exp. (75), e4387(2013).
- Barone, F. C., Knudsen, D. J., Nelson, A. H., Feuerstein, G. Z., Willette, R. N. Mouse strain differences in susceptibility to cerebral ischemia are related to cerebral vascular anatomy. J Cereb Blood Flow Metab. 13 (4), 683-692 (1993).
- Wellons, J. C., et al. A comparison of strain-related susceptibility in two murine recovery models of global cerebral ischemia. Brain Res. 868 (1), 14-21 (2000).
- Cao, G., et al. In Vivo delivery of a Bcl-xL fusion protein containing the TAT protein transduction domain protects against ischemic brain injury and neuronal apoptosis. J Neurosci. 22 (13), 5423-5431 (2002).
Przedruki i uprawnienia
