Solidna izolacja mitochondriów z tkanki serca gryzoni

Podsumowanie

Badania bioenergetyczne i metabolomiczne mitochondriów ujawniły ich wieloaspektową rolę w wielu chorobach, ale metody izolacji tych organelli są różne. Opisana tutaj metoda jest w stanie oczyścić wysokiej jakości mitochondria z wielu źródeł tkankowych. Jakość określa się na podstawie współczynników kontroli oddechu i innych wskaźników ocenianych za pomocą respirometrii o wysokiej rozdzielczości.

Streszczenie

Izolacja mitochondrialna jest praktykowana od dziesięcioleci, zgodnie z procedurami ustanowionymi przez pionierów w dziedzinie biologii molekularnej i biochemii do badania zaburzeń metabolicznych i chorób. Stała jakość mitochondriów jest niezbędna do prawidłowego zbadania fizjologii mitochondriów i bioenergetyki; Jednak dla badaczy dostępnych jest wiele różnych opublikowanych metod izolacji. Chociaż różne strategie eksperymentalne wymagają różnych metod izolacji, podstawowe zasady i procedury są podobne. Protokół ten szczegółowo opisuje metodę zdolną do ekstrakcji dobrze sprzężonych mitochondriów z różnych źródeł tkanek, w tym małych zwierząt i komórek. Przedstawione kroki obejmują sekcję narządów, oczyszczanie mitochondriów, kwantyfikację białek i różne kontrole jakości. Podstawowym wskaźnikiem kontroli jakości używanym do identyfikacji mitochondriów wysokiej jakości jest współczynnik kontroli oddechowej (RCR). RCR to stosunek częstości oddechów podczas fosforylacji oksydacyjnej do szybkości przy braku ADP. Omówiono alternatywne wskaźniki. Chociaż za pomocą tego protokołu uzyskuje się wysokie wartości RCR w stosunku do ich tkankowego źródła, kilka kroków można zoptymalizować w celu dopasowania do indywidualnych potrzeb badaczy. Procedura ta jest solidna i konsekwentnie prowadzi do powstania izolowanych mitochondriów z ponadprzeciętnymi wartościami RCR w modelach zwierzęcych i źródłach tkankowych.

Wprowadzenie

Mitochondria to subkomórkowe organelle, które tworzą cytoplazmatyczne warunki energetyczne zoptymalizowane pod kątem określonych funkcji komórki. Podczas gdy badania na poziomie komórek, tkanek i organizmów mogą dostarczyć informacji na temat funkcji mitochondriów, izolacja organelli zapewnia poziom kontroli eksperymentalnej, który nie jest możliwy w inny sposób. Izolacje mitochondrialne są wykonywane od 1940 roku, umożliwiając mechanistyczne badania metabolizmu i oddychania w różnych komórkach i tkankach^1,2. Historyczne znaczenie mitochondriów jest również dobrze udokumentowane³. Jako główni producenci ATP, mitochondria odgrywają wiele kluczowych ról, które są niezbędne dla optymalnego funkcjonowania komórek i narządów⁴. W macierzy mitochondrialnej substraty są utleniane w cyklu TCA, wytwarzając redukujące odpowiedniki i ruchome nośniki elektronów, takie jak NADH i UQH₂^5,6. Cytochrom C jest trzecim głównym ruchomym nośnikiem elektronów w mitochondrialnej sieci reakcji biochemicznych⁷. Cząsteczki te są następnie utleniane przez kompleksy transbłonowe systemu transportu elektronów (ETS) osadzone w wewnętrznej błonie mitochondrialnej⁸. Reakcje redoks ETS są sprzężone z translokacją protonów z matrycy do przestrzeni międzybłonowej. Procesy te ustanawiają elektrochemiczny gradient protonów, który jest używany do fosforylacji ADP za pomocą Pi przez syntazę F₁F₀ ATP w celu wytworzenia ATP^9,10. Poszczególne procesy zachodzące w każdym kompleksie można badać za pomocą respirometrii o wysokiej rozdzielczości przy użyciu elektrod typu Clark lub testów zużycia tlenu na mikropłytkach^11,12. Ponadto modele chorób i terapie wykorzystujące izolowane mitochondria mogą określić wpływ lub znaczenie funkcji mitochondriów w postępie niektórych patologii. Okazało się to owocne w dziedzinie kardiologii, gdzie zmiany w dostarczaniu paliwa i substratu zostały wykorzystane do wyjaśnienia, w jaki sposób dysfunkcja mitochondriów wpływa na niewydolność serca^13,14,15,16. Wiadomo również, że mitochondria wpływają na rozwój innych stanów chorobowych, takich jak cukrzyca, rak, otyłość, zaburzenia neurologiczne i miopatie^17,18. W związku z tym zastosowanie wyizolowanych lub oczyszczonych mitochondriów umożliwia mechanistyczne badania metabolizmu oksydacyjnego i produkcji ATP w tkance źródłowej.

Nie brakuje protokołów izolacji mitochondriów ze względu na ich znaczenie w badaniach bioenergetycznych. Ponadto można znaleźć wysoce specyficzne metody dostosowane do subpopulacji mitochondriów w tkankach i komórkach^19,20. Podstawowe etapy proceduralne są podobne między metodami izolacji, ale można wprowadzić zmiany w składzie bufora, etapach homogenizacji i wirowaniu w celu poprawy ilości i jakości mitochondriów. Zmiany w tych aspektach opierają się na zapotrzebowaniu metabolicznym tkanki, ogólnej funkcji narządów, gęstości mitochondriów i innych czynnikach. W tkankach takich jak wątroba i mięśnie szkieletowe stosuje się ręczne homogenizatory w celu zachowania integralności mitochondriów i ograniczenia uszkodzeń błon mitochondrialnych²¹. Jednak w przypadku izolacji od nerek niektóre protokoły sugerują użycie ręcznej homogenizacji lub komercyjnych zestawów w celu uzyskania lepszych wyników²². Chociaż obie metody dają funkcjonalne mitochondria, jakość organelli może zostać zagrożona przez dodatkowy czas potrzebny na ukończenie izolacji przy użyciu tych protokołów. Wirowanie jest również niezbędne do ekstrakcji białka mitochondrialnego, ponieważ oddziela składniki komórkowe, takie jak jądra i inne organelle, od mitochondriów²³. Podczas procesu izolacji zastanawia się, czy należy zastosować wirowanie różnicowe, czy oparte na gęstości, aby uzyskać czystsze izolaty²⁴. Podczas gdy wirowanie gęstości może oddzielić mitochondria od organelli o podobnym ciężarze właściwym, takich jak peroksysomy, nie jest dobrze ustalone, czy mitochondria z tych metod lepiej reprezentują funkcję organelli in situ w porównaniu z mitochondriami wyizolowanymi za pomocą wirowania różnicowego. W dziedzinie fizjologii mitochondriów preferowane jest wirowanie oparte na gęstości i można je łatwo zmienić w celu zwiększenia czystości izolatu. Przed eksperymentami należy rozważyć, czy zmiany sił g, czasu wirowania i liczby spinów wirowania są uwzględniane ze względu na ich wpływ na oczyszczanie mitochondriów. Co więcej, resuspension mitochondriów, prawdopodobnie najważniejszy etap podczas izolacji, różni się znacznie między badaniami, z zastosowaniem skrobania, mieszania na bazie wirów lub homogenizacji^23,25,26. Mechaniczne ponowne zawieszenie tego typu może być zbyt ścierne i naruszać integralność błony mitochondriów. Z tego powodu należy przeprowadzić delikatne mycie, aby to skorygować. Pomimo mnogości modulacji i sugerowanych metodologii, istnieje mniej kompleksowych protokołów o wysokiej odtwarzalności i zdolności adaptacyjnych dla modeli gryzoni.

Metody opisane tutaj opisują szczegółowy, solidny i wysoce powtarzalny protokół, który daje oczyszczone, dobrze sprzężone mitochondria z tkanki serca małych zwierząt. Jak wykazano, metodę tę można łatwo dostosować do specyficznych potrzeb każdego eksperymentu i/lub środowiska laboratoryjnego w zakresie izolowania mitochondriów od nerek, wątroby i hodowanych komórek. Dalsze modyfikacje można wprowadzić w celu wyizolowania mitochondriów z tkanek i innych zwierząt niewymienionych tutaj. Dostępne są receptury używane dla wszystkich izolacji, które w razie potrzeby mogą być modyfikowane. Podobnie jak w przypadku innych opublikowanych protokołów, wdraża się homogenizację zmotoryzowaną i wirowanie różnicowe; Jednak w zależności od źródła izolacji dokonuje się korekt zarówno czasu ścinania, jak i siły, z jaką próbki są odwirowywane, aby konsekwentnie dostarczać wysokiej jakości izolaty mitochondrialne. Warto zauważyć, że protokół ten różni się od innych tym, że wykorzystuje delikatne mycie za pomocą pipetowania w celu ponownego zawieszenia granulowanych mitochondriów, co pomaga zachować integralność błony mitochondrialnej i utrzymać ogólną funkcjonalność organelli. Białko mitochondrialne określa się ilościowo albo przez oznaczenie całkowitego białka, albo przez pomiar aktywności syntazy cytrynianu. Użyteczność i szerokie zastosowanie tej metody izolacji są dodatkowo poparte wartościami współczynników kontroli oddechowej (RCR) uzyskanymi w różnych organizmach i źródłach tkankowych.

Protokół

Użytkowanie i leczenie wszystkich kręgowców zostało przeprowadzone zgodnie z zatwierdzonymi protokołami, sprawdzonymi i zaakceptowanymi przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) na Uniwersytecie Stanowym Michigan. Protokół ten został opracowany przy użyciu zarówno samców, jak i samic świnek morskich albinosów Hartley oraz szczurów Sprague Dawley (SD). W celu wyizolowania mitochondriów sercowych od świnek morskich zwierzęta uśmierano w wieku od 4 do 6 tygodni (300-450 g). Mitochondria serca od szczurów SD obu płci uzyskano w wieku 10-13 tygodni (250-400 g). Przepisy na są opisane w tabeli 1 i powinny być przygotowane z wyprzedzeniem. Szczegółowe informacje na temat odczynników i sprzętu użytego w tym badaniu znajdują się w Tabeli materiałów.

1. Przygotowanie eksperymentalne

1. Przed rozpoczęciem izolacji oznacz dwie probówki wirówkowe o pojemności 50 ml jako "Spiny 1 i 2" oraz "Wirowanie 3".
2. Na lodzie umieścić probówki, świeżo rozmrożony bufor izolacyjny (IB), ostre nożyczki do mielenia mięsa, zmontowaną sondę homogenizacyjną i zlewkę o pojemności 5 ml lub pojemnik o równoważnej wielkości.
3. Umieść świeżo rozmrożony bufor oddechowy (RB) w inkubatorze, aby się ogrzał do kolejnych testów oddechowych.
4. Wstępnie schłodzić wirówkę z chłodzeniem do temperatury 4 °C.
5. Upewnij się, że cały sprzęt jest ułożony i 20 μl proteazy 7-15 U/mg z Bacillus licheniformis zostało dodane do probówki oznaczonej "Spiny 1 i 2".
6. Skonfiguruj zależny od grawitacji system ciśnieniowy do perfuzji przez kaniulację za pomocą buforu Cardioplegia (CB, Tabela 1), szklanej kaniuli i plastikowej rurki z dołączonym zaworem odcinającym.
7. Ułóż narzędzia chirurgiczne i dołącz odpowiednie nożyczki i kleszcze do preparowania i kaniulacji serca.
   UWAGA: Cała woda powinna być czystej jakości (18,2 MΩ·cm)

2. Sekcja tkanek

1. Zwierzętom wstrzykiwać jałowy siarczan heparyny dootrzewnowo w dawce 500 j./kg.
2. Pozostawić zwierzę w komorze indukcyjnej na 15 minut po podaniu heparyny. W tym czasie należy dostarczyć 2 l/min czystego gazu_O2, aby w pełni natlenić zwierzęta, uspokoić je i zminimalizować stres, który może mieć niekorzystne konsekwencje dla tkanki będącej przedmiotem zainteresowania.
3. Indukcję znieczulenia należy rozpocząć od ciągłego przepływu izofluranu w stężeniu 0,5%. Po 1 minucie zwiększ do 1%. Kontynuujzwiększaj o 1% co minutę, aż zostanie osiągnięte 5%. Po osiągnięciu 5% odczekaj 1 minutę i monitoruj wzorzec oddychania zwierzęcia.
4. Gdy oddech zwolni i stanie się ciężki (mniej więcej po 6,5 minuty), wyłącz przepływ izofluranu i tlenu.
5. Szybko wyjmij zwierzę z komory indukcyjnej i sprawdź, czy jest odpowiednia głębokość znieczulenia, ściskając łapę i sprawdzając, czy nie ma odruchu rogówkowego. Jeśli zwierzę zareaguje na którykolwiek z bodźców, umieść je z powrotem w komorze indukcyjnej, przeczytajpodać znieczulenie i powtórz kontrolę głębokości znieczulenia.
6. Po osiągnięciu odpowiedniej głębokości znieczulenia należy szybko odciąć głowę gilotyną, aby zranić kręgosłup szyjny i położyć leżące ciało na lodzie.
7. Wykonaj dwa równoległe pionowe nacięcia od obojczyków biegnące wzdłuż bocznej klatki piersiowej w dół klatki piersiowej. Upewnij się, że nacięcia są wystarczająco głębokie, aby przeciąć żebra po bocznej stronie klatki piersiowej, ale unikaj uszkadzania struktur wewnątrz klatki piersiowej, takich jak serce lub duże naczynia.
   UWAGA: Rozmiary pionowych nacięć zależą od użytego zwierzęcia. Jeśli używasz świnek morskich i szczurów, przytnij do przepony (około 6,35 cm dla szczurów i 11 cm dla świnek morskich). Jeśli używasz myszy, wykonaj standardową torakotomię²⁷.
8. Odsłoń serce za pomocą hemostatu, aby przemieścić przednią część klatki piersiowej i wypełnij odsłoniętą klatkę piersiową lodem. Ten krok minimalizuje czas ciepłego niedokrwienia i zwiększa żywotność wyizolowanych organelli.
9. Użyj pęsety, aby tępo wypreparować grasicę i osierdzie oraz całkowicie odsłonić serce.
10. Za pomocą kleszczy zastosuj delikatną dolną trakcję na sercu, aby odsłonić i zidentyfikować aortę. Aorta jest najgrubszym dużym naczyniem rozgałęziającym się od podstawy serca. Inne duże naczynia, takie jak żyła płucna, są zauważalnie bardziej przezroczyste niż aorta.
11. Przetnij aortę około 4-6 mm powyżej korzenia aorty, ale poniżej punktów rozgałęzień tętnicy szyjnej.
12. Kanalenuj aortę i perfunduj serce^28,29 lodowatym roztworem kardioplegii (CB) za pomocą zależnej od grawitacji głowicy ciśnieniowej, aż tętnice wieńcowe zostaną oczyszczone z krwi, a narząd stanie się zblednięty.
    UWAGA: W przypadku dużych gryzoni dobrze sprawdza się średnica kaniuli 1,8-2,2 mm, natomiast w przypadku mniejszych gryzoni zalecany jest zakres średnic 1,4-1,8 mm. Retroperfuzja nie powinna trwać dłużej niż 15-30 sekund, aby naczynia wieńcowe oczyściły się z krwi.
13. Odizoluj mięsień sercowy komory, wycinając przedsionki, chrzęstną tkankę zastawkową i tkankę tłuszczową.
14. Umieść komory we wstępnie schłodzonej zlewce o pojemności 10 ml zawierającej 0,1-0,2 ml lodowatego IB.
15. Zmiel tkankę ostrymi nożyczkami chirurgicznymi, aż kawałki będą miały około 1 mm³.

3. Oczyszczanie mitochondriów i kwantyfikacja białek

1. Przenieść zmieloną tkankę do wstępnie schłodzonej probówki wirówkowej oznaczonej jako "Spiny 1 i 2" zawierającej roztwór proteazy.
2. Dodaj lodowaty IB do końcowej objętości 25 ml.
3. Za pomocą zmotoryzowanego ręcznego homogenizatora wirnikowo-stojanowego rozprowadź tkankę z prędkością 18 000 obr./min na lodzie przez 20-25 s.
4. Odwirować homogenizowaną tkankę w probówce oznaczonej jako "Spiny 1 i 2" przy 8 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
5. Odrzucić supernatant (który zawiera proteazę), wlewając go do pojemnika na odpady i delikatnie przepłukać osad 5 ml IB w celu usunięcia pozostałości proteazy.
6. Po wyrzuceniu płukania, ponownie zawiesić osad ze świeżym, lodowatym IB do końcowej objętości 25 ml za pomocą delikatnego wiru.
7. Wirować przy 800 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
8. Usuń supernatant (zawiera mitochondria), delikatnie wlewając go do wstępnie schłodzonej probówki o pojemności 50 ml oznaczonej "Spin 3". Podczas nalewania należy uważać, aby nie przesunąć luźnej górnej części granulki. Alternatywnie do pobrania supernatantu można użyć pipety transferowej lub stripette.
9. Odwirować supernatant o stężeniu 8000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
10. Odrzucić powstały supernatant i zachować osad zawierający mitochondria.
11. Użyj niestrzępiącej się chusteczki, aby wchłonąć nadmiar supernatantu z wewnętrznej ścianki probówki, uważając, aby nie naruszyć osadu. Przechowywać granulki w temperaturze 4 °C na lodzie tak długo, jak to możliwe.
12. Aby ponownie zawiesić mitochondria, dodaj 80 μl lodowatego IB na dno probówki. Delikatnie zawiesić osad, wielokrotnie myjąc IB nad osadem.
13. Aby uniknąć tworzenia się pęcherzyków, ustaw mikropipetę na zasysanie i dostarczanie od 40 do 60 μl objętości.
14. W miarę rozpraszania się osadu mitochondrialnego należy zwiększyć objętość mikropipety, aby skutecznie zawiesić granulowane mitochondria. Unikaj dotykania granulki końcówką pipety i unikaj tworzenia pęcherzyków.
15. Po ponownym zawieszeniu przenieś mitochondria do wstępnie schłodzonej probówki mikrowirówkowej i oznacz ją jako mitochondria podstawowe. Zanotuj całkowitą objętość ponownego zawieszenia.
16. Aby określić stężenie białka mitochondrialnego w próbce, należy przeprowadzić test białka całkowitego przy użyciu dobrze znanych testów białkowych BCA lub Bradforda, zgodnie z instrukcjami producenta.
    UWAGA: Alternatywną lub uzupełniającą strategią oceny plonu jest określenie aktywności syntazy cytrynianu. Dla porównania, zawartość mitochondriów można określić ilościowo, postępując zgodnie z protokołem opisanym w Vinnakota et al.³⁰.

4. Kontrole jakości

1. We wstępnie schłodzonej probówce do mikrowirówek rozcieńczyć materiał mitochondrialny do pożądanego stężenia roboczego za pomocą IB.
   UWAGA: Zapasy mitochondrialne rozcieńcza się do 40 mg / ml, aby działały przy końcowym stężeniu 0,1 mg / ml do testów respirometrycznych przy użyciu izolatów z tkanki serca.
2. Przepłukać komory oksygraficzne, korki i strzykawki mikrolitrowe dziesięć razy wodą destylowaną, aby je wyczyścić przed użyciem w testach respirometrycznych.
3. Aby przetestować żywotność i jakość izolatów mitochondrialnych, należy załadować 2,3 ml buforu oddechowego (RB) do komór oksygraficznych i pozwolić, aby sygnał zużycia tlenu zrównoważył się w temperaturze 37 °C przez około 10 minut lub gdy szybkość jest bliska 0.
4. Po wyrównaniu sygnału należy wcisnąć korki i zassać nadmiar bufora, który wyłania się z kapilary korka
.
5. Dodać 1 mM EGTA za pomocą mikrolitrowej strzykawki, aby chelatować resztki wapnia w lub próbce mitochondrialnej.
6. Aby wspomóc oddychanie, dodaj 5 mM pirogronianu sodu i 1 mM L-jabłczanu.
7. Po dodaniu substratów dodać bolus rozcieńczonych mitochondriów, aby osiągnąć stężenie robocze i umożliwić oddychanie przez 5 minut. Okres ten określa się mianem LEAK lub oddychania w stanie 2.
8. Po 5 minutach dodaj bolus 500 μM ADP, aby zainicjować oddychanie w stanie 3, zwanym również OXHPOS, i pozwól mitochondriom oddychać aż do niedotlenienia.
9. Oblicz współczynnik kontroli oddechowej (RCR), dzieląc maksymalną szybkość zużycia tlenu w stanie 3 przez szybkość zużycia tlenu tuż przed dodaniem ADP w stanie 2 (patrz Rysunek 1).
   UWAGA: Alternatywne wyrażenie RCR od 1 do 1/RCR może być również używane jako metryka jakości, która jest ograniczona między 0 a 1; jednak utrudnia to rozróżnienie jakości za pomocą tej metryki, gdy RCR > 10 (patrz Rysunek 2).
10. Przepłukać komory i korki 10 razy czystą wodą, aby oczyścić oksygraf do kolejnych testów. Jeśli respirometria jest zakończona, napełnij komory 70% etanolem i umieść korki w komorach do następnego użycia.

Wyniki

Po zakończeniu izolacji mitochondrialnej, jakość i funkcjonalność izolatów powinna być testowana poprzez ilościowe określanie zużycia tlenu (J_O2) za pomocą respirometrii o wysokiej rozdzielczości. W tym celu zapasy mitochondrialne rozcieńczono do 40 mg/ml, aby umożliwić uzyskanie stężeń roboczych 0,1 mg/ml w 2 ml RB dla wszystkich testów respirometrycznych z użyciem izolowanych mitochondriów serca. Oddychanie było zasilane 5 mM pirogronianu sodu i 1 mM L-jabłczanu w obecności 1 mM EGTA, chelatora wapnia, i pozostawiono do równowagi przez 5 minut w celu ustalenia stanu oddychania 2. W tym stanie tempo zużycia tlenu powinno wynosić średnio 45-55 pmol/mL/s lub 27-33 nmol/mg/min. Należy pamiętać o wskaźniku zużycia tlenu zależnym od elektrody i w razie potrzeby wykonać odpowiednie korekty tła. Fosforylacja oksydacyjna (stan 3) jest inicjowana po 5 minutach przez bolus 500 μM ADP. Dodawanie substratów i śledzenie reprezentatywne są szczegółowo opisane w Rysunek 1. Funkcjonalne mitochondria będą miały natychmiastowy wzrost J_O2 po dodaniu ADP, który waha się w zależności od źródła tkanki, jak pokazano na Rysunek 2. Bez użycia EGTA, resztkowy wapń ma zmienny wpływ na maksymalne dawki J_O2 podczas OXPHOS, w zależności od stężenia mitochondriów, dostępności substratu i innych czynników środowiskowych. Skład buforowy jest ważny dla zachowania integralności i funkcjonalności błony mitochondrialnej. Wszystkie receptury wymienione w całym protokole są bardziej szczegółowo opisane w Tabeli 1 i mogą być stosowane we wszystkich preparatach mitochondrialnych opisanych w niniejszym dokumencie.

Pomyślne wyizolowanie mitochondriów oznacza uzyskanie wartości RCR, które mieszczą się w podanym zakresie dla każdego gatunku i źródła tkanki, jak pokazano w Tabeli 2. Na podstawie danych zebranych przy użyciu tego protokołu, w przypadku izolowania mitochondriów serca od świnek morskich, szczurów lub myszy, RCR powinny wynosić odpowiednio ≥16, ≥8 i ≥5. W przypadku izolacji z wątroby lub nerki szczura RCR powinny wynosić ≥6, podczas gdy RCR z komórek są uważane za dopuszczalne, jeśli przekraczają 3,8. Jeśli wartości RCR spadną poniżej tych zakresów lub jeśli występują różnice jakościowe w śledztwach respirometrycznych, zaleca się wykonanie dodatkowego testu z nowymi RB i substratami w celu wykluczenia problemów wynikających z zanieczyszczenia. Chociaż transformacja 1-1/RCR ogranicza wartości z zakresu od 0 do 1, ta metryka nie jest zalecana w przypadku porównywania jakości mitochondriów między płciami lub gatunkami, gdy wartość RCR jest większa niż 10. Z tego powodu standardowe wartości RCR (stan 3/stan 2 lub OXPHOS/LEAK) zostały określone ilościowo podczas wszystkich eksperymentów. Informacje dotyczące modulacji, które można wprowadzić do tego protokołu, aby lepiej wyizolować mitochondria od serc, wątroby, nerek i komórek myszy, są szczegółowo opisane w Tabeli 3.

Rysunek 1: Obszary zainteresowania do kontroli jakości za pomocą respirometrii o wysokiej rozdzielczości. Komory oddechowe załadowano 2 ml RB i pozostawiono do zrównoważenia w temperaturze 37 °C, aż szybkość zużycia tlenu zbliżyła się do 0. Po zrównoważeniu dodano 1 mM EGTA, chelator wapnia, wraz z 5 mM pirogronianu sodu i 1 mM L-jabłczanu. Po dodaniu tych substratów mitochondria dodano w pożądanym stężeniu roboczym (0,1 mg/ml) i pozostawiono do oddychania przez 5 minut, aby osiągnąć stan oddychania 2 (żółty). Po 5 minutach dodano 500 μM ADP, aby zainicjować oddychanie w stanie 3 (czerwony). RCR określono na podstawie uśrednienia w czasie wskaźników zużycia tlenu oznaczonych czerwonymi i żółtymi polami, aby porównać stan 3 ze stanem 2. Stan 4 jest oznaczony zielonym polem i reprezentuje okres pozamitochondrialnej hydrolizy ATPazy ATP i może być wykorzystany do oceny integralności błony zewnętrznej w testach cytochromu C. Wyświetlane dane zostały zebrane przy użyciu mitochondriów serca szczura SD. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Reprezentatywne ślady J_O2 i współczynniki kontroli oddechowej w źródłach zwierzęcych i tkankowych. Jakość izolowanych mitochondriów badano poprzez ilościowe określanie wskaźników zużycia tlenu za pomocą respirometrii o wysokiej rozdzielczości. Oddychanie było napędzane 5 mM pirogronianu sodu i 1 mM L-jabłczanu w obecności 1 mM EGTA. Mitochondria i substraty pozostawiono do oddychania przez 5 minut, aby oddech w stanie 2 się ustabilizował. Maksymalne wskaźniki zużycia tlenu po dodaniu ADP porównano ze wskaźnikami zużycia tlenu w stanie 2 przed ADP w celu obliczenia współczynników kontroli oddechowej (RCR) dla każdej tkanki. Jakość mitochondriów poddano dalszej ocenie poprzez obliczenie wartości 1-1/RCR scharakteryzowanych przez normy skuteczności kontroli P-L. Wykresy słupkowe po prawej stronie każdego śladu oznaczają średnie wartości RCR dla mężczyzn (niebieski) i samic (zielony) oraz 1-1/RCR ± SD dla danej tkanki. (A), (B) i (C) odnoszą się do danych zebranych odpowiednio przy użyciu świnek morskich, szczurów Sprague Dawley (SD) i serc myszy z wirusem białaczki Friend (FVB). (D) i (E) szczegółowe wyniki z wątroby i nerek szczura SD, podczas gdy (F) odnosi się do komórek HEK293. Pobrano trzy większe płaty wątroby, podczas gdy obie nerki wykorzystano do izolacji. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Tabela 1: Receptury. Bufor do kardioplegii (CB), bufor izolacyjny (IB) i bufor oddechowy (RB) stosowane w całym procesie izolacji należy przygotować z wyprzedzeniem zgodnie z podanymi instrukcjami. CB może być przechowywany przez okres do miesiąca w temperaturze 4 °C, natomiast IB i RB mogą być przechowywane przez 4 miesiące w temperaturze -80 °C. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Tabela 2: Analiza współczynnika kontroli oddechu. Izolację mitochondriów do analiz funkcjonalnych przeprowadzono w szerokim zakresie gatunków i źródeł tkankowych, zarówno samców, jak i samic gryzoni, a także komórek HEK293. Wielkość próby dla każdej płci, źródła tkanki i gatunku jest szczegółowo opisana wraz ze średnimi wartościami RCR i 1-1/RCR ± SD. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Tabela 3: Zalecane modulacje protokołu izolacji mitochondriów dla różnych tkanek w celu zwiększenia wydajności białka. Zmiany w ilości proteazy i wirowania są wyświetlane w zależności od źródła tkanki. Średnie ilości białka całkowitego (mg) obliczono na podstawie wyników testu białka BSA i objętości repozycji końcowej osadu mitochondrialnego. Wartości są podawane jako średnia ± SD. Pogrubione instrukcje zawarte w kolumnie wirowania informują, czy należy odrzucić, zachować czy połączyć supernatant. Odrzucanie odnosi się do unieszkodliwiania supernatantu w pojemniku na odpady biologiczne, podczas gdy zatrzymywanie i łączenie odnoszą się odpowiednio do przeniesienia supernatantu do następnej probówki wirówkowej lub zebrania go do końcowego wirowania. Więcej szczegółów na temat zmian w protokole można znaleźć w sekcji dyskusji. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Dyskusja

Przestrzeganie metod zwięźle opisanych w tym protokole zapewni izolację dobrze sprzężonych mitochondriów z tkanki serca małych gryzoni, a także innych typów tkanek i źródeł. Ogólnie rzecz biorąc, proces powinien trwać łącznie 3-3,5 godziny, podczas których wszystkie tkanki zwierzęce, próbki i izolaty powinny pozostać na lodzie w temperaturze 4 °C w jak największym stopniu, aby ograniczyć degradację. Ta procedura jest solidna i może być zmieniona na kilka sposobów, aby lepiej dopasować się do celów eksperymentalnych i wykorzystywanych modeli. Jedną z modulacji, którą można wykonać podczas procesu rozwarstwiania tkanki, jest wykluczenie heparyny. Heparyna jest podawana w celu zapobieżenia tworzeniu się skrzepów krwi³¹ , ale nie jest konieczna, jeśli serce jest kaniulowane i perfuzjowane wystarczająco szybko (w ciągu 1,5 minuty od dekapitacji). Ponadto w przypadku większych gryzoni zaleca się perfuzję serca za pomocą CB, dlatego podczas pracy z sercami myszy lub innymi narządami zaleca się włączenie płukania IB przed mieleniem i wstępną homogenizacją. Ten etap pozwala na odrzucenie krwi przeniesionej z procesu preparacji. Inne zmiany obejmują zmiany w prędkościach homogenizacji i wirowania w celu zwiększenia wydajności białka mitochondrialnego. Te opisane powyżej służą do izolowania mitochondriów serca od świnek morskich i szczurów. Co ważne, protokół ten można dostosować do izolowania mitochondriów od wątroby, nerek, serc i komórek myszy gryzoni. Zalecane zmiany objętości proteazy, homogenizacji i wirowania w oparciu o określone typy tkanek i zwierzęta są bardziej szczegółowo opisane w Tabeli 3.

Po utworzeniu oczyszczonego osadu mitochondrialnego z końcowego etapu wirowania, mitochondria należy ponownie zawiesić we wstępnie schłodzonym IB. Objętość dodanego IB zależy od wielkości osadu mitochondrialnego, ale wynosi około 80 μl dla świnek morskich i szczurów. W przypadku izolacji od serc myszy dodaje się 60 μl IB w celu ponownego wymieszania. Podczas pierwszego izolowania mitochondriów zaleca się dodanie mniejszych objętości IB, aby nie rozcieńczać roztworu podstawowego. Ze względu na konsystencję granulek mitochondrialnych powstałych po oczyszczeniu próbek z wątroby i nerek, do ponownego wymieszania należy dodać znacznie mniej IB (20 μL). Inne metody sugerują zastosowanie mechanicznego ponownego zawieszenia poprzez skrobanie, które może być ścierne dla błon mitochondrialnych i zmniejszać ogólną integralność^32,33. Podczas stosowania tego protokołu zaleca się delikatne mycie osadu IB w celu poprawy jakości mitochondriów. Podczas tego procesu należy uważać, aby nie wytwarzać pęcherzyków ani nie naruszać osadu końcówką pipety, ponieważ może to prowadzić do pęknięcia błony i nieprawidłowego fałdowania białka³⁴. Tylko dociśnięcie pipety do pierwszego oporu może pomóc zmniejszyć prawdopodobieństwo tworzenia się pęcherzyków. Delikatne mycie pipetami należy przeprowadzać do momentu, gdy cała osadka znajdzie się w zawiesinie. Całkowita wydajność reprodukcji powinna wynosić 150-200 μl w przypadku mitochondriów serca świnek morskich i szczurów i mieć jasnobrązowy kolor. Bardziej skoncentrowane próbki będą miały ciemniejszy odcień brązu i można je rozcieńczyć, aby dopasować się do pożądanego zakresu stężeń roboczych po ilościowym określeniu białka mitochondrialnego.

Standardowe testy białkowe z wykorzystaniem BSA są optymalne do ilościowego oznaczania białek mitochondrialnych³⁵. Oznaczanie białek powinno być opóźnione i inkubowane przez zalecany czas i temperaturę, zgodnie z protokołem producenta. W przypadku izolowanych mitochondriów inkubacja w temperaturze 37 °C przez 30 minut pozwala na dobrze rozprowadzone opracowanie koloru i dokładną ocenę ilościową białka. Podczas ilościowego określania całkowitej ilości białka zaleca się najpierw rozcieńczenie zawieszonych mitochondriów i IB w proporcjach 1:50, 1:100 i 1:200, aby upewnić się, że wyniki testu białka będą mieścić się w zakresie kalibracyjnym. Dalsze szczegóły dotyczące sposobu przeprowadzania testów białek przy użyciu BSA jako standardu znajdują się w zestawie producenta, więc zalecenia wymienione w niniejszym dokumencie mogą nie mieć zastosowania. Należy również wykonać test CS w celu określenia zawartości mitochondriów w każdej próbce. Ten test jest dobrze ugruntowany i pozwala na dalszą normalizację w przypadku badania różnic biologicznych między podtypami mitochondriów³⁶.

Po oznaczeniu białka materiał mitochondrialny należy rozcieńczyć w celu uzyskania pożądanego końcowego stężenia roboczego do testów respirometrycznych. Mitochondria wyizolowane od świnek morskich i serc szczurów rozcieńcza się do 40 mg/ml, a 5 μl tego bulionu dodaje się do komory oddechowej, uzyskując stężenie robocze 0,1 mg/ml. W przypadku izolacji z pojedynczych serc myszy lub z nerek i wątroby, rozcieńczenie materiału mitochondrialnego może nie być konieczne. Można również dodać większe objętości mitochondriów w celu uzyskania pożądanych stężeń. Wskaźniki zużycia tlenu w stanie 2, które wynoszą od 35 do 55 pmol/ml/s, są dopuszczalne dla większości analiz respirometrycznych²⁸. Szczegółowe informacje dotyczące sposobu przeprowadzania i analizowania RCR przedstawiono na rysunku 1 oraz w sekcji poświęconej reprezentatywnym wynikom; Należy jednak pamiętać, że oddychanie jest napędzane przez pirogronian i jabłczan. Inne warunki substratowe, takie jak bursztynian i rotenon, spowodują różne wartości RCR, ponieważ stosunek P/O i inne zmienne bioenergetyczne są różne³⁷. Zastosowanie pirogronianu i jabłczanu jako paliw do układu oddechowego pozwala osiągnąć niemal maksymalny obrót w cyklu TCA i produkcję ekwiwalentów redukujących; jednak maksymalną aktywność cyklu TCA i sprzężoną funkcję ETS uzyskuje się za pomocą 5 mM pirogronianu, 1 mM L-jabłczanu i 20 mM bursztynianu. Podczas stymulacji fosforylacji oksydacyjnej w celu ilościowego określenia szybkości zużycia tlenu w stanie 3, ADP dodaje się w stężeniach co najmniej 10 razy większych niż szacowany_{K D} dla ADP translokatora nukleotydów adeninowych³⁸. Można to osiągnąć za pomocą bolusów większych niż 350 μM ADP, dlatego we wszystkich testach eksperymentalnych stosowano 500 μM. Jeśli czas trwania stanu 3 jest zbyt krótki, do jego przedłużenia można zastosować niższe stężenia mitochondriów. W celu dalszej analizy oddychania można dokonać modulacji stężenia ADP, które jest wprowadzane do systemu, aby lepiej dopasować parametry eksperymentalne³⁹. Podczas pierwszego opracowywania tego protokołu zastosowano test cytochromu C do oceny integralności błony zewnętrznej izolatów mitochondrialnych⁴⁰. Jeśli wartości RCR są poniżej oczekiwanych zakresów, wykonaj test cytochromu C, aby ocenić, czy uszkodzenie błony zewnętrznej jest znaczące. Aby to zrobić, dodaj 10 μM cytochromu C do komory oddechowej i potwierdź, że wzrost oddychania jest poniżej 5 lub 10% szybkości stanu 4. Oczekiwane zakresy pochodzą z wcześniej opublikowanych badań i są specyficzne dla gatunku, tkanki i substratu. Jeśli dodanie cytochromu c stymuluje oddychanie w stanie 4 powyżej 10%, ostatnie 8 000 x g wirowania można powtórzyć w celu usunięcia uszkodzonych mitochondriów. To powiedziawszy, uszkodzenie błony zewnętrznej może być częścią fenotypu choroby, a zatem test cytochromu C powinien być interpretowany z myślą o tym⁴¹. Po uzyskaniu konsekwentnie wysokich wartości RCR z niskimi (<10%) efektami stymulowanymi cytochromem C, badanie to staje się konieczne i zalecane tylko wtedy, gdy wartości RCR leżą poza dopuszczalnymi zakresami. Jeżeli wynik testu na obecność cytochromu C wynosi <10%, a wartości RCR wykraczają poza oczekiwany zakres, jak wyszczególniono w Tabeli 2, należy powtórzyć test respirometryczny z nowym RB po 10-krotnym przemyciu wodą destylowaną. Jeśli nadal obserwuje się zmniejszone wskaźniki, należy wykonać nowe odczynniki (pirogronian, jabłczan, EGTA i ADP) w celu zdiagnozowania problemu. Dodatkowo testy cytochromu C można przeprowadzać za pomocą testów ELISA i przy użyciu barwników mitochondrialnych, takich jak TMRE^33,42. W zależności od rodzaju tkanki i źródła, opcje te mogą być lepiej odpowiednie do określenia integralności błony zewnętrznej.

Chociaż nie ma większych ograniczeń związanych z używaniem tego protokołu do izolowania mitochondriów serca, ważne jest, aby pamiętać, że podczas korzystania z tych metod należy wziąć pod uwagę pewne kwestie. Na jakość izolatów mitochondrialnych duży wpływ ma temperatura i czas potrzebny zarówno do perfuzji serca, jak i ponownego zawieszenia oczyszczonego osadu. W związku z tym znajomość tych procesów może być wymagana w celu uzyskania RCR porównywalnych z tymi zgłoszonymi w niniejszym dokumencie. Dodatkowo ważny jest skład i roztworów stosowanych podczas procesu izolacji, ponieważ bezpośrednio wpływa na integralność i funkcję mitochondriów⁴³. Bufor wymienione w tabeli 1 są podane jako odniesienia i pozwoliły na izolację dobrze sprzężonych mitochondriów z różnych źródeł tkankowych, ale można wprowadzić zmiany w celu ograniczenia ilości chlorku w analizach oddychania, ponieważ może to zakłócać translokację nukleotydów adeninowych i funkcję ETS²⁸. Skład buforu można również zmienić, aby lepiej wyizolować mitochondria wątroby. Ponieważ wątroba jest narażona na wysokie stężenia kwasów tłuszczowych, zaleca się, aby narząd i tkankę mieloną przemyć buforem zawierającym podwyższone stężenia BSA, jeśli zaobserwowane są RCR wykraczające poza oczekiwany zakres. Chociaż jakość izolatów mitochondrialnych uzyskanych z odcinków wątroby jest dobrze sprzężona i spójna, zmiana ta może skutkować poprawą funkcji organelli. Należy również pamiętać, że izolacja mitochondriów od komórek wykorzystujących te metody wymaga dużej ilości hodowanych komórek, co stanowi potencjalne ograniczenie. Co więcej, protokół ten nie jest specjalnie zaprojektowany dla izolatów komórkowych, ale okazał się skuteczny po wdrożeniu. W związku z tym ukierunkowane metody izolacji hodowanych komórek mogą być lepiej przydatne. Alternatywnie, aby ocenić jakość mitochondriów, naukowcy mogą zdecydować się na sondy fluorescencyjne do obliczenia RCR. Metody spektrofluorometryczne są popularnym wyborem, zwłaszcza jeśli ekstrahowane są mniejsze ilości białka^44,45.

Ogólnie rzecz biorąc, protokół ten może być stosowany do konsekwentnego izolowania dobrze sprzężonych mitochondriów sercowych od małych zwierząt, takich jak świnki morskie i szczury. Można go łatwo zmodyfikować w celu zwiększenia wydajności białka poprzez zmianę prędkości homogenizacji, czasu wirowania i liczby spinów, aby umożliwić izolację mitochondriów od serc, wątroby, nerek i komórek myszy. Co więcej, protokół ten jest na tyle ogólny i solidny, że został wykorzystany do zbadania funkcji mitochondriów u gatunków innych niż ssaki, takich jak minóg morski⁴⁶, a także do przeprowadzenia analizy strukturalnej przy użyciu klasycznej mikroskopii elektronowej i krioelektronowej ^40,47. Podczas gdy wiele ostatnich badań koncentruje się na badaniu zachowania mitochondriów w nienaruszonych systemach komórkowych i tkankowych, zakres i głębokość informacji uzyskanych z izolowanych mitochondriów przy użyciu tych metod ujawnia wpływ na metabolomikę, stres oksydacyjny i produkcję ATP, który nigdy nie będzie bezpodstawny. Izolacja dobrze sprzężonych mitochondriów pozwala naukowcom na zbadanie kluczowych aspektów rozwoju i progresji choroby, które nie są możliwe w innych modelach komórkowych. Ze względu na wszechstronność tego protokołu, zmiany w energetyce mitochondriów obserwowane w patologiach, takich jak choroby sercowo-naczyniowe, cukrzyca i zaburzenia neurologiczne, mogą być badane przy użyciu opisanej w nim metodologii.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
1,7 ml probówki do mikrowirówek Zlewka
		szklana 10 ml	Do rozwarstwiania i mielenia narządów
Probówki			Wirowanie
Adenozyno5'-difosforan sól monopotasowa dwuwodny	Sigma	A5285	Testy respirometryczne
Zestaw do oznaczania białek BSA	Thermo Scentific	PI23225	Kwantyfikacja białek mitochondrialnych
Dekstroza	Sigma	DX0145	Do buforu (CB)
Glikol etylenowy-bis(2-aminoeter etylowy)-N,N,N',N'-kwas tetraoctowy	Sigma	E4378	Do (CB i IB) i testów respirometrycznych
Kaniula szklana	Radnoti		Perfuzja serca świnki morskiej i szczura
Heparyna sodowa błona śluzowa świni	Sigma	SRE0027-250KU	Zwierzęce wstrzykiwanie IP
Respirometr			Elektroda typu Clark; oksygraf z komorami 2 ml
Komora
Isoflurane	Sigma	792632	Znieczulenie
Kwas L-jabłkowy	Sigma	02288-50G	Testy respirometryczne
Chlorek magnezu sześciowodny	Sigma	M9272	Do bufora (RB)
Mannitol	Sigma	MX0214	Do strzykawek
		Microlitr	Rozmiary od 5 & ndash; 50 &mikro; L
		mikropłytek	Musi być w stanie inkubować w temperaturze 37 & stopni; C
MOPS	Sigma	475898	Do wszystkich zbiorników
O2
Homogenizator OMNI THQ OMNI	International	12-500	Podobne homogenizatory stojana wirnika będą działać
pipety			Objętości  2– 20 &mikro; L; 20– 200 i mikro; L; 200– 1000 &mikro; L
Chlorek potasu	Sigma	P3911	Do (RB i CB)
Fosforan potasu dwuzasadowy	Sigma	795496	Dla (IB i RB)
Proteaza z Bacillus licheniformis	Sigma	P5459
Chlorek sodu	Sigma	S9888	Do buforu (CB)
Pirogronian sodu	Odczynniki Fishera	BP356-100	Testy respirometryczne
Sacharoza	Sigma	8510-OP	Do bufora (IB)
		do chirurgicznego rozwarstwiania	W zależności od źródła pochodzenia zwierzęcego i tkankowego
Wirówka			Musi schłodzić do 4 & stopni; C