Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Solidna izolacja mitochondriów z tkanki serca gryzoni

1.9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/67093

⸱

23 sierpnia 2024

 ,  ,  ,  , 
1Department of Physiology, Michigan State University, 2Department of Kinesiology, Michigan State University

W tym artykule

Podsumowanie

Badania bioenergetyczne i metabolomiczne mitochondriów ujawniły ich wieloaspektową rolę w wielu chorobach, ale metody izolacji tych organelli są różne. Opisana tutaj metoda jest w stanie oczyścić wysokiej jakości mitochondria z wielu źródeł tkankowych. Jakość określa się na podstawie współczynników kontroli oddechu i innych wskaźników ocenianych za pomocą respirometrii o wysokiej rozdzielczości.

Streszczenie

Izolacja mitochondrialna jest praktykowana od dziesięcioleci, zgodnie z procedurami ustanowionymi przez pionierów w dziedzinie biologii molekularnej i biochemii do badania zaburzeń metabolicznych i chorób. Stała jakość mitochondriów jest niezbędna do prawidłowego zbadania fizjologii mitochondriów i bioenergetyki; Jednak dla badaczy dostępnych jest wiele różnych opublikowanych metod izolacji. Chociaż różne strategie eksperymentalne wymagają różnych metod izolacji, podstawowe zasady i procedury są podobne. Protokół ten szczegółowo opisuje metodę zdolną do ekstrakcji dobrze sprzężonych mitochondriów z różnych źródeł tkanek, w tym małych zwierząt i komórek. Przedstawione kroki obejmują sekcję narządów, oczyszczanie mitochondriów, kwantyfikację białek i różne kontrole jakości. Podstawowym wskaźnikiem kontroli jakości używanym do identyfikacji mitochondriów wysokiej jakości jest współczynnik kontroli oddechowej (RCR). RCR to stosunek częstości oddechów podczas fosforylacji oksydacyjnej do szybkości przy braku ADP. Omówiono alternatywne wskaźniki. Chociaż za pomocą tego protokołu uzyskuje się wysokie wartości RCR w stosunku do ich tkankowego źródła, kilka kroków można zoptymalizować w celu dopasowania do indywidualnych potrzeb badaczy. Procedura ta jest solidna i konsekwentnie prowadzi do powstania izolowanych mitochondriów z ponadprzeciętnymi wartościami RCR w modelach zwierzęcych i źródłach tkankowych.

Wprowadzenie

Mitochondria to subkomórkowe organelle, które tworzą cytoplazmatyczne warunki energetyczne zoptymalizowane pod kątem określonych funkcji komórki. Podczas gdy badania na poziomie komórek, tkanek i organizmów mogą dostarczyć informacji na temat funkcji mitochondriów, izolacja organelli zapewnia poziom kontroli eksperymentalnej, który nie jest możliwy w inny sposób. Izolacje mitochondrialne są wykonywane od 1940 roku, umożliwiając mechanistyczne badania metabolizmu i oddychania w różnych komórkach i tkankach1,2. Historyczne znaczenie mitochondriów jest również dobrze udokumentowane3. Jako główni producenci ATP, mitochondria odgrywają wiele kluczowych ról, które są niezbędne dla optymalnego funkcjonowania komórek i narządów4. W macierzy mitochondrialnej substraty są utleniane w cyklu TCA, wytwarzając redukujące odpowiedniki i ruchome nośniki elektronów, takie jak NADH i UQH25,6. Cytochrom C jest trzecim głównym ruchomym nośnikiem elektronów w mitochondrialnej sieci reakcji biochemicznych7. Cząsteczki te są następnie utleniane przez kompleksy transbłonowe systemu transportu elektronów (ETS) osadzone w wewnętrznej błonie mitochondrialnej8. Reakcje redoks ETS są sprzężone z translokacją protonów z matrycy do przestrzeni międzybłonowej. Procesy te ustanawiają elektrochemiczny gradient protonów, który jest używany do fosforylacji ADP za pomocą Pi przez syntazę F1F0 ATP w celu wytworzenia ATP9,10. Poszczególne procesy zachodzące w każdym kompleksie można badać za pomocą respirometrii o wysokiej rozdzielczości przy użyciu elektrod typu Clark lub testów zużycia tlenu na mikropłytkach11,12. Ponadto modele chorób i terapie wykorzystujące izolowane mitochondria mogą określić wpływ lub znaczenie funkcji mitochondriów w postępie niektórych patologii. Okazało się to owocne w dziedzinie kardiologii, gdzie zmiany w dostarczaniu paliwa i substratu zostały wykorzystane do wyjaśnienia, w jaki sposób dysfunkcja mitochondriów wpływa na niewydolność serca13,14,15,16. Wiadomo również, że mitochondria wpływają na rozwój innych stanów chorobowych, takich jak cukrzyca, rak, otyłość, zaburzenia neurologiczne i miopatie17,18. W związku z tym zastosowanie wyizolowanych lub oczyszczonych mitochondriów umożliwia mechanistyczne badania metabolizmu oksydacyjnego i produkcji ATP w tkance źródłowej.

Nie brakuje protokołów izolacji mitochondriów ze względu na ich znaczenie w badaniach bioenergetycznych. Ponadto można znaleźć wysoce specyficzne metody dostosowane do subpopulacji mitochondriów w tkankach i komórkach19,20. Podstawowe etapy proceduralne są podobne między metodami izolacji, ale można wprowadzić zmiany w składzie bufora, etapach homogenizacji i wirowaniu w celu poprawy ilości i jakości mitochondriów. Zmiany w tych aspektach opierają się na zapotrzebowaniu metabolicznym tkanki, ogólnej funkcji narządów, gęstości mitochondriów i innych czynnikach. W tkankach takich jak wątroba i mięśnie szkieletowe stosuje się ręczne homogenizatory w celu zachowania integralności mitochondriów i ograniczenia uszkodzeń błon mitochondrialnych21. Jednak w przypadku izolacji od nerek niektóre protokoły sugerują użycie ręcznej homogenizacji lub komercyjnych zestawów w celu uzyskania lepszych wyników22. Chociaż obie metody dają funkcjonalne mitochondria, jakość organelli może zostać zagrożona przez dodatkowy czas potrzebny na ukończenie izolacji przy użyciu tych protokołów. Wirowanie jest również niezbędne do ekstrakcji białka mitochondrialnego, ponieważ oddziela składniki komórkowe, takie jak jądra i inne organelle, od mitochondriów23. Podczas procesu izolacji zastanawia się, czy należy zastosować wirowanie różnicowe, czy oparte na gęstości, aby uzyskać czystsze izolaty24. Podczas gdy wirowanie gęstości może oddzielić mitochondria od organelli o podobnym ciężarze właściwym, takich jak peroksysomy, nie jest dobrze ustalone, czy mitochondria z tych metod lepiej reprezentują funkcję organelli in situ w porównaniu z mitochondriami wyizolowanymi za pomocą wirowania różnicowego. W dziedzinie fizjologii mitochondriów preferowane jest wirowanie oparte na gęstości i można je łatwo zmienić w celu zwiększenia czystości izolatu. Przed eksperymentami należy rozważyć, czy zmiany sił g, czasu wirowania i liczby spinów wirowania są uwzględniane ze względu na ich wpływ na oczyszczanie mitochondriów. Co więcej, resuspension mitochondriów, prawdopodobnie najważniejszy etap podczas izolacji, różni się znacznie między badaniami, z zastosowaniem skrobania, mieszania na bazie wirów lub homogenizacji23,25,26. Mechaniczne ponowne zawieszenie tego typu może być zbyt ścierne i naruszać integralność błony mitochondriów. Z tego powodu należy przeprowadzić delikatne mycie, aby to skorygować. Pomimo mnogości modulacji i sugerowanych metodologii, istnieje mniej kompleksowych protokołów o wysokiej odtwarzalności i zdolności adaptacyjnych dla modeli gryzoni.

Metody opisane tutaj opisują szczegółowy, solidny i wysoce powtarzalny protokół, który daje oczyszczone, dobrze sprzężone mitochondria z tkanki serca małych zwierząt. Jak wykazano, metodę tę można łatwo dostosować do specyficznych potrzeb każdego eksperymentu i/lub środowiska laboratoryjnego w zakresie izolowania mitochondriów od nerek, wątroby i hodowanych komórek. Dalsze modyfikacje można wprowadzić w celu wyizolowania mitochondriów z tkanek i innych zwierząt niewymienionych tutaj. Dostępne są receptury używane dla wszystkich izolacji, które w razie potrzeby mogą być modyfikowane. Podobnie jak w przypadku innych opublikowanych protokołów, wdraża się homogenizację zmotoryzowaną i wirowanie różnicowe; Jednak w zależności od źródła izolacji dokonuje się korekt zarówno czasu ścinania, jak i siły, z jaką próbki są odwirowywane, aby konsekwentnie dostarczać wysokiej jakości izolaty mitochondrialne. Warto zauważyć, że protokół ten różni się od innych tym, że wykorzystuje delikatne mycie za pomocą pipetowania w celu ponownego zawieszenia granulowanych mitochondriów, co pomaga zachować integralność błony mitochondrialnej i utrzymać ogólną funkcjonalność organelli. Białko mitochondrialne określa się ilościowo albo przez oznaczenie całkowitego białka, albo przez pomiar aktywności syntazy cytrynianu. Użyteczność i szerokie zastosowanie tej metody izolacji są dodatkowo poparte wartościami współczynników kontroli oddechowej (RCR) uzyskanymi w różnych organizmach i źródłach tkankowych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Użytkowanie i leczenie wszystkich kręgowców zostało przeprowadzone zgodnie z zatwierdzonymi protokołami, sprawdzonymi i zaakceptowanymi przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) na Uniwersytecie Stanowym Michigan. Protokół ten został opracowany przy użyciu zarówno samców, jak i samic świnek morskich albinosów Hartley oraz szczurów Sprague Dawley (SD). W celu wyizolowania mitochondriów sercowych od świnek morskich zwierzęta uśmierano w wieku od 4 do 6 tygodni (300-450 g). Mitochondria serca od szczurów SD obu płci uzyskano w wieku 10-13 tygodni (250-400 g). Przepisy na są opisane w tabeli 1 i powinny być przygotowane z wyprzedzeniem. Szczegółowe informacje na temat odczynników i sprzętu użytego w tym badaniu znajdują się w Tabeli materiałów.

1. Przygotowanie eksperymentalne

  1. Przed rozpoczęciem izolacji oznacz dwie probówki wirówkowe o pojemności 50 ml jako "Spiny 1 i 2" oraz "Wirowanie 3".
  2. Na lodzie umieścić probówki, świeżo rozmrożony bufor izolacyjny (IB), ostre nożyczki do mielenia mięsa, zmontowaną sondę homogenizacyjną i zlewkę o pojemności 5 ml lub pojemnik o równoważnej wielkości.
  3. Umieść świeżo rozmrożony bufor oddechowy (RB) w inkubatorze, aby się ogrzał do kolejnych testów oddechowych.
  4. Wstępnie schłodzić wirówkę z chłodzeniem do temperatury 4 °C.
  5. Upewnij się, że cały sprzęt jest ułożony i 20 μl proteazy 7-15 U/mg z Bacillus licheniformis zostało dodane do probówki oznaczonej "Spiny 1 i 2".
  6. Skonfiguruj zależny od grawitacji system ciśnieniowy do perfuzji przez kaniulację za pomocą buforu Cardioplegia (CB, Tabela 1), szklanej kaniuli i plastikowej rurki z dołączonym zaworem odcinającym.
  7. Ułóż narzędzia chirurgiczne i dołącz odpowiednie nożyczki i kleszcze do preparowania i kaniulacji serca.
    UWAGA: Cała woda powinna być czystej jakości (18,2 MΩ·cm)

2. Sekcja tkanek

  1. Zwierzętom wstrzykiwać jałowy siarczan heparyny dootrzewnowo w dawce 500 j./kg.
  2. Pozostawić zwierzę w komorze indukcyjnej na 15 minut po podaniu heparyny. W tym czasie należy dostarczyć 2 l/min czystego gazuO2, aby w pełni natlenić zwierzęta, uspokoić je i zminimalizować stres, który może mieć niekorzystne konsekwencje dla tkanki będącej przedmiotem zainteresowania.
  3. Indukcję znieczulenia należy rozpocząć od ciągłego przepływu izofluranu w stężeniu 0,5%. Po 1 minucie zwiększ do 1%. Kontynuujzwiększaj o 1% co minutę, aż zostanie osiągnięte 5%. Po osiągnięciu 5% odczekaj 1 minutę i monitoruj wzorzec oddychania zwierzęcia.
  4. Gdy oddech zwolni i stanie się ciężki (mniej więcej po 6,5 minuty), wyłącz przepływ izofluranu i tlenu.
  5. Szybko wyjmij zwierzę z komory indukcyjnej i sprawdź, czy jest odpowiednia głębokość znieczulenia, ściskając łapę i sprawdzając, czy nie ma odruchu rogówkowego. Jeśli zwierzę zareaguje na którykolwiek z bodźców, umieść je z powrotem w komorze indukcyjnej, przeczytajpodać znieczulenie i powtórz kontrolę głębokości znieczulenia.
  6. Po osiągnięciu odpowiedniej głębokości znieczulenia należy szybko odciąć głowę gilotyną, aby zranić kręgosłup szyjny i położyć leżące ciało na lodzie.
  7. Wykonaj dwa równoległe pionowe nacięcia od obojczyków biegnące wzdłuż bocznej klatki piersiowej w dół klatki piersiowej. Upewnij się, że nacięcia są wystarczająco głębokie, aby przeciąć żebra po bocznej stronie klatki piersiowej, ale unikaj uszkadzania struktur wewnątrz klatki piersiowej, takich jak serce lub duże naczynia.
    UWAGA: Rozmiary pionowych nacięć zależą od użytego zwierzęcia. Jeśli używasz świnek morskich i szczurów, przytnij do przepony (około 6,35 cm dla szczurów i 11 cm dla świnek morskich). Jeśli używasz myszy, wykonaj standardową torakotomię27.
  8. Odsłoń serce za pomocą hemostatu, aby przemieścić przednią część klatki piersiowej i wypełnij odsłoniętą klatkę piersiową lodem. Ten krok minimalizuje czas ciepłego niedokrwienia i zwiększa żywotność wyizolowanych organelli.
  9. Użyj pęsety, aby tępo wypreparować grasicę i osierdzie oraz całkowicie odsłonić serce.
  10. Za pomocą kleszczy zastosuj delikatną dolną trakcję na sercu, aby odsłonić i zidentyfikować aortę. Aorta jest najgrubszym dużym naczyniem rozgałęziającym się od podstawy serca. Inne duże naczynia, takie jak żyła płucna, są zauważalnie bardziej przezroczyste niż aorta.
  11. Przetnij aortę około 4-6 mm powyżej korzenia aorty, ale poniżej punktów rozgałęzień tętnicy szyjnej.
  12. Kanalenuj aortę i perfunduj serce28,29 lodowatym roztworem kardioplegii (CB) za pomocą zależnej od grawitacji głowicy ciśnieniowej, aż tętnice wieńcowe zostaną oczyszczone z krwi, a narząd stanie się zblednięty.
    UWAGA: W przypadku dużych gryzoni dobrze sprawdza się średnica kaniuli 1,8-2,2 mm, natomiast w przypadku mniejszych gryzoni zalecany jest zakres średnic 1,4-1,8 mm. Retroperfuzja nie powinna trwać dłużej niż 15-30 sekund, aby naczynia wieńcowe oczyściły się z krwi.
  13. Odizoluj mięsień sercowy komory, wycinając przedsionki, chrzęstną tkankę zastawkową i tkankę tłuszczową.
  14. Umieść komory we wstępnie schłodzonej zlewce o pojemności 10 ml zawierającej 0,1-0,2 ml lodowatego IB.
  15. Zmiel tkankę ostrymi nożyczkami chirurgicznymi, aż kawałki będą miały około 1 mm3.

3. Oczyszczanie mitochondriów i kwantyfikacja białek

  1. Przenieść zmieloną tkankę do wstępnie schłodzonej probówki wirówkowej oznaczonej jako "Spiny 1 i 2" zawierającej roztwór proteazy.
  2. Dodaj lodowaty IB do końcowej objętości 25 ml.
  3. Za pomocą zmotoryzowanego ręcznego homogenizatora wirnikowo-stojanowego rozprowadź tkankę z prędkością 18 000 obr./min na lodzie przez 20-25 s.
  4. Odwirować homogenizowaną tkankę w probówce oznaczonej jako "Spiny 1 i 2" przy 8 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
  5. Odrzucić supernatant (który zawiera proteazę), wlewając go do pojemnika na odpady i delikatnie przepłukać osad 5 ml IB w celu usunięcia pozostałości proteazy.
  6. Po wyrzuceniu płukania, ponownie zawiesić osad ze świeżym, lodowatym IB do końcowej objętości 25 ml za pomocą delikatnego wiru.
  7. Wirować przy 800 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
  8. Usuń supernatant (zawiera mitochondria), delikatnie wlewając go do wstępnie schłodzonej probówki o pojemności 50 ml oznaczonej "Spin 3". Podczas nalewania należy uważać, aby nie przesunąć luźnej górnej części granulki. Alternatywnie do pobrania supernatantu można użyć pipety transferowej lub stripette.
  9. Odwirować supernatant o stężeniu 8000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
  10. Odrzucić powstały supernatant i zachować osad zawierający mitochondria.
  11. Użyj niestrzępiącej się chusteczki, aby wchłonąć nadmiar supernatantu z wewnętrznej ścianki probówki, uważając, aby nie naruszyć osadu. Przechowywać granulki w temperaturze 4 °C na lodzie tak długo, jak to możliwe.
  12. Aby ponownie zawiesić mitochondria, dodaj 80 μl lodowatego IB na dno probówki. Delikatnie zawiesić osad, wielokrotnie myjąc IB nad osadem.
  13. Aby uniknąć tworzenia się pęcherzyków, ustaw mikropipetę na zasysanie i dostarczanie od 40 do 60 μl objętości.
  14. W miarę rozpraszania się osadu mitochondrialnego należy zwiększyć objętość mikropipety, aby skutecznie zawiesić granulowane mitochondria. Unikaj dotykania granulki końcówką pipety i unikaj tworzenia pęcherzyków.
  15. Po ponownym zawieszeniu przenieś mitochondria do wstępnie schłodzonej probówki mikrowirówkowej i oznacz ją jako mitochondria podstawowe. Zanotuj całkowitą objętość ponownego zawieszenia.
  16. Aby określić stężenie białka mitochondrialnego w próbce, należy przeprowadzić test białka całkowitego przy użyciu dobrze znanych testów białkowych BCA lub Bradforda, zgodnie z instrukcjami producenta.
    UWAGA: Alternatywną lub uzupełniającą strategią oceny plonu jest określenie aktywności syntazy cytrynianu. Dla porównania, zawartość mitochondriów można określić ilościowo, postępując zgodnie z protokołem opisanym w Vinnakota et al.30.

4. Kontrole jakości

  1. We wstępnie schłodzonej probówce do mikrowirówek rozcieńczyć materiał mitochondrialny do pożądanego stężenia roboczego za pomocą IB.
    UWAGA: Zapasy mitochondrialne rozcieńcza się do 40 mg / ml, aby działały przy końcowym stężeniu 0,1 mg / ml do testów respirometrycznych przy użyciu izolatów z tkanki serca.
  2. Przepłukać komory oksygraficzne, korki i strzykawki mikrolitrowe dziesięć razy wodą destylowaną, aby je wyczyścić przed użyciem w testach respirometrycznych.
  3. Aby przetestować żywotność i jakość izolatów mitochondrialnych, należy załadować 2,3 ml buforu oddechowego (RB) do komór oksygraficznych i pozwolić, aby sygnał zużycia tlenu zrównoważył się w temperaturze 37 °C przez około 10 minut lub gdy szybkość jest bliska 0.
  4. Po wyrównaniu sygnału należy wcisnąć korki i zassać nadmiar bufora, który wyłania się z kapilary korka
    5. .
  5. Dodać 1 mM EGTA za pomocą mikrolitrowej strzykawki, aby chelatować resztki wapnia w lub próbce mitochondrialnej.
  6. Aby wspomóc oddychanie, dodaj 5 mM pirogronianu sodu i 1 mM L-jabłczanu.
  7. Po dodaniu substratów dodać bolus rozcieńczonych mitochondriów, aby osiągnąć stężenie robocze i umożliwić oddychanie przez 5 minut. Okres ten określa się mianem LEAK lub oddychania w stanie 2.
  8. Po 5 minutach dodaj bolus 500 μM ADP, aby zainicjować oddychanie w stanie 3, zwanym również OXHPOS, i pozwól mitochondriom oddychać aż do niedotlenienia.
  9. Oblicz współczynnik kontroli oddechowej (RCR), dzieląc maksymalną szybkość zużycia tlenu w stanie 3 przez szybkość zużycia tlenu tuż przed dodaniem ADP w stanie 2 (patrz Rysunek 1).
    UWAGA: Alternatywne wyrażenie RCR od 1 do 1/RCR może być również używane jako metryka jakości, która jest ograniczona między 0 a 1; jednak utrudnia to rozróżnienie jakości za pomocą tej metryki, gdy RCR > 10 (patrz Rysunek 2).
  10. Przepłukać komory i korki 10 razy czystą wodą, aby oczyścić oksygraf do kolejnych testów. Jeśli respirometria jest zakończona, napełnij komory 70% etanolem i umieść korki w komorach do następnego użycia.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Po zakończeniu izolacji mitochondriów należy przetestować jakość i funkcjonalność izolatów poprzez ilościowe oznaczenie szybkości zużycia tlenu (JO2) przy użyciu respirometrii wysokiej rozdzielczości. W tym celu zapasy mitochondriów rozcieńczono do 40 mg/mL, aby uzyskać stężenia robocze 0,1 mg/mL w 2 mL buforu RB dla wszystkich testów respirometrycznych z użyciem izolowanych mitochondriów serca. Oddychanie stymulowano za pomocą 5 mM pirogronianu sodu i 1 mM L-jabłczanu w obecności 1 mM EGTA, chelatora...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Przestrzeganie metod zwięźle opisanych w tym protokole zapewni izolację dobrze sprzężonych mitochondriów z tkanki serca małych gryzoni, a także innych typów tkanek i źródeł. Ogólnie rzecz biorąc, proces powinien trwać łącznie 3-3,5 godziny, podczas których wszystkie tkanki zwierzęce, próbki i izolaty powinny pozostać na lodzie w temperaturze 4 °C w jak największym stopniu, aby ograniczyć degradację. Ta procedura jest solidna i może być zmieniona na kilka sposobów, aby lepiej dopasować się do celów eksperymentalnych i wyk...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie ma nic do ujawnienia.

Podziękowania

Chcielibyśmy podziękować Danielowi A. Beardowi i Kalyanowi C. Vinnakocie za ich fundamentalny wkład w ten protokół. Ta praca została sfinansowana z grantu NSF CAREER MCB-2237117.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
1,7 ml probówki do mikrowirówek Zlewka
szklana 10 mlDo rozwarstwiania i mielenia narządów
ProbówkiWirowanie
Adenozyno5'-difosforan sól monopotasowa dwuwodnySigma A5285Testy respirometryczne
Zestaw do oznaczania białek BSAThermo ScentificPI23225Kwantyfikacja białek mitochondrialnych
DekstrozaSigma DX0145Do buforu (CB)
Glikol etylenowy-bis(2-aminoeter etylowy)-N,N,N',N'-kwas tetraoctowy Sigma E4378Do (CB i IB) i testów respirometrycznych
Kaniula szklanaRadnotiPerfuzja serca świnki morskiej i szczura
Heparyna sodowa błona śluzowa świniSigma SRE0027-250KUZwierzęce wstrzykiwanie IP
RespirometrElektroda typu Clark; oksygraf z komorami 2 ml
Komora
IsofluraneSigma 792632Znieczulenie 
Kwas L-jabłkowySigma 02288-50GTesty respirometryczne
Chlorek magnezu sześciowodnySigma M9272Do bufora (RB)
MannitolSigma MX0214Do strzykawek
MicrolitrRozmiary od 5 & ndash; 50 &mikro; L
mikropłytekMusi być w stanie inkubować w temperaturze 37 & stopni; C 
MOPSSigma 475898Do wszystkich zbiorników
O2
Homogenizator OMNI THQ OMNIInternational 12-500Podobne homogenizatory stojana wirnika będą działać
pipetyObjętości  2– 20 &mikro; L; 20– 200 i mikro; L; 200– 1000 &mikro; L
Chlorek potasuSigma P3911Do (RB i CB)
Fosforan potasu dwuzasadowySigma 795496Dla (IB i RB)
Proteaza z Bacillus licheniformisSigma P5459
Chlorek soduSigma S9888Do buforu (CB)
Pirogronian soduOdczynniki FisheraBP356-100Testy respirometryczne
SacharozaSigma 8510-OPDo bufora (IB)
do chirurgicznego rozwarstwianiaW zależności od źródła pochodzenia zwierzęcego i tkankowego
WirówkaMusi schłodzić do 4 & stopni; C 
wirówkowe 50 ml o wysokiej rozdzielczości indukcyjna buforowych (IB) Czytnik Zestaw stołowa

Bibliografia

  1. Hogeboom, G. H., Schneider, W. C., Pallade, G. E. Cytochemical studies of mammalian tissues; isolation of intact mitochondria from rat liver; some biochemical properties of mitochondria and submicroscopic particulate material. J Biol Chem. 172 (2), 619-635 (1948).
  2. Claude, A. Fractionation of mammalian liver cells by differential centrifugation: Ii. Experimental procedures and results. J Exp Med. 84 (1), 61-89 (1946).
  3. Ernster, L., Schatz, G. Mitochondria: A historical review. J Cell Biol. 91 (3 Pt 2), 227s-255s (1981).
  4. Martinez-Reyes, I., Chandel, N. S. Mitochondrial tca cycle metabolites control physiology and disease. Nat Commun. 11 (1), 102(2020).
  5. Vercellino, I., Sazanov, L. A. The assembly, regulation, and function of the mitochondrial respiratory chain. Nat Rev Mol Cell Biol. 23 (2), 141-161 (2022).
  6. Fernie, A. R., Carrari, F., Sweetlove, L. J. Respiratory metabolism: Glycolysis, the TCA cycle and mitochondrial electron transport. Curr Opin Plant Biol. 7 (3), 254-261 (2004).
  7. Kalpage, H. A., et al. Cytochrome C phosphorylation: Control of mitochondrial electron transport chain flux and apoptosis. Int J Biochem Cell Biol. 121, 105704(2020).
  8. Sousa, J. S., D'imprima, E., Vonck, J. Mitochondrial respiratory chain complexes. Subcell Biochem. 87, 167-227 (2018).
  9. Mitchell, P., Moyle, J. Chemiosmotic hypothesis of oxidative phosphorylation. Nature. 213 (5072), 137-139 (1967).
  10. Chance, B., Williams, G. R. Respiratory enzymes in oxidative phosphorylation. I. Kinetics of oxygen utilization. J Biol Chem. 217 (1), 383-393 (1955).
  11. Li, Z., Graham, B. H. Measurement of mitochondrial oxygen consumption using a Clark electrode. Methods Mol Biol. 837, 63-72 (2012).
  12. Rogers, G. W., et al. High throughput microplate respiratory measurements using minimal quantities of isolated mitochondria. PLoS One. 6 (7), e21746(2011).
  13. Bisaccia, G., Ricci, F., Gallina, S., Di Baldassarre, A., Ghinassi, B. Mitochondrial dysfunction and heart disease: Critical appraisal of an overlooked association. Int J Mol Sci. 22 (2), 614(2021).
  14. Zhou, B., Tian, R. Mitochondrial dysfunction in pathophysiology of heart failure. J Clin Invest. 128 (9), 3716-3726 (2018).
  15. Holzem, K. M., et al. Mitochondrial structure and function are not different between nonfailing donor and end-stage failing human hearts. FASEB J. 30 (8), 2698-2707 (2016).
  16. Cordero-Reyes, A. M., et al. Freshly isolated mitochondria from failing human hearts exhibit preserved respiratory function. J Mol Cell Cardiol. 68, 98-105 (2014).
  17. Norat, P., et al. Mitochondrial dysfunction in neurological disorders: Exploring mitochondrial transplantation. NPJ Regen Med. 5 (1), 22(2020).
  18. Diaz-Vegas, A., et al. Is mitochondrial dysfunction a common root of noncommunicable chronic diseases. Endocr Rev. 41 (3), bnaa005(2020).
  19. Lai, N., et al. Isolation of mitochondrial subpopulations from skeletal muscle: Optimizing recovery and preserving integrity. Acta Physiol (Oxf). 225 (2), e13182(2019).
  20. Holmuhamedov, E. L., Oberlin, A., Short, K., Terzic, A., Jahangir, A. Cardiac subsarcolemmal and interfibrillar mitochondria display distinct responsiveness to protection by diazoxide. PLoS One. 7 (9), e44667(2012).
  21. Frezza, C., Cipolat, S., Scorrano, L. Organelle isolation: Functional mitochondria from mouse liver, muscle and cultured fibroblasts. Nat Protoc. 2 (2), 287-295 (2007).
  22. Micakovic, T., et al. Isolation of pure mitochondria from rat kidneys and western blot of mitochondrial respiratory chain complexes. Bio Protoc. 9 (19), e3379(2019).
  23. Liao, P. C., Bergamini, C., Fato, R., Pon, L. A., Pallotti, F. Isolation of mitochondria from cells and tissues. Methods Cell Biol. 155, 3-31 (2020).
  24. Hubbard, W. B., et al. Fractionated mitochondrial magnetic separation for isolation of synaptic mitochondria from brain tissue. Sci Rep. 9 (1), 9656(2019).
  25. Zhou, D., et al. Protocol for mitochondrial isolation and sub-cellular localization assay for mitochondrial proteins. STAR Protoc. 4 (1), 102088(2023).
  26. Hernandez-Camacho, J. D., et al. Isolation of mitochondria from mouse skeletal muscle for respirometric assays. J Vis Exp. (180), e63336(2022).
  27. Farrugia, G. E., et al. A protocol for rapid and parallel isolation of myocytes and non-myocytes from multiple mouse hearts. STAR Protoc. 2 (4), 100866(2021).
  28. Wollenman, L. C., Vander Ploeg, M. R., Miller, M. L., Zhang, Y., Bazil, J. N. The effect of respiration buffer composition on mitochondrial metabolism and function. PLoS One. 12 (11), e0187523(2017).
  29. Vinnakota, K. C., et al. Open-loop control of oxidative phosphorylation in skeletal and cardiac muscle mitochondria by ca(2). Biophys J. 110 (4), 954-961 (2016).
  30. Vinnakota, K. C., Bazil, J. N., Van Den Bergh, F., Wiseman, R. W., Beard, D. A. Feedback regulation and time hierarchy of oxidative phosphorylation in cardiac mitochondria. Biophys J. 110 (4), 972-980 (2016).
  31. Warnock, L. B., Huang, D. Heparin. Statpearls. , StatPearls Publishing. Treasure Island (FL). (2024).
  32. Sercel, A. J., et al. Generating stable isolated mitochondrial recipient clones in mammalian cells using mitopunch mitochondrial transfer. STAR Protoc. 2 (4), 100850(2021).
  33. Lampl, T., Crum, J. A., Davis, T. A., Milligan, C., Del Gaizo Moore, V. Isolation and functional analysis of mitochondria from cultured cells and mouse tissue. J Vis Exp. (97), e52076(2015).
  34. Sobolewski, P., Kandel, J., Eckmann, D. M. Air bubble contact with endothelial cells causes a calcium-independent loss in mitochondrial membrane potential. PLoS One. 7 (10), e47254(2012).
  35. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).
  36. Wei, P., Liu, Q., Xue, W., Wang, J. A colorimetric assay of citrate synthase activity in drosophila melanogaster. J Vis Exp. (155), e59454(2020).
  37. Tomar, N., et al. Substrate-dependent differential regulation of mitochondrial bioenergetics in the heart and kidney cortex and outer medulla. Biochim Biophys Acta Bioenerg. 1863 (2), 148518(2022).
  38. Ter Veld, F., Jeneson, J. A., Nicolay, K. Mitochondrial affinity for ADP is twofold lower in creatine kinase knock-out muscles. Possible role in rescuing cellular energy homeostasis. FEBS J. 272 (4), 956-965 (2005).
  39. Gouspillou, G., et al. Accurate determination of the oxidative phosphorylation affinity for ADP in isolated mitochondria. PLoS One. 6 (6), e20709(2011).
  40. Strubbe-Rivera, J. O., et al. The mitochondrial permeability transition phenomenon elucidated by cryo-em reveals the genuine impact of calcium overload on mitochondrial structure and function. Sci Rep. 11 (1), 1037(2021).
  41. Zhou, Z., et al. Diverse functions of cytochrome C in cell death and disease. Cell Death Differ. 31 (4), 387-404 (2024).
  42. Certo, M., et al. Mitochondria primed by death signals determine cellular addiction to antiapoptotic bcl-2 family members. Cancer Cell. 9 (5), 351-365 (2006).
  43. Bose, S., French, S., Evans, F. J., Joubert, F., Balaban, R. S. Metabolic network control of oxidative phosphorylation: Multiple roles of inorganic phosphate. J Biol Chem. 278 (40), 39155-39165 (2003).
  44. Motawe, Z. Y., Abdelmaboud, S. S., Breslin, J. W. Evaluation of glycolysis and mitochondrial function in endothelial cells using the seahorse analyzer. Methods Mol Biol. 2711, 241-256 (2024).
  45. Will, Y., Hynes, J., Ogurtsov, V. I., Papkovsky, D. B. Analysis of mitochondrial function using phosphorescent oxygen-sensitive probes. Nat Protoc. 1 (6), 2563-2572 (2006).
  46. Huerta, B., et al. Sea lamprey cardiac mitochondrial bioenergetics after exposure to TFM and its metabolites. Aquat Toxicol. 219, 105380(2020).
  47. Malyala, S., Zhang, Y., Strubbe, J. O., Bazil, J. N. Calcium phosphate precipitation inhibits mitochondrial energy metabolism. PLoS Comput Biol. 15 (1), e1006719(2019).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

Oczyszczanie mitochondriówwskaźnik kontroli oddechowejilościowe oznaczenie białkasekcja narządówzaburzenia bioenergetycznegranulki fosforanu wapnianiewydolność sercafizjologia mitochondriów
Solidna izolacja mitochondriów z tkanki serca gryzoni
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.