Method Article

Określanie funkcji rzęsek i nieprzepuszczalności błony pseudostratyfikowanego nabłonka dróg oddechowych płuc

DOI:

10.3791/67094

⸱

February 21st, 2025

 , 
1Department of Biomedical Sciences, School of Medicine and Health Sciences, University of North Dakota

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kultura interfejsu powietrze-ciecz jest powszechnie stosowana do tworzenia pseudostratyfikowanego nabłonka dróg oddechowych poprzez różnicowanie pierwotnych normalnych ludzkich komórek nabłonka oskrzeli, które naśladują wierzchołkową stronę drogi oddechowej płuc. W tym miejscu opisujemy prosty protokół określania jego jakości poprzez monitorowanie jego właściwości biofizycznych, takich jak funkcja rzęsek i integralność błony.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Różnicowanie pierwotnych komórek nabłonka dróg oddechowych płuc na granicy powietrze-ciecz (ALI) jest popularną techniką tworzenia wielokomórkowego pseudowarstwowego nabłonka dróg oddechowych, który naśladuje wierzchołkową stronę drogi oddechowej płuc. Podczas gdy oczekuje się różnicowania pierwotnych komórek dróg oddechowych płuc, ocena właściwości biofizycznych, takich jak funkcja rzęsek i nieprzepuszczalność błony, zapewnia ocenę jakości nabłonka dróg oddechowych i zapewnia wiarygodność eksperymentu. W tym miejscu opisujemy prosty protokół rozwoju wielokomórkowego pseudostratyfikowanego nabłonka dróg oddechowych w hodowli ALI i oceniamy dwie ważne właściwości biofizyczne: funkcję rzęsek i nieprzepuszczalność błony. Aby określić funkcję rzęsek, uchwyciliśmy ruch rzęsek w 4-tygodniowym zróżnicowanym nabłonku dróg oddechowych za pomocą szybkiej kamery przymocowanej do odwróconego mikroskopu, a następnie określiliśmy ilościowo częstotliwość uderzeń rzęsek (CBF) za pomocą systemu Simon Amon Video Analysis (SAVA). Zmierzyliśmy również transepitelialną rezystancję elektryczną (TEER) za pomocą woltomierza-oma, aby określić integralność bariery nabłonkowej nabłonka dróg oddechowych.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przewlekłe choroby układu oddechowego, takie jak astma, przewlekła obturacyjna choroba płuc (POChP) i mukowiscydoza, są jednymi z głównych problemów zdrowotnych na całym świecie1. Rozpowszechnienie chorób układu oddechowego wywoływanych przez wirusy, takie jak wirus grypy A u ludzi, syncytialny wirus oddechowy (RSV) i koronawirus zespołu ciężkiej ostrej niewydolności oddechowej 2 (SARS-CoV-2) również powoduje obciążenia ekonomiczne i zdrowotne2. Dlatego istnieje ogromna potrzeba opracowania schematów leczenia chorób układu oddechowego, które prowadzą do nieodwracalnego uszkodzenia tkanek układu oddechowego. Sama tkanka n....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół powinien być wykonany w sterylnym stanie pod okapem z przepływem laminarnym poziomu bezpieczeństwa biologicznego 2 (komora bezpieczeństwa biologicznego). Wszystkie podłoża i roztwory należy rozmrozić w temperaturze 37 °C przed użyciem. Wirowanie powinno odbywać się w temperaturze 4 °C. Wszystkie materiały użyte w eksperymencie muszą być sterylne. Komórki pierwotne (dawcy pozbawionego tożsamości użytkownika) uzyskano we współpracy z dr Kristiną Bailey z University of Nebraska Medical Center (UNMC), Omaha, NE. Pierwotne komórki pochodzą od niezidentyfikowanych dawców, a komórki nie należą do NIH Human Subject. Ogniwa zostały pozyskane na podstawie zatwierdzonej....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Oceniliśmy zarówno funkcję rzęsek, jak i nieprzepuszczalność błony nabłonka dróg oddechowych uzyskaną dzięki różnicowaniu pierwotnych komórek NHBE od dwóch niezależnych, niezidentyfikowanych dawców (dwóch niepalących, zdrowych dorosłych lub dorosłych z POChP, powyżej 50-letnich kobiet). Aby określić funkcję rzęsek, określiliśmy CBF 28-dniowego zróżnicowanego nabłonka dróg oddechowych. Zaobserwowaliśmy, że CBF osiągnął co najmniej 3 Hz dla obu nabłonków dróg oddechowych, co było porównywalne z wcześniej publikowanymi wyni.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ludzki pierwotny nabłonek dróg oddechowych (hodowla ALI) jest coraz częściej wykorzystywany jako model płuc in vitro do ocen biologicznych w celu zbadania funkcji i mechanizmów oraz ograniczenia stosowania przez zwierzęta14. ALI ma kilka zalet w porównaniu z jakąkolwiek monowarstwową kulturą zanurzoną. Na przykład zapewnia podobny do tkanki pseudostratyfikowany nabłonek dróg oddechowych, który naśladuje wierzchołkową stronę dróg oddechowych płuc

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie pozostają w konflikcie interesów.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca została sfinansowana przez NIH P20GM113123 i UND SMHS pilotażowy grant.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1x DPBSThermo Fisher Scientific, USA14190-144
Pożywka do wzrostu komórek nabłonka dróg oddechowychPromoCell, NiemcyC-21060
Amfoterycyna BThermo Fisher Scientific, USA15290-026
Omomierz EVOM2 VWorld Precision Instruments, USANie dotyczy
Roztwór heparynyTechnologie STEMCELL, USA07980
Hydrokortyzon stockSTEMCELL technologies, USA07926
Mikroskop: Leica DMI8 (Leica Microscope) z szybką kamerą 120f/s (Basler) powiązaną z mikroskopem. Microsope mocowany również za pomocą inkubatora komorowego i8.Leica, Stany ZjednoczoneNie dotyczy
Penicylina-StreptomycynaCorning, USA30-002-CI
PneumaCult-ALI Basal Medium STEMCELL technologies, USA05002
PureColAdvanced BioMatrix, USA5005
System analizy wideo (SAVA) Sissona-Ammonsa. Oprogramowanie V.2.1.15 Amson Engineering, Stany ZjednoczoneNie dotyczy

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. GBDCRD Collaborators. Global burden of chronic respiratory diseases and risk factors, 1990-2019: an update from the Global Burden of Disease Study 2019. E Clin Med. 59, 101936(2023).
  2. Fendrick, A. M., Monto, A. S., Nightengale, B., Sarnes, M.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Ciliary FunctionMembrane ImpermeabilityAirway EpitheliumAir Liquid InterfaceCiliary Beat FrequencyTransepithelial Electrical ResistancePseudostratified EpitheliumBronchial Epithelial CellsHigh Speed MicroscopySAVA System

Related Articles