Artykuł metodologiczny

Procedury operacyjne i hermetyzacji biologicznej w obiekcie dla myszy laboratoryjnych z naturalnym mikrobiomem: procedura immunofenotypowania

DOI:

10.3791/67100

⸱

13 grudnia 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1BIH QUEST Center for Responsible Research, Berlin Institute of Health (BIH) at Charité - Universitätsmedizin Berlin, 2German Federal Institute for Risk Assessment (BfR), German Centre for the Protection of Laboratory Animals (Bf3R), 3Institute of Microbiology, Infectious Diseases and Immunology, Charité - Universitätsmedizin Berlin, corporate member of Freie Universität Berlin and Humboldt-Universität zu Berlin, 4Experimental and Clinical Research Center (ECRC) & Max-Delbrück-Centrum für Molekulare Medizin in der Helmholtz-Gemeinschaft (MDC), 5Department of Experimental Neurology, Charité - Universitätsmedizin Berlin, corporate member of Freie Universität Berlin and Humboldt-Universität zu Berlin, Klinik und Hochschulambulanz für Neurologie, 6Center for Stroke Research Berlin, Charité - Universitätsmedizin Berlin, corporate member of Freie Universität Berlin and Humboldt-Universität zu Berlin, 7Einstein Center for Neuroscience, 8German Center for Cardiovascular Research (DZHK), partner site Berlin, 9Department of Neuropathology, Charité - Universitätsmedizin Berlin, corporate member of Freie Universität Berlin and Humboldt-Universität zu Berlin, 10Cluster of Excellence, NeuroCure, 11German Center for Neurodegenerative Diseases (DZNE) Berlin, 12Department of Hepatology and Gastroenterology, Charité - Universitätsmedizin Berlin, corporate member of Freie Universität Berlin and Humboldt-Universität zu Berlin, 13Institute of Animal Welfare, Animal Behavior and Laboratory Animal Science, Freie Universität Berlin, 14Forschungseinrichtungen für Experimentelle Medizin/FEM, Charité - Universitätsmedizin Berlin, corporate member of Freie Universität Berlin and Humboldt-Universität zu Berlin, 15Department of Pediatric Respiratory Medicine, Immunology and Critical Care Medicine, Charité - Universitätsmedizin Berlin, corporate member of Freie Universität Berlin and Humboldt-Universität zu Berlin, 16German Center for Lung Research (DZL), associated partner site, Berlin, 17Department of Infectious Diseases, Respiratory Medicine and Critical Care, Charité - Universitätsmedizin Berlin, corporate member of Freie Universität Berlin and Humboldt-Universität zu Berlin, 18Division of Toxicology, Institute of Clinical Pharmacology and Toxicology, Charité - Universitätsmedizin Berlin, corporate member of Freie Universität Berlin, Humboldt-Universität zu Berlin, and Berlin Institute of Health, 19Institute of Immunology, Charité-Universitätsmedizin Berlin, corporate member of Freie Universität Berlin and Humboldt-Universität zu Berlin, 20German Cancer Research Center, 21German Cancer Consortium, partner site Berlin, 22Department of Radiology (including Pediatric Radiology), Charité - Universitätsmedizin Berlin, corporate member of Freie Universität Berlin and Humboldt-Universität zu Berlin, 23Department of Microbiome Research, University Hospital Erlangen, Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg (FAU), 24Department of Medicine II, Faculty of Medicine, Medical Center - University of Freiburg

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj opisujemy strukturę i procedury operacyjne, w tym środki powstrzymywania mikroorganizmów w obiekcie dla "dzikich myszy", używając próbki krwi do immunofenotypowania jako przykładu.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wykorzystanie myszy laboratoryjnych z naturalnym mikrobiomem, takich jak "Dzikie myszy", oferuje obiecujące narzędzie badawcze zarówno dla nauk podstawowych, jak i stosowanych, ze względu na ich bliskie podobieństwo do ludzkiego superorganizmu. Jednak hodowla i utrzymanie tych myszy, które są siedliskiem zróżnicowanego mikrobiomu, w tym bakterii, wirusów i pasożytów, stanowi poważne wyzwanie dla obiektów hodowli zwierząt w instytucjach badawczych. Aby sprostać tym wyzwaniom, opracowano specjalistyczną koncepcję obiektu, w którym trzymane są "dzikie myszy" na Charité - Universitätsmedizin Berlin. Podejście to polegało na zaprojektowaniu obiektu o określonych cechach konstrukcyjnych i protokołach operacyjnych, aby skutecznie powstrzymać naturalny mikrobiom, chroniąc w ten sposób obszary o wyższych standardach higieny.

Metodologia pobierania próbek krwi zarówno od określonych myszy wolnych od patogenów (SPF), jak i "dzikich myszy" do immunofenotypowania, podkreślając przepływ pracy i środki biohermetyczności wdrożone w obiekcie. Niezwykłe wyniki pokazują, że "dzikie myszy" wystawione na działanie naturalnego mikrobiomu rozwijają odrębne populacje komórek odpornościowych, które są znacznie zmniejszone u myszy hodowanych i utrzymywanych w rygorystycznych warunkach higienicznych.

Znaczenie tego badania polega na jego potencjale do zapewnienia badaczom dostępu do myszy, które posiadają naturalny mikrobiom i dojrzały układ odpornościowy podobny do dorosłego człowieka. Podejście to może zwiększyć możliwości przełożenia wyników badań przedklinicznych na praktykę kliniczną, przyczyniając się tym samym do rozwoju badań biomedycznych.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Eksperymentowanie na myszach jest nadal niezbędne w naukach podstawowych i stosowanych, takich jak badania przedkliniczne i toksykologiczne. Jednak standaryzacja higieny w środowiskach laboratoryjnych, mająca na celu zmniejszenie szumu biologicznego i zminimalizowanie zmienności wyników eksperymentalnych, doprowadziła w dużym stopniu do wykluczenia naturalnej mikrobioty. W związku z tym warunki, w których rodzą się i są trzymane myszy laboratoryjne znormalizowane higienicznie, wolne od określonych patogenów (SPF), różnią się od rzeczywistych warunków, na które zwykle narażeni są ludzie i zwierzęta. Ta rozbieżność między warunkami laboratoryjnymi a naturalnym środowiskiem, w którym występują choroby u ludzi, prowadzi do "błędu standaryzacji": zakładania, że minimalizacja zmienności w warunkach eksperymentalnych poprawia wyniki translacyjne. Jednak w rzeczywistości ogranicza to biologiczne znaczenie wyników1,2. Na przykład badania wykazały, że brak różnorodności mikrobiologicznej i środowiskowej u myszy z SPF może skutkować słabo rozwiniętym układem odpornościowym, podważając wiarygodność badań immunologicznych i przedklinicznych3.

Zaproponowano kilka podejść do rozwiązania problemu zmienności biologicznej w modelach mysich, każde z własnymi zaletami i ograniczeniami, w tym wspólne zamieszkiwanie z dzikimi i zoologicznymi myszami3,4,5,6,7,8, sekwencyjna ekspozycja na komensale9, trzymanie zwierząt w pomieszczeniach zewnętrznych10 lub na ściółce od dużych zwierząt11, oraz przeszczepy kału od dzikich myszy12. Obiecującym nowym modelem mysim do badań przedklinicznych i toksykologicznych jest model "Dzikie myszy", który składa się ze standardowych laboratoryjnych szczepów myszy zawierających naturalny mikrobiom13. Te "dzikie myszy" są generowane przez przeszczepianie embrionów z laboratoryjnych szczepów myszy do dzikich myszy. Podczas porodu laboratoryjne szczepy myszy uzyskują naturalny mikrobiom swoich zastępczych matek, naśladując naturalne zaszczepienie, które ma miejsce podczas porodu u ludzi13. "Dzikie myszy" mogą być hodowane jak każdy inny szczep myszy laboratoryjnych, z zachowaniem naturalnego mikrobiomu przez pokolenia.

"Dzikie myszy" posiadają różnorodną mikrobiotę - w tym bakterie, wirusy i pasożyty - które zazwyczaj są wykluczane z obiektów dla myszy SPF. W związku z tym utrzymanie naturalnego mikrobiomu w ośrodkach badawczych stanowi wyzwanie, ponieważ drobnoustroje te muszą być kontrolowane bez naruszania ogólnych standardów higieny SPF.

Na Charité - Universitätsmedizin Berlin założono specjalny obiekt dla "dzikich myszy", oddzielony od obszarów SPF ścisłymi środkami ochrony biologicznej. W obiekcie znajdują się pomieszczenia hodowlane i eksperymentalne, zapewniające utrzymanie naturalnego mikrobiomu "dzikich myszy" podczas ochrony obszarów SPF (Rysunek 1).

Pary założycielskie kolonii Charité zostały zaimportowane z kolonii "Dzikich myszy" założonej w Dziale Badań nad Mikrobiomem, Szpitalu Uniwersyteckim w Erlangen, Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg (FAU), Niemcy. Są one dostarczane ze świadectwem zdrowia i monitorowane za pomocą rozszerzonego panelu pod kątem patogenów odzwierzęcych przed importem założycieli kolonii. Sentinele będą wykorzystywane do monitorowania mikrobiomu w czasie. Zarówno SPF, jak i "dzikie myszy" są trzymane w tych samych warunkach. Myszy są hodowane i trzymane preferencyjnie w indywidualnie wentylowanych klatkach (IVC) typu II w grupach po pięć myszy. Temperatura wewnątrz obiektu wynosi 22 °C, a cykl światło/ciemność to 12 godzin. Myszy otrzymują standardową karmę na bazie zbóż i wodę z kranu. Sterylizacja ściółki i przedmiotów wzbogacających nie jest konieczna w przypadku "dzikich myszy". Jednak autoklawowanie tych przedmiotów zapobiega mieszaniu się materiałów w miejscach, w których trzymane są myszy SPF.

W tym protokole pokazane są procedury immunofenotypowania zarówno dla SPF, jak i dla "dzikich myszy", podkreślając rygorystyczne protokoły zapobiegania mikroorganizmom w obiekcie "Wildling mouse". Środki te zapewniają integralność środowisk SPF, zapewniając jednocześnie korzyści płynące z pracy z myszami przenoszącymi naturalny mikrobiom.

figure-introduction-1
Rysunek 1: Układ obiektu dla myszy Wildling. E1 = dostęp do obiektu. Strzałki wskazują drogę wejścia na teren obiektu. E2 = dostęp do kabiny z laminarnym przepływem powietrza z zewnątrz obiektu. PA = śluza powietrzna dla personelu z natryskiem powietrznym. AS = prysznic powietrzny. R1, R2 = pomieszczenia do hodowli dzikich myszy. R3 = miejsce do trzymania myszy Wilding. R4 = miejsce do trzymania myszy z filtrem SPF. PR1 = sala zabiegowa dla myszy SPF. PR2 = pomieszczenie zabiegowe dla dzikich myszy. SB = sterylny stół roboczy. EE = wyjścia ewakuacyjne. CR = przebieralnia przed kabiną LAF. LAF = kabina z laminarnym przepływem powietrza do interwencji pod ochronnym przepływem powietrza. A = autoklaw. ER = pomieszczenie sprzętowe. Zielone strzałki reprezentują trasy dostępne podczas pracy ze zwierzętami SPF, a żółte strzałki wskazują ścieżki dostępne do pracy z myszami Wildling po prysznicu powietrznym. Niebieskie strzałki wskazują dostęp tylko dla personelu hodowlanego. Czerwona linia oznacza szklaną ścianę wewnątrz kabiny LAF, która dzieli przestrzeń na dwie sekcje, do których można dostać się z E1 przez PR2 lub z E2 przez CR. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Obiekt do "dzikich myszy" i procedury z udziałem żywych zwierząt zostały zatwierdzone przez odpowiedzialne biuro państwowe ds. eksperymentów na zwierzętach, "Landesamt für Gesundheit und Soziales Berlin" (LAGeSo). Najważniejsze kroki protokołu są podsumowane w Rysunek 2.

1. Uzyskanie dostępu do obiektu Wilding

  1. Uzyskaj osobiste wprowadzenie do procedur operacyjnych i biohermetycznych w obiekcie od odpowiedzialnego inspektora ds. dobrostanu zwierząt.
  2. Zdobądź klucz transpondera, aby wejść do placówki dla "dzikich myszy" i zarezerwować sale zabiegowe za pośrednictwem systemu rezerwacji online.

2. Wejście do placówki dla "Dzikich myszy"

  1. Zdeponuj ubrania w przebieralni.
  2. Przebierz się w odzież obszarową: spodnie, kasak i jednorazowe ochraniacze na buty (Rysunek 3).

3. Pobieranie próbek krwi od myszy SPF w obszarze SPF

  1. Przenieś myszy SPF (samce i samice, 8-20 tygodni) z pomieszczenia, w którym są trzymane (R4) do sali zabiegowej dla zwierząt SPF (PR1) w zamkniętej klatce IVC.
  2. Włącz ławkę z przepływem laminarnym i zdezynfekuj powierzchnię miejsca pracy etanolem o sile 70% obj. Pracuj wewnątrz ławki.
  3. Sprawdź rurki kapilarne pod kątem pękniętych lub wyszczerbionych odcinków, aby uniknąć zwiększonego ryzyka pęknięcia lub uszkodzenia.
  4. W krótkim znieczuleniu ogólnym izofluranem (indukcja przy 5% izofluranu w powietrzu medycznym wzbogaconym tlenem, a następnie 1,5%-2,0% w celu utrzymania), po utracie odruchu wycofania pedału (jak wskazano przez uszczypnięcie palca), ściśnij żyły szyjne myszy, chwytając kark szyi.
  5. Jedną ręką zabezpiecz głowę zwierzęcia kciukiem i palcem wskazującym. Wprowadzić świeżą kapilarnę do przyśrodkowej kanty oka pod błoną nazębną pod kątem 45°. Upewnij się, że naczynia włosowate znajdują się między gałką oczną a kostnym oczodołem oka.
    UWAGA: Aby uniknąć urazu, nie pozwól, aby końcówka rurki kapilarnej dotykała powierzchni oka.
  6. Przeprowadź kapilarę przez błonę zatokową delikatnym osiowym ruchem obrotowym. Kontynuuj obracanie rurki z tyłu oczodołu, aż zacznie płynąć krew. Zebrać co najmniej 15 μl krwi do probówki zawierającej kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA) (około 1 kropla).
  7. Przed usunięciem naczynia włosowatego poluzuj uchwyt na karku szyi, aby ograniczyć krwawienie do tkanki do minimum. Aby zapewnić dobrą hemostazę, użyj czystego gazika lub wacika, aby zatrzymać krwawienie.
  8. Lekko obróć probówkę, aby wymieszać krew i EDTA. Nie potrząsaj tubką. Próbkę krwi należy przechowywać na lodzie.
  9. Zdezynfekuj powierzchnię roboczą i wyłącz stół z przepływem laminarnym. Zwróć myszy SPF w zamkniętym IVC do pomieszczenia z SPF (R4).

4. Wejście do obszaru dla "Dzikich myszy"

  1. Zdejmij buty i skarpetki w przedpokoju prysznica powietrznego (PA). Załóż skarpety i środki ochrony osobistej całego ciała (PPE) składające się z kombinezonu Tyvek, siatki na włosy, jeśli to konieczne, bawełnianych rękawiczek, rękawiczek nitrylowych i masek na twarz (Rysunek 3).
  2. Wejdź do prysznica powietrznego w skarpetach przez samoprzylepną wykładzinę podłogową. Podczas kąpieli powietrznej podnieś ramiona i wykonaj obrót o 360°.
  3. Wyjdź z prysznica powietrznego i załóż obuwie po drugiej stronie.

5. Pobieranie próbek krwi od "dzikich myszy"

  1. Przenieś "dzikie myszy" (samce i samice, 8 - 20 tygodni) z pomieszczenia, w którym są trzymane (R3) w zamkniętej klatce IVC, do sali zabiegowej (PR2).
  2. Włącz ławkę z przepływem laminarnym i zdezynfekuj powierzchnię miejsca pracy.
  3. Postępuj zgodnie z procedurami opisanymi dla pobierania próbek myszy SPF w sekcji 3, krokach 2-8.
  4. Po zakończeniu pobierania krwi należy zmienić rękawiczki. Zdezynfekuj wszystkie materiały i powierzchnie. Wyłączyć ławkę z przepływem laminarnym.

6. Eksport próbek krwi z obszaru "Dzikie myszy" za pomocą szafki z laminarnym przepływem powietrza (LAF)

UWAGA: Sala zabiegowa (PR2) zawiera szafkę LAF, która służy jako zamek materiałowy i sterylne pomieszczenie interwencyjne. Próbki są przenoszone przez kabinę LAF. Wnętrze jest dostępne zarówno od wewnątrz (przez E1 i PR2), jak i na zewnątrz (przez E2 i CR) obszar Wildling i jest podzielony pośrodku szklaną ścianą z przesuwanymi drzwiami (Rysunek 1). Do eksportu materiałów potrzebne są dwie osoby: Osoba 1 (wewnątrz obszaru Wildling [via PR2]) wykona kroki 6.1 i 6.2. Osoba 2 (poza obszarem Dzikich [przez E2]) wykona kroki 6.3-6.5.

  1. Zdezynfekować pojemniki na próbki. Wyjąć pojemniki na próbki przez drzwi przesuwne w szklanej ścianie kabiny LAF.
  2. Po zakończeniu przekazywania pojemników z próbkami osobie 2 należy odebrać odzież ochronną od osoby 2 (nosi odzież ochronną w zamku ochronnym kabiny) znajdującą się po drugiej stronie kabiny LAF i zutylizować ją. Zdezynfekuj wszystkie powierzchnie.
  3. Załóż odzież ochronną w dostępie LAF przed kabiną LAF (CR, Rysunek 1).
  4. Zdezynfekowane pojemniki na próbki z obszaru Wildling należy odbierać bezdotykowo przez przesuwane drzwi w szklanej ścianie kabiny LAF.
  5. Zdjąć odzież ochronną i przepuścić ją przez drzwi przesuwne do wnętrza kabiny LAF w celu utylizacji.

7. Wyjście z placówki dla "Dzikich myszy"

  1. Zostaw jednorazowe kombinezony i obuwie terenowe w tym obszarze. Wyrzuć siatkę na włosy, gumowe rękawiczki i maskę na twarz.
    UWAGA: Buty i kombinezony mogą być ponownie użyte.
  2. Natychmiast wejdź do prysznica powietrznego w skarpetkach obszarowych. Podnieś ramiona i wykonaj obrót o 360° podczas kąpieli powietrznej.
  3. Pozostaw prysznic powietrzny i umieść skarpetki w kolektorze na pranie. Załóż skarpetki i buty oraz jednorazowe ochraniacze na buty. Zdeponuj odzież w przebieralni w kolektorze pralniczym. Przebieranie się w ubrania w przebieralni

8. Przetwarzanie i analiza próbek krwi

  1. Przynieś próbki krwi do laboratorium.
    1. Przygotuj koktajl barwienia przeciwciał sprzężonych z fluoroforem: Do każdej próbki dodać 0,25 μl anty-mysiego CD45 Alexa Fluor 700, 0,25 μl łańcucha anty-mysiego TCR-β Brilliant Violet 605, 0,25 μl anty-mysiego CD4 APC, 0,25 μl anty-mysiego CD8 Brilliant Violet, 0,25 μl anty-mysiego CD44 FITC i 0,25 μl przeciwciała anty-mysiego CD62L PerCP/cyjanine5,5 do 50 μl buforu cytometrii przepływowej (sól fizjologiczna buforowana fosforanami, 2 mM EDTA, 0,1% albumina surowicy bydlęcej, 4 °C). Trzymaj w ciemności na lodzie do kroku 8.8.
      UWAGA: Zastosowane fluorofory można dostosować do konfiguracji cytometru przepływowego, który będzie używany do pobierania próbki.
  2. Zdezynfekuj probówki do pobierania krwi. Dodać 2 ml lodowatego buforu do cytometrii przepływowej do 5 ml probówki z polistyrenu o okrągłym dnie. Umieść rurkę na lodzie.
  3. Otwarta probówka do pobierania krwi. Dodać 10 μl krwi do probówki zawierającej bufor cytometrii przepływowej i wir impulsowy.
  4. Wirować przy 400 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
  5. Odessać supernatant. Dodać 1 ml buforu do lizy czerwonych krwinek (RBC), wirować pulsacyjnie i inkubować przez 3 minuty w temperaturze pokojowej (RT).
  6. Dodać 100 μL z 10x PBS. Wirować przy 400 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
  7. Powtórz kroki 8.5-8.6.
  8. Odessać supernatant. Dodaj 50 μl koktajlu barwiącego przeciwciała, wiruj i inkubuj przez 20 minut na lodzie w ciemności.
  9. Dodać 1 ml buforu do cytometrii przepływowej. Wirować przy 400 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
  10. Odessać supernatant. Dodać 180 μl buforu do cytometrii przepływowej.
  11. Dodać 20 μl SYTOX Blue Dead Cell Stain (końcowe stężenie 1:1000) w celu rozróżnienia żywych/martwych.
  12. Pobieraj próbki za pomocą cytometru przepływowego i analizuj dane za pomocą oprogramowania do akwizycji cytometru przepływowego lub programu do analizy danych cytometrii przepływowej.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

"Dzikie myszy" potencjalnie zawierają mikroorganizmy zwykle wykluczone z obiektów SPF, co stanowi wyzwanie dla praktyk hodowlanych zwierząt w instytucjach badawczych, które przestrzegają rygorystycznych standardów higieny. W ciągu ostatnich 4 lat naukowcy i weterynarze z Charité - Universitätsmedizin Berlin i Niemieckiego Centrum Ochrony Zwierząt Laboratoryjnych (Bf3R) opracowali urządzenie przeznaczone dla myszy z naturalnym mikrobiomem, wprowadzając rygorystyczne środki ochrony biologicznej w ramach wspólnego wysiłku (Rysunek 1). Aby zrealizować ten projekt, istniejący obiekt dla myszy został poddany gruntownej przebudowie, w tym instalacji prysznica powietrznego i kabiny z laminarnym przepływem powietrza. Obszary, w których hodowane i trzymane są "dzikie myszy" i myszy SPF, są oddzielone prysznicem powietrznym, a oba obszary mają wyznaczone sale zabiegowe. Materiał termostabilny opuszcza obszar dla "dzikich myszy" tylko przez autoklaw, podczas gdy materiały termolabilne, takie jak próbki, mogą być eksportowane przez szafę LAF do dalszego przetwarzania w obszarach laboratoryjnych (Rysunek 2). Ścisłe przestrzeganie wszystkich środków ochrony biologicznej jest niezbędne, aby zapobiec skażeniu obszarów, w których utrzymywane są warunki higieniczne SPF (Rysunek 3). Reasumując, projekt i środki bezpieczeństwa biologicznego w obiekcie dla "dzikich myszy" na Charité - Universitätsmedizin Berlin dają naukowcom możliwość prowadzenia badań na myszach posiadających naturalny mikrobiom, jednocześnie skutecznie zapobiegając rozprzestrzenianiu się mikroorganizmów na obszary obiektu dla zwierząt o wyższym poziomie higieny.

Cytometria przepływowa jest złotym standardem w immunologii komórkowej i służy do badania populacji komórek odpornościowych we krwi i tkankach w odpowiedzi na zmienione warunki środowiskowe. Na przykład dorośli ludzie mają znaczną liczbę limfocytów T pamięci krążących we krwi, które rozwijają się pod wpływem mikroorganizmów ze środowiska3. W tym przypadku cytometria przepływowa została wykorzystana do zbadania limfocytów T pamięci we krwi myszy hodowanych i trzymanych w warunkach SPF oraz we krwi "dzikich myszy" (Ryc. 4). "Dzikie myszy" skolonizowane naturalnym mikrobiomem, prezentują odrębną populację limfocytów T pamięci. W przeciwieństwie do tego, myszy hodowane i trzymane w warunkach SPF mają znacznie zmniejszone limfocyty T pamięci w krążeniu krwi. W związku z tym cytometria przepływowa może scharakteryzować wpływ różnych środowisk mikrobiologicznych na przedział immunologiczny. Granulację danych można zwiększyć, dodając dodatkowe markery komórek odpornościowych. Niedawno opracowane metody cytometrii przepływowej, takie jak cytometria czasu przelotu (CyTOF) i spektralna cytometria przepływowa, pozwalają na pozyskiwanie informacji na temat wielu parametrów, a tym samym na rozszerzanie liczby (sub)populacji komórek odpornościowych, które można określić ilościowo w tej samej próbce krwi i tkanki. Co więcej, produkcję cytokin komórkowych można również ocenić za pomocą cytometrii przepływowej, dostarczając informacji na temat funkcji komórek w odpowiedzi na naturalny mikrobiom.

figure-results-1
Rysunek 2: Przebieg pracy w placówce Wildling. Pobieranie próbek krwi i przetwarzanie próbek są przykładami, ale można je zastąpić innymi procedurami, takimi jak interwencje chirurgiczne z pobieraniem próbek tkanek i histologią. Skróty można znaleźć w Rysunek 1 legenda. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 3: Porównanie wymagań dotyczących środków ochrony osobistej (PPE) dla obszarów SPF i Wildling. W obszarze SPF (po lewej) standardowe środki ochrony indywidualnej składają się z jednej warstwy odzieży ochronnej. Z kolei obszar Wildling (po prawej) wymaga trzyetapowego procesu ochrony osobistej przed wejściem do prysznica powietrznego: pod kombinezonem zakłada się kasac (bielizna ochronna = krok 1) (krok 2). Ta dodatkowa warstwa pomaga utrzymać higienę i zapobiega zanieczyszczeniu krzyżowemu między obszarami. Po prysznicu powietrznym należy założyć obuwie przeznaczone do obszaru Dzikich (krok 3). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 4: Immunofenotyp "dzikich myszy". Próbki krwi od samców myszy SPF (n = 5 myszy i "dzikich myszy" (n = 5 myszy) w wieku 14 tygodni zostały wybarwione koktajlem przeciwciał skoniugowanych z fluoroforem przeciwko CD45, łańcuchowi TCR-β, CD4, CD8, CD44 i CD62L. Liczby to stosunek bramki rodzicielskiej ± odchylenia standardowego. Strategia bramkowania jest pokazana dla myszy SPF, z wyjątkiem dwóch ostatnich plam z SPF i "dzikich myszy". U "dzikich myszy" limfocyty T pamięci centralnej i efektorowej są zwiększone w porównaniu z myszami, które są hodowane i utrzymywane w warunkach SPF. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Myszy z naturalnym mikrobiomem są obiecującym narzędziem badawczym dla nauk podstawowych i stosowanych ze względu na ich bliższe podobieństwo do ludzkiego superorganizmu 3,9,10,11,12. Próby włączenia złożoności biologicznej do modeli mysich doprowadziły do opracowania różnych podejść, z których każde ma swoje zalety i ograniczenia 3,7,8,9,10,11,12. "Dzikie myszy" łączą w sobie korzyści płynące z kontrolowanego środowiska laboratoryjnego z naturalnym mikrobiomem. Takie podejście pozwala zachować stabilność w warunkach eksperymentalnych przy jednoczesnym zachowaniu naturalnej różnorodności mikrobiologicznej niezbędnej do badania złożonych interakcji biologicznych. W związku z tym terapie biomedyczne opracowane i przetestowane na "dzikich myszach" mają ogromny potencjał skutecznego przełożenia na zastosowania kliniczne.

Jednak nadal należy określić, w których przedklinicznych modelach choroby "dzikie myszy" są lepsze od myszy SPF. Co więcej, myszy z naturalnym mikrobiomem są nosicielami mikroorganizmów, takich jak wysoce zakaźne robaki, które są zwykle wykluczane z placówek instytucjonalnych. Dlatego hodowla i praca z tymi myszami stanowią wyzwanie dla praktyk hodowli zwierząt w instytucjach badawczych.

Stworzenie ośrodka dla "dzikich myszy" wymagało wspólnego wysiłku naukowców, weterynarzy i urzędników instytucjonalnych z Charité - Universitätsmedizin, Niemieckiego Centrum Ochrony Zwierząt Laboratoryjnych (Bf3R) i Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg (FAU). Po opracowaniu koncepcji obiektu, istniejący obiekt dla myszy został poddany gruntownej przebudowie w celu uwzględnienia rygorystycznych środków ochrony biologicznej. Zakład posiada certyfikat bezpieczeństwa biologicznego na poziomie 2 (BSL-2) w zakresie badań nad ludzkimi patogenami.

Tutaj opisano procedury operacyjne i biologiczne przechowawcze w obiekcie dla "dzikich myszy" na przykładzie pobierania próbek krwi do immunofenotypowania za pomocą cytometrii przepływowej. Ścisłe przestrzeganie środków bezpieczeństwa biologicznego podczas pracy w obiekcie dla "dzikich myszy" jest obowiązkowe, aby zapobiec rozprzestrzenianiu się mikroorganizmów na inne obszary obiektu dla zwierząt. Obejmuje to ograniczenie dostępu do placówki do jak najmniejszej liczby osób w ramach grupy badawczej. Dodatkowo, przed uzyskaniem wstępnego dostępu do obiektu, wymagana jest obowiązkowa sesja wprowadzająca prowadzona przez instytucjonalnego inspektora ds. dobrostanu zwierząt. Ogólne informacje i Standardowe Procedury Operacyjne (SOP) dotyczące pracy w placówce Wildling są również dostępne na wewnętrznej stronie internetowej ("Wildling wiki")14,15.

Podczas pracy wewnątrz obiektu należy prawidłowo nosić środki ochrony indywidualnej. Na przykład ważne jest, aby upewnić się, że żadne włosy nie są odsłonięte poza siatką do włosów, ponieważ jaja pasożytów mogą się do niej przyczepić. Jeśli eksperyment obejmuje zarówno myszy "dzikie", jak i myszy SPF, najpierw należy zająć się myszami SPF. Obszary dla "dzikich myszy" i myszy SPF w obiekcie są oddzielone prysznicem powietrznym, a każdy obszar jest wyposażony w wyznaczone sale zabiegowe. Pokoje te można rezerwować za pośrednictwem systemu rezerwacji online, co zapewnia płynność procesów pracy i ograniczoną liczbę osób wewnątrz obiektu. W każdej barierze mogą pracować jednocześnie maksymalnie dwie osoby z każdej strefy na salę zabiegową (PR1, PR2, LAF). Wyjątki dotyczą eksperymentów wymagających dodatkowego personelu w celu zapewnienia etycznego i sprawnego wykonania procedur. Myszy są przenoszone między pomieszczeniami w odpowiednich obszarach w zamkniętych klatkach IVC, które można otworzyć tylko pod stołem z przepływem laminarnym, aby zapewnić ochronę mikrobiologiczną i bezpieczeństwo pracy. W sali zabiegowej w strefie "Dzikie myszy" znajduje się również kabina z laminarnym przepływem powietrza (LAF). Ta kabina LAF musi być używana do preparacji i operacji "dzikich myszy", w tym do transferu zarodków. Transfer zarodków jest kluczową procedurą w kontekście "dzikich myszy", ponieważ jest używany do generowania nowych modeli "dzikich myszy". Na przykład przenoszenie zarodków z genetycznie zmodyfikowanych (GMO) szczepów myszy do "dzikich myszy" typu dzikiego jest wykorzystywane do tworzenia szczepów Wildling GMO. Kabina LAF wykorzystywana jest również do wywozu próbek, co wymaga koordynacji z osobą spoza obszaru "Dzikich myszy". Dalsze przetwarzanie próbek może odbywać się w sąsiedniej przestrzeni laboratoryjnej, co pozwala naukowcom na pracę z materiałami wrażliwymi na czas na miejscu, jednocześnie ograniczając miejsca, w których przetwarzane są próbki od "dzikich myszy".

Wszystkie inne materiały muszą pozostać w obiekcie Wildling lub muszą zostać autoklawowane przed opuszczeniem obiektu. Po zakończeniu pracy wszystkie materiały i powierzchnie są dezynfekowane środkami dezynfekującymi odpowiednimi dla warunków BSL2. Osoby, które weszły do obiektu dla "dzikich myszy" nie mogą tego samego dnia wchodzić do żadnego innego obiektu dla zwierząt.

Badania w placówce prowadzone są w ramach konsorcjum naukowego "The Wildling Mouse Model in Health and Disease (Wildling HeaD)" ułatwiającego komunikację między naukowcami pracującymi z "Wildling myszami", a także wymianę metod i wiedzy specjalistycznej. Konsorcjum jest wspierane przez Responsible PrecliniX z Berlińskiego Instytutu Zdrowia (BIH) QUEST Center for Responsible Research, które pomaga w procedurach wstępnej rejestracji badań na zwierzętach, solidnym projektowaniu eksperymentów i zarządzaniu jakością (www.bihealth.org/en/quest/service/service/responsible-preclinix).

Podsumowując, stworzono najnowocześniejszy obiekt, wyposażony w rygorystyczne środki ochrony biologicznej, aby wspierać bezpieczne i etyczne badania przedkliniczne. Placówka ta ułatwia badanie "dzikich myszy", które posiadają naturalny mikrobiom, skutecznie wypełniając lukę między kontrolowanymi warunkami laboratoryjnymi a rzeczywistymi środowiskami mikrobiologicznymi. Aby zbudować obiekt taki jak opisany, konieczne jest nadanie priorytetu nauce zespołowej i interdyscyplinarnej współpracy, z uwzględnieniem wiedzy naukowców, weterynarzy i urzędników instytucjonalnych, aby zapewnić skuteczne projektowanie i działanie środowisk o wysokim stopniu hermetyczności. Ponadto kluczowe znaczenie ma wdrożenie rygorystycznych środków ochrony biologicznej, zapewnienie kompleksowych szkoleń i opracowanie jasnych standardowych procedur operacyjnych (SOP). Ustanowienie wydajnej struktury komunikacyjnej, takiej jak wewnętrzna wiki, oraz ciągłe monitorowanie i walidacja warunków eksperymentalnych jeszcze bardziej zwiększy skuteczność i bezpieczeństwo placówki w zarządzaniu złożonymi modelami, takimi jak "dzikie myszy".

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez Charité 3R| S.P.R. był wspierany przez Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Niemiecka Fundacja Badawcza) Emmy Noether-Programm RO 6247/1-1 (numer projektu 446316360), DFG SFB1160 IMPATH (numer projektu 256073931) oraz TRR 359 PILOT (numer projektu 491676693). S.J. był wspierany przez Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Niemiecka Fundacja Badawcza) JO 1216/2-1 oraz Niemieckie Towarzystwo Stwardnienia Rozsianego (DMSG e.V.).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Alexa Fluor 700 przeciwciało anty-mysie CD45BioLegend103127Clone 30F-11
Animal ChowAltromin1324
APC przeciwciało anty-mysie CD4BioLegend100515Clone RM4-5
Probówka do pobierania krwiGreiner450475MiniCollect K3E, K3EDTA
Albumina surowicy bydlęcejSigma-AldrichA9647-100G
Przeciwciało przeciw mysim łańcuchowi TCR-beta Brilliant Violet 605BioLegend109241Clone H57-597
Przeciwciało anty-mysie CD8 Brilliant Violet 785Włosowate
Hirschmann9000210Hirschmann Minicaps, Na-hep
EDTAPrzeciwciało
anty-mysie CD44 FITCBioLegend103021Clone IM7
PerCP/Cyjanine5.5 przeciwciało anty-mysie CD62LBioLegend104431Clone MEL-14
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (10x)Gibco12579099
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (1x)Bufor lizujący RBC Gibco14190094
BioLegend420302
Rurka z polistyrenu z okrągłym dnemSarstedt55.476.005
SYTOX Niebieska plama martwych komórekInvitrogenS34852
Kombinezon Tyvek (DuPont)Fisher Scientific11371633
100749

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Voelkl, B., Wurbel, H., Krzywinski, M., Altman, N. The standardization fallacy. Nat Methods. 18 (1), 5-7 (2021).
  2. Voelkl, B., et al. Reproducibility of animal research in light of biological variation. Nat Rev Neurosci. 21 (7), 384-393 (2020).
  3. Beura, L. K., et al. Normalizing the environment recapitulates adult human immune traits in laboratory mice. Nature. 532 (7600), 512-516 (2016).
  4. Caruso, R., Ono, M., Bunker, M. E., Nunez, G., Inohara, N. Dynamic and asymmetric changes of the microbial communities after cohousing in laboratory mice. Cell Rep. 27 (11), 3401-3412.e3 (2019).
  5. Labuda, J. C., Fong, K. D., Mcsorley, S. J. Cohousing with dirty mice increases the frequency of memory T cells and has variable effects on intracellular bacterial infection. Immunohorizons. 6 (2), 184-190 (2022).
  6. Martin, M. D., et al. Cd115(+) monocytes protect microbially experienced mice against e. Coli-induced sepsis. Cell Rep. 42 (11), 113345(2023).
  7. Burger, S., et al. Natural microbial exposure from the earliest natural time point enhances immune development by expanding immune cell progenitors and mature immune cells. J Immunol. 210 (11), 1740-1751 (2023).
  8. Tabilas, C., et al. Early microbial exposure shapes adult immunity by altering cd8+ t cell development. Proc Natl Acad Sci U S A. 119 (49), e2212548119(2022).
  9. Reese, T. A., et al. Sequential infection with common pathogens promotes human-like immune gene expression and altered vaccine response. Cell Host Microbe. 19 (5), 713-719 (2016).
  10. Leung, J. M., et al. Rapid environmental effects on gut nematode susceptibility in rewilded mice. PLoS Biol. 16 (3), e2004108(2018).
  11. Sbierski-Kind, J., et al. Distinct housing conditions reveal a major impact of adaptive immunity on the course of obesity-induced type 2 diabetes. Front Immunol. 9, 1069(2018).
  12. Rosshart, S. P., et al. Wild mouse gut microbiota promotes host fitness and improves disease resistance. Cell. 171 (5), 1015-1028.e13 (2017).
  13. Rosshart, S. P., et al. Laboratory mice born to wild mice have natural microbiota and model human immune responses. Science. 365 (6452), eaaw4361(2019).
  14. Dirnagl, U., Kurreck, C., Castanos-Velez, E., Bernard, R. Quality management for academic laboratories: Burden or boon? Professional quality management could be very beneficial for academic research but needs to overcome specific caveats. EMBO Rep. 19 (11), e47143(2018).
  15. Dirnagl, U., Kurreck, C., Bernard, R., Przesdzing, I. Premier. , https://premier-qms.org/ (2024).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

myszy typu wildlingpobieranie krwipomieszczenie dla myszy laboratoryjnychhodowla zwierz tpopulacje kom rek odporno ciowychosobiste rodki ochrony indywidualnejluza powietrzna

Powiązane artykuły