Artykuł metodologiczny

Procedury operacyjne i hermetyzacji biologicznej w obiekcie dla myszy laboratoryjnych z naturalnym mikrobiomem: procedura immunofenotypowania

1.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/67100

⸱

13 grudnia 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1BIH QUEST Center for Responsible Research, Berlin Institute of Health (BIH) at Charité - Universitätsmedizin Berlin, 2German Federal Institute for Risk Assessment (BfR), German Centre for the Protection of Laboratory Animals (Bf3R), 3Institute of Microbiology, Infectious Diseases and Immunology, Charité - Universitätsmedizin Berlin, corporate member of Freie Universität Berlin and Humboldt-Universität zu Berlin, 4Experimental and Clinical Research Center (ECRC) & Max-Delbrück-Centrum für Molekulare Medizin in der Helmholtz-Gemeinschaft (MDC), 5Department of Experimental Neurology, Charité - Universitätsmedizin Berlin, corporate member of Freie Universität Berlin and Humboldt-Universität zu Berlin, Klinik und Hochschulambulanz für Neurologie, 6Center for Stroke Research Berlin, Charité - Universitätsmedizin Berlin, corporate member of Freie Universität Berlin and Humboldt-Universität zu Berlin, 7Einstein Center for Neuroscience, 8German Center for Cardiovascular Research (DZHK), partner site Berlin, 9Department of Neuropathology, Charité - Universitätsmedizin Berlin, corporate member of Freie Universität Berlin and Humboldt-Universität zu Berlin, 10Cluster of Excellence, NeuroCure, 11German Center for Neurodegenerative Diseases (DZNE) Berlin, 12Department of Hepatology and Gastroenterology, Charité - Universitätsmedizin Berlin, corporate member of Freie Universität Berlin and Humboldt-Universität zu Berlin, 13Institute of Animal Welfare, Animal Behavior and Laboratory Animal Science, Freie Universität Berlin, 14Forschungseinrichtungen für Experimentelle Medizin/FEM, Charité - Universitätsmedizin Berlin, corporate member of Freie Universität Berlin and Humboldt-Universität zu Berlin, 15Department of Pediatric Respiratory Medicine, Immunology and Critical Care Medicine, Charité - Universitätsmedizin Berlin, corporate member of Freie Universität Berlin and Humboldt-Universität zu Berlin, 16German Center for Lung Research (DZL), associated partner site, Berlin, 17Department of Infectious Diseases, Respiratory Medicine and Critical Care, Charité - Universitätsmedizin Berlin, corporate member of Freie Universität Berlin and Humboldt-Universität zu Berlin, 18Division of Toxicology, Institute of Clinical Pharmacology and Toxicology, Charité - Universitätsmedizin Berlin, corporate member of Freie Universität Berlin, Humboldt-Universität zu Berlin, and Berlin Institute of Health, 19Institute of Immunology, Charité-Universitätsmedizin Berlin, corporate member of Freie Universität Berlin and Humboldt-Universität zu Berlin, 20German Cancer Research Center, 21German Cancer Consortium, partner site Berlin, 22Department of Radiology (including Pediatric Radiology), Charité - Universitätsmedizin Berlin, corporate member of Freie Universität Berlin and Humboldt-Universität zu Berlin, 23Department of Microbiome Research, University Hospital Erlangen, Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg (FAU), 24Department of Medicine II, Faculty of Medicine, Medical Center - University of Freiburg

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj opisujemy strukturę i procedury operacyjne, w tym środki powstrzymywania mikroorganizmów w obiekcie dla "dzikich myszy", używając próbki krwi do immunofenotypowania jako przykładu.

Streszczenie

Wykorzystanie myszy laboratoryjnych z naturalnym mikrobiomem, takich jak "Dzikie myszy", oferuje obiecujące narzędzie badawcze zarówno dla nauk podstawowych, jak i stosowanych, ze względu na ich bliskie podobieństwo do ludzkiego superorganizmu. Jednak hodowla i utrzymanie tych myszy, które są siedliskiem zróżnicowanego mikrobiomu, w tym bakterii, wirusów i pasożytów, stanowi poważne wyzwanie dla obiektów hodowli zwierząt w instytucjach badawczych. Aby sprostać tym wyzwaniom, opracowano specjalistyczną koncepcję obiektu, w którym trzymane są "dzikie myszy" na Charité - Universitätsmedizin Berlin. Podejście to polegało na zaprojektowaniu obiektu o określonych cechach konstrukcyjnych i protokołach operacyjnych, aby skutecznie powstrzymać naturalny mikrobiom, chroniąc w ten sposób obszary o wyższych standardach higieny.

Metodologia pobierania próbek krwi zarówno od określonych myszy wolnych od patogenów (SPF), jak i "dzikich myszy" do immunofenotypowania, podkreślając przepływ pracy i środki biohermetyczności wdrożone w obiekcie. Niezwykłe wyniki pokazują, że "dzikie myszy" wystawione na działanie naturalnego mikrobiomu rozwijają odrębne populacje komórek odpornościowych, które są znacznie zmniejszone u myszy hodowanych i utrzymywanych w rygorystycznych warunkach higienicznych.

Znaczenie tego badania polega na jego potencjale do zapewnienia badaczom dostępu do myszy, które posiadają naturalny mikrobiom i dojrzały układ odpornościowy podobny do dorosłego człowieka. Podejście to może zwiększyć możliwości przełożenia wyników badań przedklinicznych na praktykę kliniczną, przyczyniając się tym samym do rozwoju badań biomedycznych.

Wprowadzenie

Eksperymenty na myszach są nadal niezbędne w nauce podstawowej i stosowanej, takiej jak badania przedkliniczne i toksykologiczne. Jednak standaryzacja higieny w środowiskach laboratoryjnych, mająca na celu redukcję szumu biologicznego i minimalizację zmienności wyników eksperymentalnych, doprowadziła w dużej mierze do wyeliminowania naturalnej mikrobioty. W związku z tym warunki, w których rodzą się i są utrzymywane higienicznie standaryzowane myszy laboratoryjne wolne od określonych patogenów (SPF), różnią się od rzeczywistych warunków, na które normalnie narażeni są ludzie i zwierzęta. Ta niezgodność między warunkami laboratoryjnymi a naturalnym środowiskiem, w którym występują ludzkie choroby, prowadzi do tzw. „błędu standaryzacji”: założenia, że minimalizacja zmienności warunków eksperymentalnych poprawia wyniki translacyjne. W rzeczywistości ogranicza to jednak biologiczną istotność odkryć1,2. Na przykład badania wykazały, że brak różnorodności mikrobiologicznej i środowiskowej u myszy SPF może skutkować niedorozwojem układu odpornościowego, co podważa wiarygodność badań immunologicznych i przedklinicznych3.

Zaproponowano kilka podejść w celu ograniczenia zmienności biologicznej w modelach mysich, z których każde posiada własne zalety i ograniczenia; obejmują one m.in. wspólne kwaterowanie z myszami dzikimi i myszami ze sklepów zoologicznych3,4,5,6,7,8, sekwencyjną ekspozycję na komensale9, utrzymywanie zwierząt w zewnętrznych wybiegach10 lub na ściółce pochodzącej od dużych zwierząt11 oraz przeszczepy kału od myszy dzikich12. Obiecującym nowym modelem mysim w badaniach przedklinicznych i toksykologicznych jest model „myszy Wildling”, który składa się ze standardowych szczepów myszy laboratoryjnych posiadających naturalny mikrobiom13. „Myszy Wildling” są uzyskiwane poprzez przeszczepianie embrionów ze szczepów myszy laboratoryjnych do myszy odłowionych w naturze. Podczas narodzin szczepy myszy laboratoryjnych przejmują naturalny mikrobiom swoich matek zastępczych, co naśladuje naturalną inokulację zachodzącą podczas porodu u ludzi13. „Myszy Wildling” można rozmnażać jak każdy inny szczep myszy laboratoryjnych, przy czym ich naturalny mikrobiom jest zachowywany w kolejnych pokoleniach.

„Myszy dzikie” (wildling mice) są nosicielami zróżnicowanej mikrobioty – w tym bakterii, wirusów i pasożytów – które są zazwyczaj wykluczane z hodowli myszy SPF. W związku z tym utrzymanie naturalnego mikrobiomu w placówkach badawczych stanowi wyzwanie, ponieważ mikroby te muszą być izolowane bez naruszania ogólnych standardów higieny SPF.

W Charité - Universitätsmedizin Berlin utworzono specjalistyczny ośrodek dla „myszy Wildling”, oddzielony od obszarów SPF rygorystycznymi środkami bioasekuracyjnymi. Obiekt obejmuje pomieszczenia hodowlane i doświadczalne, co zapewnia utrzymanie naturalnego mikrobiomu „myszy Wildling” przy jednoczesnej ochronie obszarów SPF (Rycina 1).

Pary założycielskie kolonii w Charité zostały sprowadzone z kolonii „Wilding mice”, utworzonej w Departamencie Badań nad Mikrobiomem w Szpitalu Uniwersyteckim w Erlangen na Uniwersytecie Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg (FAU) w Niemczech. Zostaną one dostarczone wraz z certyfikatem zdrowia i poddane monitorowaniu za pomocą rozszerzonego panelu w kierunku patogenów zoonotycznych przed importem założycieli kolonii. Do monitorowania mikrobiomu w czasie wykorzystywane będą zwierzęta strażnicze (sentinele). Zarówno myszy SPF, jak i „Wildling mice” są utrzymywane w tych samych warunkach. Myszy są rozrodzone i utrzymywane preferencyjnie w indywidualnie wentylowanych klatkach (IVC) typu II long w grupach po pięć myszy. Temperatura w obiekcie wynosi 22 °C, a cykl światło/ciemność trwa 12 h. Myszy otrzymują standardową paszę zbożową oraz wodę z kranu. Sterylizacja ściółki i elementów wzbogacających środowisko nie jest konieczna w przypadku myszy „Wildling mice”. Jednakże autoklawowanie tych przedmiotów zapobiega pomieszaniu materiałów w obszarach, w których utrzymywane są mysze SPF.

W niniejszym protokole zaprezentowano procedury immunofenotypowania zarówno dla myszy SPF, jak i „myszy Wildling”, podkreślając rygorystyczne protokoły ograniczania rozprzestrzeniania się drobnoustrojów w placówce dla „myszy Wildling”. Środki te zapewniają integralność środowisk SPF, umożliwiając jednocześnie korzystanie z zalet pracy z myszami posiadającymi naturalny mikrobiom.

Schemat sieci przepływu powietrza w układzie budynku, pokazujący drogi wentylacji i oznaczenia pomieszczeń w celu zapewnienia wydajności.
Rysunek 1: Układ zaplecza dla myszy typu Wildling. E1 = wejście do obiektu. Strzałki wskazują drogę wejścia do obiektu. E2 = dostęp do kabiny z laminarnym przepływem powietrza z zewnątrz obiektu. PA = śluza personelu z prysznicem powietrznym. AS = prysznic powietrzny. R1, R2 = pomieszczenia do hodowli myszy typu Wildling. R3 = pomieszczenie do utrzymywania myszy typu Wildling. R4 = pomieszczenie do utrzymywania myszy SPF. PR1 = pomieszczenie zabiegowe dla myszy SPF. PR2 = pomieszczenie zabiegowe dla myszy typu Wildling. SB = sterylny stół roboczy. EE = wyjścia ewakuacyjne. CR = szatnia przed kabiną LAF. LAF = kabina z laminarnym przepływem powietrza do interwencji w warunkach ochronnego przepływu powietrza. A = autoklaw. ER = pomieszczenie sprzętowe. Zielone strzałki reprezentują drogi dostępne podczas pracy ze zwierzętami SPF, a żółte strzałki wskazują ścieżki dostępne podczas pracy z myszami typu Wildling po skorzystaniu z prysznica powietrznego. Niebieskie strzałki wskazują dostęp wyłącznie dla personelu opiekuńczego. Czerwona linia oznacza szklaną ścianę wewnątrz kabiny LAF, która dzieli przestrzeń na dwie sekcje, do których można dostać się albo z E1 przez PR2, albo z E2 przez CR. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Protokół

Obiekt do "dzikich myszy" i procedury z udziałem żywych zwierząt zostały zatwierdzone przez odpowiedzialne biuro państwowe ds. eksperymentów na zwierzętach, "Landesamt für Gesundheit und Soziales Berlin" (LAGeSo). Najważniejsze kroki protokołu są podsumowane w Rysunek 2.

1. Uzyskanie dostępu do obiektu Wilding

  1. Uzyskaj osobiste wprowadzenie do procedur operacyjnych i biohermetycznych w obiekcie od odpowiedzialnego inspektora ds. dobrostanu zwierząt.
  2. Zdobądź klucz transpondera, aby wejść do placówki dla "dzikich myszy" i zarezerwować sale zabiegowe za pośrednictwem systemu rezerwacji online.

2. Wejście do placówki dla "Dzikich myszy"

  1. Zdeponuj ubrania w przebieralni.
  2. Przebierz się w odzież obszarową: spodnie, kasak i jednorazowe ochraniacze na buty (Rysunek 3).

3. Pobieranie próbek krwi od myszy SPF w obszarze SPF

  1. Przenieś myszy SPF (samce i samice, 8-20 tygodni) z pomieszczenia, w którym są trzymane (R4) do sali zabiegowej dla zwierząt SPF (PR1) w zamkniętej klatce IVC.
  2. Włącz ławkę z przepływem laminarnym i zdezynfekuj powierzchnię miejsca pracy etanolem o sile 70% obj. Pracuj wewnątrz ławki.
  3. Sprawdź rurki kapilarne pod kątem pękniętych lub wyszczerbionych odcinków, aby uniknąć zwiększonego ryzyka pęknięcia lub uszkodzenia.
  4. W krótkim znieczuleniu ogólnym izofluranem (indukcja przy 5% izofluranu w powietrzu medycznym wzbogaconym tlenem, a następnie 1,5%-2,0% w celu utrzymania), po utracie odruchu wycofania pedału (jak wskazano przez uszczypnięcie palca), ściśnij żyły szyjne myszy, chwytając kark szyi.
  5. Jedną ręką zabezpiecz głowę zwierzęcia kciukiem i palcem wskazującym. Wprowadzić świeżą kapilarnę do przyśrodkowej kanty oka pod błoną nazębną pod kątem 45°. Upewnij się, że naczynia włosowate znajdują się między gałką oczną a kostnym oczodołem oka.
    UWAGA: Aby uniknąć urazu, nie pozwól, aby końcówka rurki kapilarnej dotykała powierzchni oka.
  6. Przeprowadź kapilarę przez błonę zatokową delikatnym osiowym ruchem obrotowym. Kontynuuj obracanie rurki z tyłu oczodołu, aż zacznie płynąć krew. Zebrać co najmniej 15 μl krwi do probówki zawierającej kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA) (około 1 kropla).
  7. Przed usunięciem naczynia włosowatego poluzuj uchwyt na karku szyi, aby ograniczyć krwawienie do tkanki do minimum. Aby zapewnić dobrą hemostazę, użyj czystego gazika lub wacika, aby zatrzymać krwawienie.
  8. Lekko obróć probówkę, aby wymieszać krew i EDTA. Nie potrząsaj tubką. Próbkę krwi należy przechowywać na lodzie.
  9. Zdezynfekuj powierzchnię roboczą i wyłącz stół z przepływem laminarnym. Zwróć myszy SPF w zamkniętym IVC do pomieszczenia z SPF (R4).

4. Wejście do obszaru dla "Dzikich myszy"

  1. Zdejmij buty i skarpetki w przedpokoju prysznica powietrznego (PA). Załóż skarpety i środki ochrony osobistej całego ciała (PPE) składające się z kombinezonu Tyvek, siatki na włosy, jeśli to konieczne, bawełnianych rękawiczek, rękawiczek nitrylowych i masek na twarz (Rysunek 3).
  2. Wejdź do prysznica powietrznego w skarpetach przez samoprzylepną wykładzinę podłogową. Podczas kąpieli powietrznej podnieś ramiona i wykonaj obrót o 360°.
  3. Wyjdź z prysznica powietrznego i załóż obuwie po drugiej stronie.

5. Pobieranie próbek krwi od "dzikich myszy"

  1. Przenieś "dzikie myszy" (samce i samice, 8 - 20 tygodni) z pomieszczenia, w którym są trzymane (R3) w zamkniętej klatce IVC, do sali zabiegowej (PR2).
  2. Włącz ławkę z przepływem laminarnym i zdezynfekuj powierzchnię miejsca pracy.
  3. Postępuj zgodnie z procedurami opisanymi dla pobierania próbek myszy SPF w sekcji 3, krokach 2-8.
  4. Po zakończeniu pobierania krwi należy zmienić rękawiczki. Zdezynfekuj wszystkie materiały i powierzchnie. Wyłączyć ławkę z przepływem laminarnym.

6. Eksport próbek krwi z obszaru "Dzikie myszy" za pomocą szafki z laminarnym przepływem powietrza (LAF)

UWAGA: Sala zabiegowa (PR2) zawiera szafkę LAF, która służy jako zamek materiałowy i sterylne pomieszczenie interwencyjne. Próbki są przenoszone przez kabinę LAF. Wnętrze jest dostępne zarówno od wewnątrz (przez E1 i PR2), jak i na zewnątrz (przez E2 i CR) obszar Wildling i jest podzielony pośrodku szklaną ścianą z przesuwanymi drzwiami (Rysunek 1). Do eksportu materiałów potrzebne są dwie osoby: Osoba 1 (wewnątrz obszaru Wildling [via PR2]) wykona kroki 6.1 i 6.2. Osoba 2 (poza obszarem Dzikich [przez E2]) wykona kroki 6.3-6.5.

  1. Zdezynfekować pojemniki na próbki. Wyjąć pojemniki na próbki przez drzwi przesuwne w szklanej ścianie kabiny LAF.
  2. Po zakończeniu przekazywania pojemników z próbkami osobie 2 należy odebrać odzież ochronną od osoby 2 (nosi odzież ochronną w zamku ochronnym kabiny) znajdującą się po drugiej stronie kabiny LAF i zutylizować ją. Zdezynfekuj wszystkie powierzchnie.
  3. Załóż odzież ochronną w dostępie LAF przed kabiną LAF (CR, Rysunek 1).
  4. Zdezynfekowane pojemniki na próbki z obszaru Wildling należy odbierać bezdotykowo przez przesuwane drzwi w szklanej ścianie kabiny LAF.
  5. Zdjąć odzież ochronną i przepuścić ją przez drzwi przesuwne do wnętrza kabiny LAF w celu utylizacji.

7. Wyjście z placówki dla "Dzikich myszy"

  1. Zostaw jednorazowe kombinezony i obuwie terenowe w tym obszarze. Wyrzuć siatkę na włosy, gumowe rękawiczki i maskę na twarz.
    UWAGA: Buty i kombinezony mogą być ponownie użyte.
  2. Natychmiast wejdź do prysznica powietrznego w skarpetkach obszarowych. Podnieś ramiona i wykonaj obrót o 360° podczas kąpieli powietrznej.
  3. Pozostaw prysznic powietrzny i umieść skarpetki w kolektorze na pranie. Załóż skarpetki i buty oraz jednorazowe ochraniacze na buty. Zdeponuj odzież w przebieralni w kolektorze pralniczym. Przebieranie się w ubrania w przebieralni

8. Przetwarzanie i analiza próbek krwi

  1. Przynieś próbki krwi do laboratorium.
    1. Przygotuj koktajl barwienia przeciwciał sprzężonych z fluoroforem: Do każdej próbki dodać 0,25 μl anty-mysiego CD45 Alexa Fluor 700, 0,25 μl łańcucha anty-mysiego TCR-β Brilliant Violet 605, 0,25 μl anty-mysiego CD4 APC, 0,25 μl anty-mysiego CD8 Brilliant Violet, 0,25 μl anty-mysiego CD44 FITC i 0,25 μl przeciwciała anty-mysiego CD62L PerCP/cyjanine5,5 do 50 μl buforu cytometrii przepływowej (sól fizjologiczna buforowana fosforanami, 2 mM EDTA, 0,1% albumina surowicy bydlęcej, 4 °C). Trzymaj w ciemności na lodzie do kroku 8.8.
      UWAGA: Zastosowane fluorofory można dostosować do konfiguracji cytometru przepływowego, który będzie używany do pobierania próbki.
  2. Zdezynfekuj probówki do pobierania krwi. Dodać 2 ml lodowatego buforu do cytometrii przepływowej do 5 ml probówki z polistyrenu o okrągłym dnie. Umieść rurkę na lodzie.
  3. Otwarta probówka do pobierania krwi. Dodać 10 μl krwi do probówki zawierającej bufor cytometrii przepływowej i wir impulsowy.
  4. Wirować przy 400 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
  5. Odessać supernatant. Dodać 1 ml buforu do lizy czerwonych krwinek (RBC), wirować pulsacyjnie i inkubować przez 3 minuty w temperaturze pokojowej (RT).
  6. Dodać 100 μL z 10x PBS. Wirować przy 400 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
  7. Powtórz kroki 8.5-8.6.
  8. Odessać supernatant. Dodaj 50 μl koktajlu barwiącego przeciwciała, wiruj i inkubuj przez 20 minut na lodzie w ciemności.
  9. Dodać 1 ml buforu do cytometrii przepływowej. Wirować przy 400 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
  10. Odessać supernatant. Dodać 180 μl buforu do cytometrii przepływowej.
  11. Dodać 20 μl SYTOX Blue Dead Cell Stain (końcowe stężenie 1:1000) w celu rozróżnienia żywych/martwych.
  12. Pobieraj próbki za pomocą cytometru przepływowego i analizuj dane za pomocą oprogramowania do akwizycji cytometru przepływowego lub programu do analizy danych cytometrii przepływowej.

Wyniki

„Myszy dzikie” (wilding mice) mogą być nosicielami mikroorganizmów zazwyczaj wykluczanych z obiektów SPF, co stanowi wyzwanie dla praktyk chowu zwierząt w instytucjach badawczych przestrzegających rygorystycznych norm higienicznych. W ciągu ostatnich 4 lat naukowcy i lekarze weterynarii z Charité - Universitätsmedizin Berlin oraz Niemieckiego Centrum Ochrony Zwierząt Laboratoryjnych (Bf3R) w ramach wspólnego przedsięwzięcia opracowali zaplecze przeznaczone dla myszy z naturalnym mikrobiomem, wdrażając rygorystyczne środki bioasekuracji (Rysunek 1). Aby zrealizować ten projekt, istniejący wybieg dla myszy poddano gruntownej przebudowie, w tym instalacji śluzy powietrznej oraz kabiny z laminarnym przepływem powietrza. Obszary, w których rozmnażane i utrzymywane są „myszy dzikie” oraz myszy SPF, są oddzielone śluzą powietrzną, a oba obszary posiadają wyznaczone pomieszczenia zabiegowe. Materiały termostabilne opuszczają obszar „myszy dzikich” wyłącznie za pomocą autoklawu, natomiast materiały termolabilne, takie jak próbki, mogą być eksportowane przez komorę LAF w celu dalszego przetwarzania w obszarach laboratoryjnych (Rysunek 2). Ścisłe przestrzeganie wszystkich środków bioasekuracji jest niezbędne, aby zapobiec kontaminacji obszarów, w których zachowane są warunki higieniczne SPF (Rysunek 3). Podsumowując, projekt i środki bioasekuracji zaplecza dla „myszy dzikich” w Charité - Universitätsmedizin Berlin dają naukowcom możliwość prowadzenia badań na myszach z naturalnym mikrobiomem, skutecznie zapobiegając rozprzestrzenianiu się mikroorganizmów do częściy hodowli zwierząt o wyższym poziomie higieny.

Cytometria przepływowa jest złotym standardem w immunologii komórkowej i służy do badania populacji komórek odpornościowych we krwi i tkankach w odpowiedzi na zmienne warunki środowiskowe. Na przykład u dorosłych ludzi w krwi krąży znaczna liczba limfocytów T pamięci, które rozwijają się po ekspozycji na mikroorganizmy z otoczenia3. W niniejszej pracy cytometrię przepływową wykorzystano do badania limfocytów T pamięci we krwi myszy hodowanych i utrzymywanych w warunkach SPF oraz we krwi tzw. „myszy dzikich” („Wildling mice”) (Rycyna 4). „Myszy dzikie”, skolonizowane naturalnym mikrobiomem, wykazują odrębną populację limfocytów T pamięci. W przeciwieństwie do nich, myszy hodowane i utrzymywane w warunkach SPF mają znacznie zredukowaną liczbę limfocytów T pamięci w krwiobiegu. Zatem cytometria przepływowa pozwala scharakteryzować wpływ różnych środowisk mikrobiologicznych na komponent immunologiczny. Szczegółowość danych można zwiększyć poprzez zastosowanie dodatkowych markerów komórek odpornościowych. Niedawno opracowane podejścia w cytometrii przepływowej, takie jak cytometria czasu przelotu (CyTOF) oraz spektralna cytometria przepływowa, umożliwiają pozyskiwanie informacji o wielu parametrach, rozszerzając tym samym liczbę (sub)populacji komórek odpornościowych, które można ilościowo określić w tej samej próbce krwi i tkanki. Ponadto za pomocą cytometrii przepływowej można ocenić produkcję cytokin komórkowych, co dostarcza informacji o funkcji komórek w odpowiedzi na naturalny mikrobiom.

Schemat dostępu do obiektu Wildling; ŚOI, śluza powietrzna, eksport próbek, pobieranie krwi, analiza cytometryczna.
Rysunek 2: Schemat pracy w obiekcie Wildling. Pobieranie krwi i przetwarzanie próbek są przykładami, ale mogą zostać zastąpione innymi procedurami, takimi jak interwencje chirurgiczne z pobieraniem tkanek i badaniem histologicznym. Skróty wyjaśniono w legendzie do Rysunku 1. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Proces zakładania kombinezonu ochronnego; schemat; przedstawia etapy zmiany odzieży sterylnej w warunkach pomieszczenia czystego.
Rysunek 3: Porównanie wymagań dotyczących środków ochrony indywidualnej (PPE) dla obszarów SPF i Wildling. W obszarze SPF (po lewej) standardowe PPE składa się z jednej warstwy odzieży ochronnej. W przeciwieństwie do niego, obszar Wildling (po prawej) wymaga trzyetapowego procesu zakładania PPE przed wejściem do śluzy powietrznej: pod kombinezon (etap 2) zakłada się kasac (bieliznę ochronną = etap 1). Ta dodatkowa warstwa pomaga utrzymać higienę i zapobiega kontaminacji krzyżowej między obszarami. Po przejściu przez śluzę powietrzną należy założyć obuwie przeznaczone dla obszaru Wildling (etap 3). Aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku, kliknij tutaj.

Schematy analizy cytometrii przepływowej leukocytów, limfocytów i komórek CD45+ z markerami TCR-β+.
Rycina 4: Immunofenotyp „myszy Wildling”. Próbki krwi od samców myszy SPF (n = 5 myszy) oraz „myszy Wilding” (n = 5 myszy) w wieku 14 tygodni barwiono koktajlem przeciwciał sprzężonych z fluoroforami przeciwko CD45, łańcuchowi TCR-β, CD4, CD8, CD44 i CD62L. Liczby oznaczają proporcję w bramce nadrzędnej ± odchylenie standardowe. Strategia bramkowania przedstawiona jest dla myszy SPF, z wyjątkiem dwóch ostatnich wykresów dla myszy SPF i „myszy Wildling”. U „myszy Wildling” liczba centralnych i efektorowych komórek T pamięci jest zwiększona w porównaniu z myszami hodowanymi i utrzymywanymi w warunkach SPF. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Dyskusja

Myszy z naturalnym mikrobiomem są obiecującym narzędziem badawczym dla nauk podstawowych i stosowanych ze względu na ich bliższe podobieństwo do ludzkiego superorganizmu 3,9,10,11,12. Próby włączenia złożoności biologicznej do modeli mysich doprowadziły do opracowania różnych podejść, z których każde ma swoje zalety i ograniczenia 3,7,8,9,10,11,12. "Dzikie myszy" łączą w sobie korzyści płynące z kontrolowanego środowiska laboratoryjnego z naturalnym mikrobiomem. Takie podejście pozwala zachować stabilność w warunkach eksperymentalnych przy jednoczesnym zachowaniu naturalnej różnorodności mikrobiologicznej niezbędnej do badania złożonych interakcji biologicznych. W związku z tym terapie biomedyczne opracowane i przetestowane na "dzikich myszach" mają ogromny potencjał skutecznego przełożenia na zastosowania kliniczne.

Jednak nadal należy określić, w których przedklinicznych modelach choroby "dzikie myszy" są lepsze od myszy SPF. Co więcej, myszy z naturalnym mikrobiomem są nosicielami mikroorganizmów, takich jak wysoce zakaźne robaki, które są zwykle wykluczane z placówek instytucjonalnych. Dlatego hodowla i praca z tymi myszami stanowią wyzwanie dla praktyk hodowli zwierząt w instytucjach badawczych.

Stworzenie ośrodka dla "dzikich myszy" wymagało wspólnego wysiłku naukowców, weterynarzy i urzędników instytucjonalnych z Charité - Universitätsmedizin, Niemieckiego Centrum Ochrony Zwierząt Laboratoryjnych (Bf3R) i Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg (FAU). Po opracowaniu koncepcji obiektu, istniejący obiekt dla myszy został poddany gruntownej przebudowie w celu uwzględnienia rygorystycznych środków ochrony biologicznej. Zakład posiada certyfikat bezpieczeństwa biologicznego na poziomie 2 (BSL-2) w zakresie badań nad ludzkimi patogenami.

Tutaj opisano procedury operacyjne i biologiczne przechowawcze w obiekcie dla "dzikich myszy" na przykładzie pobierania próbek krwi do immunofenotypowania za pomocą cytometrii przepływowej. Ścisłe przestrzeganie środków bezpieczeństwa biologicznego podczas pracy w obiekcie dla "dzikich myszy" jest obowiązkowe, aby zapobiec rozprzestrzenianiu się mikroorganizmów na inne obszary obiektu dla zwierząt. Obejmuje to ograniczenie dostępu do placówki do jak najmniejszej liczby osób w ramach grupy badawczej. Dodatkowo, przed uzyskaniem wstępnego dostępu do obiektu, wymagana jest obowiązkowa sesja wprowadzająca prowadzona przez instytucjonalnego inspektora ds. dobrostanu zwierząt. Ogólne informacje i Standardowe Procedury Operacyjne (SOP) dotyczące pracy w placówce Wildling są również dostępne na wewnętrznej stronie internetowej ("Wildling wiki")14,15.

Podczas pracy wewnątrz obiektu należy prawidłowo nosić środki ochrony indywidualnej. Na przykład ważne jest, aby upewnić się, że żadne włosy nie są odsłonięte poza siatką do włosów, ponieważ jaja pasożytów mogą się do niej przyczepić. Jeśli eksperyment obejmuje zarówno myszy "dzikie", jak i myszy SPF, najpierw należy zająć się myszami SPF. Obszary dla "dzikich myszy" i myszy SPF w obiekcie są oddzielone prysznicem powietrznym, a każdy obszar jest wyposażony w wyznaczone sale zabiegowe. Pokoje te można rezerwować za pośrednictwem systemu rezerwacji online, co zapewnia płynność procesów pracy i ograniczoną liczbę osób wewnątrz obiektu. W każdej barierze mogą pracować jednocześnie maksymalnie dwie osoby z każdej strefy na salę zabiegową (PR1, PR2, LAF). Wyjątki dotyczą eksperymentów wymagających dodatkowego personelu w celu zapewnienia etycznego i sprawnego wykonania procedur. Myszy są przenoszone między pomieszczeniami w odpowiednich obszarach w zamkniętych klatkach IVC, które można otworzyć tylko pod stołem z przepływem laminarnym, aby zapewnić ochronę mikrobiologiczną i bezpieczeństwo pracy. W sali zabiegowej w strefie "Dzikie myszy" znajduje się również kabina z laminarnym przepływem powietrza (LAF). Ta kabina LAF musi być używana do preparacji i operacji "dzikich myszy", w tym do transferu zarodków. Transfer zarodków jest kluczową procedurą w kontekście "dzikich myszy", ponieważ jest używany do generowania nowych modeli "dzikich myszy". Na przykład przenoszenie zarodków z genetycznie zmodyfikowanych (GMO) szczepów myszy do "dzikich myszy" typu dzikiego jest wykorzystywane do tworzenia szczepów Wildling GMO. Kabina LAF wykorzystywana jest również do wywozu próbek, co wymaga koordynacji z osobą spoza obszaru "Dzikich myszy". Dalsze przetwarzanie próbek może odbywać się w sąsiedniej przestrzeni laboratoryjnej, co pozwala naukowcom na pracę z materiałami wrażliwymi na czas na miejscu, jednocześnie ograniczając miejsca, w których przetwarzane są próbki od "dzikich myszy".

Wszystkie inne materiały muszą pozostać w obiekcie Wildling lub muszą zostać autoklawowane przed opuszczeniem obiektu. Po zakończeniu pracy wszystkie materiały i powierzchnie są dezynfekowane środkami dezynfekującymi odpowiednimi dla warunków BSL2. Osoby, które weszły do obiektu dla "dzikich myszy" nie mogą tego samego dnia wchodzić do żadnego innego obiektu dla zwierząt.

Badania w placówce prowadzone są w ramach konsorcjum naukowego "The Wildling Mouse Model in Health and Disease (Wildling HeaD)" ułatwiającego komunikację między naukowcami pracującymi z "Wildling myszami", a także wymianę metod i wiedzy specjalistycznej. Konsorcjum jest wspierane przez Responsible PrecliniX z Berlińskiego Instytutu Zdrowia (BIH) QUEST Center for Responsible Research, które pomaga w procedurach wstępnej rejestracji badań na zwierzętach, solidnym projektowaniu eksperymentów i zarządzaniu jakością (www.bihealth.org/en/quest/service/service/responsible-preclinix).

Podsumowując, stworzono najnowocześniejszy obiekt, wyposażony w rygorystyczne środki ochrony biologicznej, aby wspierać bezpieczne i etyczne badania przedkliniczne. Placówka ta ułatwia badanie "dzikich myszy", które posiadają naturalny mikrobiom, skutecznie wypełniając lukę między kontrolowanymi warunkami laboratoryjnymi a rzeczywistymi środowiskami mikrobiologicznymi. Aby zbudować obiekt taki jak opisany, konieczne jest nadanie priorytetu nauce zespołowej i interdyscyplinarnej współpracy, z uwzględnieniem wiedzy naukowców, weterynarzy i urzędników instytucjonalnych, aby zapewnić skuteczne projektowanie i działanie środowisk o wysokim stopniu hermetyczności. Ponadto kluczowe znaczenie ma wdrożenie rygorystycznych środków ochrony biologicznej, zapewnienie kompleksowych szkoleń i opracowanie jasnych standardowych procedur operacyjnych (SOP). Ustanowienie wydajnej struktury komunikacyjnej, takiej jak wewnętrzna wiki, oraz ciągłe monitorowanie i walidacja warunków eksperymentalnych jeszcze bardziej zwiększy skuteczność i bezpieczeństwo placówki w zarządzaniu złożonymi modelami, takimi jak "dzikie myszy".

Oświadczenia

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez Charité 3R| S.P.R. był wspierany przez Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Niemiecka Fundacja Badawcza) Emmy Noether-Programm RO 6247/1-1 (numer projektu 446316360), DFG SFB1160 IMPATH (numer projektu 256073931) oraz TRR 359 PILOT (numer projektu 491676693). S.J. był wspierany przez Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Niemiecka Fundacja Badawcza) JO 1216/2-1 oraz Niemieckie Towarzystwo Stwardnienia Rozsianego (DMSG e.V.).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Alexa Fluor 700 przeciwciało anty-mysie CD45BioLegend103127Clone 30F-11
Animal ChowAltromin1324
APC przeciwciało anty-mysie CD4BioLegend100515Clone RM4-5
Probówka do pobierania krwiGreiner450475MiniCollect K3E, K3EDTA
Albumina surowicy bydlęcejSigma-AldrichA9647-100G
Przeciwciało przeciw mysim łańcuchowi TCR-beta Brilliant Violet 605BioLegend109241Clone H57-597
Przeciwciało anty-mysie CD8 Brilliant Violet 785Włosowate
Hirschmann9000210Hirschmann Minicaps, Na-hep
EDTAPrzeciwciało
anty-mysie CD44 FITCBioLegend103021Clone IM7
PerCP/Cyjanine5.5 przeciwciało anty-mysie CD62LBioLegend104431Clone MEL-14
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (10x)Gibco12579099
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (1x)Bufor lizujący RBC Gibco14190094
BioLegend420302
Rurka z polistyrenu z okrągłym dnemSarstedt55.476.005
SYTOX Niebieska plama martwych komórekInvitrogenS34852
Kombinezon Tyvek (DuPont)Fisher Scientific11371633
100749

Bibliografia

  1. Voelkl, B., Wurbel, H., Krzywinski, M., Altman, N. The standardization fallacy. Nat Methods. 18 (1), 5-7 (2021).
  2. Voelkl, B., et al. Reproducibility of animal research in light of biological variation. Nat Rev Neurosci. 21 (7), 384-393 (2020).
  3. Beura, L. K., et al. Normalizing the environment recapitulates adult human immune traits in laboratory mice. Nature. 532 (7600), 512-516 (2016).
  4. Caruso, R., Ono, M., Bunker, M. E., Nunez, G., Inohara, N. Dynamic and asymmetric changes of the microbial communities after cohousing in laboratory mice. Cell Rep. 27 (11), 3401-3412.e3 (2019).
  5. Labuda, J. C., Fong, K. D., Mcsorley, S. J. Cohousing with dirty mice increases the frequency of memory T cells and has variable effects on intracellular bacterial infection. Immunohorizons. 6 (2), 184-190 (2022).
  6. Martin, M. D., et al. Cd115(+) monocytes protect microbially experienced mice against e. Coli-induced sepsis. Cell Rep. 42 (11), 113345(2023).
  7. Burger, S., et al. Natural microbial exposure from the earliest natural time point enhances immune development by expanding immune cell progenitors and mature immune cells. J Immunol. 210 (11), 1740-1751 (2023).
  8. Tabilas, C., et al. Early microbial exposure shapes adult immunity by altering cd8+ t cell development. Proc Natl Acad Sci U S A. 119 (49), e2212548119(2022).
  9. Reese, T. A., et al. Sequential infection with common pathogens promotes human-like immune gene expression and altered vaccine response. Cell Host Microbe. 19 (5), 713-719 (2016).
  10. Leung, J. M., et al. Rapid environmental effects on gut nematode susceptibility in rewilded mice. PLoS Biol. 16 (3), e2004108(2018).
  11. Sbierski-Kind, J., et al. Distinct housing conditions reveal a major impact of adaptive immunity on the course of obesity-induced type 2 diabetes. Front Immunol. 9, 1069(2018).
  12. Rosshart, S. P., et al. Wild mouse gut microbiota promotes host fitness and improves disease resistance. Cell. 171 (5), 1015-1028.e13 (2017).
  13. Rosshart, S. P., et al. Laboratory mice born to wild mice have natural microbiota and model human immune responses. Science. 365 (6452), eaaw4361(2019).
  14. Dirnagl, U., Kurreck, C., Castanos-Velez, E., Bernard, R. Quality management for academic laboratories: Burden or boon? Professional quality management could be very beneficial for academic research but needs to overcome specific caveats. EMBO Rep. 19 (11), e47143(2018).
  15. Dirnagl, U., Kurreck, C., Bernard, R., Przesdzing, I. Premier. , https://premier-qms.org/ (2024).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

myszy typu wildlingpobieranie krwipomieszczenie dla myszy laboratoryjnychhodowla zwierzątpopulacje komórek odpornościowychosobiste środki ochrony indywidualnejśluza powietrzna
Procedury operacyjne i hermetyzacji biologicznej w obiekcie dla myszy laboratoryjnych z naturalnym mikrobiomem: procedura immunofenotypowania
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.