Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Podłużne obrazowanie in vivo komórek siatkówki z dostosowanymi serotypami wirusa związanego z adenowirusem za pomocą konfokalnej skaningowej oftalmoskopii laserowej

993 wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/67106

⸱

11 października 2024

 ,  ,  ,  ,  , 
1Beijing Institute of Ophthalmology, Beijing Tongren Eye Center, Beijing Tongren Hospital, Capital Medical University, Beijing Ophthalmology & Visual Sciences Key Laboratory, 2Second Clinical Medical School, Capital Medical University, 3Beijing Institute of Brain Disorders, Collaborative Innovation Center for Brain Disorders, Capital Medical University, 4Beijing Key Laboratory of Fundamental Research on Biomechanics in Clinical Application, Capital Medical University

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół opisuje użycie wektorów wirusa związanego z adenowirusem (AAV) do znakowania specyficznego dla komórki oraz obrazowania in vivo za pomocą konfokalnego skaningowego oftalmoskopu laserowego (CSLO). Metoda ta umożliwia badanie różnych typów komórek siatkówki i ich udziału w funkcjonowaniu i chorobie siatkówki.

Streszczenie

Dynamiczna natura procesów komórkowych siatkówki wymaga postępu w dostarczaniu genów i technikach monitorowania na żywo, aby zwiększyć zrozumienie i leczenie chorób oczu. Badanie to wprowadza zoptymalizowane podejście do wirusa związanego z adenowirusem (AAV), wykorzystujące określone serotypy i promotory w celu osiągnięcia optymalnej wydajności transfekcji w docelowych komórkach siatkówki, w tym komórkach zwojowych siatkówki (RGC) i gleju Müllera. Wykorzystując precyzję konfokalnej skaningowej oftalmoskopii laserowej (CSLO), praca ta przedstawia nieinwazyjną metodę obrazowania in vivo, która rejestruje podłużną ekspresję białka zielonej fluorescencji (GFP), w którym pośredniczy AAV. Takie podejście eliminuje potrzebę przeprowadzania procedur terminalnych, zachowując ciągłość obserwacji i dobre samopoczucie badanego. Co więcej, sygnał GFP można śledzić w RGC zakażonych AAV wzdłuż ścieżki wzrokowej do górnego wzgórka (SC) i jądra kolankowatego bocznego (LGN), co umożliwia bezpośrednie mapowanie szlaków wzrokowych. Odkrycia te dostarczają szczegółowego protokołu i demonstrują zastosowanie tego potężnego narzędzia do badań w czasie rzeczywistym nad zachowaniem komórek siatkówki, patogenezą choroby i skutecznością interwencji terapii genowej, oferując cenne informacje na temat żywej siatkówki i jej połączeń.

Wprowadzenie

Będąc jedyną optycznie dostępną częścią ośrodkowego układu nerwowego, siatkówka służy jako cenny model do badań neurologicznych1. Komórki zwojowe siatkówki (RGC), neurony wyjściowe siatkówki, które przekazują informacje wizualne do mózgu, odgrywają kluczową rolę w funkcjonowaniu wzrokowym. Ich utrata lub dysfunkcja prowadzi do upośledzenia wzroku i nieodwracalnej ślepoty, co widać w jaskrze i innych neuropatiach nerwu wzrokowego2. Komórki glejowe Müllera, główne komórki glejowe siatkówki, są niezbędne do utrzymania homeostazy siatkówki, zapewnienia strukturalnego i metabolicznego wsparcia neuronom, regulacji poziomu neuroprzekaźników oraz przyczyniania się do naprawy i regeneracji siatkówki3. Ich dysfunkcja jest związana z różnymi chorobami siatkówki, w tym retinopatią cukrzycową4, zwyrodnieniem plamki żółtej związanym z wiekiem5 i zespołem niedokrwiennym oka6. RGC i glej Müllera wykazują bliskie interakcje i współzależność; Glej Müllera stanowi istotne wsparcie dla RGC, podczas gdy aktywność RGC może wpływać na funkcję gleju Müllera3,7. Badanie zarówno RGC, jak i gleju Müllera ma kluczowe znaczenie dla zrozumienia funkcji siatkówki i opracowania skutecznych metod leczenia wielu chorób siatkówki.

Obecne oceny w badaniach siatkówki wykorzystują przede wszystkim techniki takie jak optyczna tomografia koherentna (OCT) do pomiaru grubości warstwy włókien nerwowych siatkówki lub trajektorii wiązek aksonów8,9. Chociaż metody te są nieocenione w wykrywaniu utraty RGC, nie zapewniają szczegółowego obrazu morfologii RGC i komórek glejowych ze względu na ograniczoną rozdzielczość. Podobnie, chociaż zaawansowane techniki, takie jak optyka adaptatywna skaningowa oftalmoskopia laserowa (AO-SLO), umożliwiają obrazowanie na poziomie komórkowym RGC, fotoreceptorów i komórek glejowych w żywej ludzkiej siatkówce10, ich złożoność techniczna i ograniczona dostępność ograniczają ich zastosowanie głównie do specjalistycznych warunków badawczych. Biorąc pod uwagę te ograniczenia, istnieje ciągła potrzeba opracowania bardziej dostępnych i wiarygodnych metod dogłębnego badania określonych populacji komórek siatkówki in vivo.

W związku z tym, ten protokół ma na celu wprowadzenie alternatywnego podejścia do obrazowania, odpowiedniego do zastosowań badawczych w komórkach siatkówki. Łączy w sobie moc znakowania specyficznego dla typu komórki za pośrednictwem AAV z nieinwazyjnym charakterem obrazowania CSLO. Wirusy związane z adenowirusami (AAV) są wszechstronnymi wektorami dostarczania genów, znanymi ze swojej niskiej immunogenności i zdolności do transdukcji szerokiego zakresu typów komórek, w tym zarówno komórek dzielących się, jak i niedzielących się11. To sprawia, że są idealnymi narzędziami do celowania w określone populacje komórek w złożonym środowisku siatkówki. Wykorzystując wektory AAV ze starannie dobranymi serotypami i promotorami, można osiągnąć selektywną ekspresję białek fluorescencyjnych w wielu typach komórek, takich jak RGC i glej Müllera. Na przykład AAV2 jest znany ze swojej wyższej wydajności transdukcji w RGCs12,13, podczas gdy AAV8 jest wyraźnie skuteczny w celowaniu w fotoreceptory14, a AAV9 wykazuje silne zdolności transfekcyjne w Müller glia15, wykazując szeroką skuteczność w różnych warstwach komórek siatkówki. Ważne jest, aby zauważyć, że skuteczność AAV zależy nie tylko od wyboru serotypu, ale także od promotorów, które dyktują intensywność i specyficzność komórkową ekspresji transgenu, co podkreśla znaczenie starannej selekcji w celu osiągnięcia optymalnej transdukcji.

Do znakowania RGC, ten protokół wykorzystuje AAV2 z promotorem ludzkiej synapsyny (hSyn). AAV2 wykazuje efektywną transdukcję RGC po wstrzyknięciu do ciała szklistego13, a promotor hSyn, wszechobecny promotor neuronów, napędza silną i specyficzną ekspresję transgenu w tych komórkach16. W przypadku gleju Müllera protokół wykorzystuje wektory AAV9 sterowane przez promotor GfaABC1D17, który wykazuje silną ekspresję transgenu w tych komórkach15. To ukierunkowane podejście do znakowania umożliwia naukowcom odróżnienie tych komórek od otaczającej tkanki siatkówki i śledzenie ich w czasie, zapewniając podstawę do nadzoru in vivo komórek siatkówki i ich reakcji na zmiany biośrodowiskowe.

Konfokalna skaningowa oftalmoskopia laserowa (CSLO) to nieinwazyjna technika obrazowania, która dostarcza obrazy żywej siatkówki o wysokiej rozdzielczości, umożliwiając wizualizację w czasie rzeczywistym fluorescencyjnie znakowanych populacji komórek siatkówki18,19,20. Skupiona wiązka laserowa skanuje siatkówkę, wychwytując emitowane światło, które przechodzi przez otwór w celu wyeliminowania nieostrych sygnałów, co skutkuje ostrzejszymi obrazami o zwiększonym kontraście. Protokół ten wykorzystuje system Heidelberg Spectralis CSLO, który jest szeroko stosowany do obrazowania komórek siatkówki u żywych zwierząt, w tym do badań wizualizujących transgenicznie znakowane RGCs21,22i microglia23. Wykorzystując jednostkę HRA CSLO z laserem o długości fali 488 nm i odpowiednimi filtrami, naukowcy mogą obrazować znakowane fluorescencyjnie RGC lub komórki glejowe Müllera u żywych zwierząt po wstrzyknięciu do ciała szklistego wektorów AAV zawierających fluorescencyjne geny reporterowe. Protokół obrazowania podłużnego, z cotygodniowymi sesjami obejmującymi zarówno siatkówkę centralną, jak i obwodową, śledzi zmiany w czasie. Aby nadać priorytet dobrostanowi zwierząt, protokół wykorzystuje automatyczny system śledzenia ruchu gałek ocznych (ART) jednostki HRA CSLO, umożliwiając precyzyjne pozyskiwanie obrazu bez konieczności stosowania znieczulenia ogólnego lub soczewek kontaktowych.

Ten protokół wykorzystuje połączoną moc AAV i CSLO, aby umożliwić podłużne monitorowanie określonych typów komórek siatkówki in vivo. Łącząc specyficzność typu komórki znakowania za pośrednictwem AAV z nieinwazyjnymi możliwościami obrazowania w wysokiej rozdzielczości CSLO, metoda ta pozwala naukowcom badać dynamiczne zmiany w RGC i gleju Müllera w odpowiedzi na różne bodźce lub interwencje. Spostrzeżenia te mają znaczący potencjał w zakresie opracowywania nowych strategii diagnostycznych i terapeutycznych w chorobach siatkówki.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie eksperymenty zostały przeprowadzone zgodnie z Oświadczeniem ARVO dotyczącym wykorzystania zwierząt w badaniach okulistycznych i wzrokowych i zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Stołecznego Uniwersytetu Medycznego w Pekinie. Czterotygodniowe dorosłe samce myszy C57BL/6J (o wadze od 15 do 20 g) wykorzystano do wszystkich eksperymentów i umieszczono w pomieszczeniach o kontrolowanej temperaturze z 12/12-godzinnym cyklem światła/ciemności. Standardowa karma dla gryzoni i woda były dostępne ad libitum. Szczegółowe informacje na temat odczynników i sprzętu użytego w tym badaniu są wymienione w Tabeli Materiałów.

1. Transfekcja komórek siatkówki za pośrednictwem AAV

UWAGA: Do ukierunkowanej transdukcji RGC, ten protokół wykorzystuje AAV2-hSyn-eGFP, który wykorzystuje promotor hSyn do napędzania silnej ekspresji wzmocnionego GFP. Glej Müllera jest ukierunkowany za pomocą AAV9-GfaABC1D-eGFP. Aby osiągnąć optymalną wydajność transdukcji i silną ekspresję transgenu, do wstrzyknięć doszklistkowych u >10 12 genomów wirusa (vg)/ml.

  1. Przestrzegaj rygorystycznych protokołów bezpieczeństwa podczas przeprowadzania procedur transfekcji komórek siatkówki za pośrednictwem AAV, aby zapobiec przypadkowemu narażeniu i zapewnić bezpieczne środowisko pracy.
  2. Wszystkie procedury z udziałem wektorów wirusowych należy wykonywać w certyfikowanej komorze bezpieczeństwa biologicznego (BSC). Wyposaż personel w odpowiednie środki ochrony osobistej (PPE), w tym fartuchy laboratoryjne, rękawice i ochronę oczu, przez cały czas trwania zabiegu.
  3. Wszystkie ostre narzędzia i materiały stanowiące zagrożenie biologiczne należy utylizować w odpowiedni sposób, zgodnie z instytucjonalnymi protokołami bezpieczeństwa, aby zachować zgodność i chronić cały personel laboratoryjny.

2. Przygotowanie wektorów wirusowych i zwierząt

  1. Otrzymać wektory AAV2-hSyn-eGFP lub AAV9-GfaABC1D-eGFP przechowywane w temperaturze -80 °C. Bezpośrednio przed użyciem rozmrozić wektory na lodzie, aby zachować integralność wirusa.
  2. Znieczulić myszy wstrzyknięciem dootrzewnowym pentobarbitalu sodu w dawce 50 mg/kg. Potwierdź głębokość znieczulenia, badając odruchy tylnej stopy przed dalszymi działaniami.
  3. Przytnij wąsy, aby zapobiec ingerencji w obszar chirurgiczny podczas zabiegu. Zdezynfekuj orbitę 20% roztworem jodu powidonu przez 2 s, a następnie dokładnie spłucz sterylną solą fizjologiczną.
  4. Zastosuj miejscowo kroplę 0,5% proparakainy, aby zminimalizować dyskomfort i zapobiec mimowolnym ruchom gałek ocznych.

3. Postępowanie z wektorami wirusowymi i iniekcja do ciała szklistego

  1. Przenieś 1 μl wybranego roztworu AAV (AAV2-hSyn-eGFP lub AAV9-GfaABC1D-eGFP) do kawałka czystej, wstępnie schłodzonej folii parafinowej, aby uniknąć wahań temperatury, które mogą wpływać na aktywność wirusa.
  2. Odessać roztwór AAV za pomocą szklanej strzykawki Hamilton z igłą ze skosem 33 G pod mikroskopem operacyjnym
    3. .
  3. Umieść mysz w pozycji leżącej brzusznej pod mikroskopem. Lekko przechylić głowę, aby unieść stronę oka przeznaczoną do wstrzyknięcia. Dostosuj i zoptymalizuj powiększenie mikroskopu, aby wyraźnie zidentyfikować górny obszar orbity myszy.
  4. Wbić igłę 1-2 mm za rąbkiem na górnym brzegu twardówki oka do jamy ciała szklistego. Roztwory AAV należy wstrzykiwać powoli, aby uniknąć przepływu wstecznego lub uszkodzeń spowodowanych ciśnieniem.
    UWAGA: Lokalizacja miejsca wstrzyknięcia: Wstrzyknięcie należy wykonać w górnym kwadrancie skroniowym oka, około 1 mm za rąbkiem. Wybierz to miejsce, aby uniknąć głównych naczyń krwionośnych i zminimalizować ryzyko uszkodzenia soczewki. Należy unikać miejsc wstrzyknięć znajdujących się zbyt blisko rąbka, aby zapobiec przebiciu tęczówki lub ścieraniu soczewki. Unikanie naczyń krwionośnych: Przed wstrzyknięciem należy dokładnie zbadać planowane miejsce wstrzyknięcia pod kątem widocznych naczyń krwionośnych. Jeśli obecne są naczynia, nieznacznie dostosuj punkt wejścia, aby ich uniknąć. Wprowadzić igłę pod płytkim kątem, równolegle do tęczówki, aby jeszcze bardziej zmniejszyć ryzyko uszkodzenia naczyń krwionośnych. Należy unikać wielokrotnych wstrzyknięć w to samo miejsce, aby zmniejszyć ryzyko krwotoku podsiatkówkowego.
  5. Trzymaj igłę na miejscu przez 30 sekund, aby wektory mogły rozproszyć się w komorze ciała szklistego i osiąść na powierzchni siatkówki, maksymalizując w ten sposób szanse na udaną transdukcję.
  6. Powoli wyjmować igłę, aby zminimalizować ryzyko cofania się ciała szklistego.
  7. Natychmiast po wstrzyknięciu należy nałożyć miejscową maść z antybiotykiem na miejsce wstrzyknięcia. Upewnij się, że maść jest nakładana równomiernie, aby całkowicie pokryć powierzchnię oka, zapobiegając infekcji i zapaleniu oka.
    UWAGA: Maść z antybiotykiem zawiera 1 mg/g deksametazonu, 3500 j.m./g siarczanu neomycyny i 6000 j.m./g siarczanu polimyksyny B.
  8. Umieść mysz na poduszce grzewczej, aby utrzymać temperaturę ciała podczas rekonwalescencji po znieczuleniu i uważnie monitoruj ją pod kątem wszelkich oznak niepokoju lub nieprawidłowości. Gdy w pełni wyzdrowieją i nie będą wykazywać żadnych komplikacji, wróć do klatek z dostępem do normalnego jedzenia i wody.

4. Obrazowanie in vivo za pomocą CSLO

  1. Przygotowanie zwierząt
    1. Wybierz mysz zakażoną AAV2-hSyn-eGFP lub AAV9-GfaABC1D-eGFP po 4 tygodniach wstrzyknięcia do ciała szklistego. Nanieś jedną kroplę roztworu do oczu zawierającego 0,5% tropikamidu i 0,5% fenylefryny na powierzchnię oka, aby rozszerzyć źrenicę do około 2 mm średnicy22.
      UWAGA: Zalecany jest co najmniej 4-tygodniowy odstęp czasu transdukcji AAV dla optymalnego znakowania fluorescencyjnego komórek siatkówki po wstrzyknięciu doszklistkowym13. Dodatkowo, w naszych eksperymentach z uciskiem nerwu wzrokowego (ONC), siatkówki zostały zobrazowane 4 tygodnie po zakażeniu, a także w 7 i 14 dniu po urazie zmiażdżenia. Te punkty czasowe zostały wybrane tak, aby uchwycić zarówno początkową ekspresję AAV, jak i progresję zmian siatkówki po ONC.
    2. Przykryj platformę obrazowania kawałkiem czystej podkładki, aby uniknąć możliwego zanieczyszczenia odchodami zwierzęcymi podczas procesu operacji.
      UWAGA: Specjalnie zaprojektowana platforma obrazowania zapewnia zwierzęciu wystarczająco dużo miejsca do leżenia w pozycji leżącej, zapewniając stabilność i minimalizując ruchy podczas ręcznego unieruchamiania w celu optymalnego uzyskania obrazu.
    3. Ostrożnie przenieś mysz na platformę obrazowania i pozwól na okres aklimatyzacji wynoszący 2-5 minut przed obrazowaniem, aby zminimalizować stres i ułatwić adaptację do środowiska obrazowania.
    4. Z pomocą drugiego technika delikatnie przytrzymuj zwierzę, zachowując przytomność przez cały czas trwania zabiegu. Zapewnij 10-sekundowy odstęp czasu na odpoczynek po 15 sekundach obrazowania, aby umożliwić mruganie oczami i utrzymać wilgotność rogówki.
      UWAGA: Delikatnie szoruj skórę głowy, aby wywołać spontaniczne uniesienie powiek, unikając stosowania wymuszonego krępowania powiek lub dodatkowych urządzeń, takich jak klipsy, zmniejszając w ten sposób ryzyko urazu oczu. Znieczulenie ogólne nie jest stosowane w celu zachowania przejrzystości optycznej podczas długich sesji obrazowania, ponieważ może potencjalnie pogorszyć przejściowe zmętnienie soczewki. Zachowaj równowagę między wysoką jakością pozyskiwania obrazu a komfortem i bezpieczeństwem zwierząt podczas całej procedury. Całą procedurę należy wykonać w ciągu 5 minut, aby zapewnić dobrostan zwierząt i utrzymać jakość obrazowania.
    5. Dostosuj ułożenie głowy i wyrównaj obiektyw aparatu, dostrajając pokrętło ostrości (Rysunek 1B) i mikromanipulator (Rysunek 1C), aby skierować się w obszar zainteresowania (ROI) do późniejszego obrazowania in vivo.
  2. Konfiguracja systemu
    1. Zamocuj bezkontaktowy obiektyw szerokokątny 55° do aparatu, aby rozszerzyć pole widzenia obszaru dna.
    2. Ustaw koło filtra w pozycji A (angiografia), aby umożliwić akwizycję w trybie obrazowania w podczerwieni (IR) i angiografii fluorescencyjnej (FA) (Rysunek 1A). Włącz laser i zasilacz, aby aktywować system obrazowania CSLO.
    3. Otwórz oprogramowanie Heidelberg Eye Explorer i utwórz nowe badanie, klikając ikonę nowego pacjenta u góry paska menu. Wprowadź odpowiednie informacje o zwierzęciu i zaakceptuj domyślną krzywiznę rogówki wynoszącą 7,7 mm w wyskakującym okienku.
    4. Wybierz żółty przycisk Start (Rysunek 1E) na ekranie panelu sterowania, aby zainicjować tryb obrazowania na żywo.
  3. Obrazowanie CSLO in vivo
    1. Wybierz tryb IR (Rysunek 1G) z autofluorescencją przy długości fali wzbudzenia 820 nm na panelu sterowania. Aby uzyskać obrazowanie w wysokiej rozdzielczości, High Res. Tryb (HR) jest aktywowany za pomocą interfejsu okiennego lub ręcznego panelu sterowania (Rysunek 1F).
      UWAGA: Obrazowanie odbicia w podczerwieni (IR) jest zazwyczaj pierwszym krokiem w obrazowaniu okulistycznym CLSO, uzyskanym przed angiografią fluoresceinową (FA), w celu zapewnienia widoku wyjściowego. Nawet oświetlenie, minimalna ilość artefaktów i ostra ostrość na głównych naczyniach siatkówki mają kluczowe znaczenie dla niezawodności ogniskowania w płaszczyźnie Z i uzyskania wysokiej jakości obrazów w podczerwieni.
    2. Przesuń obiektyw w kierunku oka myszy za pomocą joysticka z mikromanipulatorem XYZ w celu precyzyjnej regulacji. Sprawdź przezroczystość optyczną i przekręć pokrętło czułości (Rysunek 1D) w kierunku przeciwnym do ruchu wskazówek zegara, aby zmniejszyć jasność obrazu dna oka do 40%-60%, unikając w ten sposób prześwietlenia dna oka i poprawiając wizualizację szczegółów siatkówki.
    3. Wyreguluj pokrętło ostrości i mikromanipulator, aż tarcza nerwu wzrokowego i naczynia siatkówki zostaną jednoznacznie zidentyfikowane na dnie oka.
      UWAGA: Kryteria optymalnej płaszczyzny ogniskowej: (1) Równomiernie oświetlony widok dna oka bez ciemnych narożników. (2) Równomierne oświetlenie otaczające tarczę nerwu wzrokowego bez ogniskowych ciemnych plam lub zniekształceń. (3) Wyraźny kształt światła dużych naczyń siatkówki z widocznym ruchem przepływu krwi.
    4. Przełącz się na tryb FA (Rysunek 1H) z niebieskim laserem półprzewodnikowym o długości fali wzbudzenia 488 nm i filtrem barierowym o długości fali 500 nm. Obróć pokrętło czułości (Rysunek 1D) zgodnie z ruchem wskazówek zegara, aby zwiększyć jasność obrazu dna oka do 50%-107%, aby oświetlić docelowy obszar siatkówki.
    5. Ustaw średnią wartość ART (niebieski pasek w lewym dolnym rogu interfejsu oprogramowania) na co najmniej 15, aby zwiększyć stosunek sygnału do szumu. Ta funkcja uśrednia serię skanów B uzyskanych w tym samym miejscu, poprawiając jakość obrazu.
      UWAGA: Podczas gdy wyższa wartość uśredniania ART zazwyczaj poprawia jakość obrazu poprzez uśrednianie, wydłuża również czas skanowania. Ten wydłużony czas trwania może potencjalnie zwiększyć ryzyko odwodnienia rogówki i zmęczenia zwierząt, czynników, które należy dokładnie rozważyć, szczególnie w przypadku obrazowania zwierząt po przebudzeniu.
    6. Ponownie wyrównaj się z wewnętrzną płaszczyzną siatkówki, w szczególności celując w RGC wyrażające GFP lub komórki glejowe Müllera. Dokonuje się precyzyjnych regulacji, aby zapewnić ostre oświetlenie pożądanej populacji komórek, takich jak soma i aksony RGC lub korpus komórki Müllera. Czułość obrazowania jest zrównoważona, aby uzyskać optymalną wizualizację i zapobiec przesyceniu komórek GFP-dodatnich.
      UWAGA: Aby uzyskać obrazy o porównywalnej klarowności i jasności sygnału GFP, akwizycja czułości powinna być stała dla wszystkich myszy w eksperymencie.
    7. Naciśnij pokrętło czułości (Rysunek 1D), aby uruchomić tryb ART, który generuje średni obraz na żywo w trybie online. Poczekaj, aż niebieski pasek (reprezentujący średnią wartość ART) w lewym dolnym rogu interfejsu oprogramowania osiągnie ustawioną wartość ART (≥ 20 klatek) i dotknij przycisku Zdobądź w interfejsie sterowania, aby przechwycić obrazy dna oka.
      UWAGA: W trybie ART włączono śledzenie ruchu gałek ocznych, aby automatycznie kompensować niewielkie ruchy gałek ocznych podczas obrazowania in vivo, umożliwiając stałą ostrość na wybranej płaszczyźnie ogniskowej siatkówki.
    8. Po uzyskaniu żądanych obrazów wyjdź z trybu ART, naciskając pokrętło czułości na panelu dotykowym.
      UWAGA: Aby zapobiec wysuszeniu rogówki i umożliwić spontaniczne mruganie oczami, podczas procesu obrazowania wprowadzono 10-sekundowe przerwy co 15 sekund.
    9. Aby poruszać się po obszarze nosa i skroniowej siatkówki, przesuń głowicę kamery poziomo, obserwując obraz na żywo na ekranie. Po osiągnięciu obszaru docelowego dostosuj ostrość i rozpocznij proces obrazowania zgodnie z opisem w krokach 2.3.1-2.3.8.
      UWAGA: Utrzymuj powolne i kontrolowane ruchy kamery, zapewniając jednocześnie stałe i jasne oświetlenie dna oka. Jeśli pojawią się ciemne obszary, użyj mikromanipulatora, aby dostosować pozycję kamery w pionie i ponownie wyśrodkować siatkówkę.
    10. Aby zobrazować górną siatkówkę, delikatnie dostosuj pozycję główki myszy do pozycji skierowanej do góry. Umiarkowanie przechyl głowicę kamery do góry, aby wyrównać się z górnym obszarem siatkówki. W razie potrzeby ponownie dostosuj ostrość i kontynuuj obrazowanie.
    11. Po zakończeniu obrazowania wszystkie pożądane obszary siatkówki wyjdź z okna akwizycji, a obrazy zostaną automatycznie zapisane. Nałóż miejscowy lubrykant na obrazowane oko, aby utrzymać nawilżenie rogówki.
    12. Aby rozpocząć badanie przeciwległego oka, przenieś zwierzę na przeciwną stronę platformy i powtórz kroki 2.3.1-2.3.11.

5. Przetwarzanie i analiza obrazu

  1. Eksport i przygotowanie obrazu
    1. Otwórz oprogramowanie Heidelberg Eye Explorer i wybierz żądaną sesję obrazowania CSLO o dobrej jakości. Wybierz pojedyncze lub kolejne obrazy tej samej lokalizacji siatkówki ze spójnymi ustawieniami czułości w czasie.
    2. Wyklucz rozmyte obrazy o słabej ostrości lub jasności rogówki, upewniając się, że do analizy używane są tylko obrazy z wyraźną wizualizacją struktur siatkówki. Wyeksportuj te obrazy w formacie TIFF do dalszej obróbki.
  2. Wyrównanie i kadrowanie obrazu
    1. Grupuj obrazy na oko myszy na podstawie tego samego regionu siatkówki.
      UWAGA: Oryginalne obrazy pozyskane z systemu CSLO są zapisywane w następującym formacie: TIFF, o wymiarze 1536 x 1536 pikseli, rozdzielczości 5,69 um/piksel i wartości ART ≥15.
    2. W celu przeprowadzenia badań kontrolnych należy zaimportować obrazy do odpowiedniego oprogramowania do przetwarzania obrazów. W razie potrzeby obróć i wyrównaj obrazy, aby dopasować je do orientacji obrazu linii bazowej. Podczas zapisywania lub eksportowania przetworzonych obrazów należy używać ustawień, które zachowują najwyższą możliwą jakość obrazu, aby zminimalizować potencjalne artefakty kompresji.
    3. Wyrównaj obrazy CSLO z serii czasowej tego samego oka, obracając je tak, aby pasowały do odpowiedniego obrazu linii bazowej, używając układu naczyniowego i tarczy nerwu wzrokowego jako punktów orientacyjnych.
      UWAGA: Dokładnie zbadaj każdy wyrównany obraz, a przed przystąpieniem do przycinania upewnij się, że spełniają następujące kryteria: (1) Uchwycenie pełnego obszaru siatkówki: Obraz musi w pełni obejmować zamierzony obszar siatkówki będący przedmiotem zainteresowania, w tym kluczowe punkty orientacyjne, takie jak tarcza nerwu wzrokowego i główne naczynia krwionośne; (2) Brak artefaktów ruchu: Obraz powinien być wolny od rozmycia, smug lub duplikacji struktur spowodowanych ruchem gałek ocznych podczas obrazowania; (3) Minimalne zniekształcenia: Obraz powinien dokładnie odwzorowywać strukturę siatkówki bez artefaktów zniekształceń, rozciągania lub kompresji, które mogą powstać w wyniku kątów obrazowania lub efektów soczewki. (4) Równowaga wskaźników jakości obrazu: ocena poziomu szumu tła (odchylenie standardowe intensywności pikseli w obszarach pozbawionych struktury< 5 (skala 0–255)); stosunek sygnału do szumu (SNR >20), spójność oświetlenia (współczynnik zmienności między sześcioma kwadrantami obrazu <10%) i jednorodność obrazu (współczynnik zmienności w jednorodnych obszarach <15%).
    4. Wybierz obrócony obraz i wyeksportuj go w formacie TIFF. Dla każdego punktu czasowego użyj narzędzia do przycinania, aby losowo wybrać i przyciąć 5-10 obszarów (300 x 300 pikseli każdy) zawierających komórki GFP z obrazów o zatwierdzonej jakości. Eksportuj każdy przycięty obraz indywidualnie w formacie TIFF w celu dalszej analizy.
  3. Pomiar intensywności fluorescencji
    1. Otwórz przycięte obrazy CSLO (8-bitowa skala szarości, 300 x 300 pikseli) w ImageJ/Fiji.
    2. Aby zbadać ogólne zmiany w sygnałach fluorescencyjnych, zmierz całkowitą intensywność fluorescencji na przycięty obraz za pomocą funkcji Analizuj > Mierz (lub Ctrl + M). Zapisz wartość "Średnia", reprezentująca średnią intensywność fluorescencji GFP dla całego wykadrowanego obrazu.
  4. Kwantyfikacja RGC
    1. W ImageJ/Fiji dostosuj próg intensywności przyciętych obrazów CSLO za pomocą opcji Image > Dostosuj > Jasność/Kontrast, aby uzyskać optymalną wizualizację poszczególnych białych ciał somy na czarnym tle.
      UWAGA: Określ zindywidualizowany próg po przejrzeniu partii przyciętych obrazów lub zastosuj spójny algorytm progowania (np. metoda Huanga5 w ImageJ/Fiji). W przypadku metody Huanga: (1) Konwertuj obrazy na 8-bitową skalę szarości (Typ > obrazu > 8-bitowy). (2) Uzyskaj dostęp do narzędzia do określania progów (Obraz > Dostosuj próg >). (3) Wybierz Huang jako metodę progowania. (4) Wyświetl podgląd segmentacji i kliknij Zastosuj. Próg zostanie automatycznie obliczony i wyświetlony na histogramie obrazu.
    2. Aktywuj wtyczkę Cell Counter i kliknij każdą somę RGC z dodatnim wynikiem GFP, aby ją policzyć. Zapisz całkowitą liczbę komórek zaznaczonych w analizowanym regionie. Powtórz ten proces dla wszystkich przyciętych obrazów z każdego kolejnego punktu czasowego.
  5. analiza danych
    1. Eksportuj dane dotyczące liczby komórek i intensywności fluorescencji do arkusza kalkulacyjnego lub oprogramowania statystycznego (np. GraphPad Prism).
    2. Wykonaj odpowiednie testy statystyczne w oparciu o odpowiedni projekt eksperymentalny i hipotezy. Zinterpretuj wyniki i wyciągnij wnioski.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Zgodnie z przedstawionym protokołem, różne komórki siatkówki zostały pomyślnie zwizualizowane i śledzone in vivo przy użyciu kombinacji dostarczania genów za pośrednictwem AAV oraz CSLO. AAV2-hSyn-eGFP skutecznie transdukowało RGC, co zaowocowało silną ekspresją eGFP w całej siatkówce, co potwierdzono za pomocą CSLO oraz kolokalizacji z markerem specyficznym dla RGC, białkiem wiążącym RNA z wielokrotnym splicingiem (RBPMS), znajdującym się konkretnie w warstwie komórek zwojowych (Rycina 2

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Przedstawiony protokół szczegółowo opisuje solidną i dostępną metodę nadzoru in vivo określonych populacji komórek siatkówki, wykorzystując moc zarówno dostarczania genów za pośrednictwem AAV, jak i obrazowania CSLO. Podejście to ma kilka zalet w porównaniu z tradycyjnymi metodami, ułatwiając podłużne badania dynamiki komórek siatkówki i ich reakcji na uraz lub chorobę w warunkach fizjologicznych lub patologicznych.

Sukces tej metody zależy od kilku kluczowych kroków. Po pierwsze, osi...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca została wsparta grantem z Narodowej Fundacji Nauk Przyrodniczych Chin (82130029). Rysunki 2A i 4A zostały utworzone za pomocą BioRender.com.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
33 Gauge NeedleHamilton Corp., Reno, NV, USA7803-05Do wstrzykiwań doszklistkowych
0,5% proparakainy Santen Pharmaceutical Co., Sp. z o.o.Miejscowe leki przeciwbólowe
AAV2-hSyn-eGFP OBiO Technology Corp., ChinyMiano wirusa: 2,7 x 1012 genomy wirusa (vg)/mL 
AAV9-GfaABC1D-eGFPWZ Biosciences Inc., ChinyMiano wirusa: 4,5 x 1012 genomy wirusa (vg)/mL 
BetadineZdrowa firma medyczna001651Miejscowe środki antyseptyczne
Kleszcze rogówkowe (ząbkowane)Mingren Eye Instruments, ChinyMR-F301ADo zabezpieczania powieki podczas iniekcji doszklistkowej
Kleszcze Dumont 05 #FST51-AGT5385Do zmiażdżenia nerwu wzrokowego
Pryzmat GraphpadGraphPad Prism, USARysowanie wykresów i analiza statystyczna
HRA SpectralisHeidelberg Engineering, GmbH, Dossenheim, NiemcyTryb"IR" i "FA" do obrazowania CSLO
Obraz J/FijiNational Institutes of Health, USAPrzetwarzanie obrazu
Maść z antybiotykiem MaxitrolAlcon Laboratories, INC. USA0065-0631Antybiotyki miejscowe
Microliter SyringeHamilton Corp., Reno, NV, USA7633-01Do iniekcji doszklistkowych
Mydrin-P Roztwór okulistycznySanten Pharmaceutical Co., Ltd, JaponiaRozszerzenie źrenicy
Okulistyczny mikroskop chirurgiczny Leica AG, Heerbrugg, SzwajcariaM220Do operacji chirurgicznych
Pentorbarbitol SodiumSigma Aldrich, USA57-33-0Genereal Aneasthetics
PowerpointMicrosoft Corporation, USAWyrównanie i kadrowanie
obrazu VISCOTEARS Liquid Gel (Carbomer)Dr. Gerhard Mann, Chem.-Pharm. Fabrik, NiemcySmar do stosowania miejscowego 

Bibliografia

  1. Cheung, C. Y., Ikram, M. K., Chen, C., Wong, T. Y. Imaging retina to study dementia and stroke. Prog Retin Eye Res. 57, 89-107 (2017).
  2. Ju, W. K., et al. Glaucomatous optic neuropathy: Mitochondrial dynamics, dysfunction and protection in retinal ganglion cells. Prog Retin Eye Res. 95, 101136(2023).
  3. Vecino, E., Rodriguez, F. D., Ruzafa, N., Pereiro, X., Sharma, S. C. Glia-neuron interactions in the mammalian retina. Prog Retin Eye Res. 51, 1-40 (2016).
  4. Llorián-Salvador, M., Cabeza-Fernández, S., Gomez-Sanchez, J. A., De La Fuente, A. G. Glial cell alterations in diabetes-induced neurodegeneration. Cell Mol Life Sci. 81 (1), 47(2024).
  5. Zhao, N., Hao, X. N., Huang, J. M., Song, Z. M., Tao, Y. Crosstalk between microglia and müller glia in the age-related macular degeneration: Role and therapeutic value of neuroinflammation. Aging Dis. 15 (3), 1132-1154 (2023).
  6. Minhas, G., Sharma, J., Khan, N. Cellular stress response and immune signaling in retinal ischemia-reperfusion injury. Front Immunol. 7, 444(2016).
  7. Miao, Y., Zhao, G. L., Cheng, S., Wang, Z., Yang, X. L. Activation of retinal glial cells contributes to the degeneration of ganglion cells in experimental glaucoma. Prog Retin Eye Res. 93, 101169(2023).
  8. Leung, C. K. S., et al. Diagnostic assessment of glaucoma and non-glaucomatous optic neuropathies via optical texture analysis of the retinal nerve fibre layer. Nat Biomed Eng. 6 (5), 593-604 (2022).
  9. Hood, D. C., et al. Detecting glaucoma with only OCT: Implications for the clinic, research, screening, and AI development. Prog Retin Eye Res. 90, 101052(2022).
  10. Burns, S. A., Elsner, A. E., Sapoznik, K. A., Warner, R. L., Gast, T. J. Adaptive optics imaging of the human retina. Prog Retin Eye Res. 68, 1-30 (2019).
  11. Dinculescu, A., Glushakova, L., Min, S. H., Hauswirth, W. W. Adeno-associated virus-vectored gene therapy for retinal disease. Hum Gene Ther. 16 (6), 649-663 (2005).
  12. Nickells, R. W., Schmitt, H. M., Maes, M. E., Schlamp, C. L. AAV2-mediated transduction of the mouse retina after optic nerve injury. Invest Ophthalmol Vis Sci. 58 (14), 6091-6104 (2017).
  13. Cao, X., Yung, J., Mak, H., Leung, C. K. S. Factors governing the transduction efficiency of adeno-associated virus in the retinal ganglion cells following intravitreal injection. Gene Ther. 26 (3-4), 109-120 (2019).
  14. Vandenberghe, L. H., et al. Dosage thresholds for AAV2 and AAV8 photoreceptor gene therapy in monkey. Sci Transl Med. 3 (88), 88ra54(2011).
  15. Gao, Y., et al. Develop an efficient and specific AAV-based labeling system for Muller glia in mice. Sci Rep. 12 (1), 22410(2022).
  16. Nieuwenhuis, B., et al. Improving adeno-associated viral (AAV) vector-mediated transgene expression in retinal ganglion cells: Comparison of five promoters. Gene Ther. 30 (6), 503-519 (2023).
  17. Kawabata, H., et al. Improving cell-specific recombination using AAV vectors in the murine CNS by capsid and expression cassette optimization. Mol Ther Methods Clin Dev. 32 (1), 101185(2024).
  18. Smith, C. A., Chauhan, B. C. In vivo imaging of adeno-associated viral vector labelled retinal ganglion cells. Sci Rep. 8 (1), 1490(2018).
  19. Smith, C. A., Chauhan, B. C. Imaging retinal ganglion cells: Enabling experimental technology for clinical application. Prog Retin Eye Res. 44, 1-14 (2015).
  20. Leung, C. K. S., et al. Longitudinal profile of retinal ganglion cell damage after optic nerve crush with blue-light confocal scanning laser ophthalmoscopy. Invest Ophthalmol Vis Sci. 49 (11), 4898(2008).
  21. Leung, C. K. S., et al. In vivo imaging of murine retinal ganglion cells. J Neurosci Methods. 168 (2), 475-478 (2008).
  22. Mak, H. K., Ng, S. H., Ren, T., Ye, C., Leung, C. K. S. Impact of PTEN/SOCS3 deletion on amelioration of dendritic shrinkage of retinal ganglion cells after optic nerve injury. Exp Eye Res. 192, 107938(2020).
  23. Kokona, D., Jovanovic, J., Ebneter, A., Zinkernagel, M. S. In Vivo imaging of Cx3CR1GFP/GFP reporter mice with spectral-domain optical coherence tomography and scanning laser ophthalmoscopy. J Vis Exp. (129), e55984(2017).
  24. Abbott, C. J., et al. Imaging axonal transport in the rat visual pathway. Biomed Opt Express. 4 (2), 364-386 (2013).
  25. Levkovitch-Verbin, H., et al. RGC death in mice after optic nerve crush injury: Oxidative stress and neuroprotection. Invest Ophthalmol Vis Sci. 41 (13), 4169-4174 (2000).
  26. LaRocca, F., et al. Optimization of confocal scanning laser ophthalmoscope design. J Biomed Opt. 18 (7), 076015(2013).
  27. Vienola, K. V., et al. Real-time eye motion compensation for OCT imaging with tracking SLO. Biomed Opt Express. 3 (11), 2950-2963 (2012).
  28. Geng, Y., et al. Optical properties of the mouse eye. Biomed Opt Express. 2 (4), 717-738 (2011).
  29. Bosco, A., Romero, C. O., Ambati, B. K., Vetter, M. L. In vivo dynamics of retinal microglial activation during neurodegeneration: Confocal ophthalmoscopic imaging and cell morphometry in mouse glaucoma. J Vis Exp. (99), e52731(2015).
  30. Joseph, A., Power, D., Schallek, J. Imaging the dynamics of individual processes of microglia in the living retina in vivo. Biomed Opt Express. 12 (10), 6157-6170 (2021).
  31. Chaffiol, A., et al. A new promoter allows optogenetic vision restoration with enhanced sensitivity in macaque retina. Mol Ther. 25 (11), 2546-2560 (2017).
  32. Li, L., et al. Longitudinal in vivo Ca2+ imaging reveals dynamic activity changes of diseased retinal ganglion cells at the single-cell level. Proc Natl Acad Sci U S A. 119 (48), e2206829119(2022).
  33. Bille, J. F. Optical Coherence Tomography (OCT): Principle and technical realization. High-resolution imaging in microscopy and ophthalmology: New Frontiers in Biomedical Optics. , Springer International Publishing. 59-85 (2019).
  34. Spaide, R. F., et al. Lateral resolution of a commercial optical coherence tomography instrument. Transl Vis Sci Technol. 11 (1), 28(2022).
  35. Franze, K., et al. Muller cells are living optical fibers in the vertebrate retina. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (20), 8287-8292 (2007).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

Obrazowanie komórek siatkówkiserotypy AAVkonfokalna skaningowa oftalmoskopiakomórki zwojowe siatkówkiglej Mülleradostarczanie genówekspresja GFPmapowanie dróg wzrokowych

Ten artykuł został opublikowany

Film wkrótce dostępny

Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.