Podłużne obrazowanie in vivo komórek siatkówki z dostosowanymi serotypami wirusa związanego z adenowirusem za pomocą konfokalnej skaningowej oftalmoskopii laserowej

Podsumowanie

Ten protokół opisuje użycie wektorów wirusa związanego z adenowirusem (AAV) do znakowania specyficznego dla komórki oraz obrazowania in vivo za pomocą konfokalnego skaningowego oftalmoskopu laserowego (CSLO). Metoda ta umożliwia badanie różnych typów komórek siatkówki i ich udziału w funkcjonowaniu i chorobie siatkówki.

Streszczenie

Dynamiczna natura procesów komórkowych siatkówki wymaga postępu w dostarczaniu genów i technikach monitorowania na żywo, aby zwiększyć zrozumienie i leczenie chorób oczu. Badanie to wprowadza zoptymalizowane podejście do wirusa związanego z adenowirusem (AAV), wykorzystujące określone serotypy i promotory w celu osiągnięcia optymalnej wydajności transfekcji w docelowych komórkach siatkówki, w tym komórkach zwojowych siatkówki (RGC) i gleju Müllera. Wykorzystując precyzję konfokalnej skaningowej oftalmoskopii laserowej (CSLO), praca ta przedstawia nieinwazyjną metodę obrazowania in vivo, która rejestruje podłużną ekspresję białka zielonej fluorescencji (GFP), w którym pośredniczy AAV. Takie podejście eliminuje potrzebę przeprowadzania procedur terminalnych, zachowując ciągłość obserwacji i dobre samopoczucie badanego. Co więcej, sygnał GFP można śledzić w RGC zakażonych AAV wzdłuż ścieżki wzrokowej do górnego wzgórka (SC) i jądra kolankowatego bocznego (LGN), co umożliwia bezpośrednie mapowanie szlaków wzrokowych. Odkrycia te dostarczają szczegółowego protokołu i demonstrują zastosowanie tego potężnego narzędzia do badań w czasie rzeczywistym nad zachowaniem komórek siatkówki, patogenezą choroby i skutecznością interwencji terapii genowej, oferując cenne informacje na temat żywej siatkówki i jej połączeń.

Wprowadzenie

Będąc jedyną optycznie dostępną częścią ośrodkowego układu nerwowego, siatkówka służy jako cenny model do badań neurologicznych¹. Komórki zwojowe siatkówki (RGC), neurony wyjściowe siatkówki, które przekazują informacje wizualne do mózgu, odgrywają kluczową rolę w funkcjonowaniu wzrokowym. Ich utrata lub dysfunkcja prowadzi do upośledzenia wzroku i nieodwracalnej ślepoty, co widać w jaskrze i innych neuropatiach nerwu wzrokowego². Komórki glejowe Müllera, główne komórki glejowe siatkówki, są niezbędne do utrzymania homeostazy siatkówki, zapewnienia strukturalnego i metabolicznego wsparcia neuronom, regulacji poziomu neuroprzekaźników oraz przyczyniania się do naprawy i regeneracji siatkówki³. Ich dysfunkcja jest związana z różnymi chorobami siatkówki, w tym retinopatią cukrzycową⁴, zwyrodnieniem plamki żółtej związanym z wiekiem⁵ i zespołem niedokrwiennym oka⁶. RGC i glej Müllera wykazują bliskie interakcje i współzależność; Glej Müllera stanowi istotne wsparcie dla RGC, podczas gdy aktywność RGC może wpływać na funkcję gleju Müllera^3,7. Badanie zarówno RGC, jak i gleju Müllera ma kluczowe znaczenie dla zrozumienia funkcji siatkówki i opracowania skutecznych metod leczenia wielu chorób siatkówki.

Obecne oceny w badaniach siatkówki wykorzystują przede wszystkim techniki takie jak optyczna tomografia koherentna (OCT) do pomiaru grubości warstwy włókien nerwowych siatkówki lub trajektorii wiązek aksonów8^,9. Chociaż metody te są nieocenione w wykrywaniu utraty RGC, nie zapewniają szczegółowego obrazu morfologii RGC i komórek glejowych ze względu na ograniczoną rozdzielczość. Podobnie, chociaż zaawansowane techniki, takie jak optyka adaptatywna skaningowa oftalmoskopia laserowa (AO-SLO), umożliwiają obrazowanie na poziomie komórkowym RGC, fotoreceptorów i komórek glejowych w żywej ludzkiej siatkówce¹⁰, ich złożoność techniczna i ograniczona dostępność ograniczają ich zastosowanie głównie do specjalistycznych warunków badawczych. Biorąc pod uwagę te ograniczenia, istnieje ciągła potrzeba opracowania bardziej dostępnych i wiarygodnych metod dogłębnego badania określonych populacji komórek siatkówki in vivo.

W związku z tym, ten protokół ma na celu wprowadzenie alternatywnego podejścia do obrazowania, odpowiedniego do zastosowań badawczych w komórkach siatkówki. Łączy w sobie moc znakowania specyficznego dla typu komórki za pośrednictwem AAV z nieinwazyjnym charakterem obrazowania CSLO. Wirusy związane z adenowirusami (AAV) są wszechstronnymi wektorami dostarczania genów, znanymi ze swojej niskiej immunogenności i zdolności do transdukcji szerokiego zakresu typów komórek, w tym zarówno komórek dzielących się, jak i niedzielących się¹¹. To sprawia, że są idealnymi narzędziami do celowania w określone populacje komórek w złożonym środowisku siatkówki. Wykorzystując wektory AAV ze starannie dobranymi serotypami i promotorami, można osiągnąć selektywną ekspresję białek fluorescencyjnych w wielu typach komórek, takich jak RGC i glej Müllera. Na przykład AAV2 jest znany ze swojej wyższej wydajności transdukcji w RGCs^12,13, podczas gdy AAV8 jest wyraźnie skuteczny w celowaniu w fotoreceptory¹⁴, a AAV9 wykazuje silne zdolności transfekcyjne w Müller glia¹⁵, wykazując szeroką skuteczność w różnych warstwach komórek siatkówki. Ważne jest, aby zauważyć, że skuteczność AAV zależy nie tylko od wyboru serotypu, ale także od promotorów, które dyktują intensywność i specyficzność komórkową ekspresji transgenu, co podkreśla znaczenie starannej selekcji w celu osiągnięcia optymalnej transdukcji.

Do znakowania RGC, ten protokół wykorzystuje AAV2 z promotorem ludzkiej synapsyny (hSyn). AAV2 wykazuje efektywną transdukcję RGC po wstrzyknięciu do ciała szklistego¹³, a promotor hSyn, wszechobecny promotor neuronów, napędza silną i specyficzną ekspresję transgenu w tych komórkach¹⁶. W przypadku gleju Müllera protokół wykorzystuje wektory AAV9 sterowane przez promotor GfaABC1D¹⁷, który wykazuje silną ekspresję transgenu w tych komórkach¹⁵. To ukierunkowane podejście do znakowania umożliwia naukowcom odróżnienie tych komórek od otaczającej tkanki siatkówki i śledzenie ich w czasie, zapewniając podstawę do nadzoru in vivo komórek siatkówki i ich reakcji na zmiany biośrodowiskowe.

Konfokalna skaningowa oftalmoskopia laserowa (CSLO) to nieinwazyjna technika obrazowania, która dostarcza obrazy żywej siatkówki o wysokiej rozdzielczości, umożliwiając wizualizację w czasie rzeczywistym fluorescencyjnie znakowanych populacji komórek siatkówki^18,19,20. Skupiona wiązka laserowa skanuje siatkówkę, wychwytując emitowane światło, które przechodzi przez otwór w celu wyeliminowania nieostrych sygnałów, co skutkuje ostrzejszymi obrazami o zwiększonym kontraście. Protokół ten wykorzystuje system Heidelberg Spectralis CSLO, który jest szeroko stosowany do obrazowania komórek siatkówki u żywych zwierząt, w tym do badań wizualizujących transgenicznie znakowane RGCs^21,22i microglia²³. Wykorzystując jednostkę HRA CSLO z laserem o długości fali 488 nm i odpowiednimi filtrami, naukowcy mogą obrazować znakowane fluorescencyjnie RGC lub komórki glejowe Müllera u żywych zwierząt po wstrzyknięciu do ciała szklistego wektorów AAV zawierających fluorescencyjne geny reporterowe. Protokół obrazowania podłużnego, z cotygodniowymi sesjami obejmującymi zarówno siatkówkę centralną, jak i obwodową, śledzi zmiany w czasie. Aby nadać priorytet dobrostanowi zwierząt, protokół wykorzystuje automatyczny system śledzenia ruchu gałek ocznych (ART) jednostki HRA CSLO, umożliwiając precyzyjne pozyskiwanie obrazu bez konieczności stosowania znieczulenia ogólnego lub soczewek kontaktowych.

Ten protokół wykorzystuje połączoną moc AAV i CSLO, aby umożliwić podłużne monitorowanie określonych typów komórek siatkówki in vivo. Łącząc specyficzność typu komórki znakowania za pośrednictwem AAV z nieinwazyjnymi możliwościami obrazowania w wysokiej rozdzielczości CSLO, metoda ta pozwala naukowcom badać dynamiczne zmiany w RGC i gleju Müllera w odpowiedzi na różne bodźce lub interwencje. Spostrzeżenia te mają znaczący potencjał w zakresie opracowywania nowych strategii diagnostycznych i terapeutycznych w chorobach siatkówki.

Protokół

Wszystkie eksperymenty zostały przeprowadzone zgodnie z Oświadczeniem ARVO dotyczącym wykorzystania zwierząt w badaniach okulistycznych i wzrokowych i zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Stołecznego Uniwersytetu Medycznego w Pekinie. Czterotygodniowe dorosłe samce myszy C57BL/6J (o wadze od 15 do 20 g) wykorzystano do wszystkich eksperymentów i umieszczono w pomieszczeniach o kontrolowanej temperaturze z 12/12-godzinnym cyklem światła/ciemności. Standardowa karma dla gryzoni i woda były dostępne ad libitum. Szczegółowe informacje na temat odczynników i sprzętu użytego w tym badaniu są wymienione w Tabeli Materiałów.

1. Transfekcja komórek siatkówki za pośrednictwem AAV

UWAGA: Do ukierunkowanej transdukcji RGC, ten protokół wykorzystuje AAV2-hSyn-eGFP, który wykorzystuje promotor hSyn do napędzania silnej ekspresji wzmocnionego GFP. Glej Müllera jest ukierunkowany za pomocą AAV9-GfaABC1D-eGFP. Aby osiągnąć optymalną wydajność transdukcji i silną ekspresję transgenu, do wstrzyknięć doszklistkowych u >^{10 12} genomów wirusa (vg)/ml.

1. Przestrzegaj rygorystycznych protokołów bezpieczeństwa podczas przeprowadzania procedur transfekcji komórek siatkówki za pośrednictwem AAV, aby zapobiec przypadkowemu narażeniu i zapewnić bezpieczne środowisko pracy.
2. Wszystkie procedury z udziałem wektorów wirusowych należy wykonywać w certyfikowanej komorze bezpieczeństwa biologicznego (BSC). Wyposaż personel w odpowiednie środki ochrony osobistej (PPE), w tym fartuchy laboratoryjne, rękawice i ochronę oczu, przez cały czas trwania zabiegu.
3. Wszystkie ostre narzędzia i materiały stanowiące zagrożenie biologiczne należy utylizować w odpowiedni sposób, zgodnie z instytucjonalnymi protokołami bezpieczeństwa, aby zachować zgodność i chronić cały personel laboratoryjny.

2. Przygotowanie wektorów wirusowych i zwierząt

1. Otrzymać wektory AAV2-hSyn-eGFP lub AAV9-GfaABC1D-eGFP przechowywane w temperaturze -80 °C. Bezpośrednio przed użyciem rozmrozić wektory na lodzie, aby zachować integralność wirusa.
2. Znieczulić myszy wstrzyknięciem dootrzewnowym pentobarbitalu sodu w dawce 50 mg/kg. Potwierdź głębokość znieczulenia, badając odruchy tylnej stopy przed dalszymi działaniami.
3. Przytnij wąsy, aby zapobiec ingerencji w obszar chirurgiczny podczas zabiegu. Zdezynfekuj orbitę 20% roztworem jodu powidonu przez 2 s, a następnie dokładnie spłucz sterylną solą fizjologiczną.
4. Zastosuj miejscowo kroplę 0,5% proparakainy, aby zminimalizować dyskomfort i zapobiec mimowolnym ruchom gałek ocznych.

3. Postępowanie z wektorami wirusowymi i iniekcja do ciała szklistego

1. Przenieś 1 μl wybranego roztworu AAV (AAV2-hSyn-eGFP lub AAV9-GfaABC1D-eGFP) do kawałka czystej, wstępnie schłodzonej folii parafinowej, aby uniknąć wahań temperatury, które mogą wpływać na aktywność wirusa.
2. Odessać roztwór AAV za pomocą szklanej strzykawki Hamilton z igłą ze skosem 33 G pod mikroskopem operacyjnym
.
3. Umieść mysz w pozycji leżącej brzusznej pod mikroskopem. Lekko przechylić głowę, aby unieść stronę oka przeznaczoną do wstrzyknięcia. Dostosuj i zoptymalizuj powiększenie mikroskopu, aby wyraźnie zidentyfikować górny obszar orbity myszy.
4. Wbić igłę 1-2 mm za rąbkiem na górnym brzegu twardówki oka do jamy ciała szklistego. Roztwory AAV należy wstrzykiwać powoli, aby uniknąć przepływu wstecznego lub uszkodzeń spowodowanych ciśnieniem.
   UWAGA: Lokalizacja miejsca wstrzyknięcia: Wstrzyknięcie należy wykonać w górnym kwadrancie skroniowym oka, około 1 mm za rąbkiem. Wybierz to miejsce, aby uniknąć głównych naczyń krwionośnych i zminimalizować ryzyko uszkodzenia soczewki. Należy unikać miejsc wstrzyknięć znajdujących się zbyt blisko rąbka, aby zapobiec przebiciu tęczówki lub ścieraniu soczewki. Unikanie naczyń krwionośnych: Przed wstrzyknięciem należy dokładnie zbadać planowane miejsce wstrzyknięcia pod kątem widocznych naczyń krwionośnych. Jeśli obecne są naczynia, nieznacznie dostosuj punkt wejścia, aby ich uniknąć. Wprowadzić igłę pod płytkim kątem, równolegle do tęczówki, aby jeszcze bardziej zmniejszyć ryzyko uszkodzenia naczyń krwionośnych. Należy unikać wielokrotnych wstrzyknięć w to samo miejsce, aby zmniejszyć ryzyko krwotoku podsiatkówkowego.
5. Trzymaj igłę na miejscu przez 30 sekund, aby wektory mogły rozproszyć się w komorze ciała szklistego i osiąść na powierzchni siatkówki, maksymalizując w ten sposób szanse na udaną transdukcję.
6. Powoli wyjmować igłę, aby zminimalizować ryzyko cofania się ciała szklistego.
7. Natychmiast po wstrzyknięciu należy nałożyć miejscową maść z antybiotykiem na miejsce wstrzyknięcia. Upewnij się, że maść jest nakładana równomiernie, aby całkowicie pokryć powierzchnię oka, zapobiegając infekcji i zapaleniu oka.
   UWAGA: Maść z antybiotykiem zawiera 1 mg/g deksametazonu, 3500 j.m./g siarczanu neomycyny i 6000 j.m./g siarczanu polimyksyny B.
8. Umieść mysz na poduszce grzewczej, aby utrzymać temperaturę ciała podczas rekonwalescencji po znieczuleniu i uważnie monitoruj ją pod kątem wszelkich oznak niepokoju lub nieprawidłowości. Gdy w pełni wyzdrowieją i nie będą wykazywać żadnych komplikacji, wróć do klatek z dostępem do normalnego jedzenia i wody.

4. Obrazowanie in vivo za pomocą CSLO

1. Przygotowanie zwierząt
   1. Wybierz mysz zakażoną AAV2-hSyn-eGFP lub AAV9-GfaABC1D-eGFP po 4 tygodniach wstrzyknięcia do ciała szklistego. Nanieś jedną kroplę roztworu do oczu zawierającego 0,5% tropikamidu i 0,5% fenylefryny na powierzchnię oka, aby rozszerzyć źrenicę do około 2 mm średnicy²².
      UWAGA: Zalecany jest co najmniej 4-tygodniowy odstęp czasu transdukcji AAV dla optymalnego znakowania fluorescencyjnego komórek siatkówki po wstrzyknięciu doszklistkowym¹³. Dodatkowo, w naszych eksperymentach z uciskiem nerwu wzrokowego (ONC), siatkówki zostały zobrazowane 4 tygodnie po zakażeniu, a także w 7 i 14 dniu po urazie zmiażdżenia. Te punkty czasowe zostały wybrane tak, aby uchwycić zarówno początkową ekspresję AAV, jak i progresję zmian siatkówki po ONC.
   2. Przykryj platformę obrazowania kawałkiem czystej podkładki, aby uniknąć możliwego zanieczyszczenia odchodami zwierzęcymi podczas procesu operacji.
      UWAGA: Specjalnie zaprojektowana platforma obrazowania zapewnia zwierzęciu wystarczająco dużo miejsca do leżenia w pozycji leżącej, zapewniając stabilność i minimalizując ruchy podczas ręcznego unieruchamiania w celu optymalnego uzyskania obrazu.
   3. Ostrożnie przenieś mysz na platformę obrazowania i pozwól na okres aklimatyzacji wynoszący 2-5 minut przed obrazowaniem, aby zminimalizować stres i ułatwić adaptację do środowiska obrazowania.
   4. Z pomocą drugiego technika delikatnie przytrzymuj zwierzę, zachowując przytomność przez cały czas trwania zabiegu. Zapewnij 10-sekundowy odstęp czasu na odpoczynek po 15 sekundach obrazowania, aby umożliwić mruganie oczami i utrzymać wilgotność rogówki.
      UWAGA: Delikatnie szoruj skórę głowy, aby wywołać spontaniczne uniesienie powiek, unikając stosowania wymuszonego krępowania powiek lub dodatkowych urządzeń, takich jak klipsy, zmniejszając w ten sposób ryzyko urazu oczu. Znieczulenie ogólne nie jest stosowane w celu zachowania przejrzystości optycznej podczas długich sesji obrazowania, ponieważ może potencjalnie pogorszyć przejściowe zmętnienie soczewki. Zachowaj równowagę między wysoką jakością pozyskiwania obrazu a komfortem i bezpieczeństwem zwierząt podczas całej procedury. Całą procedurę należy wykonać w ciągu 5 minut, aby zapewnić dobrostan zwierząt i utrzymać jakość obrazowania.
   5. Dostosuj ułożenie głowy i wyrównaj obiektyw aparatu, dostrajając pokrętło ostrości (Rysunek 1B) i mikromanipulator (Rysunek 1C), aby skierować się w obszar zainteresowania (ROI) do późniejszego obrazowania in vivo.
2. Konfiguracja systemu
   1. Zamocuj bezkontaktowy obiektyw szerokokątny 55° do aparatu, aby rozszerzyć pole widzenia obszaru dna.
   2. Ustaw koło filtra w pozycji A (angiografia), aby umożliwić akwizycję w trybie obrazowania w podczerwieni (IR) i angiografii fluorescencyjnej (FA) (Rysunek 1A). Włącz laser i zasilacz, aby aktywować system obrazowania CSLO.
   3. Otwórz oprogramowanie Heidelberg Eye Explorer i utwórz nowe badanie, klikając ikonę nowego pacjenta u góry paska menu. Wprowadź odpowiednie informacje o zwierzęciu i zaakceptuj domyślną krzywiznę rogówki wynoszącą 7,7 mm w wyskakującym okienku.
   4. Wybierz żółty przycisk Start (Rysunek 1E) na ekranie panelu sterowania, aby zainicjować tryb obrazowania na żywo.
3. Obrazowanie CSLO in vivo
   1. Wybierz tryb IR (Rysunek 1G) z autofluorescencją przy długości fali wzbudzenia 820 nm na panelu sterowania. Aby uzyskać obrazowanie w wysokiej rozdzielczości, High Res. Tryb (HR) jest aktywowany za pomocą interfejsu okiennego lub ręcznego panelu sterowania (Rysunek 1F).
      UWAGA: Obrazowanie odbicia w podczerwieni (IR) jest zazwyczaj pierwszym krokiem w obrazowaniu okulistycznym CLSO, uzyskanym przed angiografią fluoresceinową (FA), w celu zapewnienia widoku wyjściowego. Nawet oświetlenie, minimalna ilość artefaktów i ostra ostrość na głównych naczyniach siatkówki mają kluczowe znaczenie dla niezawodności ogniskowania w płaszczyźnie Z i uzyskania wysokiej jakości obrazów w podczerwieni.
   2. Przesuń obiektyw w kierunku oka myszy za pomocą joysticka z mikromanipulatorem XYZ w celu precyzyjnej regulacji. Sprawdź przezroczystość optyczną i przekręć pokrętło czułości (Rysunek 1D) w kierunku przeciwnym do ruchu wskazówek zegara, aby zmniejszyć jasność obrazu dna oka do 40%-60%, unikając w ten sposób prześwietlenia dna oka i poprawiając wizualizację szczegółów siatkówki.
   3. Wyreguluj pokrętło ostrości i mikromanipulator, aż tarcza nerwu wzrokowego i naczynia siatkówki zostaną jednoznacznie zidentyfikowane na dnie oka.
      UWAGA: Kryteria optymalnej płaszczyzny ogniskowej: (1) Równomiernie oświetlony widok dna oka bez ciemnych narożników. (2) Równomierne oświetlenie otaczające tarczę nerwu wzrokowego bez ogniskowych ciemnych plam lub zniekształceń. (3) Wyraźny kształt światła dużych naczyń siatkówki z widocznym ruchem przepływu krwi.
   4. Przełącz się na tryb FA (Rysunek 1H) z niebieskim laserem półprzewodnikowym o długości fali wzbudzenia 488 nm i filtrem barierowym o długości fali 500 nm. Obróć pokrętło czułości (Rysunek 1D) zgodnie z ruchem wskazówek zegara, aby zwiększyć jasność obrazu dna oka do 50%-107%, aby oświetlić docelowy obszar siatkówki.
   5. Ustaw średnią wartość ART (niebieski pasek w lewym dolnym rogu interfejsu oprogramowania) na co najmniej 15, aby zwiększyć stosunek sygnału do szumu. Ta funkcja uśrednia serię skanów B uzyskanych w tym samym miejscu, poprawiając jakość obrazu.
      UWAGA: Podczas gdy wyższa wartość uśredniania ART zazwyczaj poprawia jakość obrazu poprzez uśrednianie, wydłuża również czas skanowania. Ten wydłużony czas trwania może potencjalnie zwiększyć ryzyko odwodnienia rogówki i zmęczenia zwierząt, czynników, które należy dokładnie rozważyć, szczególnie w przypadku obrazowania zwierząt po przebudzeniu.
   6. Ponownie wyrównaj się z wewnętrzną płaszczyzną siatkówki, w szczególności celując w RGC wyrażające GFP lub komórki glejowe Müllera. Dokonuje się precyzyjnych regulacji, aby zapewnić ostre oświetlenie pożądanej populacji komórek, takich jak soma i aksony RGC lub korpus komórki Müllera. Czułość obrazowania jest zrównoważona, aby uzyskać optymalną wizualizację i zapobiec przesyceniu komórek GFP-dodatnich.
      UWAGA: Aby uzyskać obrazy o porównywalnej klarowności i jasności sygnału GFP, akwizycja czułości powinna być stała dla wszystkich myszy w eksperymencie.
   7. Naciśnij pokrętło czułości (Rysunek 1D), aby uruchomić tryb ART, który generuje średni obraz na żywo w trybie online. Poczekaj, aż niebieski pasek (reprezentujący średnią wartość ART) w lewym dolnym rogu interfejsu oprogramowania osiągnie ustawioną wartość ART (≥ 20 klatek) i dotknij przycisku Zdobądź w interfejsie sterowania, aby przechwycić obrazy dna oka.
      UWAGA: W trybie ART włączono śledzenie ruchu gałek ocznych, aby automatycznie kompensować niewielkie ruchy gałek ocznych podczas obrazowania in vivo, umożliwiając stałą ostrość na wybranej płaszczyźnie ogniskowej siatkówki.
   8. Po uzyskaniu żądanych obrazów wyjdź z trybu ART, naciskając pokrętło czułości na panelu dotykowym.
      UWAGA: Aby zapobiec wysuszeniu rogówki i umożliwić spontaniczne mruganie oczami, podczas procesu obrazowania wprowadzono 10-sekundowe przerwy co 15 sekund.
   9. Aby poruszać się po obszarze nosa i skroniowej siatkówki, przesuń głowicę kamery poziomo, obserwując obraz na żywo na ekranie. Po osiągnięciu obszaru docelowego dostosuj ostrość i rozpocznij proces obrazowania zgodnie z opisem w krokach 2.3.1-2.3.8.
      UWAGA: Utrzymuj powolne i kontrolowane ruchy kamery, zapewniając jednocześnie stałe i jasne oświetlenie dna oka. Jeśli pojawią się ciemne obszary, użyj mikromanipulatora, aby dostosować pozycję kamery w pionie i ponownie wyśrodkować siatkówkę.
   10. Aby zobrazować górną siatkówkę, delikatnie dostosuj pozycję główki myszy do pozycji skierowanej do góry. Umiarkowanie przechyl głowicę kamery do góry, aby wyrównać się z górnym obszarem siatkówki. W razie potrzeby ponownie dostosuj ostrość i kontynuuj obrazowanie.
   11. Po zakończeniu obrazowania wszystkie pożądane obszary siatkówki wyjdź z okna akwizycji, a obrazy zostaną automatycznie zapisane. Nałóż miejscowy lubrykant na obrazowane oko, aby utrzymać nawilżenie rogówki.
   12. Aby rozpocząć badanie przeciwległego oka, przenieś zwierzę na przeciwną stronę platformy i powtórz kroki 2.3.1-2.3.11.

5. Przetwarzanie i analiza obrazu

1. Eksport i przygotowanie obrazu
   1. Otwórz oprogramowanie Heidelberg Eye Explorer i wybierz żądaną sesję obrazowania CSLO o dobrej jakości. Wybierz pojedyncze lub kolejne obrazy tej samej lokalizacji siatkówki ze spójnymi ustawieniami czułości w czasie.
   2. Wyklucz rozmyte obrazy o słabej ostrości lub jasności rogówki, upewniając się, że do analizy używane są tylko obrazy z wyraźną wizualizacją struktur siatkówki. Wyeksportuj te obrazy w formacie TIFF do dalszej obróbki.
2. Wyrównanie i kadrowanie obrazu
   1. Grupuj obrazy na oko myszy na podstawie tego samego regionu siatkówki.
      UWAGA: Oryginalne obrazy pozyskane z systemu CSLO są zapisywane w następującym formacie: TIFF, o wymiarze 1536 x 1536 pikseli, rozdzielczości 5,69 um/piksel i wartości ART ≥15.
   2. W celu przeprowadzenia badań kontrolnych należy zaimportować obrazy do odpowiedniego oprogramowania do przetwarzania obrazów. W razie potrzeby obróć i wyrównaj obrazy, aby dopasować je do orientacji obrazu linii bazowej. Podczas zapisywania lub eksportowania przetworzonych obrazów należy używać ustawień, które zachowują najwyższą możliwą jakość obrazu, aby zminimalizować potencjalne artefakty kompresji.
   3. Wyrównaj obrazy CSLO z serii czasowej tego samego oka, obracając je tak, aby pasowały do odpowiedniego obrazu linii bazowej, używając układu naczyniowego i tarczy nerwu wzrokowego jako punktów orientacyjnych.
      UWAGA: Dokładnie zbadaj każdy wyrównany obraz, a przed przystąpieniem do przycinania upewnij się, że spełniają następujące kryteria: (1) Uchwycenie pełnego obszaru siatkówki: Obraz musi w pełni obejmować zamierzony obszar siatkówki będący przedmiotem zainteresowania, w tym kluczowe punkty orientacyjne, takie jak tarcza nerwu wzrokowego i główne naczynia krwionośne; (2) Brak artefaktów ruchu: Obraz powinien być wolny od rozmycia, smug lub duplikacji struktur spowodowanych ruchem gałek ocznych podczas obrazowania; (3) Minimalne zniekształcenia: Obraz powinien dokładnie odwzorowywać strukturę siatkówki bez artefaktów zniekształceń, rozciągania lub kompresji, które mogą powstać w wyniku kątów obrazowania lub efektów soczewki. (4) Równowaga wskaźników jakości obrazu: ocena poziomu szumu tła (odchylenie standardowe intensywności pikseli w obszarach pozbawionych struktury< 5 (skala 0–255)); stosunek sygnału do szumu (SNR >20), spójność oświetlenia (współczynnik zmienności między sześcioma kwadrantami obrazu <10%) i jednorodność obrazu (współczynnik zmienności w jednorodnych obszarach <15%).
   4. Wybierz obrócony obraz i wyeksportuj go w formacie TIFF. Dla każdego punktu czasowego użyj narzędzia do przycinania, aby losowo wybrać i przyciąć 5-10 obszarów (300 x 300 pikseli każdy) zawierających komórki GFP z obrazów o zatwierdzonej jakości. Eksportuj każdy przycięty obraz indywidualnie w formacie TIFF w celu dalszej analizy.
3. Pomiar intensywności fluorescencji
   1. Otwórz przycięte obrazy CSLO (8-bitowa skala szarości, 300 x 300 pikseli) w ImageJ/Fiji.
   2. Aby zbadać ogólne zmiany w sygnałach fluorescencyjnych, zmierz całkowitą intensywność fluorescencji na przycięty obraz za pomocą funkcji Analizuj > Mierz (lub Ctrl + M). Zapisz wartość "Średnia", reprezentująca średnią intensywność fluorescencji GFP dla całego wykadrowanego obrazu.
4. Kwantyfikacja RGC
   1. W ImageJ/Fiji dostosuj próg intensywności przyciętych obrazów CSLO za pomocą opcji Image > Dostosuj > Jasność/Kontrast, aby uzyskać optymalną wizualizację poszczególnych białych ciał somy na czarnym tle.
      UWAGA: Określ zindywidualizowany próg po przejrzeniu partii przyciętych obrazów lub zastosuj spójny algorytm progowania (np. metoda Huanga⁵ w ImageJ/Fiji). W przypadku metody Huanga: (1) Konwertuj obrazy na 8-bitową skalę szarości (Typ > obrazu > 8-bitowy). (2) Uzyskaj dostęp do narzędzia do określania progów (Obraz > Dostosuj próg >). (3) Wybierz Huang jako metodę progowania. (4) Wyświetl podgląd segmentacji i kliknij Zastosuj. Próg zostanie automatycznie obliczony i wyświetlony na histogramie obrazu.
   2. Aktywuj wtyczkę Cell Counter i kliknij każdą somę RGC z dodatnim wynikiem GFP, aby ją policzyć. Zapisz całkowitą liczbę komórek zaznaczonych w analizowanym regionie. Powtórz ten proces dla wszystkich przyciętych obrazów z każdego kolejnego punktu czasowego.
5. analiza danych
   1. Eksportuj dane dotyczące liczby komórek i intensywności fluorescencji do arkusza kalkulacyjnego lub oprogramowania statystycznego (np. GraphPad Prism).
   2. Wykonaj odpowiednie testy statystyczne w oparciu o odpowiedni projekt eksperymentalny i hipotezy. Zinterpretuj wyniki i wyciągnij wnioski.

Wyniki

Zgodnie z przedstawionym protokołem, różne komórki siatkówki zostały pomyślnie zwizualizowane i śledzone in vivo przy użyciu kombinacji dostarczania genów za pośrednictwem AAV oraz CSLO. AAV2-hSyn-eGFP skutecznie transdukowało RGC, co zaowocowało silną ekspresją eGFP w całej siatkówce, co potwierdzono za pomocą CSLO oraz kolokalizacji z markerem specyficznym dla RGC, białkiem wiążącym RNA z wielokrotnym splicingiem (RBPMS), znajdującym się konkretnie w warstwie komórek zwojowych (Rycina 2 i Rycina 3). Protokół potwierdził również możliwość celowania w glej Müllera przy użyciu AAV9-GfaABC1D-eGFP. Wizualizacja CSLO wykazała rozległą ekspresję eGFP, szczególnie w wewnętrznych warstwach siatkówki, co jest zgodne ze znanym głównym segmentem rozmieszczenia gleju Müllera. Sygnał dodatni dla GFP silnie kolokalizował również z markerem gleju Müllera, syntetazą glutaminową (GS), co dodatkowo potwierdziło specyficzność tego podejścia (Rycina 2E,F i Rycina 3B). Wyniki te potwierdziły wszechstronność dostarczania genów wspomaganego przez AAV w badaniu różnych typów komórek siatkówki. Aby potwierdzić możliwość celowania w glej Müllera, zastosowano AAV9-GfaABC1D-eGFP. Obrazowanie CSLO wykazało rozległą ekspresję eGFP, szczególnie w wewnętrznych warstwach siatkówki, co jest zgodne ze znanym rozmieszczeniem gleju Müllera (Rycina 2E,F). Ten selektywny wzorzec ekspresji został dodatkowo zwalidowany przez wysoki stopień kolokalizacji zaobserwowany pomiędzy sygnałem GFP a markerem gleju Müllera, syntetazą glutaminową (GS) (Rycina 3B).

Aby określić swoistość i wydajność metody celowania wirusowego zarówno w przypadku RGC, jak i gleju Müllera, przeprowadzono analizę kolokalizacji w celu porównania fluorescencji GFP ze standardowymi markerami typów komórek (Rysunek 3B,D). Przeanalizowano łącznie 6 oczu myszy. W przypadku RGC celowanych za pomocą AAV2-hSyn-GFP wydajność transdukcji wyniosła 64% ± 3%, natomiast swoistość transdukcji wyniosła 68% ± 3%. Dla gleju Müllera celowanego za pomocą AAV9-GfaABC1D-GFP wydajność transdukcji wyniosła 58% ± 2%, a swoistość transdukcji wyniosła 71% ± 2%. Wyniki te wykazują, że ta metoda dostarczania genów za pośrednictwem AAV umożliwia selektywne znakowanie odrębnych typów komórek siatkówki, co podkreśla jej wszechstronność w badaniu procesów komórkowych i molekularnych w siatkówce.

Aby ocenić przydatność CSLO do podłużnego monitorowania zaburzeń komórek siatkówki, przeprowadzono model przejściowego ONC u myszy zainfekowanych AAV2-hSyn-eGFP. W ciągu dwóch tygodni zaobserwowano progresywny spadek sygnału eGFP oraz liczby RGC (Rysunek 4). Przeżywalność RGC określono za pomocą trzech parametrów: intensywności fluorescencji CSLO, zliczania komórek in vivo na obrazach CSLO oraz zliczania RGC ex vivo dla komórek dodatnich dla RBPMS. Po przetworzeniu obrazów zgodnie z opisem w kroku 4, z każdej siatkówki (łącznie 6 oczu) wycięto co najmniej 10 obszarów zainteresowania (ROI), dbając o to, aby każdy ROI obejmował tę samą lokalizację w siatkówce i wykazywał wyraźne sygnały komórkowe w każdym punkcie czasowym. Intensywność fluorescencji CSLO określono poprzez pomiar średniej intensywności w każdym wyciętym ROI w każdym punkcie czasowym. Liczbę komórek in vivo uzyskano poprzez ręczne zliczanie poszczególnych RGC dodatnich dla GFP w tych samych wyciętych ROI w każdym punkcie czasowym. Na koniec pobrano siatkówki do immunobarwienia RBPMS i policzono komórki dodatnie dla RBPMS w 24 zdefiniowanych obszarach obrazowanych na sektor siatkówki dla każdej siatkówki. Stwierdzono istotne ujemne korelacje między wszystkimi trzema parametrami przeżywalności RGC (intensywnością fluorescencji CSLO, liczbą komórek in vivo oraz liczbą komórek dodatnich dla RBPMS ex vivo) a czasem po ONC (p < 0.001 dla wszystkich, Rysunek 4C), co wykazało progresywną utratę i degenerację RGC. Co ważne, nie zaobserwowano istotnych różnic między poszczególnymi grupami eksperymentalnymi pod kątem początkowej gęstości RGC lub tempa ich spadku, co wskazuje na ogólną spójność modelu ONC i podejścia obrazowego. Wyniki te są zgodne z poprzednimi badaniami nad uszkodzeniami RGC po ONC i potwierdzają skuteczność niniejszego protokołu opartego na CSLO jako nieinwazyjnego i wiarygodnego narzędzia do monitorowania stanu zdrowia RGC.

Aby dalej zbadać projekcje aksonalne RGC w obrębie szlaku wzrokowego, zastosowano metodę podwójnego znakowania, łącząc znakowanie eGFP za pośrednictwem AAV z anterogradnym znacznikiem – podjednostką B toksyny cholerycznej (CTB)²⁴. Myszy otrzymały iniekcję dokonawczą z CTB i zostały uśmiercone 2 dni później w celu przeprowadzenia analizy histologicznej. Kolokalizacja sygnałów eGFP i CTB w nerwach wzrokowych potwierdziła prawidłowe śledzenie aksonów RGC (Rycina 5A). Aby dalej badać zmiany sygnałów po uszkodzeniu aksonalnym, u myszy przeprowadzono jednostronny ucisk nerwu wzrokowego (ONC), będący modelem ostrego uszkodzenia RGC²⁵. W skrócie, myszy zanieziono, a jeden nerw wzrokowy odsłonięto i uciśnięto precyzyjną pęsetą przez 5 s w odległości około 1 mm za gałką oczną, co wywołało znaczną aksotomię RGC i następującą po niej degenerację. Po urazie ONC zaobserwowano wyraźny spadek intensywności zarówno eGFP, jak i CTB, co wskazywało na znaczną utratę włókien nerwowych i zaburzenie transportu aksonalnego. Dalsza analiza przekrojów mózgu ujawniła projekcje RGC do kolliculus superior (SC), struktury śródmózgowia zaangażowanej w integrację sensoryczno-motoryczną i ruchy gałek ocznych, oraz do ciała kolankowatego bocznego (LGN), głównego ośrodka przekaźnikowego informacji wzrokowej do kory wzrokowej. Po ONC stwierdzono zmniejszoną intensywność GFP po stronie przeciwległej do urazu (Rycina 5B-E). Wyniki te demonstrują użyteczność tej metody w badaniu degeneracji aksonalnej RGC i mapowaniu wzorów ich projekcji in vivo, stanowiąc potencjalną alternatywę dla tradycyjnych inwazyjnych metod śledzenia.

Rycina 1: System obrazowania konfokalnym skaningowym oftalmoskopem laserowym (CSLO) oraz interfejs panelu sterowania do obrazowania siatkówki na żywo. (A-D) Komponenty systemu obrazowania: Te obrazy przedstawiają kluczowe elementy urządzenia HRA CSLO. (A) Dźwignia filtra jest ustawiona w pozycji „A” dla połączonego obrazowania refleksji podczerwieni (IR) i angiografii z fluoresceiną (FA). (B) Pokrętło ostrości służy do precyzyjnej regulacji ostrości soczewki obiektywu. (C) Mikromanipulator umożliwia precyzyjne pozycjonowanie, wyrównywanie i oświetlanie wiązki światła na siatkówkę poprzez wiele stopni swobody (np. osie X, Y, Z) oraz obrót. (D) Pokrętło czułości kontroluje jasność obrazów IR i FA poprzez regulację wzmocnienia wykrywanego sygnału świetlnego. Naciśnięcie pokrętła inicjuje uśrednianie obrazu, co łączy wiele klatek w celu redukcji szumów i poprawy stosunku sygnału do szumu. (E-H) Interfejs panelu sterowania: Zrzuty ekranu pokazują panel sterowania CSLO z ustawieniami użytymi do akwizycji i wizualizacji obrazów na żywo. (E) Inicjacja panelu sterowania akwizycją. (F) Zaleca się tryb wysokiej rozdzielczości dla optymalnej jakości obrazu. (G) Wyróżniono ustawienia obrazowania IR, umożliwiające wizualizację struktur siatkówki i naczyń krwionośnych. (H) Ustawienia obrazowania FA wyświetlają opcje obrazowania fluorescencyjnego jednopunktowego i wielopunktowego, umożliwiając wykrywanie sygnałów fluorescencyjnych w komórkach siatkówki. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Rycina 2: Obrazowanie CSLO in vivo fluorescencyjnie znakowanych komórek siatkówki po transfekcji AAV u myszy C57. (A) Harmonogram eksperymentalny podłużnego obrazowania wspomaganego CSLO po transfekcji AAV w oku myszy. (B) Reprezentatywne obrazy CSLO obszarów górnych i centralnych siatkówki myszy C57 po 4 tygodniach ekspresji AAV2-hSyn-eGFP. Pasek skali: 500 µm. (C) Ręcznie zszyty montaż siatkówki z (B) przedstawiający rozkład komórek siatkówki wykazujących ekspresję eGFP. Pasek skali: 500 µm. (D) Powiększony obraz CSLO obszaru zaznaczonego ramką w (C) oraz odpowiadający mu obraz mikroskopii konfokalnej preparatu siatkówki typu flatmount. Kolokalizacja eGFP (zielony) z markerem RGC RBPMS (czerwony) potwierdza ekspresję zapośredniczoną przez AAV w komórkach zwojowych siatkówki (przykłady zaznaczone okręgiem). Pasek skali: 50 µm. (E) Ręcznie zszyty montaż siatkówki myszy C57 4 tygodnie po wstrzyknięciu AAV9-GfaABC1D-eGFP, wykazujący specyficzną dla gleju Müllera ekspresję eGFP. Pasek skali: 500 µm. (F) Powiększony obraz CSLO obszaru zaznaczonego ramką w (E) oraz odpowiadający mu obraz mikroskopii konfokalnej preparatu siatkówki typu flatmount. Kolokalizacja eGFP (zielony) z markerem gleju Müllera syntetazą glutaminową (GS, czerwony) potwierdza ekspresję zapośredniczoną przez AAV w komórkach gleju Müllera (przykłady zaznaczone okręgiem). Pasek skali: 50 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Rysunek 3: Specyficzność typów komórek w dostarczaniu genów za pomocą AAV w siatkówce myszy. (A) Immunohistochemia przekroju siatkówki oraz preparatu typu flatmount od myszy C57 po 4 tygodniach infekcji AAV2-hSyn-eGFP. Kolokalizacja GFP (zielony) z RBPMS (czerwony) potwierdza ekspresję specyficzną dla RGC. Pasek skali: 50 µm. (B) Ilościowe oznaczenie wydajności i specyficzności transdukcji AAV2-hSyn-GFP w RGC. Wydajność przedstawiono jako procent RGC dodatnich pod kątem RBPMS, które wykazują również ekspresję GFP w preparacie flatmount siatkówki. Specyficzność przedstawiono jako procent komórek dodatnich pod kątem GFP, które są jednocześnie dodatnie pod kątem RBPMS w przekroju siatkówki (n = 6 oczu od 4 myszy). (C) Barwienie immunofluorescencyjne przekroju siatkówki oraz preparatu typu flatmount od myszy C57 po 4 tygodniach infekcji AAV9-GfaABC1D-eGFP. Kolokalizacja GFP (zielony) z GS (czerwony) potwierdza ekspresję specyficzną dla gleju Müllera. Pasek skali: 50 µm. (D) Ilościowe oznaczenie wydajności i specyficzności transdukcji AAV9-GfaABC1D-GFP w gleju Müllera. Wydajność przedstawiono jako procent komórek gleju Müllera dodatnich pod kątem GS, które wykazują również ekspresję GFP w preparacie flatmount siatkówki. Specyficzność przedstawiono jako procent komórek dodatnich pod kątem GFP, które są jednocześnie dodatnie pod kątem GS w przekroju siatkówki (n = 6 oczu od 3 myszy). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Rycina 4: Podłużne monitorowanie CSLO przeżywalności RGC po ostrym zmiażdżeniu nerwu wzrokowego (ONC) u myszy AAV2-hSyn-eGFP. (A) Schematyczny diagram osi czasu eksperymentu dotyczącego ostrego uszkodzenia nerwu wzrokowego po infekcji AAV. (B) Podłużne obrazowanie CSLO tej samej siatkówki u myszy AAV2-hSyn-eGFP w punkcie wyjściowym, 7 dni oraz 14 dni po ONC, wizualizujące RGC wykazujące sygnały GFP. Powiększone obrazy obszarów zaznaczonych ramką przedstawiono po prawej stronie, obok reprezentatywnych obrazów mikroskopii konfokalnej preparatów płaskich siatkówki, demonstrujących morfologię i rozkład RGC. Paski skali: 100 µm. (C) Ilościową ocenę przeżywalności RGC w ciągu dwóch tygodni po ONC przeprowadzono poprzez pomiar procentowej zmiany zarówno liczby komórek, jak i intensywności fluorescencji CSLO w stosunku do punktu wyjściowego (średnia ± SEM). W każdym punkcie czasowym nie zaobserwowano istotnych różnic między grupami (jednoczynnikowa ANOVA). Analiza regresji liniowej wykazała istotne ujemne korelacje między czasem po uszkodzeniu a wskaźnikami przeżywalności RGC opartymi na fluorescencji GFP (r² = 0.945, p < 0.001), barwieniu RBPMS (r² = 0.888, p < 0.001), liczbie komórek w CSLO (r² = 0.511, p < 0.001) oraz intensywności fluorescencji CSLO (r² = 0.7486, p < 0.001). n = 6 myszy/grupa/punkt czasowy. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.

Rycina 5: Mapowanie projekcji aksonalnych RGC wzdłuż szlaku wzrokowego z pomocą AAV. (A) Reprezentatywne obrazy z mikroskopii fluorescencyjnej pary nerwów wzrokowych myszy AAV2-hSyn-eGFP, wykazujące aksony RGC znakowane GFP (zielony) i kolokalizację z anterogradnym tracerem aksonalnym toksyną choleryczną B (CTB, purpurowy). Górny panel przedstawia przekrój całych nerwów wzrokowych (pasek skali: 1000 µm), natomiast dolny panel oferuje powiększone widoki obszarów zaznaczonych ramkami (pasek skali: 100 µm). Dwa tygodnie po urazie ONC sygnały GFP i CTB wykazują wyraźną redukcję w całym nerwie wzrokowym (lewa strona), co wskazuje na utratę aksonów RGC i przerwanie ciągłości wzdłuż szlaku wzrokowego. (B) Projekcje aksonalne RGC do wzgórka górnego (SC). Koronalne przekroje mózgu myszy AAV2-hSyn-eGFP 2 tygodnie po ONC uwydatniają aksony RGC znakowane GFP (zielony) i barwienie CTB (purpurowy) w obrębie SC. Lewo (L): przeciwległy SC; Prawo (R): ipsilateralny SC (strona z urazem ONC). Pasek skali: 1000 µm. (C) Powiększony widok obszaru zaznaczonego ramką w (B) demonstruje kolokalizację sygnałów GFP i CTB (obraz złożony), uwydatniając pęczki aksonalne RGC i ich wzorce projekcji w obrębie SC. Pasek skali: 100 µm. (D) Projekcje aksonalne RGC do bocznego kolanka ciała geniculatum (LGN) po ONC, wykazujące aksony RGC znakowane GFP (zielony) i barwienie CTB (purpurowy) w obrębie LGN. Lewo (L): przeciwległy LGN; Prawo (R): ipsilateralny LGN (strona z urazem ONC). Pasek skali: 1000 µm. (E) Powiększony widok obszaru zaznaczonego ramką w (D) uwydatnia pęczki aksonalne RGC i ich wzorce projekcji w obrębie LGN. Pasek skali: 100 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Dyskusja

Przedstawiony protokół szczegółowo opisuje solidną i dostępną metodę nadzoru in vivo określonych populacji komórek siatkówki, wykorzystując moc zarówno dostarczania genów za pośrednictwem AAV, jak i obrazowania CSLO. Podejście to ma kilka zalet w porównaniu z tradycyjnymi metodami, ułatwiając podłużne badania dynamiki komórek siatkówki i ich reakcji na uraz lub chorobę w warunkach fizjologicznych lub patologicznych.

Sukces tej metody zależy od kilku kluczowych kroków. Po pierwsze, osiągnięcie optymalnej wydajności transdukcji AAV ma kluczowe znaczenie dla solidnej i specyficznej ekspresji reportera fluorescencyjnego w docelowej populacji komórek. Wpływ na to mogą mieć takie czynniki, jak selekcja serotypu AAV, miano wirusa i technika iniekcji 13,15,16. Po drugie, właściwe obchodzenie się ze zwierzętami i krępowanie podczas obrazowania CSLO są niezbędne do zminimalizowania artefaktów ruchu i utrzymania jakości obrazu. Zastosowanie specjalnie zbudowanej platformy obrazowania i unikanie znieczulenia ogólnego przyczynia się do uzyskania wyraźnej i spójnej wizualizacji struktur siatkówki. Po trzecie, konieczna jest staranna optymalizacja parametrów obrazowania CSLO, w tym ustawień ostrości, czułości i uśredniania, w celu uzyskania obrazów o wysokiej rozdzielczości z minimalnym szumem i optymalnym stosunkiem sygnału do szumu²⁶. Wreszcie, aby zaradzić potencjalnym ograniczeniom i zapewnić wiarygodność danych, wdrożyliśmy rygorystyczne środki kontroli jakości obrazu i zwiększyliśmy liczbę zwierząt w naszym projekcie badania.

System Spectralis HRA CSLO jest wyposażony w funkcję automatycznego śledzenia ruchu gałek ocznych, która usprawnia kliniczne obrazowanie podłużne. Funkcja automatycznego śledzenia w czasie rzeczywistym (ART) może blokować się na określonym obszarze siatkówki podczas obrazowania, redukując artefakty ruchu. W przypadku obrazowania klinicznego u ludzi system zawiera również algorytm długoterminowego śledzenia tej samej anatomicznej lokalizacji siatkówki²⁷. Jednak technologie te nie są zoptymalizowane pod kątem badań na gryzoniach ze względu na znaczne różnice anatomiczne między oczami ludzi i gryzoni. Oczy gryzoni są znacznie mniejsze (3-4 mm średnicy w porównaniu do 24 mm u ludzi) i nie mają pewnych punktów orientacyjnych, takich jak plamka żółta, co stanowi wyjątkowe wyzwanie dla automatycznego śledzenia²⁸. W związku z tym naukowcy badający modele gryzoni polegają przede wszystkim na metodach ręcznych, wykorzystując anatomiczne punkty orientacyjne, takie jak wzory naczyń i głowa nerwu wzrokowego, aby zlokalizować określone obszary siatkówki i utrzymać spójne płaszczyzny obrazowania we wszystkich sesjach^13,22. Takie podejście jest konieczne nie tylko ze względu na ograniczoną liczbę punktów orientacyjnych w oczach gryzoni, ale także ze względu na potencjalne znaczne zmiany w siatkówce wywołane manipulacjami eksperymentalnymi, które mogłyby zmylić zautomatyzowane systemy, które nie zostały zaprojektowane z myślą o tych konkretnych wyzwaniach. W związku z tym opracowanie specjalistycznych algorytmów śledzenia ruchu gałek ocznych i wyrównywania do obrazowania siatkówki gryzoni stanowi kluczowy kierunek w przyszłości. W szczególności dostosowanie długoterminowych algorytmów śledzenia do wykorzystania przez małe zwierzęta mogłoby znacznie zwiększyć precyzję i odtwarzalność badań podłużnych.

Podczas gdy tradycyjne techniki histologiczne wymagają składania ofiar ze zwierząt i wykluczają badania podłużne, ta metoda obrazowania CSLO wspomagana AAV oferuje nieinwazyjne podejście do monitorowania dynamiki komórek siatkówki in vivo. Podejście to opiera się na wcześniejszych pracach wykazujących przydatność obrazowania cSLO do śledzenia zmian podłużnych w określonych komórkach siatkówki po urazie, szczególnie w modelach zwierzęcych wykorzystujących transgeniczne znakowanie białek fluorescencyjnych 19,21,22,29. Badania te podkreśliły zdolność CSLO do wizualizacji szeregu zdarzeń komórek siatkówki in vivo, w tym śmierci komórki, przeżycia, a potencjalnie nawet migracji lub wzrostu procesu. Protokół ten rozszerza zastosowanie tej techniki do badania transdukcji za pośrednictwem AAV określonych populacji komórek siatkówki, umożliwiając nam monitorowanie długoterminowych skutków dostarczania AAV i ekspresji transgenu w siatkówce oraz dostarczając kluczowych informacji na temat postępu chorób siatkówki i skuteczności interwencji terapeutycznych. Obecne oceny kliniczne z wykorzystaniem OCT koncentrują się przede wszystkim na utracie aksonów RGC poprzez pomiar grubości warstwy włókien nerwowych^{siatkówki 9}, ale brakuje w nich rozdzielczości, aby ocenić indywidualną morfologię RGC lub zaangażowanie komórek glejowych. Chociaż AO-SLO umożliwia obrazowanie na poziomie komórkowym w żywej ludzkiej siatkówce¹⁰, jego złożoność i ograniczona dostępność ograniczają jego zastosowanie głównie w warunkach badawczych. Ponadto różnicowanie typów komórek glejowych w obrębie AO-SLO często wymaga dodatkowych metod znakowania³⁰. Metoda ta przezwycięża te ograniczenia, zapewniając bardziej kompleksowe i dostępne podejście do wizualizacji i śledzenia poszczególnych RGC i innych fluorescencyjnie znakowanych populacji komórek siatkówki w czasie. Otwiera to możliwości badania odpowiedzi komórkowych w różnych warunkach, pomagając w opracowywaniu terapii celowanych. Co więcej, połączenie obrazowania CSLO wspomaganego AAV z optogenetyką³¹ lub obrazowaniem wapnia³² może jeszcze bardziej pogłębić zrozumienie funkcji komórek siatkówki i jej ról w przetwarzaniu wzrokowym, rozwoju obwodów i regeneracji.

Pomimo siły tego podejścia należy wziąć pod uwagę pewne ograniczenia i potencjalne kwestie dotyczące rozwiązywania problemów. Może wystąpić zmienność w wydajności transdukcji AAV, co wymaga optymalizacji parametrów iniekcji lub miana wirusa dla określonych typów komórek lub warunków eksperymentalnych. Na obrazowanie CSLO mogą mieć wpływ takie czynniki, jak zmętnienie rogówki, niestabilność filmu łzowego i ruchy gałek ocznych, co wymaga starannego monitorowania i regulacji podczas akwizycji obrazu. Dodatkowo, ograniczona głębokość penetracji CSLO ogranicza wizualizację do wewnętrznych warstw siatkówki, potencjalnie wykluczając głębsze struktury, takie jak fotoreceptory³³. System Spectralis cSLO pozwala na wyraźną wizualizację różnych cech i wzorców komórkowych w obrębie siatkówki³⁴. Chociaż ta metoda obrazowania może ułatwić obserwację pojedynczych komórek w pewnych warunkach, jak wykazano w poprzedniej pracy wizualizującej poszczególne RGC u słabo znakowanych myszy Thy1-YFP²², może stanowić wyzwanie dla ilościowego określania pojedynczych komórek w gęsto znakowanych scenariuszach. Na przykład w tym badaniu masowe znakowanie RGC eGFP po infekcji siatkówki za pośrednictwem AAV może czasami utrudniać wyraźną wizualizację pojedynczych komórek, szczególnie w obszarach o różnicach w poziomach ekspresji i nakładaniu się komórek. Wyzwanie to jest dodatkowo spotęgowane podczas obrazowania gleju Müllera, ponieważ ich wydłużona morfologia, obejmująca całą grubość siatkówki³⁵, utrudnia uchwycenie pojedynczej komórki w jednej płaszczyźnie ogniskowej za pomocą cSLO. Ocena skuteczności infekcji glejowej Müllera za pośrednictwem AAV9 opiera się zatem przede wszystkim na ocenie ogólnych wzorców transdukcji i dystrybucji za pomocą obrazowania CSLO.

Co więcej, podczas gdy uśrednianie ART w systemie HRA poprawia jakość obrazu, wydłużony czas skanowania ma praktyczne ograniczenia, zwłaszcza w przypadku obrazowania zwierząt w stanie czuwania. Wybrana średnia wartość ART wynosząca 15 ma na celu zrównoważenie jakości obrazu z czasem skanowania, zapewniając wystarczającą redukcję szumów przy zachowaniu rozsądnego czasu skanowania. Aby zminimalizować dyskomfort i stres zwierząt, procedury obrazowania muszą być zoptymalizowane pod kątem wydajności, zatrudniony przeszkolony personel wykwalifikowany w obchodzeniu się i obrazowaniu obudzonych zwierząt oraz pilnie monitorowane zwierzęta pod kątem oznak dyskomfortu lub suchości rogówki podczas sesji obrazowania. Środki te miały kluczowe znaczenie dla zapewnienia zarówno jakości danych, jak i dobrostanu zwierząt, podkreślając znaczenie uwzględnienia obu czynników przy stosowaniu uśredniania ART do obrazowania siatkówki in vivo w obudzonych modelach zwierzęcych.

Uznając te ograniczenia i potencjalne źródła zmienności, badacze mogą podjąć odpowiednie kroki w celu optymalizacji protokołów obrazowania, zminimalizowania artefaktów oraz zapewnienia wiarygodności i odtwarzalności swoich danych.

Ogólnie rzecz biorąc, ta dostępna i łatwa do wdrożenia metoda stanowi potężny środek do badania złożonych zależności między RGC a glejem Müllera, zwłaszcza w odpowiedzi na uraz lub chorobę. Umożliwiając naukowcom wizualizację i ilościowe określenie tych dynamicznych interakcji, podejście to ułatwia odkrycie nowych mechanizmów komórkowych i molekularnych leżących u podstaw patologii siatkówki. To z kolei rzuca światło na rozwój ukierunkowanych strategii terapeutycznych i ulepszone środki przeciwdziałania chorobom.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
33 Gauge Needle	Hamilton Corp., Reno, NV, USA	7803-05	Do wstrzykiwań doszklistkowych
0,5% proparakainy	Santen Pharmaceutical Co., Sp. z o.o.		Miejscowe leki przeciwbólowe
AAV2-hSyn-eGFP	OBiO Technology Corp., Chiny		Miano wirusa: 2,7 x 1012 genomy wirusa (vg)/mL
AAV9-GfaABC1D-eGFP	WZ Biosciences Inc., Chiny		Miano wirusa: 4,5 x 1012 genomy wirusa (vg)/mL
Betadine	Zdrowa firma medyczna	001651	Miejscowe środki antyseptyczne
Kleszcze rogówkowe (ząbkowane)	Mingren Eye Instruments, Chiny	MR-F301A	Do zabezpieczania powieki podczas iniekcji doszklistkowej
Kleszcze Dumont 05 #	FST	51-AGT5385	Do zmiażdżenia nerwu wzrokowego
Pryzmat Graphpad	GraphPad Prism, USA		Rysowanie wykresów i analiza statystyczna
HRA Spectralis	Heidelberg Engineering, GmbH, Dossenheim, NiemcyTryb		"IR" i "FA" do obrazowania CSLO
Obraz J/Fiji	National Institutes of Health, USA		Przetwarzanie obrazu
Maść z antybiotykiem Maxitrol	Alcon Laboratories, INC. USA	0065-0631	Antybiotyki miejscowe
Microliter Syringe	Hamilton Corp., Reno, NV, USA	7633-01	Do iniekcji doszklistkowych
Mydrin-P Roztwór okulistyczny	Santen Pharmaceutical Co., Ltd, Japonia		Rozszerzenie źrenicy
Okulistyczny mikroskop chirurgiczny	Leica AG, Heerbrugg, Szwajcaria	M220	Do operacji chirurgicznych
Pentorbarbitol Sodium	Sigma Aldrich, USA	57-33-0	Genereal Aneasthetics
Powerpoint	Microsoft Corporation, USA		Wyrównanie i kadrowanie
obrazu VISCOTEARS Liquid Gel (Carbomer)	Dr. Gerhard Mann, Chem.-Pharm. Fabrik, Niemcy		Smar do stosowania miejscowego