Artykuł metodologiczny

Wytwarzanie i charakterystyka plastrów mikroigłowych do ładowania i dostarczania egzosomów

4.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/67109

⸱

12 lipca 2024

 ,  , 
1Medical School, Faculty of Medicine, Tianjin University, 2Hangzhou Institute of Medicine, Chinese Academy of Sciences

W tym artykule

Podsumowanie

Egzosomy mają znaczny potencjał kliniczny, ale ich praktyczne zastosowanie jest ograniczone ze względu na łatwą klirens in vivo i słabą stabilność. Mikroigły stanowią rozwiązanie, umożliwiając miejscowe dostarczanie poprzez przebijanie barier fizjologicznych i zachowanie stanu suchego, rozwiązując w ten sposób ograniczenia podawania egzosomów i rozszerzając ich użyteczność kliniczną.

Streszczenie

Egzosomy, jako wyłaniające się bioterapeutyki nowej generacji i wektory dostarczania leków, mają ogromny potencjał w różnych dziedzinach biomedycznych, począwszy od dostarczania leków i medycyny regeneracyjnej, a skończywszy na diagnostyce chorób i immunoterapii nowotworów. Jednak szybki klirens przez tradycyjne wstrzyknięcie bolusa i słaba stabilność egzosomów ograniczają ich zastosowanie kliniczne. Mikroigły służą jako rozwiązanie, które wydłuża czas przebywania egzosomów w miejscu podania, utrzymując w ten sposób stężenie leku i ułatwiając utrzymanie efektów terapeutycznych. Ponadto mikroigły posiadają również zdolność do utrzymywania stabilności substancji bioaktywnych. Dlatego wprowadzamy plaster mikroigłowy do ładowania i dostarczania egzosomów oraz dzielimy się metodami, w tym izolacją egzosomów, wytwarzaniem i charakteryzacją plastrów mikroigłowych obciążonych egzosomami. Plastry mikroigłowe zostały wyprodukowane przy użyciu trehalozy i kwasu hialuronowego jako materiałów końcówek oraz poliwinylopirolidonu jako materiału podkładowego za pomocą dwuetapowej metody odlewania. Mikroigły wykazały się solidną wytrzymałością mechaniczną, a końcówki były w stanie wytrzymać 2 N. Skóra świni została użyta do symulacji ludzkiej skóry, a końcówki mikroigieł całkowicie stopiły się w ciągu 60 s po nakłuciu skóry. Egzosomy uwolnione z mikroigieł wykazywały morfologię, wielkość cząstek, białka markerowe i funkcje biologiczne porównywalne z świeżymi egzosomami, umożliwiając wychwyt komórek dendrytycznych i sprzyjając ich dojrzewaniu.

Wprowadzenie

Egzosomy, które są małymi pęcherzykami uwalnianymi przez komórki do macierzy zewnątrzkomórkowej, zostały zaproponowane jako potencjalne bioterapeutyki i wektory dostarczania leków do leczenia wielu chorób i nowotworów1. Podczas procesu biogenezy egzosomy otaczają różne biologicznie aktywne cząsteczki z wnętrza komórek, w tym funkcjonalne białka i kwasy nukleinowe2. W rezultacie, gdy są pobierane przez komórki biorcy podczas procesu transportu, egzosomy mają zdolność do modulowania ekspresji genów i funkcji komórkowych w komórkach docelowych3. Jako rodzaj naturalnego przekaźnika informacji, egzosomy zostały w pełni wykorzystane w regeneracji tkanek, regulacji odporności oraz jako nośnik dostaw4. Dzięki technikom inżynieryjnym określone ligandy mogą być wzbogacane na powierzchni egzosomów, umożliwiając indukcję lub hamowanie zdarzeń sygnalizacyjnych w komórkach biorcy lub celując w określone typy komórek5. Środki chemoterapeutyczne mogą być również ładowane do egzosomów w celu leczenia raka6. Co więcej, egzosomy mają zdolność przekraczania bariery krew-mózg w celu dostarczania ładunku terapeutycznego, co czyni je bardzo obiecującymi w leczeniu zaburzeń mózgu7. W porównaniu z liposomami, egzosomy wykazują zwiększony wychwyt komórkowy i lepszą biokompatybilność8. Są one zdolne do skutecznego wnikania do innych komórek, wykazując jednocześnie lepszą tolerancję i niższą toksyczność9. Jednak tradycyjne wstrzyknięcie egzosomów w bolusie jest podatne na sekwestrację i szybkie usuwanie przez wątrobę, nerki i śledzionę w krwiobiegu10. Co więcej, egzosomy mają słabą stabilność in vitro i są podatne na warunki przechowywania, co ogranicza ich zastosowania kliniczne11.

Mikroigły, zestaw mikrometrycznych końcówek igieł, mają zdolność przenikania przez fizjologiczne bariery w celu dostarczania leków małocząsteczkowych12, białka13, kwasy nukleinowe14, oraz nanomedicines15. Mikroigły są precyzyjnie zaprojektowane do celowania w zmiany chorobowe na powierzchni skóry, a ich rozproszone końcówki zapewniają równomierne rozprowadzenie leku w miejscu docelowym, wzmacniając w ten sposób ich działanie terapeutyczne16. Konstrukcja i skład materiałowy mikroigieł ułatwiają przechowywanie substancji bioaktywnych w suchym stanie, takich jak białka i kwasy nukleinowe, zwiększając ich stabilność17. Tradycyjne metody iniekcji mają stosunkowo krótki czas działania i mogą powodować ból, wywołując strach u pacjentów18. Mikroigłowa o długości mikrometra minimalizuje uszkodzenia tkanek i zapobiega stymulacji nerwów, eliminując w ten sposób ból i poprawiając przestrzeganie zaleceń pacjenta19. Dodatkowo, przyjazny dla użytkownika charakter mikroigieł pozwala pacjentom na samodzielne podawanie leczenia bez konieczności korzystania z wyspecjalizowanego personelu16. Oprócz skóry, mikroigły mogą być również stosowane w tkankach, takich jak oczy20, błona śluzowa jamy ustnej21, heart22 i naczynia krwionośne23. Zastosowanie mikroigieł do klinicznego dostarczania egzosomów stanowi obiecującą i perspektywiczną strategię.

Dlatego wprowadzamy łatkę mikroigłową (exo@MN) z egzosomami i ujawniamy metodę jej wytwarzania. Plastry mikroigłowe zostały wyprodukowane przy użyciu dwuetapowej metody odlewania, wraz z wirowaniem i suszeniem próżniowym, co sprzyja agregacji egzosomów na końcach mikroigieł, zwiększając w ten sposób wydajność dostarczania. Zarówno końcówki igieł, jak i podłoże zostały skonstruowane z materiałów, które wykazują doskonałą biokompatybilność i rozpuszczalność w wodzie. Trehaloza i kwas hialuronowy (HA) zostały włączone jako materiały końcówek, aby zapewnić ochronę egzosomów, a jako materiał podkładowy wybrano poliwinylopirolidon (PVP) rozpuszczony w absolutnym etanolu. Morfologię plastra mikroigłowego scharakteryzowano za pomocą mikroskopii i skaningowego mikroskopu elektronowego (SEM). Testy mechaniczne mikroigieł oceniono za pomocą miernika rozciągania, aby potwierdzić ich zdolność do penetracji skóry, a szybkość uwalniania na skórze świni zbadano na 60 s. Ponadto scharakteryzowano morfologię, wielkość i zawartość białka zarówno w świeżych egzosomach, jak i egzosomach w exo@MN za pomocą transmisyjnego mikroskopu elektronowego (TEM), analizy śledzenia nanocząstek (NTA) i western blottingu (WB). Internalizację egzosomów przez komórki dendrytyczne (DC) scharakteryzowano za pomocą konfokalnego laserowego mikroskopu skaningowego (CLSM), a dojrzewanie DC oceniono za pomocą cytometrii przepływowej. Charakterystyka morfologiczna i funkcje biologiczne tych dwóch typów egzosomów są zasadniczo spójne.

Protokół

Niniejsze badanie nie wymaga zgody komisji etycznej, ponieważ skóra wieprzowa użyta w eksperymentach opisanych w sekcji 3 została zakupiona na rynku jako jadalne uszy wieprzowe i nie pochodziła od zwierząt doświadczalnych.

1. Izolacja egzosomów

  1. Hodowla komórkowa
    1. Hodować mysie komórki raka nabłonkowego jajnika ID8 w pożywce DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) zawierającej 10% płodowej surowicy bydlęcej oraz 1% roztworu penicyliny i streptomycyny (100×) (patrz Tabela materiałów) w szalkach Petriego o średnicy 15 cm.
    2. Inkubować komórki ID8 w inkubatorze CO2 (patrz Tabela materiałów) w temperaturze 37 °C i przy 5% CO2 do momentu osiągnięcia 90% konfluencji.
  2. Izolacja egzosomów
    1. Usunąć pożywkę hodowlaną z szalek Petriego i przemyć dwukrotnie roztworem DPBS (Dulbecco's phosphate-buffered saline). Dodać 20 mL pożywki DMEM bez płodowej surowicy bydlęcej (patrz Tabela materiałów) i bez roztworu penicyliny i streptomycyny (patrz Tabela materiałów). Kontynuować inkubację w temperaturze 37 °C i przy 5% CO2 przez 48 h.
    2. Zebrać supernatant z hodowli komórkowej z 20 szalek Petriego o średnicy 15 cm. Wirować przy 300 x g przez 10 min w temperaturze 4 °C i zebrać supernatant w celu usunięcia wolnych komórek.
    3. Wirować przy 2000 x g przez 10 min w temperaturze 4 °C i zebrać supernatant w celu usunięcia debris komórkowego.
    4. Podłączyć jednorazowy system filtracji próżniowej 0,22 µm (patrz Tabela materiałów) do pompy próżniowej z obiegiem wody (patrz Tabela materiałów). Stworzyć podciśnienie, aby supernatant przeszedł przez membranę z polietersulfonu 0,22 µm i trafił do dolnej komory systemu filtracji, co skutecznie usunie z supernatantu pęcherzyki lub zanieczyszczenia większe niż 0,22 µm.
      1. Aby podłączyć pompę próżniową, włączyć przełącznik pompy, a następnie podłączyć ją do wlotu powietrza systemu filtracji próżniowej. Podczas zamykania układu, najpierw rozłączyć połączenie z pompą, a następnie wyłączyć pompę próżniową. Procedura ta pomaga zapobiec cofaniu się zawartości pompy i zanieczyszczeniu płynu hodowlanego.
    5. Dodać 15 mL supernatantu do wewnętrznej rurki probówki do ultrafiltracji 100 kDa (patrz Tabela materiałów). Wirować przy 3500 x g przez 10 min w temperaturze 4 °C i usunąć ciecz z rurki zewnętrznej.
      UWAGA: Cząstki większe niż 100 kDa zostają zatrzymane na membranie wewnętrznej rurki, natomiast białka mniejsze niż 100 kDa zostaną odwirowane do rurki zewnętrznej wraz z roztworem. Egzosomy są większe niż 100 kDa i uległy agregacji na membranie wewnętrznej rurki.
    6. Powtarzać powyższe kroki, aż całkowita objętość cieczy wyniesie mniej niż 5 mL. Zebrać ciecz z wewnętrznej rurki i dodać 1 mL DPBS. Użyć pipety do wielokrotnego pipetowania wewnątrz rurki, aby zapewnić resuspensję przyklejonych egzosomów w DPBS, a następnie je zebrać.
    7. Wirować przy 10 000 x g przez 60 min w temperaturze 4 °C i przelać supernatant do 6 mL probówki wirówkowej typu quick-snap (patrz Tabela materiałów). Uszczelnić probówkę za pomocą zgrzewarki termicznej.
    8. Wirować przy 100 000 x g przez 2 h w temperaturze 4 °C w ultracentryfudze (patrz Tabela materiałów). Przeciąć probówkę wirówkową typu quick-snap, usunąć supernatant i resuspendować osad w 100 µL DPBS. Otrzymany roztwór to roztwór egzosomów.
      UWAGA: Podczas procesu resuspensji osadu konieczne jest pipetowanie i uderzanie o ściankę probówki pipetą co najmniej 200 razy.

2. Wytwarzanie exo@MN

  1. Przygotowanie formy matki
    1. Zaprojektować w oprogramowaniu CAD model mikroiły w układzie macierzy 10 x 10 z końcówkami o kształcie stożka o następujących parametrach: wysokości 1200 µm, średnicy podstawy 400 µm i skoku (odległości między sąsiednimi mikroigłami) 900 µm.
    2. Wykorzystać żywicę HTL jako materiał i wydrukować formę matki mikroigieł za pomocą drukarki 3D (patrz Tabela materiałów).
    3. Zanurzyć formę matki w absolutnym etanolu na 1 h w celu usunięcia żywicy przylegającej do powierzchni.
    4. Naświetlać formę światłem ultrafioletowym przez 5 min w celu jej utwardzenia.
    5. Ponownie zanurzyć formę w absolutnym etanolu na 1 h, a następnie suszyć w temperaturze 60 °C w suszarce przez 1 h. Forma matki jest gotowa.
  2. Przygotowanie formy produkcyjnej
    1. Wymieszać składniki A i B polidimetylosiloksanu (PDMS, patrz Tabela materiałów) w stosunku 10:1. Dobrze wymieszać i wlać mieszaninę do formy matki.
    2. Umieścić formę PDMS pod ciśnieniem 1 psi przez 15 min w celu usunięcia pęcherzyków powietrza z mieszaniny PDMS.
    3. Utwardzić formę PDMS w temperaturze 60 °C przez 2 h, a następnie wyjąć z formy, aby otrzymać formę produkcyjną mikroigieł.
    4. Przed użyciem oczyścić formę produkcyjną wodą ultrapurozną.
  3. Przygotowanie roztworów
    1. Oznaczyć zawartość białka w roztworze egzosomów za pomocą zestawu do analizy BCA (patrz Tabela materiałów). Dodać odpowiednią ilość DPBS, aby uzyskać stężenie 10 µg/µL dla roztworu egzosomów.
    2. Przygotować roztwór trehalozy o stężeniu 200 mg/mL (patrz Tabela materiałów), stosując DPBS jako rozpuszczalnik. Mieszać przez 20 min do całkowitego rozpuszczenia.
    3. Przygotować roztwór kwasu hialuronowego (HA, patrz Tabela materiałów) o stężeniu 200 mg/mL, stosując DPBS jako rozpuszczalnik. Mieszać przez noc w celu zapewnienia pełnego rozpuszczenia.
    4. Przygotować roztwór poliwinylopirolidonu (PVP, patrz Tabela materiałów) o stężeniu 150 mg/mL, stosując absolutny etanol jako rozpuszczalnik. Mieszać przez noc w celu zapewnienia pełnego rozpuszczenia.
    5. Wymieszać roztwór egzosomów (10 µg/µL) i roztwór trehalozy (200 mg/mL) w stosunku objętościowym 1:1. Następnie dodać taką samą objętość roztworu HA (200 mg/mL). Dokładnie wymieszać, aby otrzymać roztwór do końcówek.
  4. Wytwarzanie exo@MN
    1. Obrobić powierzchnię formy PDMS za pomocą oczyszczacza plazmowego (patrz Tabela materiałów) przez 30 s przy niskiej mocy w celu zwiększenia jej hydrofilowości.
    2. Dodać 40 µL roztworu do końcówek do formy PDMS. Wirować w temperaturze pokojowej (RT) przy 3000 x g przez 3 min, aby upewnić się, że ciecz wypełnia warstwę igieł w formie.
    3. Usunąć nadmiar cieczy z formy i suszyć w temperaturze RT w próżniowej suszarce (patrz Tabela materiałów) przez 1 dzień.
    4. Dodać 200 µL roztworu PVP do formy PDMS. Wirować przy 3000 x g przez 3 min w temperaturze RT, aby upewnić się, że ciecz wypełnia warstwę podkładu w formie.
    5. Suszyć formę w temperaturze RT w suszarce przez 1 dzień, a następnie wyjąć z formy, aby otrzymać plaster exo@MN.
      UWAGA: Przechowywać plaster exo@MN w suszarce aż do momentu użycia.

Schemat procesu enkapsulacji egzosomów z wirowaniem, suszeniem, przy użyciu roztworów trehalozy/HA i PVP.
Rycina 1: Proces wytwarzania plastrów exo@MN. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

3. Charakterystyka plastrów exo@MN

  1. Obserwacja morfologii
    1. Przykleić podkład plastra do powierzchni nachylonej pod kątem 45° i ustawić go pod mikroskopem stereoskopowym (patrz Tabela materiałów).
    2. Włączyć oświetlenie i utrwalić morfologię plastra przy użyciu obiektywu 4x.
  2. Skaningowa mikroskopia elektronowa (SEM)
    1. Przymocować plaster do stolika obiektowego za pomocą przewodzącego kleju i poddać go naparowaniu w urządzeniu auto fine coater (patrz Tabela materiałów) przez 30 s.
    2. Wykonać obrazy plastra exo@MN za pomocą SEM (patrz Tabela materiałów) przy napięciu przyspieszającym 1 kV.
  3. Badania mechaniczne
    1. Wyciąć z plastra macierz o rozmiarze 3 x 3 i umieścić ją końcówkami skierowanymi do góry na sztywnej platformie pomiarowej maszyny do badań rozciągania (patrz Tabela materiałów). Dostosować wysokość sondy tak, aby znajdowała się blisko końcówek igieł, ale ich nie dotykała.
    2. Ustawić parametry tak, aby pomiar zatrzymał się automatycznie po osiągnięciu nacisku 20 N. Ścisnąć końcówki igieł w pionie z prędkością 0,5 mm/min i zapisać profil obciążenia w funkcji przemieszczenia.
  4. Rozpuszczanie
    1. Zakupić świeże uszy wieprzowe na targu i pokroić je na kawałki (5 cm x 5 cm x 0,3 cm). Rozłożyć skórę wieprzową na stole i osuszyć powierzchnię za pomocą papieru.
    2. Przygotować cztery suche plastry z mikroiğłami, kładąc je końcówkami igieł skierowanymi w dół na skórze wieprzowej w niewielkich odstępach. Docisnąć każdy plaster z mikroiğłami pionowo, używając kciuka i palca wskazującego. Usuwać jeden plaster co 15 s.
    3. Usunięty plaster natychmiast umieścić w suszarce i suszyć przez 5 min. Odciąć kolumnę końcówek mikroiğieł, ułożyć je poziomo pod mikroskopem (patrz Tabela materiałów) i użyć obiektywu 4x, aby zaobserwować rozpuszczanie końcówek.

4. Charakterystyka egzosomów w plastrze exo@MN

UWAGA: Końcówki mikroigieł exo@MN rozpuszcza się w 100 µL roztworu DPBS, aby przeprowadzić następującą charakterystykę uwolnionych egzosomów.

  1. Transmisyjna mikroskopia elektronowa (TEM)
    1. Poddać siatkę miedzianą (patrz Tabela materiałów) obróbce hydrofilowej przy użyciu czyściela jonowego (patrz Tabela materiałów) przez 5 min.
    2. Nanieść 10 µL próbki na stronę z węglem siatki miedzianej. Pozostawić na 1 min, a następnie usunąć nadmiar cieczy, osuszając krawędzie papierem filtracyjnym.
    3. Dodać 10 µL 3% octanu uranylu (patrz Tabela materiałów) do próbki. Pozostawić na 10 s, a następnie usunąć nadmiar cieczy, osuszając krawędzie papierem filtracyjnym.
    4. Dodać 10 µL 3% octanu uranylu do próbki. Pozostawić na 1 min, a następnie usunąć nadmiar cieczy, osuszając krawędzie papierem filtracyjnym i wysuszyć na powietrzu w RT.
    5. Wykonać obrazy egzosomów za pomocą TEM (patrz Tabela materiałów) przy napięciu przyspieszającym 80 kV.
  2. Analiza śledzenia nanocząstek (NTA)
    1. Rozcieńczyć roztwór egzosomów w DPBS, aby uzyskać stężenie cząstek 1 x 107 cząstek/mL. Powoli wstrzyknąć 1 mL roztworu egzosomów do komory próbkowej NTA, używając strzykawki 1 mL (patrz Tabela materiałów).
    2. Ustawić typ standardowej procedury operacyjnej (SOP) instrumentu na EV-488, aby wykryć rozkład wielkości egzosomów.
  3. Western blotting (WB)
    1. Przygotować bufor do lizy, mieszając bufor do lizy RIPA (radioimmunoprecipitation assay): fluorek fenylometanosulfonylu (patrz Tabela materiałów) w stosunku 100:1. Lizować egzosomy na lodzie przez 20 min, mieszając w vorteksie co 10 min.
    2. Odwirować roztwór przy 12 000 x g przez 10 min w 4 °C. Zebrać nadsącz w celu oznaczenia stężenia białek.
    3. Dodać do nadsączu bufor do nakładania SDS-PAGE 5x (patrz Tabela materiałów) w stosunku objętościowym 1 : 4 i dokładnie wymieszać. Podgrzewać w 100 °C przez 10 min, aby zdenaturować białka.
    4. Dodać 5 µL markeru białkowego pre-stain 180 kDa (patrz Tabela materiałów) oraz 10 µg zdenaturowanej próbki do gotowego żelu 4%-20% (patrz Tabela materiałów). Prowadzić elektroforezę (patrz Tabela materiałów) przy 60 V przez 10 min, a następnie przy 140 V przez 50 min.
    5. Przenieść białka z żelu na membranę PVDF (patrz Tabela materiałów) uprzednio aktywowaną metanolem. Prowadzić elektroforezę przy 290 mA przez 90 min na lodzie.
    6. Inkubować membranę PVDF w 5% roztworze mleka odtłuszczonego przez 1 h. Przemyć trzy razy solą buforową z Tweenem (TBST, patrz Tabela materiałów) po 5 min każdego płukania.
    7. Wyciąć docelowe prążki na podstawie pozycji białka. Inkubować prążki z przeciwciałem anty-mysim CD63 i przeciwciałem anty-mysim Alix (patrz Tabela materiałów) rozcieńczonymi do odpowiedniego stężenia zgodnie z instrukcją producenta, inkubując przez noc w 4 °C.
    8. Przemyć prążki trzy razy TBST. Inkubować z przeciwciałem anty-króliczym IgG sprzężonym z HRP (patrz Tabela materiałów) w RT przez 1 h. Następnie ponownie przemyć trzy razy TBST.
    9. Nanieść odczynnik detekcyjny super ECL (patrz Tabela materiałów), aby pokryć powierzchnię prążków, a następnie niezwłocznie naświetlić i zarejestrować prążki za pomocą obrazowacza żeli (patrz Tabela materiałów).
  4. Konfokalna mikroskopia skaningowa (CLSM)
    1. Hodować 5 x 105 DC w naczyniu konfokalnym w 2 mL pożywki Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI 1640) (patrz Tabela materiałów). Dodać egzosomy lub exo@MN i inkubować w 37 °C przez 24 h.
    2. Dodać kroplę Hoechst 33342 do każdego naczynia konfokalnego i inkubować w ciemności w 37 °C przez 20 min.
    3. Wykonać obrazowanie za pomocą CLSM (patrz Tabela materiałów) przy użyciu obiektywu 60x. Nanieść kroplę oleju immersyjnego (patrz Tabela materiałów) na obiektyw i umieścić naczynie konfokalne na stoliku. Dostosować osie x/y/z, aby zlokalizować odpowiednią płaszczyznę ogniskową komórek.
    4. Rozpocząć obrazowanie w kanałach DAPI/TRITC/TD, wybrać rozdzielczość 1024 px i ustawić tryb szybki na 1/8 s.
  5. Cytometria przepływowa
    1. Hodować DC w płytce 6-dołkowej, gdzie każdy dołek zawiera 5 x 105 komórek i 2 mL pożywki 1640. Dodać równe objętości roztworu DPBS, egzosomów, mikroigieł bez egzosomów oraz exo@MN odpowiednio i inkubować w 37 °C przez 24 h.
    2. Przenieść pożywkę z każdego dołka do probówek wirówkowych. Odwirować przy 300 x g przez 3 min w 4 °C i usunąć nadsącz.
    3. Dodać 0,5 µL przeciwciała FITC-CD11c, 2,5 µL przeciwciała APC-CD80 oraz 0,5 µL przeciwciała Pacific Blue I-A/I-E (patrz Tabela materiałów) do 100 µL 5% roztworu BSA (patrz Tabela materiałów). Dokładnie wymieszać, resuspender komórki i inkubować na wytrząsarce na lodzie i w ciemności przez 20 min.
    4. Dodać 1 mL DPBS i odwirować przy 300 x g przez 3 min w 4 °C, a następnie usunąć nadsącz. Powtórzyć płukanie dwukrotnie, aby usunąć niezwiązane przeciwciała, a następnie przystąpić do analizy odpowiadających kanałów fluorescencyjnych za pomocą cytometrii przepływowej (patrz Tabela materiałów).
      1. Najpierw, na wykresie rozrzutu FSC-A/SSC-A, wyznaczyć bramkę dla głównej populacji komórek jako P1. Na wykresie rozrzutu SSC-A/SSC-H populacji komórek P1 wyznaczyć kwadratowy obszar P2 wzdłuż przekątnej, aby usunąć zagregowane komórki.
      2. Przeprowadzić analizę fluorescencji populacji komórek P2 przy użyciu kanałów FITC, APC i Pacific Blue. Ustawić warunek stopu na zebranie 10 000 komórek w bramce P2.

5. Analiza statystyczna

  1. Dane ilościowe przedstawić jako średnie ± odchylenia standardowe (SD). Istotność statystyczną ocenić za pomocą analizy testem t, wykorzystując odpowiednie oprogramowanie do analizy danych. Wartości p mniejsze niż 0,05 uznać za wskazujące na istotność statystyczną. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001.

Wyniki

W niniejszej pracy przedstawiamy protokół izolacji egzosomów oraz wytwarzania i charakterystyki plastra exo@MN. Rysunek 1 ilustruje schemat procesu wytwarzania plastra exo@MN. Egzosomy zmieszano z trehalozą i HA, a następnie mieszaninę dodano do formy mikroigieł i poddano wirówkowaniu. Proces ten ułatwił agregację egzosomów w końcówkach igieł, co sprzyja ich szybkiemu uwalnianiu. Po wysuszeniu dodano roztwór PVP i poddano wirówkowaniu w celu całkowitego wypełnienia formy. Po pełnym wysuszeniu formę usunięto, aby uzyskać plastry exo@MN. Morfologię mikroigieł scharakteryzowano za pomocą mikroskopii i SEM, co przedstawiono na Rysunku 2. Końcówki w plastrze exo@MN miały kształt stożkowy, ułożony w matrycę 10 x 10, z ostrymi i nienaruszonymi wierzchołkami igieł. Końcówka mikroigły może wytrzymać siłę 2 N, co pozwala jej na przeniknięcie przez barierę skóry. Ponadto skórę świńską wykorzystano jako substytut skóry ludzkiej do symulacji aplikacji plastrów exo@MN. Plastry dociskano do skóry świńskiej, aby zaobserwować czas uwalniania; końcówki mikroigieł całkowicie rozpuściły się w ciągu 60 s. Plastry exo@MN rozpuszczono w DPBS i scharakteryzowano, jak pokazano na Rysunku 3. Obrazy TEM ukazały pęcherzyki o typowej strukturze w kształcie filiżanki, co jest zgodne z morfologią egzosomów. Rozkład wielkości cząsteczek roztworu exo@MN wyznaczony metodą NTA wykazał, że cząsteczki koncentrowały się głównie w zakresie 50-250 nm. Obecne były jednak również niektóre większe cząstki, co można przypisać właściwościom adhezyjnym materiału HA, powodującym agregację egzosomów. Analiza WB białek CD63/Alix w roztworze exo@MN wykazała, że exo@MN jest w stanie częściowo zatrzymać białka egzosomów. Funkcjonalność biologiczną egzosomów uwolnionych z exo@MN zwalidowano na Rysunku 4, koncentrując się na pobieraniu egzosomów przez komórki oraz aktywacji komórek dendrytycznych w porównaniu z egzosomami świeżymi. Obrazy CLSM potwierdziły efektywne pobieranie zarówno świeżych egzosomów, jak i egzosomów w exo@MN przez komórki DC. Reprezentatywne obrazy i statystyki proporcjonalne z cytometrii przepływowej wykazują, że egzosomy w exo@MN posiadają funkcje biologiczne promujące aktywację komórek DC w sposób podobny do świeżych egzosomów.

Macierze mikroiłeczek, obraz SEM, wykres ciśnienie-przemieszczenie, badanie kinetyki dynamicznej absorpcji.
Rysunek 2: Charakterystyka plastrów exo@MN. (A) Obrazy z mikroskopu stereoskopowego plastrów exo@MN. Pasek skali = 400 µm. (B) Obraz SEM plastrów exo@MN. Pasek skali = 200 µm. (C) Profile obciążenia w funkcji przemieszczenia plastra exo@MN. (D) Obrazy mikroskopowe plastrów exo@MN wprowadzonych w skórę świni w różnych odstępach czasu. Pasek skali = 400 µm. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Obrazy TEM egzosomów, wykres rozkładu wielkości nanocząstek oraz analiza markerów białkowych.
Rysunek 3: Charakterystyka świeżych egzosomów oraz egzosomów w exo@MN. (A) Morfologia egzosomów w TEM. Pasek skali = 100 nm. (B) Rozkład wielkości cząstek egzosomów w NTA. (C) CD63 i Alix w egzosomach w WB. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Analiza wychwytu egzosomów na podstawie obrazów mikroskopowych, wykresów cytometrii przepłyewej i wyników przedstawionych na wykresie słupkowym.
Rysunek 4: Testy biologiczne świeżych egzosomów oraz egzosomów w exo@MN. (A) Obrazy CLSM egzosomów pochłoniętych przez DC. Pasek skali = 10 µm. (B) Reprezentatywne wykresy aktywacji DC metodą cytometrii przepływowej. (C) Ilościowe oznaczenie procentowego udziału komórek DC CD11c+CD80+MHCII+. Dane przedstawiono jako średnia ± SD (n = 3). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Dyskusja

Obecnie główne metody izolacji egzosomów obejmują ultrawirowanie, wirowanie w gradiencie gęstości, ultrafiltrację, wytrącanie, kulki magnetyczne powinowactwa immunologicznego i mikrofluidykę24. Ze względu na ograniczoną ładowność mikroigieł spowodowaną małą przestrzenią na końcówce igły, konieczne jest zwiększenie stężenia egzosomów, aby załadować więcej. Dlatego wybraliśmy ultrafiltrację, aby zagęścić supernatant hodowli komórkowej, a następnie zastosowaliśmy ultrawirowanie do wyizolowania egzosomów. Stężenie egzosomów zostało zwiększone przez niewielką ilość płynnej reuspensji, tak aby mikroigły można było załadować dziesiątkami do setek mikrogramów egzosomów. Jednak metoda ta skutkuje znaczną obecnością białek w wyizolowanym roztworze egzosomu. Dodatkowo podczas procesu wirowania dochodzi do znacznej utraty egzosomów. W dzisiejszych czasach jednym z ograniczeń terapeutycznego zastosowania egzosomów jest brak skutecznych metod izolowania egzosomów o wysokiej czystości i w dużych ilościach. Ponieważ potencjał kliniczny egzosomów jest coraz częściej badany, istnieje potrzeba opracowania w przyszłości bardziej zaawansowanych technik, aby sprostać wyzwaniom związanym z ich ekstrakcją.

Kluczową technologią w tym badaniu jest konstrukcja mikroigieł na bazie egzosomów. W celu zminimalizowania marnotrawstwa egzosomów i osiągnięcia silniejszych efektów terapeutycznych, do wytwarzania plastrów exo@MN zastosowano dwuetapową metodę odlewania. Trehaloza została wcześniej opisana jako odpowiedni materiał do liofilizowanej konserwacji egzosomów25, podczas gdy HA wykazuje doskonałą biokompatybilność, hydrofilowość i funkcje w hamowaniu stanu zapalnego i promowaniu naprawy skóry26. Wytwarzanie końcówek igieł obciążonych egzosomami przy użyciu tych dwóch materiałów pomaga utrzymać aktywność biologiczną egzosomów, umożliwiając ich szybkie rozpuszczanie i uwalnianie w skórze. Co więcej, takie podejście minimalizuje ryzyko infekcji i przyczynia się do szybkiej regeneracji skóry. Poprzez wirowanie i suszenie próżniowe egzosomy zostały skoncentrowane na końcach mikroigieł. Biorąc pod uwagę niekompatybilność etanolu i trehalozy, jako materiał podkładowy wybrano PVP rozpuszczony w absolutnym etanolu. Ta warstwowa metoda wytwarzania skutecznie poprawiła wydajność dostarczania egzosomów.

Słaba stabilność egzosomów in vitro, niezależnie od tego, czy są przechowywane w temperaturze 4 °C, 37 °C czy -80 °C, może prowadzić do zmian w strukturze egzosomu lub degradacji11. Aby rozwiązać ten problem, w kilku badaniach przeanalizowano metody przechowywania egzosomów, takie jak liofilizacja. Technologia mikroigłowa zapewnia kolejną nowatorską strategię. Susząc w temperaturze pokojowej, technologia mikroigłowa może poprawić stabilność egzosomów i może być bezpośrednio stosowana do dostarczania egzosomów bez innych zabiegów. Co więcej, proces ekstrakcji egzosomów jest złożony i podatny na degradację, co sprawia, że zastosowania na dużą skalę są trudne. Przechowywanie wyekstrahowanych egzosomów przy użyciu technologii mikroigłowej nie upraszcza etapów ekstrakcji, ale zmniejsza liczbę wymaganych ekstrakcji. Pojedyncza ekstrakcja może wytworzyć dużą ilość exo@MN plastrów, które mogą być przechowywane przez dłuższy czas. Wykorzystanie mikroigieł egzosomów z tej samej partii do każdego zabiegu minimalizuje potencjalny wpływ różnic między różnymi partiami na wyniki terapeutyczne, zwiększając w ten sposób powtarzalność i niezawodność nanoplatformy egzosomów27. Daje to więcej możliwości klinicznego zastosowania egzosomów.

W przyszłych badaniach warto przyjrzeć się metodom, które umożliwią precyzyjną kontrolę ładunku i zminimalizują różnice w działaniu leku między końcówkami igieł. Można to osiągnąć poprzez optymalizację procesów, wdrożenie środków kontroli jakości i wykorzystanie zaawansowanych technik. Zajęcie się tymi aspektami w znacznym stopniu przyczyni się do opracowania niezawodnych i spójnych systemów dostarczania leków.

Oświadczenia

H. C., F. L. Q i S. J. M są wynalazcami w zgłoszeniu patentowym, które zostało złożone na podstawie danych zawartych w tym manuskrypcie. H.C. jest naukowym założycielem Medcraft Biotech. Inc.

Podziękowania

F.L.Q. docenia wsparcie wspierane przez Pioneer R&D Program of Zhejiang (2022C03031), National Key Research and Development Program of China (2021YFA0910103), National Natural Science Foundation of China (22274141, 22074080), Natural Science Foundation of Shandong (ZR2022ZD28) oraz Taishan Scholar Program of Shandong Province (tsqn201909106). H.C. dziękuje za wsparcie finansowe ze strony Narodowej Fundacji Nauk Przyrodniczych Chiny (82202329). Autorzy przyznają, że instrumenty są używane w Shared Instrumentation Core Facility w Instytucie Medycyny w Hangzhou (HIM) Chińskiej Akademii Nauk.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
100x roztwory penicyliny i streptomycynyJrunbio ScientificMA0110Hodowla komórkowa
180 kDa wstępnie wybarwiony marker białkowyThermo26616Western blotting
3% octan uranyluHenan Ruixin Materiały eksperymentalneGZ02625Charakterystyka morfologiczna egzosomów
Drukarka 3DTechnologiaBMF nanoArch S130Mold Przygotowanie
4%– 20% żel prefabrykowanyGenscriptExpressPlus PAGE GELWestern blotting
5 razy; Bufor ładujący SDS-PAGETitan04048254Western blott
Przeciwciało anty-mysie AlixBiolegend12422-1-APWestern blotting
Przeciwciało anty-mysie CD63Biolegendab217345Western blotting
APC przeciwciało przeciw myszom CD80Biolegend104713
Przeciwciało automatyczne drobnoziarnisteZIZHUJBA5-100Charakterystyka morfologiczna
zestawu do oznaczania BCABeyotimeP0012Test stężenia białka
WirówkaThermo FisherMuitifuge X1R proWirówka komórkowa
Pompa próżniowa do wody obiegowejYuhua InstrumentSHZ-D(III)filtracja
Inkubator CO2EppendorfCellXpert C170Hodowla
komórkowaKonfokalny laserowy mikroskop skaningowyNikonA1HD25Obrazowanie fluorescencyjne
Siatka miedzianaPekin Zhongjingkeyi Technologia JF-ZJKY/300Charakterystyka morfologiczna egzosomów
D- (+) -Trehaloza dwuhydratAladdin5138-23-4Wytwarzanie mikroigły 
Dulbecco' s zmodyfikowany Orzeł" s mediumMeilunbioMA0212Hodowla komórkowa
Dulbecco' s sól fizjologiczna buforowana fosforanamiMeilunbioMA0010Hodowla komórkowa
System elektroforezyBio-radPowerPac-basicWestern blotting
Surowica bydlęcapłodu Jrunbio ScientificJR100Hodowla komórkowa
FITC przeciwciało anty-mysie CD11cBiolegend117305Przeciwciało
Cytometria przepływowaBDLSR FortessaDetekcja fluorescencji
Obrazownik żelowyCytivaAmersham ImageQuant 800Western blotting
IgG IgG CST sprzężone z HRPWestern blotting
Żywica HTLTechnologiaPrzygotowanie pleśni
Kwas hialuronowy (MW = 300 kDa)Bloomage Biotechnology9004-61-9Produkcja mikroigły 
Olejek immersyjnyNikonMXA22168Obrazowanie fluorescencyjne
Środek do czyszczenia jonówJEOLEC-52000ICCharakterystyka morfologiczna egzosomów
MikroskopOlympusCKX53Obserwuj proces rozpuszczania końcówki mikroigłowej
Mysia komórka nabłonka jajnika ID8MeisenCTCC  CC90105Hodowla komórkowa
Analiza śledzenia nanocząstekCząstka MetrixZetaViewAnaliza wielkości egzosomów
Pacific Blue przeciwciało anty-mysie I-A/I-E Biolegend107619Przeciwciało
Fluorek fenylometanosulfonyluBeyotimeST507Inhibitory proteazy
Środek do czyszczenia plazmyHefei Kejing Technologia materiałowaPDC-36GWytwarzanie mikroigieł 
PolidimetylosiloksanDow Corning9016-00-6Przygotowanie formy
Poliwinylopirolidon (MW = 40 kDa)Aladdin9003-39-8Wykonanie mikroigły 
Pryzmat GraphPadWersja 9Analiza statystyczna
Membrana PVDFMilliporeIPVH00010Western blotting
Wirówka szybkozatrzaskowaBeckman344619Ekstrakcja egzosomów
Bufor do lizy RIPAApplygenC1053Membrana do lizy
Roswell park memorial institute 1640MeilunbioMA0548Hodowla
komórkowaSkaningowy mikroskop elektronowyJEOLJSM-IT800Charakterystyka morfologiczna mikroskopu mikroigłowego
Mikroskop stereoskopowyOlympusSZX16Charakterystyka morfologii
Odczynnik do wykrywania Super ECLApplygenP1030Western blott
Miernik rozciąganiaInstron68SC-05Badania mechaniczne
Transmisyjny mikroskop elektronowyJEOLJEM-2100plusCharakterystyka morfologiczna egzosomów
Tris buforowana sól fizjologicznaSangon BiotechJF-A500027-0004Western blotting
Tween-20BeyotimeST825Western blotting
UltrawirówkaBeckmanOptima XPN-100Ekstrakcja egzosomów
Rurka ultrafiltracyjnaMilliporeUFC910096Koncentracja egzosomów
Piec do suszenia próżniowegoShanghai Yiheng TechnologyDZF-6024Produkcja mikroigieł
System filtracji próżniowejFiltracja BiosharpBS-500-XT
mikroigłowego BMF

Bibliografia

  1. Barile, L., Vassalli, G. Exosomes: Therapy delivery tools and biomarkers of diseases. Pharmacol Ther. 174, 63-78 (2017).
  2. Kalluri, R., Lebleu, V. S. The biology, function, and biomedical applications of exosomes. Science. 367 (640), 6977(2020).
  3. Mathieu, M., Martin-Jaular, L., Lavieu, G., Thery, C. Specificities of secretion and uptake of exosomes and other extracellular vesicles for cell-to-cell communication. Nat Cell Biol. 21 (1), 9-17 (2019).
  4. Nair, A., et al. Hybrid nanoparticle system integrating tumor-derived exosomes and poly(amidoamine) dendrimers: Implications for an effective gene delivery platform. Chem Mater. 35 (8), 3138-3150 (2023).
  5. Lu, Z., et al. Dendritic cell-derived exosomes elicit tumor regression in autochthonous hepatocellular carcinoma mouse models. J Hepatol. 67 (4), 739-748 (2017).
  6. Oskouie, M. N., Aghili Moghaddam, N. S., Butler, A. E., Zamani, P., Sahebkar, A. Therapeutic use of curcumin-encapsulated and curcumin-primed exosomes. J Cell Physiol. 234 (6), 8182-8191 (2019).
  7. Yuan, D., et al. Macrophage exosomes as natural nanocarriers for protein delivery to inflamed brain. Biomaterials. 142, 1-12 (2017).
  8. Liao, W., et al. Exosomes: The next generation of endogenous nanomaterials for advanced drug delivery and therapy. Acta Biomater. 86, 1-14 (2019).
  9. Zhu, X., et al. Comprehensive toxicity and immunogenicity studies reveal minimal effects in mice following sustained dosing of extracellular vesicles derived from hek293t cells. J Extracell Vesicles. 6 (1), 1324730(2017).
  10. Wen, S., et al. Biodistribution of mesenchymal stem cell-derived extracellular vesicles in a radiation injury bone marrow murine model. Int J Mol Sci. 20 (21), 5468-5482 (2019).
  11. Cheng, Y., Zeng, Q., Han, Q., Xia, W. Effect of pH, temperature and freezing-thawing on quantity changes and cellular uptake of exosomes. Protein Cell. 10 (4), 295-299 (2019).
  12. Jana, B. A., Shivhare, P., Srivastava, R. Gelatin-PVP dissolving microneedle-mediated therapy for controlled delivery of nifedipine for rapid antihypertension treatment. Hypertens Res. 47 (2), 427-434 (2024).
  13. Zheng, Y., et al. A rapidly dissolvable microneedle patch with tip-accumulated antigens for efficient transdermal vaccination. Macromol Biosci. 23 (12), e2300253(2023).
  14. Huang, D., et al. Efficient delivery of nucleic acid molecules into skin by combined use of microneedle roller and flexible interdigitated electroporation array. Theranostics. 8 (9), 2361-2376 (2018).
  15. Zhou, Z., et al. Reverse immune suppressive microenvironment in tumor draining lymph nodes to enhance anti-pd1 immunotherapy via nanovaccine complexed microneedle. Nano Res. 13 (6), 1509-1518 (2020).
  16. Kim, Y. C., Park, J. H., Prausnitz, M. R. Microneedles for drug and vaccine delivery. Adv Drug Deliv Rev. 64 (14), 1547-1568 (2012).
  17. Bui, V. D., et al. Dissolving microneedles for long-term storage and transdermal delivery of extracellular vesicles. Biomaterials. 287, 121644(2022).
  18. Nir, Y., Potasman, I., Sabo, E., Paz, A. Fear of injections in young adults: Prevalence and associations. Am J Trop Med Hyg. 68 (3), 341-344 (2003).
  19. Zhang, Y., Jiang, G., Yu, W., Liu, D., Xu, B. Microneedles fabricated from alginate and maltose for transdermal delivery of insulin on diabetic rats. Mater Sci Eng C Mater Biol Appl. 85, 18-26 (2018).
  20. Roy, G., Garg, P., Venuganti, V. V. K. Microneedle scleral patch for minimally invasive delivery of triamcinolone to the posterior segment of eye. Int J Pharm. 612, 121305(2022).
  21. Creighton, R. L., Woodrow, K. A. Microneedle-mediated vaccine delivery to the oral mucosa. Adv Healthc Mater. 8 (4), 1801180(2019).
  22. Hu, S., Zhu, D., Li, Z., Cheng, K. Detachable microneedle patches deliver mesenchymal stromal cell factor-loaded nanoparticles for cardiac repair. ACS Nano. 16 (10), 15935-15945 (2022).
  23. Yang, W., Zheng, H., Lv, W., Zhu, Y. Current status and prospect of immunotherapy for colorectal cancer. Int J Colorectal Dis. 38 (1), 266-276 (2023).
  24. Zhang, M., et al. Methods and technologies for exosome isolation and characterization. Small Methods. 2 (9), 1800021(2018).
  25. Bosch, S., et al. Trehalose prevents aggregation of exosomes and cryodamage. Sci Rep. 6, 36162(2016).
  26. Bhattacharyya, M., Jariyal, H., Srivastava, A. Hyaluronic acid: More than a carrier, having an overpowering extracellular and intracellular impact on cancer. Carbohydr Polym. 317, 121081(2023).
  27. Chang, H., et al. Cryomicroneedles for transdermal cell delivery. Nat Biomed Eng. 5 (9), 1008-1018 (2021).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Dostarczanie egzosomówstabilność egzosomówdostarczanie lekówizolacja egzosomówkwas hialuronowymikroiły z trehaloząpodkład z poliwinylopirolidonutesty mechanicznepobieranie przez komórki dendrytyczne
Wytwarzanie i charakterystyka plastrów mikroigłowych do ładowania i dostarczania egzosomów
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.