Artykuł metodologiczny

Wytwarzanie i charakterystyka plastrów mikroigłowych do ładowania i dostarczania egzosomów

DOI:

10.3791/67109

⸱

12 lipca 2024

 ,  , 
1Medical School, Faculty of Medicine, Tianjin University, 2Hangzhou Institute of Medicine, Chinese Academy of Sciences

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Egzosomy mają znaczny potencjał kliniczny, ale ich praktyczne zastosowanie jest ograniczone ze względu na łatwą klirens in vivo i słabą stabilność. Mikroigły stanowią rozwiązanie, umożliwiając miejscowe dostarczanie poprzez przebijanie barier fizjologicznych i zachowanie stanu suchego, rozwiązując w ten sposób ograniczenia podawania egzosomów i rozszerzając ich użyteczność kliniczną.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Egzosomy, jako wyłaniające się bioterapeutyki nowej generacji i wektory dostarczania leków, mają ogromny potencjał w różnych dziedzinach biomedycznych, począwszy od dostarczania leków i medycyny regeneracyjnej, a skończywszy na diagnostyce chorób i immunoterapii nowotworów. Jednak szybki klirens przez tradycyjne wstrzyknięcie bolusa i słaba stabilność egzosomów ograniczają ich zastosowanie kliniczne. Mikroigły służą jako rozwiązanie, które wydłuża czas przebywania egzosomów w miejscu podania, utrzymując w ten sposób stężenie leku i ułatwiając utrzymanie efektów terapeutycznych. Ponadto mikroigły posiadają również zdolność do utrzymywania stabilności substancji bioaktywnych. Dlatego wprowadzamy plaster mikroigłowy do ładowania i dostarczania egzosomów oraz dzielimy się metodami, w tym izolacją egzosomów, wytwarzaniem i charakteryzacją plastrów mikroigłowych obciążonych egzosomami. Plastry mikroigłowe zostały wyprodukowane przy użyciu trehalozy i kwasu hialuronowego jako materiałów końcówek oraz poliwinylopirolidonu jako materiału podkładowego za pomocą dwuetapowej metody odlewania. Mikroigły wykazały się solidną wytrzymałością mechaniczną, a końcówki były w stanie wytrzymać 2 N. Skóra świni została użyta do symulacji ludzkiej skóry, a końcówki mikroigieł całkowicie stopiły się w ciągu 60 s po nakłuciu skóry. Egzosomy uwolnione z mikroigieł wykazywały morfologię, wielkość cząstek, białka markerowe i funkcje biologiczne porównywalne z świeżymi egzosomami, umożliwiając wychwyt komórek dendrytycznych i sprzyjając ich dojrzewaniu.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Egzosomy, które są małymi pęcherzykami uwalnianymi przez komórki do macierzy zewnątrzkomórkowej, zostały zaproponowane jako potencjalne bioterapeutyki i wektory dostarczania leków do leczenia wielu chorób i nowotworów1. Podczas procesu biogenezy egzosomy otaczają różne biologicznie aktywne cząsteczki z wnętrza komórek, w tym funkcjonalne białka i kwasy nukleinowe2. W rezultacie, gdy są pobierane przez komórki biorcy podczas procesu transportu, egzosomy mają zdolność do modulowania ekspresji genów i funkcji komórkowych w komórkach docelowych3. Jako rodzaj naturalnego przekaźnika informacji, egzosomy zostały w pełni wykorzystane w regeneracji tkanek, regulacji odporności oraz jako nośnik dostaw4. Dzięki technikom inżynieryjnym określone ligandy mogą być wzbogacane na powierzchni egzosomów, umożliwiając indukcję lub hamowanie zdarzeń sygnalizacyjnych w komórkach biorcy lub celując w określone typy komórek5. Środki chemoterapeutyczne mogą być również ładowane do egzosomów w celu leczenia raka6. Co więcej, egzosomy mają zdolność przekraczania bariery krew-mózg w celu dostarczania ładunku terapeutycznego, co czyni je bardzo obiecującymi w leczeniu zaburzeń mózgu7. W porównaniu z liposomami, egzosomy wykazują zwiększony wychwyt komórkowy i lepszą biokompatybilność8. Są one zdolne do skutecznego wnikania do innych komórek, wykazując jednocześnie lepszą tolerancję i niższą toksyczność9. Jednak tradycyjne wstrzyknięcie egzosomów w bolusie jest podatne na sekwestrację i szybkie usuwanie przez wątrobę, nerki i śledzionę w krwiobiegu10. Co więcej, egzosomy mają słabą stabilność in vitro i są podatne na warunki przechowywania, co ogranicza ich zastosowania kliniczne11.

Mikroigły, zestaw mikrometrycznych końcówek igieł, mają zdolność przenikania przez fizjologiczne bariery w celu dostarczania leków małocząsteczkowych12, białka13, kwasy nukleinowe14, oraz nanomedicines15. Mikroigły są precyzyjnie zaprojektowane do celowania w zmiany chorobowe na powierzchni skóry, a ich rozproszone końcówki zapewniają równomierne rozprowadzenie leku w miejscu docelowym, wzmacniając w ten sposób ich działanie terapeutyczne16. Konstrukcja i skład materiałowy mikroigieł ułatwiają przechowywanie substancji bioaktywnych w suchym stanie, takich jak białka i kwasy nukleinowe, zwiększając ich stabilność17. Tradycyjne metody iniekcji mają stosunkowo krótki czas działania i mogą powodować ból, wywołując strach u pacjentów18. Mikroigłowa o długości mikrometra minimalizuje uszkodzenia tkanek i zapobiega stymulacji nerwów, eliminując w ten sposób ból i poprawiając przestrzeganie zaleceń pacjenta19. Dodatkowo, przyjazny dla użytkownika charakter mikroigieł pozwala pacjentom na samodzielne podawanie leczenia bez konieczności korzystania z wyspecjalizowanego personelu16. Oprócz skóry, mikroigły mogą być również stosowane w tkankach, takich jak oczy20, błona śluzowa jamy ustnej21, heart22 i naczynia krwionośne23. Zastosowanie mikroigieł do klinicznego dostarczania egzosomów stanowi obiecującą i perspektywiczną strategię.

Dlatego wprowadzamy łatkę mikroigłową (exo@MN) z egzosomami i ujawniamy metodę jej wytwarzania. Plastry mikroigłowe zostały wyprodukowane przy użyciu dwuetapowej metody odlewania, wraz z wirowaniem i suszeniem próżniowym, co sprzyja agregacji egzosomów na końcach mikroigieł, zwiększając w ten sposób wydajność dostarczania. Zarówno końcówki igieł, jak i podłoże zostały skonstruowane z materiałów, które wykazują doskonałą biokompatybilność i rozpuszczalność w wodzie. Trehaloza i kwas hialuronowy (HA) zostały włączone jako materiały końcówek, aby zapewnić ochronę egzosomów, a jako materiał podkładowy wybrano poliwinylopirolidon (PVP) rozpuszczony w absolutnym etanolu. Morfologię plastra mikroigłowego scharakteryzowano za pomocą mikroskopii i skaningowego mikroskopu elektronowego (SEM). Testy mechaniczne mikroigieł oceniono za pomocą miernika rozciągania, aby potwierdzić ich zdolność do penetracji skóry, a szybkość uwalniania na skórze świni zbadano na 60 s. Ponadto scharakteryzowano morfologię, wielkość i zawartość białka zarówno w świeżych egzosomach, jak i egzosomach w exo@MN za pomocą transmisyjnego mikroskopu elektronowego (TEM), analizy śledzenia nanocząstek (NTA) i western blottingu (WB). Internalizację egzosomów przez komórki dendrytyczne (DC) scharakteryzowano za pomocą konfokalnego laserowego mikroskopu skaningowego (CLSM), a dojrzewanie DC oceniono za pomocą cytometrii przepływowej. Charakterystyka morfologiczna i funkcje biologiczne tych dwóch typów egzosomów są zasadniczo spójne.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To badanie nie wymaga zgody etycznej, ponieważ skóra świni użyta do eksperymentów opisanych w sekcji 3 została zakupiona na rynku jako jadalne uszy świni, a nie od zwierząt doświadczalnych.

1. Izolacja egzosomów

  1. Hodowla komórkowa
    1. Hodować komórki nabłonka nabłonka jajnika myszy ID8 w pożywce hodowlanej Modified Eagle Medium (DMEM) firmy Dulbecco zawierającej 10% płodowej surowicy bydlęcej i 1% roztworu penicyliny i streptomycyny (100×) (patrz tabela materiałów) na szalkach Petriego o średnicy 15 cm.
    2. Inkubować komórki ID8 w inkubatorze CO2 (patrz tabela materiałów) w temperaturze 37 °C i 5% CO2 aż do osiągnięcia gęstości komórek 90%.
  2. Izolacja egzosomów
    1. Usunąć pożywkę hodowlaną z szalek Petriego i przemyć dwukrotnie roztworem soli fizjologicznej buforowanym fosforanami (DPBS) firmy Dulbecco. Dodać 20 ml DMEM bez płodowej surowicy bydlęcej (patrz tabela materiałów) i roztwór penicyliny-streptomycyny (patrz tabela materiałów). Kontynuować inkubację w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 48 godzin.
    2. Zebrać supernatant do hodowli komórkowych z 20 szalek Petriego o średnicy 15 cm. Wirować przy 300 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C i zebrać supernatant w celu usunięcia wolnych komórek.
    3. Wirować przy 2000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C i zebrać supernatant w celu usunięcia resztek komórkowych.
    4. Podłącz jednorazowy system filtracji próżniowej 0.22 μm (patrz tabela materiałów) do pompy próżniowej wody obiegowej (patrz tabela materiałów). Stwórz próżnię, aby supernatant mógł przejść przez membranę polieterosulfonową 0,22 μm i wejść do dolnej komory systemu filtracji, skutecznie usuwając pęcherzyki lub zanieczyszczenia większe niż 0,22 μm z supernatantu.
      1. Aby podłączyć pompę próżniową, włącz przełącznik pompy, a następnie podłącz ją do wlotu powietrza systemu filtracji próżniowej. Podczas zamykania należy najpierw odłączyć połączenie z pompą, a następnie wyłączyć pompę próżniową. Ta procedura pomaga zapobiec cofaniu się pompy próżniowej i zanieczyszczeniu płynu hodowlanego.
    5. Dodać 15 ml supernatantu do wewnętrznej rurki ultrafiltracyjnej o natężeniu 100 kDa (patrz tabela materiałów). Wirować przy 3500 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C i usunąć płyn z zewnętrznej probówki.
      UWAGA: Zatrzymaj cząstki większe niż 100 kDa na membranie rurki wewnętrznej, podczas gdy białka mniejsze niż 100 kDa zostaną odwirowane do rurki zewnętrznej wraz z roztworem. Egzosomy były większe niż 100 kDa i były agregowane na membranie rurki wewnętrznej.
    6. Powtarzaj powyższe kroki, aż całkowita objętość płynu będzie mieścić się w granicach 5 ml. Zbierz płyn z rurki wewnętrznej i dodaj 1 ml DPBS. Za pomocą pipety kilkakrotnie pipetuj rurkę wewnętrzną, zapewniając ponowne zawieszenie dołączonych egzosomów w DPBS, a następnie zbierz je.
    7. Wirować przy 10000 x g przez 60 minut w temperaturze 4 °C i przenieść supernatant do probówki wirówkowej o pojemności 6 ml (patrz tabela materiałów). Uszczelnij rurkę za pomocą zgrzewarki.
    8. Wirować przy 100 000 x g przez 2 godziny 4 °C za pomocą ultrawirówki (patrz tabela materiałów). Rozciąć probówkę wirówkową z szybkozłączką, usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w 100 μl DPBS. To jest roztwór egzosomu.
      UWAGA: Podczas procesu ponownego wywieszania granulki należy pipetować i mieszać ściankę probówki co najmniej 200 razy za pomocą pipety.

2. Produkcja exo@MN

  1. Przygotowanie formy wzorcowej
    1. Zbuduj model mikroigłowy z matrycą 10 x 10 za pomocą oprogramowania CAD, wyposażony w stożkowe końcówki o następujących parametrach: wysokość 1200 μm, średnica podstawy 400 μm i podziałka (odległość między sąsiednimi mikroigłami) 900 μm.
    2. Użyj żywicy HTL jako materiału i wydrukuj główną formę mikroigły za pomocą drukarki 3D (patrz Tabela materiałów).
    3. Zanurz formę wzorcową w absolutnym etanolu na 1 godzinę, aby usunąć żywicę przylegającą do powierzchni.
    4. Wystaw formę na działanie światła ultrafioletowego przez 5 minut, aby ją utwardzić.
    5. Ponownie zanurzyć formę w absolutnym etanolu na 1 godzinę, a następnie wysuszyć w temperaturze 60 °C w piecu suszącym przez 1 godzinę. Forma główna jest gotowa.
  2. Przygotowanie formy produkcyjnej
    1. Zmieszać składniki A i B polidimetylosiloksanu (PDMS, patrz tabela materiałów) w stosunku 10:1. Dobrze wymieszaj i wlej mieszaninę do formy głównej.
    2. Umieść formę PDMS pod ciśnieniem 1 psi na 15 minut, aby usunąć pęcherzyki powietrza z mieszaniny PDMS.
    3. Utwardź formę PDMS w temperaturze 60 °C przez 2 godziny, a następnie wyjmij z formy w celu uzyskania formy produkcyjnej mikroigły.
    4. Przed użyciem wyczyść formę produkcyjną ultraczystą wodą.
  3. Przygotowanie roztworu
    1. Określić ilościowo zawartość białka w roztworze egzosomu za pomocą zestawu do oznaczania BCA (patrz tabela materiałów). Dodać odpowiednią ilość DPBS, aby osiągnąć stężenie 10 μg/μL dla roztworu egzosomu.
    2. Przygotować roztwór 200 mg/ml trehalozy (patrz tabela materiałów), stosując DPBS jako rozpuszczalnik. Mieszaj przez 20 minut, aby zapewnić całkowite rozpuszczenie.
    3. Przygotować roztwór kwasu hialuronowego o stężeniu 200 mg/ml (HA, patrz tabela materiałów) przy użyciu DPBS jako rozpuszczalnika. Mieszaj przez noc, aby zapewnić całkowite rozpuszczenie.
    4. Przygotować roztwór 150 mg/ml poliwinylopirolidonu (PVP, patrz tabela materiałów), używając absolutnego etanolu jako rozpuszczalnika. Mieszaj przez noc, aby zapewnić całkowite rozpuszczenie.
    5. Wymieszać roztwór egzosomu (10 μg/μl) i roztwór trehalozy (200 mg/ml) w stosunku objętościowym 1:1. Następnie dodać równą objętość roztworu HA (200 mg/ml). Dokładnie wymieszaj, aby uzyskać roztwór końcówki.
  4. Wytwarzanie exo@MN
    1. Przetwarzaj powierzchnię formy PDMS za pomocą myjki plazmowej (patrz tabela materiałów) przez 30 s w niskiej jakości, aby zwiększyć jej hydrofilowość.
    2. Dodać 40 μl roztworu końcówki do formy PDMS. Wirować w temperaturze pokojowej (RT) i 3000 x g przez 3 minuty, aby upewnić się, że płyn wypełnia warstwę igieł formy.
    3. Usuń nadmiar płynu z formy i wysusz w temperaturze suchej w suszarce próżniowej (patrz Tabela materiałów) przez 1 dzień.
    4. Dodaj 200 μl roztworu PVP do formy PDMS. Wirować 3000 x g przez 3 minuty w temperaturze pokojowej, aby upewnić się, że ciecz wypełnia warstwę spodnią formy.
    5. Wysuszyć formę w temperaturze RT w suszarce przez 1 dzień, a następnie wyjąć z formy, aby uzyskać exo@MN łatkę.
      UWAGA: Plaster exo@MN należy przechowywać w suszarce do czasu, aż będzie gotowy do użycia.

Schemat procesu przygotowania egzosomów; Wirowanie, suszenie próżniowe, dodawanie polimeru w celu stabilizacji.
Rysunek 1: Proces produkcji exo@MN łatek. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

3. Charakterystyka exo@MN łatek

  1. Obserwacja morfologii
    1. Wklej podkład plastra na powierzchnię nachyloną pod kątem 45° i umieść go pod mikroskopem stereoskopowym (patrz Tabela materiałów).
    2. Włącz oświetlacz i uchwyć morfologię łaty za pomocą obiektywu 4x.
  2. Skaningowa mikroskopia elektronowa (SEM)
    1. Przymocuj plaster do stolika na próbkę za pomocą kleju przewodzącego i potraktuj go automatyczną drobnoziarnistą powlekarką (patrz Tabela materiałów) przez 30 sekund.
    2. Wykonaj obrazy exo@MN łaty za pomocą SEM (patrz tabela materiałów) o napięciu przyspieszającym 1 kV.
  3. Testy mechaniczne
    1. Wytnij tablicę 3 x 3 z łaty i umieść ją końcówkami skierowanymi do góry na sztywnej platformie miernika rozciągania (patrz Tabela materiałów). Dostosuj wysokość sondy, aby zbliżyć ją do końcówek igieł bez ich dotykania.
    2. Ustaw parametry tak, aby automatycznie się zatrzymywały, gdy ciśnienie osiągnie 20 N. Ściskać końcówki igieł w pionie z prędkością 0,5 mm/min i zapisywać profil obciążenia w funkcji przemieszczenia.
  4. rozpad
    1. Kup świeże uszy wieprzowe na rynku i pokrój je na kawałki (5 cm x 5 cm x 0,3 cm). Rozłóż skórę świni na stole i użyj papieru, aby wysuszyć wilgoć na powierzchni.
    2. Przygotuj cztery suche plastry mikroigłowe z końcówkami igieł skierowanymi w dół na skórze świni, lekko oddalając każdy plaster od siebie. Używając kciuka i palca wskazującego, dociśnij pionowo każdy plaster mikroigłowy. Usuwaj jedną łatkę co 15 s.
    3. Natychmiast umieść usunięty plaster w suszarce i susz przez 5 minut. Odetnij kolumnę końcówek mikroigłowych, umieść je poziomo pod mikroskopem (patrz Tabela materiałów) i użyj soczewki obiektywowej 4x, aby obserwować rozpuszczenie końcówek.

4. Charakterystyka egzosomów w exo@MN plastrze

UWAGA: Końcówki mikroigłowe exo@MN są rozpuszczone w 100 μL roztworu DPBS w celu przeprowadzenia następującej charakterystyki uwolnionych egzosomów.

  1. Transmisyjna mikroskopia elektronowa (TEM)
    1. Siatkę miedzianą (patrz Tabela materiałów) należy poddać obróbce hydrofilowej za pomocą środka do czyszczenia jonów (patrz Tabela materiałów) przez 5 minut.
    2. Dozować 10 μl próbki na węglową stronę siatki miedzianej. Odstaw na 1 minutę, a następnie usuń płyn, osuszając go bibułą filtracyjną od krawędzi.
    3. Dodać 10 μl 3% octanu uranylu (patrz tabela materiałów) do próbki. Odstaw na 10 sekund, a następnie usuń płyn, osuszając bibułą filtracyjną od krawędzi.
    4. Dodać 10 μl 3% octanu uranylu do próbki. Odstawić na 1 minutę, a następnie usunąć płyn, osuszając go bibułą filtracyjną od krawędzi i wysuszyć na powietrzu w temperaturze pokojowej.
    5. Uchwyć obrazy egzosomów za pomocą TEM (patrz tabela materiałów) o napięciu przyspieszającym 80 kV.
  2. Analiza śledzenia nanocząstek (NTA)
    1. Rozcieńczyć roztwór egzosomu DPBS, aby uzyskać stężenie cząstek 1 x 107 cząstek/ml. Wstrzyknąć powoli 1 ml roztworu egzosomu do komory na próbkę NTA za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml (patrz tabela materiałów).
    2. Ustaw typ standardowej procedury operacyjnej (SOP) instrumentu na EV-488, aby wykryć rozkład wielkości egzosomów.
  3. Western blotting (WB)
    1. Przygotować bufor do lizy, mieszając bufor do lizy do testu radioimmunoprecypitacji (RIPA): fluorek fenylometanosulfonylu (patrz tabela materiałów) w stosunku 100:1. Lizuj egzosomy na lodzie przez 20 minut, wirując co 10 minut.
    2. Odwirować roztwór o stężeniu 12 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Zebrać supernatant w celu zmierzenia stężenia białka.
    3. Dodać 5x bufor ładujący SDS-PAGE (patrz Tabela Materiałów) do supernatantu w stosunku objętościowym 1 : 4 i dobrze wymieszać. Podgrzewać w temperaturze 100 °C przez 10 minut, aby dokonać denaturacji białek.
    4. Dodać 5 μl wstępnie wybarwionego markera białkowego o stężeniu 180 kDa (patrz tabela materiałów) i 10 μg denaturowanej próbki do 4%-20% prefabrykowanego żelu (patrz tabela materiałów). Uruchomić system elektroforezy (patrz tabela materiałów) przy napięciu 60 V przez 10 minut, a następnie przy napięciu 140 V przez 50 minut.
    5. Przenieść białka z żelu do membrany PVDF (patrz tabela materiałów) wstępnie aktywowanej metanolem. Wykonaj system elektroforezy przy 290 mA przez 90 minut na lodzie.
    6. Inkubować membranę PVDF w 5% roztworze mleka odtłuszczonego przez 1 godzinę. Przemyć trzykrotnie roztworem soli fizjologicznej z trzema z dwoma (TBST, patrz tabela materiałów) przez 5 minut każdy.
    7. Wytnij pasma docelowe w zależności od położenia białka. Inkubować prążki z przeciwciałem anty-mysim CD63 i przeciwciałem anty-mysim Alix (patrz tabela materiałów) rozcieńczonymi do odpowiedniego stężenia zgodnie z instrukcjami producenta i inkubować przez noc w temperaturze 4 °C.
    8. Umyj opaski trzy razy za pomocą TBST. Inkubować z anty-króliczą IgG sprzężoną z HRP (patrz tabela materiałów) w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę. Następnie ponownie umyj trzy razy TBST.
    9. Nałożyć odczynnik do wykrywania super ECL (patrz Tabela materiałów) w celu pokrycia powierzchni pasm, a następnie natychmiast naświetlić i wychwycić pasma za pomocą urządzenia do obrazowania żelowego (patrz Tabela materiałów).
  4. Konfokalna laserowa mikroskopia skaningowa (CLSM)
    1. Hoduj 5 x 105 DC w naczyniu konfokalnym, używając 2 ml pożywki Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI 1640) (patrz tabela materiałów). Dodać egzosomy lub exo@MN i inkubować w temperaturze 37 °C przez 24 godziny.
    2. Dodać kroplę Hoechst 33342 do każdego naczynia konfokalnego i inkubować w ciemności w temperaturze 37 °C przez 20 minut.
    3. Wykonaj obrazowanie za pomocą CLSM (patrz tabela materiałów) przy użyciu soczewki obiektywowej 60x. Nałóż kroplę olejku immersyjnego (patrz Tabela materiałów) na soczewkę i umieść naczynie konfokalne na scenie. Dostosuj osie x/y/z, aby zlokalizować odpowiednią płaszczyznę ogniskową komórek.
    4. Rozpocznij obrazowanie za pomocą kanałów DAPI/TRITC/TD, wybierz rozdzielczość 1024 px i ustaw tryb szybki na 1/8 s.
  5. Cytometria przepływowa
    1. Hoduj DC na 6-dołkowej płytce, z których każda zawiera 5 x 105 komórek i 2 ml pożywki 1640. Dodać równe objętości roztworu DPBS, egzosomów, mikroigieł bez egzosomów i exo@MN, odpowiednio, i inkubować w temperaturze 37 °C przez 24 godziny.
    2. Przenieś pożywkę z każdej studzienki do probówek odśrodkowych. Wirować przy 300 x g przez 3 minuty w temperaturze 4 °C i usunąć supernatant.
    3. Dodać 0,5 μl przeciwciała FITC-CD11c, 2,5 μl przeciwciała APC-CD80 i 0,5 μl przeciwciała Pacific Blue I-A/I-E (patrz tabela materiałów) do 100 μl 5% roztworu BSA (patrz tabela materiałów). Dobrze wymieszaj, ponownie zawieś komórki i inkubuj na shakerze w lodzie i w ciemności przez 20 minut.
    4. Dodać 1 ml DPBS i odwirować przy 300 x g przez 3 minuty w temperaturze 4 °C, a następnie usunąć supernatant. Powtórzyć płukanie dwukrotnie, aby usunąć niezwiązane przeciwciała, a następnie przystąpić do analizy odpowiednich kanałów fluorescencyjnych za pomocą cytometrii przepływowej (patrz tabela materiałów).
      1. Po pierwsze, na wykresie punktowym FSC-A/SSC-A bramkuje główną populację komórek jako P1. Na wykresie punktowym SSC-A/SSC-H populacji komórek P1 bramkuje kwadratowy region P2 wzdłuż przekątnej, aby usunąć zagregowane komórki.
      2. Przeprowadź analizę fluorescencyjną populacji komórek P2 przy użyciu kanałów FITC, APC i Pacific Blue. Ustaw warunek zatrzymania, aby zebrać 10 000 komórek w bramce P2.

5. Analiza statystyczna

  1. Wyraź dane ilościowe jako średnie ± odchyleń standardowych (SD). Oceń istotność statystyczną za pomocą analizy testu t przy użyciu odpowiedniej aplikacji do analizy danych. Rozważ wartości p mniejsze niż 0,05, aby wskazać istotność statystyczną. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj prezentujemy protokół izolacji egzosomów, produkcji i charakterystyki exo@MN łaty. Rysunek 1 ilustruje schemat procesu wytwarzania exo@MN łaty. Egzosomy zmieszano z trehalozą i kwasem hialuronym, a następnie mieszaninę dodano do formy mikroigłowej i odwirowano. Proces ten ułatwił agregację egzosomów na końcach igieł, sprzyjając szybkiemu uwalnianiu. Po wysuszeniu dodano roztwór PVP i odwirowano, aby całkowicie wypełnić formę. Po całkowitym wyschnięciu pleśń została usunięta, aby uzyskać exo@MN plamy. Morfologię mikroigieł scharakteryzowano za pomocą mikroskopii i SEM, jak pokazano na rysunku Rysunek 2. Końcówki w exo@MN łacie wykazywały stożkowaty kształt ułożony w układ 10 x 10 z ostrymi i nienaruszonymi końcami igieł. Końcówka mikroigły wytrzymuje siłę 2 N, dzięki czemu przenika przez barierę skórną. Co więcej, skóra świń została wykorzystana jako substytut ludzkiej skóry, aby symulować nakładanie plastrów exo@MN. Plastry zostały dociśnięte do skóry świni, aby obserwować czas uwalniania, a końcówki mikroigieł całkowicie stopiły się w ciągu 60 sekund. Łaty exo@MN zostały rozpuszczone w DPBS i scharakteryzowane, jak pokazano na Rysunek 3. Obrazy TEM uchwyciły pęcherzyki o typowej strukturze w kształcie miseczki, zgodnej z morfologią egzosomów. Rozkład wielkości cząstek roztworu exo@MN przez NTA wykazał, że cząstki były głównie skoncentrowane w zakresie 50-250 nm. Jednak obecne były również większe cząstki, które można przypisać właściwościom adhezyjnym materiału HA, powodując agregację egzosomów. Analiza WB białek CD63/Alix w roztworze exo@MN wykazała, że exo@MN jest w stanie częściowo zatrzymać białka egzosomów. Biologiczna funkcjonalność egzosomów uwolnionych z exo@MN została zweryfikowana w Rysunek 4, koncentrując się na wychwytywaniu egzosomów przez komórki i aktywacji komórek dendrytycznych w porównaniu ze świeżymi egzosomami. Obrazy CLSM potwierdziły skuteczne wchłanianie zarówno świeżych egzosomów, jak i egzosomów w exo@MN przez DC. Reprezentatywne obrazy i proporcjonalne statystyki z cytometrii przepływowej pokazują, że egzosomy w exo@MN posiadają funkcje biologiczne, które promują aktywację DC podobnie jak świeże egzosomy.

Schemat wytwarzania mikroigieł, obraz SEM, wykres ciśnienia-przemieszczenia, sekwencja testu penetracyjnego.
Rysunek 2: Charakterystyka exo@MN łatek. (A) Stereoskopowe obrazy exo@MN plam. Podziałka = 400 μm. (B) Obraz SEM exo@MN łatek. Podziałka = 200 μm. (C) Profile obciążenia w funkcji przemieszczenia exo@MN łaty. (D) Mikroskopijne obrazy exo@MN plastrów wprowadzanych do skóry świni w odmiennym czasie. Podziałka = 400 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Mikroskopia elektronowa egzosomów; wykres rozkładu rozmiarów; Western blot markerów białkowych.
Rysunek 3: Charakterystyka świeżych egzosomów i egzosomów w exo@MN. (A) Morfologia egzosomów według TEM. Podziałka = 100 nm. (B) Rozkład wielkości cząstek egzosomów według NTA. (C) CD63 i Alix egzosomów przez WB. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Wyniki mikroskopii egzosomów i cytometrii przepływowej; barwienie komórek, analiza przepływu, ekspresja CD80 MHCII.
Rysunek 4: Biologiczne testowanie świeżych egzosomów i egzosomów w exo@MN. (A) Obrazy CLSM egzosomów pobranych przez DC. Pasek skali = 10 μm. (B) Reprezentatywne wykresy aktywacji DC za pomocą cytometrii przepływowej. (C) Kwantyfikacja procentowej zawartości CD11c+CD80+MHCII+ DC. Dane przedstawiono jako średnią ± SD (n = 3). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Obecnie główne metody izolacji egzosomów obejmują ultrawirowanie, wirowanie w gradiencie gęstości, ultrafiltrację, wytrącanie, kulki magnetyczne powinowactwa immunologicznego i mikrofluidykę24. Ze względu na ograniczoną ładowność mikroigieł spowodowaną małą przestrzenią na końcówce igły, konieczne jest zwiększenie stężenia egzosomów, aby załadować więcej. Dlatego wybraliśmy ultrafiltrację, aby zagęścić supernatant hodowli komórkowej, a następnie zastosowaliśmy ultrawirowanie do wyizolowania egzosomów. Stężenie egzosomów zostało zwiększone przez niewielką ilość płynnej reuspensji, tak aby mikroigły można było załadować dziesiątkami do setek mikrogramów egzosomów. Jednak metoda ta skutkuje znaczną obecnością białek w wyizolowanym roztworze egzosomu. Dodatkowo podczas procesu wirowania dochodzi do znacznej utraty egzosomów. W dzisiejszych czasach jednym z ograniczeń terapeutycznego zastosowania egzosomów jest brak skutecznych metod izolowania egzosomów o wysokiej czystości i w dużych ilościach. Ponieważ potencjał kliniczny egzosomów jest coraz częściej badany, istnieje potrzeba opracowania w przyszłości bardziej zaawansowanych technik, aby sprostać wyzwaniom związanym z ich ekstrakcją.

Kluczową technologią w tym badaniu jest konstrukcja mikroigieł na bazie egzosomów. W celu zminimalizowania marnotrawstwa egzosomów i osiągnięcia silniejszych efektów terapeutycznych, do wytwarzania plastrów exo@MN zastosowano dwuetapową metodę odlewania. Trehaloza została wcześniej opisana jako odpowiedni materiał do liofilizowanej konserwacji egzosomów25, podczas gdy HA wykazuje doskonałą biokompatybilność, hydrofilowość i funkcje w hamowaniu stanu zapalnego i promowaniu naprawy skóry26. Wytwarzanie końcówek igieł obciążonych egzosomami przy użyciu tych dwóch materiałów pomaga utrzymać aktywność biologiczną egzosomów, umożliwiając ich szybkie rozpuszczanie i uwalnianie w skórze. Co więcej, takie podejście minimalizuje ryzyko infekcji i przyczynia się do szybkiej regeneracji skóry. Poprzez wirowanie i suszenie próżniowe egzosomy zostały skoncentrowane na końcach mikroigieł. Biorąc pod uwagę niekompatybilność etanolu i trehalozy, jako materiał podkładowy wybrano PVP rozpuszczony w absolutnym etanolu. Ta warstwowa metoda wytwarzania skutecznie poprawiła wydajność dostarczania egzosomów.

Słaba stabilność egzosomów in vitro, niezależnie od tego, czy są przechowywane w temperaturze 4 °C, 37 °C czy -80 °C, może prowadzić do zmian w strukturze egzosomu lub degradacji11. Aby rozwiązać ten problem, w kilku badaniach przeanalizowano metody przechowywania egzosomów, takie jak liofilizacja. Technologia mikroigłowa zapewnia kolejną nowatorską strategię. Susząc w temperaturze pokojowej, technologia mikroigłowa może poprawić stabilność egzosomów i może być bezpośrednio stosowana do dostarczania egzosomów bez innych zabiegów. Co więcej, proces ekstrakcji egzosomów jest złożony i podatny na degradację, co sprawia, że zastosowania na dużą skalę są trudne. Przechowywanie wyekstrahowanych egzosomów przy użyciu technologii mikroigłowej nie upraszcza etapów ekstrakcji, ale zmniejsza liczbę wymaganych ekstrakcji. Pojedyncza ekstrakcja może wytworzyć dużą ilość exo@MN plastrów, które mogą być przechowywane przez dłuższy czas. Wykorzystanie mikroigieł egzosomów z tej samej partii do każdego zabiegu minimalizuje potencjalny wpływ różnic między różnymi partiami na wyniki terapeutyczne, zwiększając w ten sposób powtarzalność i niezawodność nanoplatformy egzosomów27. Daje to więcej możliwości klinicznego zastosowania egzosomów.

W przyszłych badaniach warto przyjrzeć się metodom, które umożliwią precyzyjną kontrolę ładunku i zminimalizują różnice w działaniu leku między końcówkami igieł. Można to osiągnąć poprzez optymalizację procesów, wdrożenie środków kontroli jakości i wykorzystanie zaawansowanych technik. Zajęcie się tymi aspektami w znacznym stopniu przyczyni się do opracowania niezawodnych i spójnych systemów dostarczania leków.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

H. C., F. L. Q i S. J. M są wynalazcami w zgłoszeniu patentowym, które zostało złożone na podstawie danych zawartych w tym manuskrypcie. H.C. jest naukowym założycielem Medcraft Biotech. Inc.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

F.L.Q. docenia wsparcie wspierane przez Pioneer R&D Program of Zhejiang (2022C03031), National Key Research and Development Program of China (2021YFA0910103), National Natural Science Foundation of China (22274141, 22074080), Natural Science Foundation of Shandong (ZR2022ZD28) oraz Taishan Scholar Program of Shandong Province (tsqn201909106). H.C. dziękuje za wsparcie finansowe ze strony Narodowej Fundacji Nauk Przyrodniczych Chiny (82202329). Autorzy przyznają, że instrumenty są używane w Shared Instrumentation Core Facility w Instytucie Medycyny w Hangzhou (HIM) Chińskiej Akademii Nauk.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
100x roztwory penicyliny i streptomycynyJrunbio ScientificMA0110Hodowla komórkowa
180 kDa wstępnie wybarwiony marker białkowyThermo26616Western blotting
3% octan uranyluHenan Ruixin Materiały eksperymentalneGZ02625Charakterystyka morfologiczna egzosomów
Drukarka 3DTechnologiaBMF nanoArch S130Mold Przygotowanie
4%– 20% żel prefabrykowanyGenscriptExpressPlus PAGE GELWestern blotting
5 razy; Bufor ładujący SDS-PAGETitan04048254Western blott
Przeciwciało anty-mysie AlixBiolegend12422-1-APWestern blotting
Przeciwciało anty-mysie CD63Biolegendab217345Western blotting
APC przeciwciało przeciw myszom CD80Biolegend104713
Przeciwciało automatyczne drobnoziarnisteZIZHUJBA5-100Charakterystyka morfologiczna
zestawu do oznaczania BCABeyotimeP0012Test stężenia białka
WirówkaThermo FisherMuitifuge X1R proWirówka komórkowa
Pompa próżniowa do wody obiegowejYuhua InstrumentSHZ-D(III)filtracja
Inkubator CO2EppendorfCellXpert C170Hodowla
komórkowaKonfokalny laserowy mikroskop skaningowyNikonA1HD25Obrazowanie fluorescencyjne
Siatka miedzianaPekin Zhongjingkeyi Technologia JF-ZJKY/300Charakterystyka morfologiczna egzosomów
D- (+) -Trehaloza dwuhydratAladdin5138-23-4Wytwarzanie mikroigły 
Dulbecco' s zmodyfikowany Orzeł" s mediumMeilunbioMA0212Hodowla komórkowa
Dulbecco' s sól fizjologiczna buforowana fosforanamiMeilunbioMA0010Hodowla komórkowa
System elektroforezyBio-radPowerPac-basicWestern blotting
Surowica bydlęcapłodu Jrunbio ScientificJR100Hodowla komórkowa
FITC przeciwciało anty-mysie CD11cBiolegend117305Przeciwciało
Cytometria przepływowaBDLSR FortessaDetekcja fluorescencji
Obrazownik żelowyCytivaAmersham ImageQuant 800Western blotting
IgG IgG CST sprzężone z HRPWestern blotting
Żywica HTLTechnologiaPrzygotowanie pleśni
Kwas hialuronowy (MW = 300 kDa)Bloomage Biotechnology9004-61-9Produkcja mikroigły 
Olejek immersyjnyNikonMXA22168Obrazowanie fluorescencyjne
Środek do czyszczenia jonówJEOLEC-52000ICCharakterystyka morfologiczna egzosomów
MikroskopOlympusCKX53Obserwuj proces rozpuszczania końcówki mikroigłowej
Mysia komórka nabłonka jajnika ID8MeisenCTCC  CC90105Hodowla komórkowa
Analiza śledzenia nanocząstekCząstka MetrixZetaViewAnaliza wielkości egzosomów
Pacific Blue przeciwciało anty-mysie I-A/I-E Biolegend107619Przeciwciało
Fluorek fenylometanosulfonyluBeyotimeST507Inhibitory proteazy
Środek do czyszczenia plazmyHefei Kejing Technologia materiałowaPDC-36GWytwarzanie mikroigieł 
PolidimetylosiloksanDow Corning9016-00-6Przygotowanie formy
Poliwinylopirolidon (MW = 40 kDa)Aladdin9003-39-8Wykonanie mikroigły 
Pryzmat GraphPadWersja 9Analiza statystyczna
Membrana PVDFMilliporeIPVH00010Western blotting
Wirówka szybkozatrzaskowaBeckman344619Ekstrakcja egzosomów
Bufor do lizy RIPAApplygenC1053Membrana do lizy
Roswell park memorial institute 1640MeilunbioMA0548Hodowla
komórkowaSkaningowy mikroskop elektronowyJEOLJSM-IT800Charakterystyka morfologiczna mikroskopu mikroigłowego
Mikroskop stereoskopowyOlympusSZX16Charakterystyka morfologii
Odczynnik do wykrywania Super ECLApplygenP1030Western blott
Miernik rozciąganiaInstron68SC-05Badania mechaniczne
Transmisyjny mikroskop elektronowyJEOLJEM-2100plusCharakterystyka morfologiczna egzosomów
Tris buforowana sól fizjologicznaSangon BiotechJF-A500027-0004Western blotting
Tween-20BeyotimeST825Western blotting
UltrawirówkaBeckmanOptima XPN-100Ekstrakcja egzosomów
Rurka ultrafiltracyjnaMilliporeUFC910096Koncentracja egzosomów
Piec do suszenia próżniowegoShanghai Yiheng TechnologyDZF-6024Produkcja mikroigieł
System filtracji próżniowejFiltracja BiosharpBS-500-XT
mikroigłowego BMF

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Barile, L., Vassalli, G. Exosomes: Therapy delivery tools and biomarkers of diseases. Pharmacol Ther. 174, 63-78 (2017).
  2. Kalluri, R., Lebleu, V. S. The biology, function, and biomedical applications of exosomes. Science. 367 (640), 6977(2020).
  3. Mathieu, M., Martin-Jaular, L., Lavieu, G., Thery, C. Specificities of secretion and uptake of exosomes and other extracellular vesicles for cell-to-cell communication. Nat Cell Biol. 21 (1), 9-17 (2019).
  4. Nair, A., et al. Hybrid nanoparticle system integrating tumor-derived exosomes and poly(amidoamine) dendrimers: Implications for an effective gene delivery platform. Chem Mater. 35 (8), 3138-3150 (2023).
  5. Lu, Z., et al. Dendritic cell-derived exosomes elicit tumor regression in autochthonous hepatocellular carcinoma mouse models. J Hepatol. 67 (4), 739-748 (2017).
  6. Oskouie, M. N., Aghili Moghaddam, N. S., Butler, A. E., Zamani, P., Sahebkar, A. Therapeutic use of curcumin-encapsulated and curcumin-primed exosomes. J Cell Physiol. 234 (6), 8182-8191 (2019).
  7. Yuan, D., et al. Macrophage exosomes as natural nanocarriers for protein delivery to inflamed brain. Biomaterials. 142, 1-12 (2017).
  8. Liao, W., et al. Exosomes: The next generation of endogenous nanomaterials for advanced drug delivery and therapy. Acta Biomater. 86, 1-14 (2019).
  9. Zhu, X., et al. Comprehensive toxicity and immunogenicity studies reveal minimal effects in mice following sustained dosing of extracellular vesicles derived from hek293t cells. J Extracell Vesicles. 6 (1), 1324730(2017).
  10. Wen, S., et al. Biodistribution of mesenchymal stem cell-derived extracellular vesicles in a radiation injury bone marrow murine model. Int J Mol Sci. 20 (21), 5468-5482 (2019).
  11. Cheng, Y., Zeng, Q., Han, Q., Xia, W. Effect of pH, temperature and freezing-thawing on quantity changes and cellular uptake of exosomes. Protein Cell. 10 (4), 295-299 (2019).
  12. Jana, B. A., Shivhare, P., Srivastava, R. Gelatin-PVP dissolving microneedle-mediated therapy for controlled delivery of nifedipine for rapid antihypertension treatment. Hypertens Res. 47 (2), 427-434 (2024).
  13. Zheng, Y., et al. A rapidly dissolvable microneedle patch with tip-accumulated antigens for efficient transdermal vaccination. Macromol Biosci. 23 (12), e2300253(2023).
  14. Huang, D., et al. Efficient delivery of nucleic acid molecules into skin by combined use of microneedle roller and flexible interdigitated electroporation array. Theranostics. 8 (9), 2361-2376 (2018).
  15. Zhou, Z., et al. Reverse immune suppressive microenvironment in tumor draining lymph nodes to enhance anti-pd1 immunotherapy via nanovaccine complexed microneedle. Nano Res. 13 (6), 1509-1518 (2020).
  16. Kim, Y. C., Park, J. H., Prausnitz, M. R. Microneedles for drug and vaccine delivery. Adv Drug Deliv Rev. 64 (14), 1547-1568 (2012).
  17. Bui, V. D., et al. Dissolving microneedles for long-term storage and transdermal delivery of extracellular vesicles. Biomaterials. 287, 121644(2022).
  18. Nir, Y., Potasman, I., Sabo, E., Paz, A. Fear of injections in young adults: Prevalence and associations. Am J Trop Med Hyg. 68 (3), 341-344 (2003).
  19. Zhang, Y., Jiang, G., Yu, W., Liu, D., Xu, B. Microneedles fabricated from alginate and maltose for transdermal delivery of insulin on diabetic rats. Mater Sci Eng C Mater Biol Appl. 85, 18-26 (2018).
  20. Roy, G., Garg, P., Venuganti, V. V. K. Microneedle scleral patch for minimally invasive delivery of triamcinolone to the posterior segment of eye. Int J Pharm. 612, 121305(2022).
  21. Creighton, R. L., Woodrow, K. A. Microneedle-mediated vaccine delivery to the oral mucosa. Adv Healthc Mater. 8 (4), 1801180(2019).
  22. Hu, S., Zhu, D., Li, Z., Cheng, K. Detachable microneedle patches deliver mesenchymal stromal cell factor-loaded nanoparticles for cardiac repair. ACS Nano. 16 (10), 15935-15945 (2022).
  23. Yang, W., Zheng, H., Lv, W., Zhu, Y. Current status and prospect of immunotherapy for colorectal cancer. Int J Colorectal Dis. 38 (1), 266-276 (2023).
  24. Zhang, M., et al. Methods and technologies for exosome isolation and characterization. Small Methods. 2 (9), 1800021(2018).
  25. Bosch, S., et al. Trehalose prevents aggregation of exosomes and cryodamage. Sci Rep. 6, 36162(2016).
  26. Bhattacharyya, M., Jariyal, H., Srivastava, A. Hyaluronic acid: More than a carrier, having an overpowering extracellular and intracellular impact on cancer. Carbohydr Polym. 317, 121081(2023).
  27. Chang, H., et al. Cryomicroneedles for transdermal cell delivery. Nat Biomed Eng. 5 (9), 1008-1018 (2021).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Dostarczanie egzosom wstabilno egzosom wdostarczanie lek wizolacja egzosom wkwas hialuronowymikroi y z trehalozpodk ad z poliwinylopirolidonutesty mechanicznepobieranie przez kom rki dendrytyczne

Powiązane artykuły