Profilowanie reakcji na zachowanie matki podczas obrazowania całego mózgu

Podsumowanie

Prezentowany tutaj jest potok analizy wideo, który pokonuje wyzwania związane z monitorowaniem zachowań w środowiskach MRI, pozwalając na wykrywanie nieinstruowanych reakcji behawioralnych na zewnętrzne sygnały. Analiza ta ułatwi bardziej kompleksowe zrozumienie wywołanych zmian stanu wewnętrznego i aktywności całego mózgu.

Streszczenie

Ostatnie osiągnięcia w narzędziach do obrazowania całego mózgu umożliwiły neurobiologom zbadanie, w jaki sposób skoordynowana aktywność mózgu przetwarza zewnętrzne sygnały, wpływając na zmiany stanu wewnętrznego i wywołując reakcje behawioralne. Na przykład funkcjonalny rezonans magnetyczny (fMRI) jest nieinwazyjną techniką, która pozwala na pomiar aktywności całego mózgu u obudzonych, zachowujących się myszy przy użyciu odpowiedzi zależnej od poziomu natlenienia krwi (BOLD). Jednak, aby w pełni zrozumieć reakcje BOLD wywoływane przez bodźce zewnętrzne, ważne jest, aby eksperymentatorzy oceniali również reakcje behawioralne podczas skanowania. Środowisko MRI stanowi wyzwanie dla osiągnięcia tego celu, sprawiając, że powszechnie stosowane metody monitorowania behawioralnego są niekompatybilne. Wyzwania te obejmują (1) ograniczone pole widzenia oraz (2) ograniczoną dostępność urządzeń bez komponentów ferromagnetycznych. Przedstawiono tutaj behawioralną analizę wideo, która pokonuje te ograniczenia, wydobywając cenne informacje z filmów uzyskanych w tych ograniczeniach środowiskowych, umożliwiając ocenę zachowania podczas pozyskiwania danych neuronowych całego mózgu. Wykorzystując takie metody, jak optyczne szacowanie przepływu i redukcja wymiarów, można wykryć znaczne różnice w reakcjach behawioralnych na bodźce prezentowane podczas skanów fMRI. Na przykład reprezentatywne wyniki sugerują, że wokalizacje młodych myszy , ale nie czyste tony, wywołują znacząco różne reakcje behawioralne u matczynych i dziewiczych samic myszy. Idąc dalej, ten potok analizy behawioralnej, początkowo dostosowany do pokonywania wyzwań w eksperymentach fMRI, może zostać rozszerzony na różne metody rejestracji neuronowej, zapewniając wszechstronne monitorowanie behawioralne w ograniczonych środowiskach. Skoordynowana ocena reakcji behawioralnych i neuronalnych zapewni bardziej kompleksowe zrozumienie, w jaki sposób percepcja bodźców prowadzi do koordynacji złożonych wyników behawioralnych.

Wprowadzenie

Monitorowanie reakcji behawioralnych podczas nagrań neuronowych jest niezbędne do zrozumienia skoordynowanej aktywności wywołanej bodźcem w mózgu. W przypadku, gdy nie przewiduje się, że zwierzęta będą reagować na bodźce w określony i zorientowany na cel sposób, obserwacja nieinstruowanych zachowań może dać wgląd w to, w jaki sposób zewnętrzne sygnały informują o ich wewnętrznych stanach^1,2. Niedawne postępy w narzędziach do neuroobrazowania, takie jak obrazowanie wapnia w szerokim polu widzenia i funkcjonalne obrazowanie metodą rezonansu magnetycznego (fMRI), umożliwiły neuronaukowcom rozszerzenie badań poza pojedyncze obszary mózgu. Jednak, aby osiągnąć bardziej wszechstronne zrozumienie takich wielowymiarowych danych neuronowych, zdolność do oceny wyników behawioralnych tych złożonych wzorców musi również odpowiednio się rozwijać.

Najnowocześniejsze metody charakteryzowania zachowań związanych z wykonywaniem zadań są szeroko stosowane w badaniach neurobiologicznych, w tym czujniki temperatury i ciśnienia do wykrywania wąchania^3,4, promienie światła do wykrywania lizaw⁵, oraz szacowanie pozycji bez znaczników do śledzenia wcześniej określonych części ciała⁶. Jednak oparta na danych ocena niepoinstruowanych wzorców zachowań pozostaje wyzwaniem w polu⁷. Podczas gdy metody analizy behawioralnej opartej na danych szybko się rozwijają, istniejące metody zazwyczaj wymagają znacznej mocy obliczeniowej, specjalistycznego sprzętu lub szczególnie wyraźnego obrazu zwierzęcia^2,6,8,9. Przedstawiono tutaj potok behawioralnej analizy wideo, który jest łatwo podatny na dowolne dane wideograficzne i pozwala na wydobycie cennych danych Pomiary behawioralne z filmów uzyskanych podczas stymulacji pasywnej.

Ten potok analizy behawioralnej został zaprojektowany tak, aby był kompatybilny ze skoordynowanym pozyskiwaniem danych neuronowych i wideo u zwierząt z głową narażonych na szeroki zakres bodźców zewnętrznych i wiele środowisk nagrywania, nawet tych ze znacznymi ograniczeniami. Na przykład środowisko MRI stwarza szczególne wyzwania dla monitorowania behawioralnego, w tym ograniczone pole widzenia i ograniczoną dostępność sprzętu bez komponentów ferromagnetycznych. Ograniczenia te sprawiają, że powszechnie stosowane metody są niekompatybilne, co sprawia, że miary takie jak ruch głowy (tj. sposób, w jaki mózg porusza się między akwizycjami objętości) są jednymi z najbardziej dostępnych, ale ograniczonych sposobów oceny reakcji organizmu podczas skanowania¹⁰. Pokonując te ograniczenia, protokół ten ułatwił analizę danych wideograficznych zgodnych z MR, pokazując, że samice myszy z różnymi doświadczeniami matczynymi wykazują różne reakcje behawioralne na bodźce słuchowe. Matkom i dziewicom prezentowano bodźce słuchowe podczas skanów fMRI, w tym wokalizacje zestresowanych szczeniąt ("nawoływania szczeniąt") i czyste tony. Bodźce te były prezentowane pasywnie, a więc bez żadnych instrukcji behawioralnych. Podczas gdy przewidywano, że matki będą wykazywać zwiększone reakcje na nawoływania szczeniąt w porównaniu z dziewicami, istnieje niewiele literatury na temat tego, jak samice myszy reagują na sygnały niemowlęcia w środowisku skupionym na głowie. W związku z tym nie było konkretnych wyników behawioralnych do śledzenia a priori, co czyni ten eksperyment idealnym testem dla proponowanych analiz behawioralnych opartych na danych. Stosując takie metody, jak optyczne szacowanie przepływu i redukcja wymiarowości, wykryto grupowe różnice w reakcjach behawioralnych, zarówno pod względem wielkości, jak i manifestacji przestrzennej.

Idąc dalej, skoordynowana ocena reakcji behawioralnych i neuronalnych może być wykorzystana do osiągnięcia bardziej wszechstronnego zrozumienia, w jaki sposób bodźce zewnętrzne zmieniają stany wewnętrzne i informują o złożonych wynikach behawioralnych. To zrozumienie powinno rozciągać się na bodźce prezentowane przy braku narzuconych zadań i poinstruowanych zachowań. Przedstawiony tutaj potok analizy można rozszerzyć o różne techniki rejestracji neuronowej, zapewniając wszechstronne monitorowanie behawioralne nawet w ograniczonych środowiskach.

Protokół

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z protokołami zatwierdzonymi przez Columbia University Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC), a wszystkie metody zostały przeprowadzone zgodnie z odpowiednimi wytycznymi, przepisami i zaleceniami. Szczegóły dotyczące używanego sprzętu i oprogramowania są wymienione w Tabeli Materiałów.

1. Oprogramowanie

1. Pobierz MATLAB ze strony internetowej Mathworks.
   UWAGA: Kod, który składa się na ten potok analizy, jest wykonywalny wyłącznie przez MATLAB i został specjalnie napisany tak, aby był zgodny z MATLAB 2023a.
2. Ten potok wymaga zestawu narzędzi przetwarzania obrazów i zestawu narzędzi do przetwarzania obrazów w programie MATLAB. Dodaj przyborniki do dodatków MATLAB, klikając Zarządzaj dodatkami, Pobierz dodatki, a następnie wyszukaj i dodaj je.
   UWAGA: Pięć skryptów MATLAB jest dostarczanych jako pliki uzupełniające, zatytułowane w następujący sposób: script1_videocoreg.m (Dodatkowy plik kodowania 1), script2_optflow_roiselect.m (Uzupełniający plik kodowania 2), script3_optflow_analysis.m (Uzupełniający plik kodowania 3), script4_optflow_pca.m (Uzupełniający plik kodowania 4) i script5_optflow_pca_analysis.m (Uzupełniający plik kodowania 5). Dostępne są również dwa przykładowe filmy (Wideo 1 i Wideo 2) oraz odpowiadające im pliki z chronometrażem zdarzeń (Plik uzupełniający 1 i Plik uzupełniający 2). Zaleca się, aby najpierw uruchomić potok z przykładowym data.
   UWAGA: Uważaj na wszelkie komentarze w kodzie, które zawierają wykrzyknik, ponieważ są to obszary, które wymagają działania przed wykonaniem. Na przykład znajdują się tam komentarze, takie jak "edytuj blok kodu poniżej!", aby wskazać, gdzie należy wprowadzić zmiany, aby dopasować je do struktur plików, szczegółów eksperymentu lub potrzeb analizy. Te opcje są domyślnie ustawione tak, aby pasowały do dwóch podanych przykładowych filmów wideo, ale będą wymagały dostosowania, gdy jeden zacznie uruchamiać potok z własnymi danymi.
3. Aby uruchomić każdą sekcję każdego skryptu, kliknij Uruchom i Przejdź w menu Edytora.

2. Rejestracja wideo

UWAGA: Pierwszym dostarczonym skryptem w tym procesie analizy jest script1_videocoreg.m (Uzupełniający Plik Kodowania 1), który przestrzennie wyrównuje wszystkie filmy do siebie poprzez korejestrację. Danymi wejściowymi dla tego skryptu są nieprzetworzone filmy, a głównymi danymi wyjściowymi są przekształcone filmy.

1. Edytuj sekcje 1, 2, 3, 4, 5 i 6 skryptu, jeśli są wskazane, aby pasowały do struktur danych.
2. Uruchom sekcję 1.
3. Wybierz trzy punkty w każdym filmie do oznaczenia, tak jak w Rysunek 1A. Te trzy punkty zostaną użyte do współzarejestrowania wszystkich ramek względem siebie. Uruchom sekcję 2 skryptu, aby wyświetlić pierwszą klatkę każdego filmu i użyj myszy, aby kliknąć raz pierwsze dwa punkty, a następnie kliknij dwukrotnie trzeci punkt. Po wybraniu punktów z ostatniego filmu naciśnij Enter.
4. Uruchom sekcję 3 i sekcję 4.
5. Ustaw flagę wyrównaną do 0 i uruchom Sekcja 5. Następnie ustaw flagę wyrównaną do 1 i ponownie uruchom Sekcję 5.
6. Uruchom sekcję 6 i porównaj wynikową figurę obok siebie z Rysunek 1B. Wszelkie aberracje zaobserwowane na niewyrównanym obrazie średnim po lewej stronie powinny zostać zmniejszone na wyrównanym obrazie uśrednionym po prawej.

3. Oszacowanie przepływu optycznego: Pełne pole widzenia

UWAGA: Aby ocenić ruch podczas skanowania filmów, należy oszacować przepływ optyczny dla każdego przekształconego wideo. Można to zrobić dla pełnego pola widzenia (FOV) każdego filmu za pomocą dostarczonego skryptu script2_optflow_roiselect.m (Supplementary Coding File 2). Danymi wejściowymi dla tego skryptu są przekształcone filmy, a danymi wyjściowymi są matryce 3D wskazujące wielkość przepływu optycznego każdego piksela w czasie dla każdego wideo. Rysunek 2A pokazuje przykładową ramkę z wektorami przepływu optycznego nałożonymi na niebiesko, gdzie długość każdego wektora reprezentuje względną wielkość przepływu optycznego tego piksela. Okazało się, że zapisywanie wyników jako filmów jest bardziej wydajne niż zapisywanie ich jako matryc 3D.

1. Edytuj sekcję 1 skryptu, jeśli jest to wskazane, aby dopasować ją do struktur danych.
2. Uruchom sekcję 1.

4. Wybór ROI

UWAGA: Następujące kroki analizy są znacznie łatwiejsze do opanowania pod względem obciążenia obliczeniowego i potrzeb przechowywania danych, wybierając obszar zainteresowania (ROI) w pełnym polu widzenia, na którym skupi się analiza. Zwrot z inwestycji można wybrać zgodnie z eksperymentem i zachowaniami, które Cię interesują lub za pomocą podejścia bardziej opartego na danych. Aby uzyskać reprezentatywne wyniki przedstawione tutaj, odchylenie standardowe wielkości przepływu optycznego każdego piksela w pełnym polu widzenia zostało obliczone za pomocą skryptu script2_optflow_roiselect.m, sekcja 2 (Dodatkowy plik kodowania 2). Dane wejściowe dla tej części skryptu są danymi wyjściowymi sekcji 1, a głównym wyjściem jest wizualizacja odchylenia standardowego wielkości przepływu optycznego we wszystkich pikselach we wszystkich filmach. W przedstawionych reprezentatywnych wynikach pole widzenia lustra wykazało stosunkowo wysokie odchylenie standardowe przepływu optycznego, co kierowało demonstrowanym wyborem ROI.

1. Edytuj sekcję 2 skryptu, jeśli jest to wskazane, aby dopasować ją do struktur danych.
2. Uruchom sekcję 2 i użyj wynikowego obrazu, aby zobaczyć, gdzie przepływ optyczny zmienia się najbardziej dramatycznie w analizowanych filmach. Przykład tego obrazu jest pokazany w Rysunek 2B.

5. Kwantyfikacja przepływu optycznego: ROI

UWAGA: Sekcja 3 skryptu script2_optflow_roiselect.m (Uzupełniający plik kodowania 2) pozwala użytkownikowi wybrać ROI za pomocą narzędzia do rysowania i zapisać współrzędne granic. Dane wejściowe dla tej części skryptu są danymi wyjściowymi sekcji 1, a danymi wyjściowymi są wektory 1D wskazujące średnią wielkość przepływu optycznego zwrotu z inwestycji w czasie dla każdego filmu.

1. Edytuj sekcję 3 skryptu tam, gdzie jest to wskazane, aby dopasować ją do struktur danych i potrzeb analizy.
   UWAGA: Istnieje kilka opcji dotyczących sposobu postępowania z wyborem ROI. Wybierz jedną opcję:
   1. Opcja 1: Przeanalizuj pełne pole widzenia wideo.
      1. Ustaw flagę selectROI na 0 i ustaw provideROI na 0.
   2. Opcja 2: Przeanalizuj nowy zwrot z inwestycji.
      1. Ustaw flagę selectROI na 1 i ustaw provideROI na 0. Następnie edytuj newCoordsName.
   3. Opcja 3: Przeanalizuj wcześniej narysowany ROI.
      UWAGA: Wybierz tę opcję tylko wtedy, gdy wcześniej uruchomiono ten kod i utworzono zwrot z inwestycji.
      1. Ustaw flagę selectROI na 0 i ustaw provideROI na 1. Następnie edytuj inputCoords, aby zapewnić wstępnie określony zestaw współrzędnych.
2. Uruchom sekcję 3.

6. Porównanie wielkości przepływu optycznego

UWAGA: Dostarczony skrypt script3_optflow_analysis.m (Uzupełniający Plik Kodowania 3) wymaga największej specjalizacji, aby dopasować dane użytkownika. Głównymi danymi wejściowymi są wektory 1D wskazujące średnią wielkość przepływu optycznego zwrotu z inwestycji w czasie dla każdego filmu, a po odpowiednim połączeniu z początkami zdarzeń i informacjami o grupach/warunkach, głównymi wynikami są porównania statystyczne, które można dostosować do zainteresowań analizy.

1. Edytuj sekcje 1-3 skryptu, aby dopasować je do struktur danych i potrzeb analizy.
2. Ustaw flagi opcji analizy zsc, blrm, blzsc, demeanPerTrial i applyLPfilter na 0 lub 1 zgodnie z potrzebami w sekcji 1. W przedstawionych reprezentatywnych wynikach zsc, blrm i applyLPfilter zostały ustawione na 1, a wszystkie inne opcje zostały ustawione na 0.
3. Ustaw LPfilter na liczbę reprezentującą żądany filtr dolnoprzepustowy w hercach (Hz). W przedstawionych reprezentatywnych wynikach zastosowano filtr dolnoprzepustowy 5 Hz, ponieważ nie spodziewano się, że reakcje behawioralne będą się wahać w tempie szybszym niż 5 Hz.
4. Uruchom sekcje 1-3. Sekcja 3 powinna zawierać wykresy dla grupowych średnich szeregów czasowych przepływu optycznego, grupowego średniego skumulowanego przepływu optycznego i sumarycznego skumulowanego przepływu optycznego, w tym wykresów takich jak te pokazane na Rysunek 3. Sekcja 3 może być uruchomiona dla dowolnej kombinacji porównań grup/warunków.

7. Przepływ optyczny PCA

UWAGA: Opierając się na oszacowaniu wielkości przepływu optycznego, dane wyjściowe script2_optflow_roiselect.m (Supplementary Coding File 2) zawierają również informacje o przestrzennym rozkładzie przepływu optycznego klatka po klatce na wideo. W celu zmniejszenia wymiarowości tej informacji przestrzennej, dostarczony skrypt script4_optflow_pca.m (Supplementary Coding File 4) przeprowadza analizę głównych składowych (PCA) na szacowanym przepływie optycznym. Głównymi danymi wejściowymi są optyczne matryce przepływu 3D, wcześniej zapisane jako filmy dla każdego filmu behawioralnego, a głównym wyjściem jest jeden plik .mat na film zawierający informacje o wariancji komputera i wyjaśnione.

1. Edytuj sekcję 1 skryptu, aby dopasować ją do struktur danych i potrzeb analizy.
2. Ustaw opcje analizy flagi stimnum, dsfactor i fnfactor zgodnie z potrzebami w sekcji 1. W przedstawionych reprezentatywnych wynikach każdy typ bodźca był analizowany oddzielnie, a domyślna wartość 1 została utrzymana dla dsfactor i fnfactor, co skutkowało brakiem downsamplingu w przestrzeni lub czasie.
3. Uruchom sekcję 1.

8. Porównanie przepływu optycznego PCA

UWAGA: Dostarczony skrypt script5_optflow_pca_analysis.m (Uzupełniający Plik Kodowania 5) przeprowadzi eksploracyjne porównania wyników PCA między grupami. Głównymi danymi wejściowymi są specyficzne dla bodźca PC i informacje o wyjaśnionej wariancji uzyskane z script4_optflow_pca.m (Supplementary Coding File 4), a głównymi danymi wyjściowymi są statystycznie progowe mapy cieplne przedstawiające obciążenia pierwszego komputera, chociaż inne komputery PC mogą być również analizowane za pomocą tego skryptu.

1. Edytuj sekcję 1 skryptu, aby dopasować ją do struktur danych i analizy.
2. Uruchom sekcję 1 i sekcję 2.
3. Edytuj dane wejściowe sekcji 3, w szczególności zmienne group i myTitle, aby odzwierciedlić żądaną analizę grupy, a także threshT. threshT reprezentuje próg statystyki T, powyżej którego wyniki zostaną uznane za istotne, który można obliczyć na podstawie publicznie dostępnych tabel statystyk T do wartości p i stopni swobody.
4. Uruchom sekcję 3 dla każdej grupy zainteresowania. Kod powinien wygenerować mapę statystyk podsumowujących grupę, taką jak te pokazane w lewym i środkowym panelu Rysunek 4. Dostosuj zakres wkrętu, a tym samym limity paska kolorów, zgodnie z potrzebami wizualizacji.
5. Edytuj dane wejściowe sekcji 4, w szczególności zmienne mag i myTitle, aby odzwierciedlić pożądane porównanie grup, a także threshT. threshT reprezentuje próg statystyki T, powyżej którego wyniki zostaną uznane za istotne, który można obliczyć na podstawie publicznie dostępnych tabel statystyk T do wartości p i stopni swobody.
6. Uruchom sekcję 4 dla każdego porównania grup będących przedmiotem zainteresowania. Kod powinien wygenerować mapę statystyk porównania grup, jak pokazano w prawym panelu Rysunek 4. Dostosuj zakres wkrętu, a tym samym limity paska kolorów, zgodnie z potrzebami wizualizacji.

Wyniki

Aby zademonstrować potencjał tego procesu analizy, nagrano filmy behawioralne samic myszy z głową - szczególnie matek i dziewic - podczas gdy myszom prezentowano bodźce słuchowe podczas skanów funkcjonalnego rezonansu magnetycznego (fMRI). Bodźce składały się z nawoływań szczeniąt i czystych tonów prezentowanych pasywnie, a więc bez żadnych instruowanych wyjść behawioralnych. Odgłosy szczeniąt były nagraniami ultradźwiękowych wokalizacji emitowanych przez 6-dniowe młode myszy tymczasowo odizolowane od gniazda. Te odgłosy szczeniąt zazwyczaj wywołują matczyny akt aportowania młodych, w którym matka lokalizuje, zbliża się, bada, a następnie podnosi szczenię i zwraca je do bezpiecznego gniazda - zachowanie, którego dziewicze samice zazwyczaj nie wykazują¹¹. Wcześniejsze prace wykazały, że odgłosy szczeniąt wywołują silną aktywność wywołaną w pierwotnej korze słuchowej matek, ale nie dziewic, podczas gdy odpowiedzi czysto dźwiękowe nie wykazują różnic grupowych¹². W związku z tym postawiono hipotezę, że zidentyfikowane zostaną różnice grupowe w reakcjach behawioralnych na nawoływania szczeniąt, ale nie czyste tony. Jednak istnieje niewiele literatury na temat specyficznych zachowań samic myszy w odpowiedzi na sygnały szczeniąt w środowisku skupionym na głowie. W związku z tym nie oczekiwano żadnych konkretnych wyników behawioralnych, co czyni ten eksperyment idealnym testem dla proponowanych analiz behawioralnych opartych na danych.

W ciągu ośmiu dni wszystkie zwierzęta stopniowo przyzwyczajały się do obsługi przez eksperymentatora, fiksacji głowy i środowiska MRI. Przyzwyczajenie do fiksacji głowy i środowiska eksperymentalnego jest kluczowe dla oceny reakcji behawioralnych na prezentowane bodźce. Jeśli zwierzęta nie są odpowiednio przyzwyczajone do środowiska, mogą wykazywać jedynie reakcje stresowe, wypłukując wszelkie efekty napędzane bodźcami, które w przeciwnym razie można by przeanalizować za pomocą wideoografii.

Chociaż ustawienie aparatury behawioralnej było generalnie takie samo dla każdej sesji zbierania danych, możliwe jest, że pole widzenia kamery (FOV) zmieniało się nieznacznie za każdym razem, gdy zwierzę było skupione na głowie podczas skanów fMRI (zobacz przykładowe FOV w Rysunek 1A). Było to prawdopodobnie spowodowane niewielkimi zmianami w ustawieniu mocowania kamery, a także indywidualnymi różnicami w mocowaniu czaszki do słupka głowy dla każdego zwierzęcia. W związku z tym filmy ze skanów musiały zostać wyrównane ze sobą za pomocą liniowej korejestracji, aby umożliwić porównanie informacji przestrzennych, które zawierały w skanach i zwierzętach. Korejestracja została dostosowana do reprezentatywnych danych. Na przykład w standardowym dniu skanowania na zwierzę przypadały 3–4 skany, co dawało 3–4 filmy na zwierzę dziennie. Pomiędzy każdym skanowaniem nie było żadnego ruchu elementów kołyski, w tym kamery i elementów mocujących głowę. W związku z tym, po ustaleniu transformacji korejestracji dla jednego filmu na zwierzę dziennie, można ją było zastosować do pozostałych 2–3 filmów z tym zwierzęciem tego samego dnia. Chociaż zaoszczędziło to czas na etapie korejestracji tego potoku, w razie potrzeby można również obliczyć transformacje przestrzenne osobno dla każdego filmu. Trzy cechy obecne w każdym filmie zostały wybrane jako punkty do oznaczania i obliczania transformacji przestrzennej. W przedstawionych reprezentatywnych danych tymi trzema punktami były: środek słupka głowy, widok z przodu prawego oka zwierzęcia oraz widok z profilu prawego oka zwierzęcia (widoczny w lustrze umieszczonym pod kątem 45 stopni). Przykłady korejestracji wideo są przedstawione na stronie Rysunek 1A,B, pokazujący średnią klatkę obliczoną na podstawie wszystkich filmów nagranych podczas tego eksperymentu, zarówno przed, jak i po korejestracji, aby zademonstrować efekt tego kroku.

Ten potok opiera się głównie na przepływie optycznym, metodzie widzenia komputerowego używanej do szacowania ruchu obiektów w filmie poprzez szacowanie ich prędkości pozornych między kolejnymi klatkami¹³. Przepływ optyczny został wybrany, ponieważ pozwala na kwantyfikację ruchu – wskaźnika zastępczego reakcji behawioralnych – bez żadnych z góry określonych części ciała lub interesujących działań. Dodatkowo, metoda ta była przystosowana do ograniczonej jakości obrazu reprezentatywnych filmów, które zostały uzyskane za pomocą jedynej kamery kompatybilnej z rezonansem magnetycznym dostępnej w czasie eksperymentu. W tym potoku wykorzystywany jest algorytm Horna-Schuncka globalnego, gęstego szacowania przepływu optycznego; jednak inne algorytmy, takie jak algorytm Lucasa-Kanade'a, można łatwo zastosować z niewielkimi zmianami w dostarczonych skryptach MATLAB^14,15,16. Rysunek 2A przedstawia przykładową klatkę wideo ze względnymi wektorami prędkości przepływu nałożonymi na każdy piksel. Zauważ, że większe wektory pojawiają się w miejscach, w których można by się spodziewać ruchu, takich jak pysk i łapy zwierzęcia.

Podczas gdy potok oszacował przepływ optyczny dla wszystkich filmów w pełnym polu widzenia, pozostałe etapy analizy stały się znacznie łatwiejsze do opanowania pod względem obciążenia obliczeniowego i potrzeb przechowywania danych, wybierając obszar zainteresowania (ROI) w obrębie FOV. Zwrot z inwestycji można wybrać zgodnie z eksperymentem i z góry określonymi zachowaniami lub za pomocą podejścia bardziej opartego na danych. Biorąc pod uwagę, że reprezentatywne dane nie zawierały żadnych konkretnych wyników behawioralnych, które można by śledzić a priori, zastosowano podejście oparte na danych. Odchylenie standardowe wielkości przepływu optycznego zostało obliczone dla wszystkich filmów w każdym pikselu, jak pokazano w Rysunek 2B. Obszary o najwyższym odchyleniu standardowym obejmowały kontury zwierzęcia, takie jak okolice oka i pyska, co daje pewność, że obserwowane fluktuacje przepływu optycznego były kierowane przez ruch zwierzęcia, a nie hałas na nagraniach. Obszary o mniejszym odchyleniu standardowym obejmowały kontury kołyski, które mogły być wynikiem niewielkich drgań w aparacie i podstawce, które wystąpiły podczas skanowania. Środowisko MRI jest nieuchronnie obciążone wibracjami podczas pozyskiwania danych z powodu przełączania gradientów, które mogą objawiać się fluktuacjami przepływu optycznego obserwowanymi w odbijających światło elementach kołyski. Na szczęście wibracje te są stałe przez cały czas pozyskiwania danych, a więc niezależne od stanu bodźca i nie powinny wpływać na wyniki analizy behawioralnej. Szczególnie zwiększone odchylenia standardowe przepływu optycznego zaobserwowano w pikselach lustra, odpowiadających widokowi profilu twarzy zwierzęcia, który kierował wyborem ROI dla reprezentatywnych danych. Był to również region, w którym można było spodziewać się reakcji behawioralnych, takich jak trzepanie i wąchanie, jako części typowego repertuaru behawioralnego samic myszy poszukujących odizolowanego szczeniaka emitującego odgłosy szczeniąt¹⁷.

Po wybraniu ROI i wyodrębnieniu średniej wielkości przepływu optycznego dla wszystkich filmów, przepływ optyczny w interesujących nas epokach może być porównany między grupami i warunkami. Zwróć uwagę, że pierwsze 20 sekund (s) wektora przepływu optycznego każdego filmu było zamaskowane w celu stabilizacji jasności; Można to jednak dostosować do potrzeb eksperymentalnych. Dla każdego filmu wektor przepływu optycznego w klatce dla wybranego ROI został oceniony Z, a następnie, zgodnie z wcześniejszymi pracami nad klasyfikacją mimiki twarzy, został przefiltrowany dolnoprzepustowy przy 5 Hz, aby uwzględnić częstotliwość odświeżania kamery 30 Hz, która jest szybsza niż jakiekolwiek oczekiwane fluktuacje behawioralne². Na koniec wektory z punktacją Z i filtrowane podzielono na epoki prezentacji bodźców, aby ocenić wpływ prezentacji bodźca na przepływ optyczny. Dla każdej epoki średni sygnał wyjściowy przed bodźcem został odjęty w celu znormalizowania przepływu optycznego do okresu przed bodźcem. Rysunek 3A pokazuje przykładowy szereg czasowy przepływu optycznego dla dwóch filmów, jednego matki i jednego dziewicy, z podsumowaniem danych grupy w Rysunek 3B-E. Rysunek 3B i Rysunek 3D pokazuje skumulowany przepływ optyczny w czasie podczas prezentacji bodźca w stosunku do linii bazowej, podczas gdy Rysunek 3C i Rysunek 3E podsumowują skumulowany przepływ optyczny 2,5 s po rozpoczęciu bodźca. Obliczono, że skumulowany przepływ optyczny uchwycił ogólny ruch w czasie bez zakładania, że spontaniczne reakcje behawioralne wystąpią w sposób zablokowany w czasie. Ogólnie rzecz biorąc, te reprezentatywne wyniki pokazują, że nawoływania szczeniąt, ale nie czyste tony, wywoływały znacząco różne reakcje behawioralne samic myszy matczynych i dziewiczych, zgodnie z przewidywaniami (międzygrupowy test U Manna-Whitneya: nawoływania szczeniąt: p = 0,026; czyste tony: p = 0,093). Jednak ten efekt bodźca nie przetrwał dwukierunkowej ANOVA, podczas gdy efekt grupowy przetrwał (bodziec: F(1,10) = 0,19, p = 0,67; grupa: F(1,10) = 8,61, p = 0,015). Ogólnie rzecz biorąc, wyniki te sugerują, że matki wykazywały wyższy ruch wywołany bodźcem w porównaniu z dziewicami, przy czym reakcja matki na wołanie szczeniąt była bardziej spójna niż na czyste tony. Może to odzwierciedlać zwiększoną uważność lub stres u matek, a także behawioralne znaczenie nawoływań szczeniąt, które, w przeciwieństwie do czystych tonów, wywołują reakcję aportowania szczeniąt u matek w naturalistycznych warunkach. Podsumowując, te reprezentatywne wyniki sugerują, że estymacja przepływu optycznego podczas prezentacji bodźca zewnętrznego może wydobyć informacje dotyczące zniuansowanych, spontanicznych reakcji behawioralnych.

Na koniec, przeprowadzono bardziej eksploracyjną analizę, aby odkryć przestrzenne cechy zachowania uchwycone w reprezentatywnych danych. Aby zbadać, które piksele w ROI zmieniały się w skoordynowany sposób podczas prezentacji bodźca, przeprowadzono analizę głównych składowych (PCA) przestrzennych informacji o przepływie optycznym w czasie. Analiza ta ujawniła piksele, które w największym stopniu przyczyniły się do powstania pierwszego komputera, a także piksele, które wykazywały różnice grupowe dla każdego warunku bodźca, jak pokazano na rysunku Rysunek 4. Skrajne prawe panele Rysunek 4A,B sugerują, że matki wykazywały więcej ruchu w nosie w porównaniu do dziewic podczas prezentacji obu typów bodźców. W dwóch grupach i dwóch warunkach bodźca, pierwszy PC wyjaśnił 5,41% ± 0,59% całkowitej wariancji w analizie przepływu optycznego. Chociaż lustrzany zwrot z inwestycji został utrzymany w tej części naszej analizy, przyszłe analizy mogą rozszerzyć się na szerszą część pola widzenia, aby scharakteryzować skoordynowane ruchy poza twarzą w odpowiedzi na bodźce. Na przykład porównanie ruchów łap może ujawnić bardziej znaczące różnice grupowe, biorąc pod uwagę, że odgłosy szczeniąt zazwyczaj inicjują aportowanie szczeniąt u matek, ale nie u dziewic, oraz że łapy mogą poruszać się swobodniej niż głowa zwierzęcia.

Podczas gdy dotychczasowe reprezentatywne wyniki sugerowały, że ten potok może oceniać nieinstruowane reakcje behawioralne na bodźce zewnętrzne w ograniczonych środowiskach wideograficznych, pozostało pytanie, czy obserwowane fluktuacje w przepływie optycznym rzeczywiście odzwierciedlają znaczące zachowanie zwierząt. Aby odpowiedzieć na to pytanie, przy użyciu tego samego potoku przeanalizowano oddzielny zestaw danych walidacyjnych. W oddzielnym eksperymencie samce myszy z ograniczoną ilością wody zostały przeszkolone, aby kojarzyły świetlną wskazówkę z dostarczeniem nagrody w postaci wody w wysokości 6 μl ("wysoka nagroda") lub 1 μl ("niska nagroda"). Warto zauważyć, że w przeciwieństwie do eksperymentu ze stymulacją słuchową, ten eksperyment miał a priori odczyt behawioralny: szybkość lizania. Lizometr został stworzony dzięki wideowizualnemu wykrywaniu lizawek, co było ułatwione dzięki analizie jasności pikseli w pobliżu wylewki wody. Odczyt behawioralny dostarczony przez lizometr może być zatem wykorzystany do porównania odczytu behawioralnego tego rurociągu dostarczonego przez optyczne oszacowanie przepływu, co potwierdza jego trafność w wykrywaniu spontanicznych zachowań. Po korejestracji wideo, oszacowaniu przepływu optycznego, wyborze ROI (po raz kolejny zawierającym lustrzane pole widzenia) i kwantyfikacji przepływu optycznego, porównanie wielkości przepływu optycznego ujawniło istotną różnicę między reakcjami behawioralnymi na wysokie i niskie nagrody. Wyniki tej analizy są pokazane w Rysunek 5A,B, gdzie Rysunek 5A pokazuje uśredniony szereg czasowy grupy, a Rysunek 5B podsumowuje skumulowany przepływ optyczny 2,5 s po wystąpieniu bodźca (test rangi ze znakiem Wilcoxona między stanami: p= 0,031). Należy zauważyć, że wartości przepływu optycznego były większe w porównaniu ze spontanicznym zachowaniem zarejestrowanym w reprezentatywnych danych, co dodatkowo podkreśla wyzwanie oceny nieinstruowanych, zniuansowanych reakcji behawioralnych. Rysunek 5C przedstawia rzeczywistą szybkość lizania zarejestrowaną przez likometr dla każdego z dwóch warunków nagrody, podczas gdy Rysunek 5D pokazuje, że więcej liźnięć jest rejestrowanych podczas warunku wysokiej nagrody w porównaniu do warunku niskiej nagrody w ciągu 2,5 s po dostarczeniu nagrody (test rangi ze znakiem Wilcoxona między warunkami: p = 0,031). Obie analizy wykazały podobny trend w porównaniu reakcji o wysokiej i niskiej nagrodzie, co potwierdza poprawność przedstawionego procesu analizy wideo w celu uchwycenia znaczących różnic w zachowaniu zwierząt w różnych warunkach.

Podsumowując, reprezentatywne wyniki pokazane tutaj sugerują, że prezentacja odgłosów szczeniąt wywołała znacząco różne reakcje u samic myszy matczynych i dziewiczych, podczas gdy czyste tony nie. Analiza zestawu danych walidacyjnych daje pewność, że obserwowane różnice w przepływie optycznym odzwierciedlają znaczące różnice w reakcjach behawioralnych na bodźce zewnętrzne.

Rysunek 1: Rejestracja wideo. (A) Przykłady korejestracji wideo przedstawiających z góry określone cechy (środek słupka na głowie, widok z przodu prawego oka, widok z profilu prawego oka) oznaczone w trzech klatkach, z których każda pochodzi z różnych filmów przedstawiających różne zwierzęta. Zauważ w nakładce, że te trzy punkty nie były wyrównane, pokazując, jak konfiguracja behawioralna zmieniła się nieznacznie między sesjami pozyskiwania danych. (B) Średnia klatka w ciągu ostatnich 10 sekund każdego filmu przed (po lewej) i po (po prawej) wspólnej rejestracji wideo. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Szacowanie przepływu optycznego. (A) Przykładowa ramka ze względnymi wektorami przepływu optycznego nałożonymi na kolor niebieski. (B) Średnie odchylenie standardowe przepływu optycznego w pikselach we wszystkich filmach. Wybrany zwrot z inwestycji wokół widoku z profilu twarzy zwierzęcia przez lustro jest obrysowany w kolorze magenta. Kolorowy pasek odpowiada odchyleniu standardowemu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Wizualizacja i porównanie przepływu optycznego między grupami i warunkami. (A) Przykładowy szereg czasowy przepływu optycznego z filtrem dolnoprzepustowym Z i 5 Hz dla jednego filmu matki i jednego filmu dziewicy. (B) i (D) Skumulowany przepływ optyczny mierzony w okresie bodźca nawoływań szczeniąt (B) i czystych tonów (D). Cieniowanie reprezentuje błąd standardowy średniej (SEM). (C) i (E) Skumulowany przepływ optyczny podczas pierwszych 2,5 s prezentacji bodźca dla nawoływań szczeniąt (C) i czystych tonów (E). * Wskazuje p < 0,05, międzygrupowy test U Manna-Whitneya (odgłosy szczeniąt: p = 0,026; czyste tony: p = 0,093), N = 6 na grupę. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4: Porównanie PC₁ między grupami. (A,B) Mapy przedstawiające obciążenia pierwszego głównego składnika (PC₁) przepływu optycznego podczas nawoływania szczeniąt (A) i czystych tonów (B) w różnych grupach, statystycznie progowe na poziomie p < 0,05 bez poprawki dla wielokrotnych porównań. Mapa cieplna wskazuje stopień, w jakim fluktuacja przepływu optycznego każdego piksela przyczyniła się do PC₁ w stosunku do innych pikseli. Mała czcionka wskazuje procent wariancji wyjaśnionej przez PC₁ (nawoływania młodych matek: 4,95% ± 0,72%; nawoływania młodych dziewic: 4,44% ± 0,59%; czyste tony matek: 4,95% ± 0,39%; czyste tony dziewic: 4,72% ± 1,24% (średnia ± odchylenia standardowego)). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 5: Walidacja potoku analizy behawioralnej. (A) Średnia punktacja Z, odjęta linia bazowa przed bodźcem i przefiltrowane dolnoprzepustowe szeregi czasowe przepływu optycznego 5 Hz podczas dostarczania wysokiej i niskiej nagrody. Cieniowanie reprezentuje SEM, biała pionowa linia wskazuje dostarczenie nagrody, a czerwone gwiazdki wskazują tymczasowe artefakty przepływu optycznego spowodowane początkiem i przesunięciem sygnału świetlnego. (B) Podsumowanie skumulowanego przepływu optycznego w ciągu pierwszych 2,5 s po dostarczeniu nagrody. * Wskazuje p < 0,05, sparowany test rangi ze znakiem Wilcoxona między warunkami (p = 0,031). (C) Średnia szybkość lizania, uzyskana za pomocą lizometru, podczas dostarczania wysokiej i niskiej nagrody. Cieniowanie reprezentuje SEM, a biała pionowa linia wskazuje dostarczenie nagrody. (D) Liczba liźnięć zarejestrowanych w ciągu pierwszych 2,5 s po dostarczeniu nagrody. * Wskazuje p < 0,05, sparowany test rangi ze znakiem Wilcoxona między warunkami (p = 0,031), N = 6. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Wideo 1: Przykładowy film 1. PCR_Br011_20231015_1842_output.avi. Kliknij tutaj, aby pobrać ten film.

Wideo 2: Przykładowe wideo 2. PCR_Br014_20231015_1722_output.avi. Kliknij tutaj, aby pobrać ten film.

Plik uzupełniający 1: Plik czasu zdarzenia dla filmu 1. PCR_Br011_20231015_1842_output_videoTimestamps.mat. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 2: Plik czasu zdarzenia dla Wideo 2. PCR_Br014_20231015_1722_output_videoTimestamps.mat. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dodatkowy plik kodowania 1: script1_videocoreg.m. Ten skrypt przestrzennie wyrównuje wszystkie filmy do siebie za pomocą korejestracji. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dodatkowy plik kodowania 2: script2_optflow_roiselect.m. Ten skrypt szacuje przepływ optyczny dla pełnego pola widzenia każdego przekształconego wideo i pozwala na wybór zwrotu z inwestycji dla pozostałej części potoku. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dodatkowy plik kodowania 3: script3_optflow_analysis.m. Ten skrypt porównuje wielkość przepływu optycznego w różnych grupach/warunkach dla wybranego zwrotu z inwestycji. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dodatkowy plik kodowania 4: script4_optflow_pca.m. Ten skrypt wykonuje PCA na szacowanym przepływie optycznym wybranego zwrotu z inwestycji. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dodatkowy plik kodowania 5: script5_optflow_pca_analysis.m. Ten skrypt porównuje wyniki PCA w różnych grupach/warunkach dla wybranego zwrotu z inwestycji. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

Prezentowany pipeline analizy behawioralnej pozwala na wydobycie cennych informacji z filmów przedstawiających zwierzęta wykazujące niewyuczone zachowania w odpowiedzi na biernie prezentowane bodźce. Te reprezentatywne filmy behawioralne zostały uzyskane w połączeniu z danymi z funkcjonalnego rezonansu magnetycznego całego mózgu (fMRI), dla których pokonano wiele ograniczeń, aby uchwycić reakcje behawioralne w środowisku MRI. Stosując metodę optycznego szacowania przepływu, ujawniono różnice w tym, jak matki i dziewice reagują na nawoływania szczeniąt - ale nie czyste tony - potwierdzając początkową hipotezę 13,14,15,16. Wykorzystując redukcję wymiarowości informacji o przepływie optycznym, odkrycie to zostało rozszerzone o eksploracyjną analizę rozkładu przestrzennego tych zachowań.

Ten potok analizy jest szeroko podatny na różne paradygmaty eksperymentalne. Jest całkowicie niezależny od rodzaju pozyskiwanych danych neuronowych i nie wymaga nadmiernej mocy obliczeniowej ani specjalistycznego sprzętu. Głównym wymogiem eksperymentalnym jest to, aby dane wideograficzne były rejestrowane z odpowiednimi znacznikami czasu rozpoczęcia prezentacji bodźców. Co więcej, dzięki udostępnieniu skryptów MATLAB używanych do wykonywania demonstrowanych analiz, implementacja tego potoku powinna być dość prosta, nawet dla osób z minimalnym doświadczeniem w MATLAB. Ogólne kroki, opisane w protokole, obejmują korejestrację wideo, oszacowanie przepływu optycznego, wybór regionu zainteresowania (ROI), kwantyfikację przepływu optycznego specyficzną dla ROI, porównanie wielkości przepływu optycznego, analizę głównych składowych (PCA) i porównanie PCA. Na każdym kroku potok może być modyfikowany w celu dopasowania do potrzeb eksperymentalnych i analitycznych, zgodnie z opisem w protokole i wyróżniony komentarzami w całym kodzie.

Istnieje kilka ograniczeń, o których należy pamiętać podczas korzystania z prezentowanego potoku analizy wideo. Po pierwsze, należy dokładnie przemyśleć projekt aparatu behawioralnego. Jeśli nie jest jasne, jakich reakcji behawioralnych można się spodziewać, korzystne może być zebranie jak największej liczby punktów widzenia zwierzęcia w przyszłych analizach. W związku z tym zaleca się zainstalowanie jednego lub wielu lusterek w celu jednoczesnego rejestrowania widoku z przodu i profilu zwierzęcia, jak pokazano na przykładowych klatkach wideo na rysunku 1A. Po drugie, zaleca się, aby oświetlenie przewidziane do akwizycji wideo było wystarczająco jasne, aby zobaczyć wszystkie istotne cechy pola widzenia (FOV), ale nie tak jasne, aby osiągnąć nasycenie. Na rysunku 1A można zaobserwować, że widok z przodu nosa myszy znajduje się w punkcie bliskim nasycenia, co utrudnia uchwycenie jakichkolwiek wahań jasności, które wskazywałyby na ruch. Mogło to przyczynić się do braku zmienności przepływu optycznego obserwowanej w tej części pola widzenia, jak pokazano na rysunku 2B. Na szczęście widok nosa z profilu nie napotkał tego problemu, co pozwoliło na analizę ROI lustra. Dodatkowo należy wziąć pod uwagę możliwość saturacji, jeśli w eksperymencie zaangażowane są bodźce wzrokowe. W eksperymencie z zestawem danych walidacyjnych sygnał świetlny używany do sygnalizowania dostarczenia nagrody wodnej wprowadzał tymczasowe nasycenie w pozyskanych filmach, stanowiąc tymczasowy artefakt w oszacowaniu przepływu optycznego. Artefakt ten można zaobserwować na rysunku 5A, gdzie dwa ostre piki w śladach przepływu optycznego dla obu warunków nagrody pokrywają się dokładnie z momentem, w którym sygnał świetlny był włączany i wyłączany. Artefakt ten sprawił, że te krótkie okna czasowe były trudne do analizy za pomocą przedstawionego potoku, a gdyby go nie było, wyniki przedstawione na rysunku 5B mogłyby być jeszcze bardziej znaczące. Stałe oświetlenie sceny jest koniecznym założeniem dla większości algorytmów przepływu optycznego^14,16. W związku z tym ten potok analizy wideo nie jest zalecany w przypadku eksperymentów, w których oświetlenie otoczenia zmienia się drastycznie, zarówno w obrębie prób, jak i między nimi. Po trzecie wreszcie, wystarczające przyzwyczajenie zwierząt do środowiska rejestrowania jest kluczowym elementem każdego eksperymentu, który będzie wykorzystywał ten potok. Jeśli nie zostaną odpowiednio przyzwyczajone, zwierzęta mogą wykazywać znaczące reakcje na stres, wypłukując wszelkie subtelne efekty napędzane bodźcami, które w przeciwnym razie można by przeanalizować za pomocą analizy wideo.

Idąc dalej, ten potok analizy behawioralnej może być wykorzystany do ułatwienia skoordynowanej oceny jednocześnie rejestrowanych reakcji behawioralnych i neuronalnych. Jak pokazano, ilościowa ocena nieinstruowanych zachowań pozwala na ocenę istotności bodźców w złożonym środowisku rejestrowania, a także testowanie różnych reakcji behawioralnych w grupach eksperymentalnych i warunkach. Można przeprowadzić dalsze analizy w celu zbadania indywidualnych różnic lub trendów w reakcjach behawioralnych próba po próbie, tak aby można było zbadać odpowiadającą im aktywność neuronalną. Dodatkowo, włączenie PCA w celu uzyskania informacji przestrzennych o ruchu wywołanym bodźcem może być wykorzystane do dalszego zbadania, czy określone typy sekwencji behawioralnych obserwowanych podczas prezentacji bodźca różnią się w zależności od grupy i warunków. Ten potok analizy można łatwo rozszerzyć na różne metody rejestracji neuronowej, zapewniając wszechstronne monitorowanie behawioralne w ograniczonych środowiskach. Badając, w jaki sposób bodźce zewnętrzne są reprezentowane zarówno w mózgu, jak i w zachowaniu, naukowcy są przygotowani do uzyskania bardziej wszechstronnego zrozumienia, w jaki sposób percepcja bodźców wpływa na stany wewnętrzne i ich zewnętrzne przejawy.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
MATLAB Computer Vision Toolbox	MathWorks		https://www.mathworks.com/products/computer-vision.html
MATLAB Image Processing Toolbox	MathWorks		https://www.mathworks.com/products/image-processing.html
Oprogramowanie MATLAB	MathWorks		https://www.mathworks.com/products/matlab.html
Kamera kompatybilna z MR " 12M-i" ze zintegrowanym oświetleniem LED	MRC Systems GmbH	12M-i	https://www.mrc-systems.de/downloads/en/mri-compatible-cameras/manual_mrcam_12m-i.pdf