Nanowłóknista błona podstawna naśladująca wykonana z rekombinowanej, funkcjonalizowanej nici pajęczej w niestandardowych wkładkach do hodowli tkankowych

Podsumowanie

Wkładki do hodowli tkankowych z plastikowymi membranami są złotym standardem w laboratoriach hodowli komórkowych jako przepuszczalne nośniki do tworzenia warstw komórkowych i modeli tkanek barierowych. W niniejszym artykule przedstawiamy prostą metodę zastąpienia plastikowej membrany bardziej biologicznie istotną membraną wykonaną z rekombinowanego funkcjonalizowanego białka pajęczej nici.

Streszczenie

Replikacja barier tkankowych jest kluczowa dla generowania odpowiednich modeli in vitro do oceny nowych terapii. Obecnie odbywa się to powszechnie za pomocą wkładek do hodowli tkankowych z plastikową membraną, która generuje stronę wierzchołkową i podstawną. Oprócz zapewnienia wsparcia dla komórek, błony te są dalekie od naśladowania swojego rodzimego odpowiednika, błony podstawnej, która jest nanofibrylarną macierzą opartą na białkach. W tej pracy pokazujemy prosty sposób na znaczną poprawę biologicznego znaczenia wkładek do hodowli tkankowych poprzez zastąpienie plastikowej membrany błoną wykonaną z czystego rekombinowanego, funkcjonalizowanego białka jedwabiu pajęczego. Jedwabna membrana tworzy się w wyniku samoorganizacji i spontanicznie przylega do bezbłonowej wkładki do hodowli tkankowej, gdzie może zapewnić wsparcie dla komórek. Specjalnie zaprojektowane wkładki do kultur tkankowych można wydrukować za pomocą standardowej drukarki 3D, postępując zgodnie z instrukcjami zawartymi w protokole, lub zamiast tego można zakupić i wykorzystać komercyjne. Protokół ten pokazuje, w jaki sposób skonfigurowany jest system hodowli z jedwabnymi membranami we wstawkach, a następnie, w jaki sposób można wdrożyć te same techniki hodowli komórek, które są stosowane w przypadku tradycyjnych, dostępnych na rynku wkładek.

Wprowadzenie

Modele in vitro, które mogą replikować bariery tkankowe, cieszą się coraz większym zainteresowaniem ze względu na ich zastosowanie w testowaniu nowych terapii i ułatwianiu zrozumienia podstawowych mechanizmów chorobowych^1,2. Aby dokładnie odtworzyć natywne mikrośrodowisko, konieczne jest podsumowanie funkcji błony podstawnej (BM), wysoce wyspecjalizowanego kompleksu macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM). BM występuje w prawie każdej tkance w ludzkim ciele, gdzie stanowi wsparcie dla komórek śródbłonka i nabłonka oraz oddziela je od leżących pod nimi tkanek^2,3. Oprócz zapewnienia wsparcia fizycznego, BM reguluje i utrzymuje również sygnały biochemiczne między komórkami a otaczającymi tkankami. Te istotne funkcje sprawiają, że konieczne jest projektowanie rusztowań, które przypominają konstrukcję, a także cechy mechaniczne i funkcjonalne natywnego BM³.

Jednym z najczęstszych sposobów naśladowania BM in vitro jest użycie dostępnych na rynku wkładek do hodowli tkankowych (TC-inserts). Są to zasadniczo cylindry z tworzywa sztucznego z przepuszczalną membraną, która dzieli komorę na boki wierzchołkowe i podstawno-boczne^4,5. Chociaż są łatwe w użyciu, membrany w komercyjnych wkładkach są zazwyczaj sztywne, trawione i wykonane z polimerów, takich jak poli(węglan) (PC) i poli(tereftalan etylenu) (PET)^3,4,6. Są elastyczne pod względem średnicy, gęstości porów i rozmiaru i mogą być powlekane w celu zwiększenia przyczepności komórek, ale brakuje im wszystkich innych istotnych cech BM, takich jak porównywalna grubość⁶, porowatość połączeń, architektura włóknista i odpowiedni moduł sprężystości³.

Standaryzacja wkładek TC i ich łatwość użycia zainspirowały kilka grup, w tym naszą, do zastąpienia plastikowej membrany bardziej podobnym do in vivo odpowiednikiem (omówione w Tabeli 1). Stosowane materiały obejmują polimery, takie jak polidimetylosiloksan (PDMS)⁷, poli(laktyd-ko-kaprolakton) (PLCL)⁸ i polikaprolakton (PCL)^4,9^,10 do materiałów białkowych, takich jak żelatyna^2,11,12, collagen^5,13 i rekombinowany pajęczy jedwab^14,15,16,17. Membrany z tych materiałów zostały przymocowane na różne sposoby, zarówno do dostępnych na rynku wkładów, z których membrana została usunięta^{4,7,8,10,12,13,14,16,18,19,20,21}, a także do specjalnie zaprojektowanych wkładek wyprodukowanych za pomocą druku 3D^{1,11,15,17,20} lub formowanie wtryskowe9^,22. Jednak większość z nich nadal jest daleka od podobieństwa do natywnego BM pod względem grubości, gdzie repliki wahają się od setek^11,18 do kilku mikrometrów5^,10,14,21,22. Wiele z nich wymaga również złożonych metod tworzenia i/lub ręcznego dołączania^{1,7,13,14,18,19,21}, co sprawia, że skalowanie i replikacja w innych laboratoriach jest wyzwaniem.

Tutaj prezentujemy prostą metodę formowania i dołączania jedwabnej membrany do wkładek oraz pokazujemy, jak hodować komórki po obu stronach membrany. Jedwabne błony powstają w wyniku samoorganizacji białka FN-4RepCT (FN-silk) na granicy ciecz-powietrze stałego roztworu^16,17. FN-silk to rekombinacyjnie wyprodukowana krótka wersja Major Ampullulate Spidroin 1 z Euprosthenops australis, funkcjonalizowana motywem RGD pochodzącym z fibronektyny²³. Wykazano, że łączy się w matryce fibrylarne, które promują adhezję, wzrost i migrację komórek^{15,16,17,23,24,25}. Metoda mocowania membrany na wkładce opiera się na spontanicznej adhezji i została uznana za odpowiednią dla dostępnych na rynku wkładek, z których membrana została usunięta¹⁶, a także drukowanych w 3D wkładek z kwasu polimlekowego (PLA)¹⁷ i Dental LT¹⁵. W tym artykule szczegółowo opisano, w jaki sposób ta metoda jest stosowana w przypadku wkładek drukowanych z Dental LT. Po przymocowaniu membran FN-silk do wkładek, można je zasadniczo traktować jak standardowe komercyjne wkładki do hodowli tkankowych. Krótko mówiąc, przedstawiamy prostą metodę generowania bardziej odpowiednich modeli in vitro barier tkankowych poprzez zastąpienie membran z tworzywa sztucznego membraną z jedwabiu FN na bazie białka.

Protokół

1. 3D-drukowanie wkładek

1. Pobierz plik . Plik projektowy STL (JoVe_Silk_Insert.stl) z pliku uzupełniającego 1.
2. Przygotuj pliki do druku, otwierając je w pakiecie oprogramowania przeznaczonym do konwersji pliku . STL do pliku do wydruku używanej drukarki 3D.
3. Skorzystaj z dedykowanego oprogramowania, aby dodać podpory. Konstrukcja nośna jest projektowana przez oprogramowanie, a potrzebna ilość będzie zależeć od drukarki i używanego oprogramowania. Ustaw wkładkę tak, aby ani platforma budowlana, ani podpory nie dotykały dna.
4. Wydrukuj żądaną liczbę wkładek za pomocą biokompatybilnej żywicy (takiej jak Dental LT lub BioMed) lub filamentu (takiego jak PLA) odpowiedniego dla używanej drukarki 3D.
   UWAGA: Upewnij się, że materiał wytrzyma odpowiedni proces sterylizacji, taki jak autoklawowanie, napromieniowanie lub zanurzenie etanolu.
5. Odłącz wydrukowane wkładki od platformy drukującej i usuń wydrukowaną konstrukcję nośną z gotowej części.
6. Jeśli używasz drukarki żywicznej, przetwarzaj wkładki przy użyciu standardowego protokołu dostarczonego przez producenta.
   UWAGA: Przetwarzanie może się różnić w zależności od użytej żywicy. Protokół zastosowany dla żywicy użytej w niniejszym dokumencie znajduje się w pliku uzupełniającym 2.
7. Wysterylizuj wkładki przy użyciu techniki odpowiedniej dla wybranego materiału.
   UWAGA: Zalecenia to autoklawowanie, napromienianie lub zanurzanie w 70% etanolu lub ich kombinacji. W przypadku korzystania z drukarki żywicznej może być potrzebny obszerny protokół wypłukiwania, aby osiągnąć optymalną biokompatybilność. Zapoznaj się z protokołem zawartym w pliku uzupełniającym 2 w celu uzyskania zalecenia.
8. Upewnij się, że wkładki są całkowicie suche i przechowuj je sterylnie do czasu użycia.

2. Tworzenie membran FN-silk

1. Napełnij pudełko suchym lodem i włóż je do zamrażarki o temperaturze -80 °C.
2. Zebrać fiolki z jedwabiem FN z zamrażarki o temperaturze -80 °C i umieścić je w suchym lodzie na czas transportu. Przynieś fiolki z jedwabiem FN do szafki bezpieczeństwa biologicznego i tam wykonaj dalsze kroki. Umieść fiolki z jedwabiem FN w stojaku na probówki do mikrowirówek, aby rozmroziły się bez nadmiernego dotykania.
3. Podczas rozmrażania jedwabiu FN rozpakuj 48-dołkową płytkę. Gdy jedwab FN całkowicie się rozmrozi, przejdź do następnego kroku w ciągu 10 minut, najlepiej jak najszybciej.
4. Rozcieńczyć roztwór jedwabiu FN w schłodzonym PBS lub w temperaturze pokojowej do pożądanego stężenia, najlepiej 1,8 mg/ml. Odpipetować 550 μl roztworu jedwabiu FN bezpośrednio na dno pustego dołka na płytce 48-dołkowej. Odpipetować roztwór jedwabiu FN, aż do przygotowania żądanej liczby membran.
   UWAGA: Unikaj wprowadzania pęcherzyków powietrza i natychmiast usuń wszelkie pęcherzyki powietrza za pomocą pipety. Nie należy używać studzienek w rzędzie A lub F ani w kolumnie 1 lub 8, ani sąsiednich studzienek (patrz schemat na rysunku uzupełniającym S1).
5. Umieść pokrywkę na 48-dołkowej płytce i umieść ją w większym, sterylnym pudełku, aby zapewnić sterylne środowisko podczas inkubacji.
6. Ostrożnie wyjmij pudełko z szafy bezpieczeństwa biologicznego i pozostaw je na noc w warunkach otoczenia w niezakłóconym miejscu bez znacznego przepływu powietrza.

3. Przyleganie membran FN do wkładek

1. Następnego dnia przynieś sterylne wkładki do szafy bezpieczeństwa biologicznego.
2. Przynieś duże sterylne pudełko zawierające 48-dołkową płytkę z membranami z jedwabiu FN z powrotem do komory bezpieczeństwa biologicznego i tam wykonaj dalsze kroki. Ostrożnie wyjmij 48-dołkową płytkę z dużego sterylnego pudełka.
3. Sprawdź wzrokowo tworzenie się membrany, obserwując zmętnienie w studzienkach i otwórz pokrywę 48-dołkowej płytki zawierającej membrany. Podnieś jedną wkładkę za pomocą sterylnej pęsety i poprowadź wkładkę w dół na membranę, aż uchwyty wkładki dotkną górnej części studzienki, jak pokazano na Rysunek 1. Utrzymuj spód wkładki równolegle do dolnej części płytki.
4. Powtarzaj krok 3.3, aż wkładki zostaną opuszczone na wszystkie uformowane membrany. Umieść pokrywkę na wierzchu płytki 48-dołkowej, a następnie włóż płytkę z powrotem do sterylnego pudełka. Pozostaw płytkę w spokoju przez 2 godziny w warunkach otoczenia, aby membrany mogły przylegać do wkładek.
5. Podgrzej pożywkę wzrostową lub PBS w temperaturze 37 °C.
6. Rozpakuj płytkę 24-dołkową.
7. Po upływie 2 godzin wyjmij płytkę 48-dołkową z pudełka i otwórz pokrywę. Za pomocą sterylnej pęsety chwyć wkładkę za uchwyty i wyjmij ją z płytki 48-dołkowej.
8. Bezpośrednio po podniesieniu należy napełnić wkład podgrzaną pożywką hodowlaną lub PBS. Użyj 100 μl pożywki hodowlanej, jeśli przystępujesz do siewu po stronie podstawowej lub 200 μl, jeśli przystępujesz do siewu wierzchołkowego. Jeśli membrany mają być przechowywane do późniejszego wykorzystania, należy zamiast tego użyć 200 μl PBS.
   PUNKT KONTROLNY: Jeśli ciecz zostanie zatrzymana nad membraną, podnoszenie zakończyło się pomyślnie. Jeśli płyn kapie na ławkę, membrana przecieka i należy ją zignorować.
9. Umieścić wkładkę w pustym dołku na płytce 24-dołkowej.
10. Wyjmij wszystkie wkładki z płytki 48-dołkowej i przenieś je do płytki 24-dołkowej. Napełnij studzienki 1,000 μl pożywki wzrostowej, jeśli przystępujesz do wysiewu komórek lub PBS do przechowywania, trzymając płytkę lekko przechyloną.
    UWAGA: Ważne jest, aby krawędź membrany znajdowała się poniżej poziomu cieczy (Rysunek 2).
11. Jeśli komórki mają być wysiane od razu, przejdź do sekcji 4 lub 5 w zależności od tego, po której stronie błony mają być wysiane komórki. Jeśli nie, przykryj pokrywką płytkę 24-dołkową i umieść ją w lodówce (4 °C) lub w inkubatorze o temperaturze 37 °C. W przypadku umieszczenia w inkubatorze należy uzupełniać PBS co drugi dzień, aby zapewnić utrzymanie wymaganej objętości.

4. Wysiewanie komórek po wierzchołkowej stronie błony

UWAGA: Jeśli membrany były przechowywane w PBS, zastąp PBS wstępnie podgrzaną pożywką hodowlaną, jak opisano w sekcji 6.

1. Zbierz komórki. Przygotować zawiesinę komórkową w taki sposób, aby pożądana liczba komórek na błonę była obecna w 20-50 μl zawiesiny. Zawiesić ponownie, aby osiągnąć pożądane stężenie komórek.
2. Za pomocą pipety P100 lub P200 odessać 20-50 μl zawiesiny komórek. Kierując końcówkę pipety w kierunku środka membrany, trzymaj końcówkę w odległości 1-2 mm od powierzchni pożywki hodowlanej wewnątrz wkładki i powoli naciskaj tłok pipety, aby utworzyć kroplę na krawędzi końcówki. Doprowadzić kroplę do kontaktu z pożywką hodowlaną wewnątrz wkładu.
   UWAGA: Pipetę należy trzymać prostopadle do powierzchni roboczej.
3. Powtórz krok 4.2 dla pozostałych membran. Ponownie zawiesić zapas komórek po wysianiu pięciu błon, aby zapewnić jednorodną dystrybucję komórek. Przesuń płytkę w kształcie ósemki, aby zapewnić lepsze rozmieszczenie komórek na błonie.
4. Hodowlę w warunkach normalnych (37 °C i 5% CO_{2 )} i zmianę pożywki co drugi dzień.

5. Wysiewanie komórek po podstawowej stronie błony

UWAGA: Jeśli membrany były przechowywane w PBS, zastąp PBS 100 μL wstępnie podgrzanej pożywki i napełnij studzienki 1 ml wstępnie podgrzanej pożywki, jak opisano w sekcji 6.

1. Zebrać komórki i przygotować zawiesinę komórkową w taki sposób, aby pożądana liczba komórek na błonę była obecna w 20 μl zawiesiny. Zawiesić ponownie, aby osiągnąć pożądane stężenie komórek.
2. Rozpakuj i otwórz pokrywę szalki Petriego. Upewnij się, że wysokość szalki Petriego jest wystarczająca, aby pomieścić wkładki tak, aby ich dno nie dotykało pokrywy.
3. Za pomocą pęsety wyjmij wkładkę z płytki 24-dołkowej, pozostawiając pożywkę hodowlaną w dołkach. Używając zestawu pęset w każdej ręce, odwróć wkładkę tak, aby strona podstawowa była skierowana do góry, a strona wierzchołkowa skierowana w stronę obszaru roboczego. Umieść odwróconą wkładkę na szalce Petriego, jak w Rysunek 3C. Powtórz dla pozostałych inserts.
   UWAGA: Nie usuwaj pożywki hodowlanej od strony wierzchołkowej. Utrzyma membranę mokrą podczas inkubacji.
4. Zawiesić zapas komórek, aby zapewnić równomierne rozprowadzenie komórek w roztworze, i odessać 20 μl zawiesiny komórek za pomocą pipety P100 lub P200. Kierując końcówkę pipety w stronę środka membrany, trzymaj końcówkę w odległości 1-2 mm od membrany i powoli naciskaj tłok pipety, aby utworzyć kroplę na krawędzi końcówki. Pipetę należy trzymać prostopadle do powierzchni membrany i pozwolić, aby kropla opadła na membranę. Powtórz dla pozostałych membran.
   UWAGA: Ponownie zawiesić zapas komórek po wysianiu pięciu błon, aby zapewnić równomierne rozprowadzenie komórek.
5. Nałożyć pokrywkę na szalkę Petriego, przenieść szalkę Petriego i płytkę 24-dołkową do inkubatora i inkubować płytki z komórkami w normalnych warunkach (37 °C i 5 % CO₂ ) przez 30 minut.
6. Umieścić 24-dołkową płytkę zawierającą pożywkę hodowlaną i szalkę Petriego do biologicznie bezpiecznej szafki. Otwórz obie pokrywki i używając zestawu pęsety w każdej ręce, podnieś jedną wkładkę i odwróć ją tak, aby wierzchołkowa strona błony była teraz skierowana do góry, a strona podstawowa do dołu.
7. Za pomocą pipety P200 dodaj 200 μl pożywki hodowlanej do wkładki. Umieść wkładkę w jednym z wstępnie wypełnionych dołków 24-dołkowej płytki i powtórz dla pozostałych membran.
8. Hodowlę w warunkach normalnych (37 °C i 5% CO_{2 )} i zmianę pożywki co drugi dzień.

6. Średnia zmiana kultur w warunkach zanurzenia

1. Przygotuj nową 24-dołkową płytkę ze świeżą pożywką hodowlaną, dodając 1 000 μl/basenik. Za pomocą pęsety wyjmij jedną wkładkę z płytki 24-dołkowej, lekko ją przechyl i usuń podłoże od strony wierzchołkowej.
2. Do wkładu dodać 200 μl świeżej pożywki hodowlanej. Umieść wkładkę w studzince, która jest wstępnie wypełniona świeżą pożywką hodowlaną. Powtórz dla wszystkich membran.

7. Średnia zmiana kultur w warunkach transportu powietrznego

1. Za pomocą pęsety podnieś wkładkę i umieść ją w pustym dołku na 24-dołkowej płytce. Powtórz dla czterech kolejnych membran.
2. Lekko przechylić 24-dołkową płytkę i powoli dodać 1 000 μl świeżej pożywki hodowlanej do każdej płytki. Powtórz dla pozostałych membran.

8. Pomiar przeznabłonkowego oporu elektrycznego (TEER)

1. Przygotować 24-dołkową płytkę z 1 000 μl pożywki hodowlanej lub PBS wewnątrz studzienek i przenieść do niej membrany. Upewnij się, że nad membraną znajduje się 200 μl odpowiedniego roztworu.
2. Za pomocą zestawu pęsety dobrze ustabilizuj wkładkę wewnątrz płytki, delikatnie naciskając na ramiona wkładki. Nie wyjmując pęsety, włóż elektrodę TEER do studzienki i zapisz pomiar.
3. Wyjmij elektrodę, a następnie podnieś pęsetę.
4. Powtórz kroki 8.2-8.3 dla pozostałych membran.

Wyniki

Reprezentatywne zdjęcia wkładek
Zdjęcia wkładek przed i po zwolnieniu z platformy drukującej są pokazane w Rysunek 3A,B. Obraz gotowej wkładki, z której usunięto podporę, jest pokazany w Rysunek 3C. Rezultatem jest partia wkładek wydrukowanych w 3D, gotowych do sterylizacji i późniejszego użycia.

Podnoszenie i obsługa membran FN-silk<br /> Ogólny schemat formowania membrany FN-silk i ręcznego podnoszenia jest pokazany na Rysunek 1. Rezultatem jest szereg wkładek z dołączoną membraną FN-silk. Aby zapewnić najwyższy wskaźnik sukcesu w podnoszeniu nienaruszonych membran, należy dokładnie przestrzegać kroków opisanych w protokole. Rysunek 4 pokazuje zdjęcia membrany w stanie nienaruszonym (A,D) i po rozerwaniu (B,E,F). Rozdarcie można uwidocznić za pomocą mikroskopii jasnego pola (Rysunek 4E,F) i/lub poprzez kapanie cieczy przez membranę (Rysunek 4B). Ważne jest, aby podnosić i opuszczać wkładki prostopadle do membrany, aby zapewnić równomierne przyleganie membrany i rozciąganie się poniżej wkładek. Przyczepność membrany można zaobserwować wizualnie, jak pokazano na Rysunek 4A. Jeśli wkładka zostanie opuszczona zgodnie z instrukcją, a poziom cieczy zostanie utrzymany, jak pokazano na rysunku Rysunek 2, membrana pozostaje przymocowana do wkładki przez długie okresy hodowli.

Tutaj, przyłączenie błony do wkładki jest weryfikowane poprzez przeprowadzenie eksperymentu przenikania^15,16,17 na błonach, które były trzymane w standardowych warunkach hodowli komórkowej przez 9 dni. Krótko mówiąc, po dodaniu cząsteczki fluorescencyjnej na wierzch membrany i zmierzeniu sygnału w roztworze poniżej, profil przenikania jedwabnych membran jest zgodny z dostępnym na rynku wkładem do hodowli tkankowej (Rysunek 4C), wykazując brak wycieków przez 36 godzin przenikania i wskazując, że membrana pozostaje zarówno nienaruszona, jak i przyczepiona do wkładki. Podobne eksperymenty przeprowadzono wcześniej z komórkami wysianymi na jednej ¹⁵ lub po obu stronach jedwabnej membrany¹⁷. Siła przyczepności została wcześniej pokazana za pomocą wcięcia makro¹⁶ i inflation tests^16,17. W eksperymentach z wgłębieniami makro użyto rysika do rozciągnięcia membrany, która pękła pod wpływem siły 1,4 mN, pozostając jednocześnie przymocowana do insert¹⁶.

Należy zauważyć, że wskaźnik sukcesu podnoszenia nienaruszonych membran jest związany z materiałem i obróbką końcową wkładek. Dzięki temu protokołowi 95% membran podniesionych za pomocą wkładek wydrukowanych z użytej żywicy było odpowiednich do wysiewu komórek, w porównaniu z 74%, gdy zamiast tego użyto porównywalnej żywicy. Spekulujemy, że adhezja jest wspomagana przez oddziaływania hydrofobowe i siły van der Waalsa, a zatem zmiana właściwości materiału zmienia siłę przyczepności. Potwierdza to również fakt, że membrany nie przylegają dobrze do materiałów hydrofilowych (dane nie pokazane).

Reprezentatywne wyniki hodowli komórkowych na błonach FN-silk
Obrazy immunofluorescencyjne keratynocytów (HaCaT) hodowanych po wierzchołkowej lub podstawowej stronie błony przedstawiono na rysunku Rysunek 5. Zaobserwowano, że przylegające komórki (Ryc. 5D.i) równomiernie pokrywają obszar hodowli w dniu 1, uzyskując typową morfologię keratynocytów brukowych (Rysunek 5A.i-B.i). W dniu 3 keratynocyty utworzyły warstwę zlewającą się ( Ryc. 5A.ii-B.ii) i utworzyły sieć ścisłych połączeń ( Ryc. 5D.ii), co wskazuje, że przyjmują fizjologiczne funkcje nabłonkowe. Wysoki poziom żywotności komórek osiągnięty w matrycach FN-silk^15,17,23,24 zostały również przedstawione w opisanej tutaj konfiguracji hodowli z wkładką z jedwabną membraną. Po 3 dniach w hodowli keratynocyty pozostały wysoce żywotne (Ryc. 5C.i-iv). Ponadto nie zaobserwowano różnicy w rozmieszczeniu martwych komórek między środkiem ( Rysunek 5C.i-ii) a obrzeżem błony ( Figura 5C.iii-iv), nie ujawniając znaczącego wpływu materiału insertu na żywotność HaCaT. Ogólnie rzecz biorąc, system hodowli z wkładkami jedwabnymi oferował podobną (Rysunek 5i-ii, v-vi), jeśli nie poprawioną (Figura 5iii-iv, vii-viii) żywotność keratynocytów z komercyjnym systemem wkładek membranowych PET.

Rysunek 1: Szczegółowa ilustracja tworzenia i podnoszenia pojedynczych membran FN-silk. (A) Napełniaj co drugą studzienkę (unikaj zewnętrznego rzędu/kolumny) w 48-dołkowej płytce roztworem białka FN-jedwabiu, gdzie (B) samoczynnie grupuje się w membranę na granicy faz ciecz-powietrze przez noc. (C) Chwyć wkładkę pęsetą i powoli opuść ją na membranę za pomocą prowadnic (D,E) na wkładce wydrukowanej w 3D, aby upewnić się, że wkładka jest opuszczona prostopadle do membrany. Powiększenie przyczepności jedwabnej membrany pokazujące przekrój poprzeczny wkładki (F) tuż nad membraną i (G) w momencie stykania się z jedwabną membraną. W ciągu 2-godzinnego okresu inkubacji (H) jedwabna membrana spontanicznie przyczepia się do wkładki, która jest następnie (I) używana do podnoszenia membrany z granicy faz. Skróty: FN = fibronektyna; PBS = sól fizjologiczna buforowana fosforanami. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Szczegółowa ilustracja pokazująca, jak obchodzić się z membraną FN-silk po zdjęciu jej z płyty formującej. (A) Wkładka (szara) z membraną (fioletowa) bezpośrednio po podniesieniu (B) Płyn (niebieski) dodaje się po wierzchołkowej stronie membrany, którą następnie umieszcza się w (C) 24-dołkowej płytce, gdzie dłuższa część ramion wkładki zwisa na ściankach, a krótsza część utrzymuje wkładkę umieszczoną w środku płytki. (D) Ciecz dodaje się do studzienki, upewniając się, że poziom cieczy jest zrównoważony i znajduje się powyżej krawędzi membrany. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Zdjęcia wkładek wydrukowanych w 3D. (A) Wkładki bezpośrednio po wyjęciu z drukarki 3D, nadal przymocowane do platformy roboczej. (B) Jedna wkładka po wyjęciu z platformy roboczej, przed złamaniem podpór. (C) Jedna wkładka po usunięciu podpór. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4: Membrana z jedwabiu FN przed i po zerwaniu. (A) Zdjęcie nienaruszonej membrany zawierającej 200 μL barwionego (niebieskiego) PBS po stronie wierzchołkowej. Krawędź membrany owinięta wokół wkładu jest oznaczona białymi strzałkami. (B) Fotografia tej samej membrany po rozerwaniu. PBS przecieka przez membranę. (C) Wykres przedstawiający przenikanie cząsteczki fluorescencji o sile 3 kDa w ciągu 36 godzin przez jedwabną membranę lub dostępną w handlu membranę PET utrzymywaną w standardowych warunkach hodowli komórkowej przez 9 dni. (D) Obraz membrany w jasnym polu przed rozerwaniem. (E) Obraz w jasnym polu tej samej membrany po rozerwaniu. Wadliwy obszar jest oznaczony niebieskim przerywanym konturem. (F) Powiększony widok rozdarcia pokazanego w D z krawędzią rozerwanej błony oznaczoną niebieskimi strzałkami. Podziałka = 1 mm (D,E), 200 μm (F). Skróty: FN = fibronektyna; PBS = sól fizjologiczna buforowana fosforanami; PET = poli(tereftalan etylenu). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 5: Keratynocyty (HaCaT) hodowane na membranie FN-silk. W dniu 1 keratynocyty przylegają i równomiernie pokrywają powierzchnię błony po stronie wierzchołkowej (A.i) lub podstawnej (B.i) (falloidyna, kolor zielony). W dniu 3 po stronie wierzchołkowej (A.ii) lub podstawowej (B.ii) tworzy się zlewająca się monowarstwa (falloidyna, kolor zielony). (C) Ocena żywotności komórek na błonie jedwabnej (i-iv) w porównaniu z komercyjną błoną PET (v-viii) w środku (i, ii, v, vi) i na obrzeżach (iii, iv, vii, viii) warstwy komórkowej. Żywe komórki są pokazane na zielono (i, iii, v, vii), a martwe komórki na czerwono (i, iii, v, vii) lub na biało (ii, iv, vi, viii). Linia przerywana oznacza interfazę membrana-wkładka. (D) Powiększone szczegółowo, (i) wskazujące (białe strzałki) przyleganie komórek do błony (falloidyna, biała) i (ii) ścisła sieć połączeń utworzoną po 3 dniach w hodowli (ZO-1, biały). Podziałka = 1 mm (górny rząd: A,B), 100 μm (dolny rząd: A,B,Ci, ii, v, vi), 500 μm (C iii, iv, vii, viii), 50 μm (D). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Tabela 1: Przegląd poprzednich prac, w których membrany zostały zintegrowane z wkładkami do hodowli komórkowych. Skróty: PCL = polikaprolakton; PEGDA = dikrylan poli(glikolu etylenowego); PLGA = poli(kwas mlekowo-ko-glikolowy); PDMS = polidimetylosiloksan; PC = Poliwęglan; RSS = Rekombinowane białko jedwabiu pajęczego; PLCL = Poli(laktyd-ko-kaprolakton); RHSIF = Rekombinowane białka pośrednie śluzu śluzu śluzu Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Tabela 2: Przegląd poprzednich prac podsumowujących różne typy komórek hodowanych na błonach FN-silk. FN-4repCT (FN-silk) to krótka wersja jedwabiu z Euprosthenops australis, który jest rekombinowany wytwarzany i funkcjonalizowany motywem RGD z fibronektyny na poziomie genetycznym. Białko to jest stosowane we wszystkich podsumowanych tutaj przypadkach. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Tabela 3: Rozwiązywanie problemów. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Plik uzupełniający 1: Plik projektowy (.stl) do druku 3D wkładek. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 2: Protokół drukowania, obróbki końcowej i sterylizacji podczas korzystania z drukarki i żywicy określonej w Tabeli Materiałów. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek uzupełniający S1: Schemat wzoru sugerowanego do użycia podczas umieszczania roztworu jedwabiu FN na płytce 48-dołkowej. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

Opisany w niniejszym dokumencie protokół przedstawia prosty sposób wytwarzania biologicznie istotnych wkładów do hodowli komórkowych. Zaczyna się od wydrukowania wkładek, następnie formowania i mocowania błon z jedwabiu FN, a kończy się pokazaniem, w jaki sposób komórki mogą być wysiewane zarówno po wierzchołkowej, jak i podstawowej stronie błony. W tym protokole jest jeden naprawdę krytyczny krok, aby zapewnić długoterminowy sukces w hodowlach komórkowych, a jest nim opuszczanie i podnoszenie wkładek na membranę. Pomyślne wykonanie tych etapów pozwoli na uzyskanie systemu hodowli z wkładką z jedwabną membraną, który będzie w stanie wytrzymać hodowlę komórkową podobnie jak dostępne na rynku systemy z membranami syntetycznymi. Aby to zapewnić, po bokach specjalnie zaprojektowanych wkładów zastosowano prowadnice, aby zapobiec ich opuszczaniu pod kątem lub przesuwaniu się na boki w studni, co prowadziłoby do nierównomiernego przylegania membrany, generując słabe punkty, a następnie przeciekanie. Często zdarza się, że drobne problemy pojawiają się podczas przestrzegania protokołu po raz pierwszy. Aby pomóc nowemu użytkownikowi w ich obejściu, jeśli napotka je podczas postępowania zgodnie z powyższym protokołem, w Tabeli 3 przedstawiliśmy potencjalne problemy i ich rozwiązania.

Wykazano, że sama błona jest korzystna dla modelowania różnych tkanek barierowych (omówionych w Tabeli 2); Należy jednak podkreślić, że żywica użyta do wydrukowania wkładek nie została dokładnie przetestowana pod kątem jej wpływu na żywotność innych typów ogniw. Chociaż do tej pory nie spotkaliśmy się z takimi problemami, możliwe jest, że żywica może negatywnie wpłynąć na żywotność i wzrost niektórych wrażliwych komórek. W związku z tym zaleca się przeprowadzenie testu żywotności podobnego do przedstawionego tutaj w celu sprawdzenia kompatybilności żywicy z każdym zastosowanym typem ogniwa. W przypadku wystąpienia cytotoksyczności należy ustanowić dokładniejszy protokół utwardzania i/lub wymywania w celu zapobieżenia wypłukiwaniu nieutwardzonych monomerów z czasem i uszkodzeniu komórek. Przykład takiego protokołu, który został użyty do wydrukowania wkładek w ramach tego protokołu, można znaleźć w pliku uzupełniającym 2. Protokół ten był wcześniej stosowany do przygotowania wkładek do hodowli śródbłonka mózgu bEnd.3 na błonach jedwabnych przez okres do 8 dni¹⁵.

Główną zaletą metody przedstawionej w tej pracy jest to, że oferuje ona prosty sposób na zastąpienie obecnych plastikowych membran we wkładkach do hodowli tkankowych, a tym samym ulepszenie statycznych modeli hodowli tkankowych. Głównym ograniczeniem jest to, że użytkownik musi mieć dostęp do sprzętu do druku 3D lub wykupić czas w zakładzie na wydrukowanie swoich wkładek. Jednak w razie potrzeby można to obejść, stosując komercyjne wkładki do kultur tkankowych po usunięciu ich błon. Ponadto, chociaż membrany jedwabne mogą być zasadniczo używane jako zwykłe wkładki do kultur tkankowych, są cieńsze i mają skład białkowy, a zatem są bardziej wrażliwe niż ich obecne syntetyczne odpowiedniki komercyjne. W związku z tym wymagają one ostrożniejszego obchodzenia się z nimi przez użytkowników i muszą być mokre, aby zachować ich elastyczność. Należy zauważyć, że membrany wytrzymują rozciąganie i nadmuchiwanie^16,17, dzięki czemu nadają się na przykład do naśladowania ruchu oddechowego. Mimo to prawdopodobne jest, że nowi użytkownicy uszkodzą niektóre membrany na początkowych etapach, ale wraz ze wzrostem ich doświadczenia w obsłudze membran oczekuje się, że wskaźnik sukcesu wzrośnie. Jeśli problemy nie ustąpią, użytkownik powinien zapoznać się z Tabelą 3 w celu rozwiązania problemu.

W ciągu ostatniej dekady przedstawiono kilka alternatyw dla komercyjnych wkładek z tworzywa sztucznego (tabela 1) i za każdym razem, gdy porównywano wydajność kultur komórkowych, nowe, bardziej istotne biologicznie membrany dawały lepsze wyniki niż ich komercyjne odpowiedniki z tworzyw sztucznych 2,5,6,7,14,22 . Zaobserwowano to przede wszystkim pod względem wzmocnionej funkcji bariery ^{2,5,6,7,14,22,} ale także w tworzeniu bardziej natywnego wzrostu komórek¹⁴ i zwiększonych interakcjach przez błonę w systemach kohodowli⁷. Trend ten zaobserwowano już wcześniej w przypadku błon FN-silk przy ustalaniu modelu ściany naczynia krwionośnego. W tym badaniu HDMEC i komórki mięśni gładkich (SMC) hodowano po przeciwnych stronach błony. Wykazano, że SMC wydzielają grubszy ECM podczas jednoczesnej hodowli z HDMEC na membranach FN-silk w porównaniu z komercyjnymi membranami PET. Podobnie, HDMEC ustanowił ściślejszą barierę na membranach FN-silk¹⁷. Lepsze wyniki hodowli komórkowych są prawdopodobnie spowodowane poprawą komunikacji komórkowej i warunkami hodowli podobnymi do in vivo. Membrana FN-silk jest znacznie bliższa natywnej BM pod względem grubości, struktury i właściwości mechanicznych. Natywny BM ma grubość od 20 nm do 3 μm²², membrany PET 10 μm, a membrany FN-silk około 1 μm, co dobrze mieści się w zakresie natywnym. Struktura membrany FN-silk jest również nanofibrylarna¹⁶, podobnie jak natywna BM²², podczas gdy membrana PET składa się z tworzywa sztucznego z wytrawionymi torami porami, zwykle o średnicy od 0,4 μm do 8 μm⁷. Membrany PET są również znacznie sztywniejsze niż BM, mają moduł Younga około 2 GPa, w porównaniu do BM, który waha się od kPa do MPa, ale zwykle podaje się go w okolicach 250-500 kPa²². Membrany FN-silk mają moduł Younga wynoszący 115 kPa¹⁶, który mieści się w warunkach natywnych. Należy również zauważyć, że gdy komórki rosną na błonie, ich siła staje się czynnikiem dominującym, a nie sama błona¹⁷. Na koniec należy również zauważyć, że zintegrowana funkcjonalizacja białka jedwabiu FN zapewnia, że komórki przylegają bezpośrednio do błony i jako takie powłoka nie będzie konieczna. W przypadku membran PET często standardowym jest powlekanie białkiem ECM w celu zapewnienia prawidłowej adhezji komórek⁷.

Porównując membranę FN-silk z innymi podejściami stosowanymi w celu zastąpienia membrany PET (omówioną w tabeli 1), główną zaletą naszej metody jest zastosowanie rekombinacyjnie wytwarzanego funkcjonalizowanego białka jedwabiu. Zapewnia to powtarzalność i określone warunki hodowli w przeciwieństwie do innych materiałów pochodzenia zwierzęcego opartych na białku, takich jak kolagen. Należy ponownie zauważyć, że funkcjonalizacja białka zapewnia, że nie są potrzebne żadne powłoki, ponieważ komórki dobrze przylegają do błon, tak jak^{to jest 17}. Co więcej, opisana tutaj produkcja membran na bazie jedwabiu opiera się na samoorganizacji i nie wymaga skomplikowanej konfiguracji ani stosowania ostrych chemikaliów, w przeciwieństwie do wielu innych technik, które opierają się na przykład na elektroprzędzeniu. Spontaniczne przyleganie membrany do wkładu eliminuje również potrzebę ręcznej obsługi związanej z wkładkami dwuczęściowymi, klejeniem i silikonowymi pierścieniami montażowymi, upraszczając w ten sposób skalowanie i umożliwiając łatwą odtwarzalność w każdym laboratorium. Oprócz łatwej produkcji, nasza metoda jest łatwa do dostosowania do eksperymentalnych potrzeb użytkownika, ponieważ można stosować różne materiały wkładek, a grubość membrany można dostosować, dostosowując stężenie jedwabiu w roztworze początkowym¹⁶. Wreszcie, protokół ten może zapewnić, zgodnie z naszą wiedzą, najcieńszą jak dotąd, wolnostojącą membranę przymocowaną do wkładki do hodowli tkankowej, co pozwala na najściślejsze podobieństwo do natywnej błony podstawnej.

Przedstawiony tutaj protokół tworzenia i obchodzenia się z jedwabną membraną jest prosty w użyciu dla każdego, kto jest przyzwyczajony do pracy z wkładkami do hodowli tkankowych w laboratorium hodowli komórkowych. Jest to prosty sposób na odejście od membran z tworzywa sztucznego na rzecz ich odpowiedników bardziej zbliżonych do in vivo, co pozwala na generowanie bardziej odpowiednich modeli tkanek przy użyciu różnych typów komórek (tabela 2). Błony jedwabne mogą wspierać hodowlę komórkową po ich wierzchołkowej lub podstawowej stronie, a także kohodowle różnych typów komórek obustronnie¹⁷. Modele tkanek barierowych opracowane na membranach jedwabnych mogą być wykorzystywane do tego samego zakresu zastosowań, co wkładki do kultur tkankowych, w tym do badań przesiewowych leków oraz badań nad przenikaniem i infekcjami. W przypadkach, w których interesujący jest przesłuch między różnymi typami komórek, wykazano, że przewyższają one wstawki TC ze względu na ich właściwości bardziej podobne do in vivo ¹⁷.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
CHEMICALS
Alexa Fluor 488	Invitrogen; Thermo Fisher Scientific	A-21121	Kozia anty-mysz, Rozcieńczenie 1:500
Alexa Fluor 488 Phalloidin	Invitrogen; Thermo Fisher Scientific	A12379	Rozcieńczenie 1:400
przeciwciało anty-ZO-1 (1A12)	Invitrogen; Thermo Fisher Naukowy	33-9100	Mysi anty-ludzki, monoklonalny, Rozcieńczenie 1:200
Dekstran, Alexa Fluor 680; 3,000 MW, Anionowy	invitrogen; Thermo Fisher Scientific	D34681	Rozcieńczony 2,5% (w/v) w 200 ul pożywki hodowlanej
DMEM/F-12	Gibco; Thermo Fisher Scientific	31330095	Uzupełniony o 5% v/v FBS i 1% v/v Penicylina-Streptomycyna
Etanol	Solveco	1326	70% (nr CAS 64-17-5)
Płodowa surowica bydlęca, kwalifikowana, inaktywowana termicznie, Stany Zjednoczone	Gibco; Thermo Fisher Scientific	16140071
FN-silk	Spiber technologies AB		Sklep w temperaturze -80 & stopni; C
Izopropanol, odczynnik analityczny EMPARTA ACS	Supelco	1096342511	≥ 99,5% (nr CAS 67-63-0)
Żywy/martwy żywotność/cytotoksyczność Zestaw	Invitrogen; Thermo Fisher Scientific	L3224
PBS	Szwedzka Agencja Weterynaryjna / Statens veterinä rmedicinska anstalt	992420	bez Ca i Mg, przefiltrowana
penicylina-streptomycyna (10 000 U/ml)	Gibco; Thermo Fisher Scientific	11548876
MATERIAL
Dental LT Clear Resin	Denthouse	#DLCL-01
Komórki HaCaT	CLS	300493
Nunc Hodowla komórkowa Multinaczynia 24-dołkowe	Fisher Scientific	10604903
Nunc Multidish poddane hodowli komórkowej 48- wel	Fisher Scientific	10644901
TC wkładka, do płytek 24-dołkowych, PET, przezroczysta	Sarstedt	83.3932.041	wielkość porów: 0,4 i mikro; m
Wkładki do hodowli komórkowych ThinCert, membrana półprzezroczysta (PET)	Greiner	662640	wielkość porów: 0,4 i mikro;
mSPRZĘT
EVOM miernik z pałeczkami	World Precision Instruments (WPI) Niemcy, GMBH
Form 3B	FormLabs
Form Wash	FormLabs
Form Cure	FormLabs
Isotemp General Purpose Deluxe Water Baths	Fisherbrand
Odwrócony mikroskop fluorescencyjny Eclipse Ti	Nikon
Odwrócony mikroskop fluorescencyjny DMI6000 B	Okap
Ninosafe, klasa II	Labolutions
Midi CO2  Inkubator, 40 L	Thermo Scientific