Wkładki do hodowli tkankowych z plastikowymi membranami są złotym standardem w laboratoriach hodowli komórkowych jako przepuszczalne nośniki do tworzenia warstw komórkowych i modeli tkanek barierowych. W niniejszym artykule przedstawiamy prostą metodę zastąpienia plastikowej membrany bardziej biologicznie istotną membraną wykonaną z rekombinowanego funkcjonalizowanego białka pajęczej nici.
Artykuł metodologiczny
Nanowłóknista błona podstawna naśladująca wykonana z rekombinowanej, funkcjonalizowanej nici pajęczej w niestandardowych wkładkach do hodowli tkankowych
* These authors contributed equally
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Replikacja barier tkankowych jest kluczowa dla generowania odpowiednich modeli in vitro do oceny nowych terapii. Obecnie odbywa się to powszechnie za pomocą wkładek do hodowli tkankowych z plastikową membraną, która generuje stronę wierzchołkową i podstawną. Oprócz zapewnienia wsparcia dla komórek, błony te są dalekie od naśladowania swojego rodzimego odpowiednika, błony podstawnej, która jest nanofibrylarną macierzą opartą na białkach. W tej pracy pokazujemy prosty sposób na znaczną poprawę biologicznego znaczenia wkładek do hodowli tkankowych poprzez zastąpienie plastikowej membrany błoną wykonaną z czystego rekombinowanego, funkcjonalizowanego białka jedwabiu pajęczego. Jedwabna membrana tworzy się w wyniku samoorganizacji i spontanicznie przylega do bezbłonowej wkładki do hodowli tkankowej, gdzie może zapewnić wsparcie dla komórek. Specjalnie zaprojektowane wkładki do kultur tkankowych można wydrukować za pomocą standardowej drukarki 3D, postępując zgodnie z instrukcjami zawartymi w protokole, lub zamiast tego można zakupić i wykorzystać komercyjne. Protokół ten pokazuje, w jaki sposób skonfigurowany jest system hodowli z jedwabnymi membranami we wstawkach, a następnie, w jaki sposób można wdrożyć te same techniki hodowli komórek, które są stosowane w przypadku tradycyjnych, dostępnych na rynku wkładek.
Wprowadzenie
Modele in vitro, które mogą replikować bariery tkankowe, cieszą się coraz większym zainteresowaniem ze względu na ich zastosowanie w testowaniu nowych terapii i ułatwianiu zrozumienia podstawowych mechanizmów chorobowych1,2. Aby dokładnie odtworzyć natywne mikrośrodowisko, konieczne jest podsumowanie funkcji błony podstawnej (BM), wysoce wyspecjalizowanego kompleksu macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM). BM występuje w prawie każdej tkance w ludzkim ciele, gdzie stanowi wsparcie dla komórek śródbłonka i nabłonka oraz oddziela je od leżących pod nimi tkanek2,3. Oprócz zapewnienia wsparcia fizycznego, BM reguluje i utrzymuje również sygnały biochemiczne między komórkami a otaczającymi tkankami. Te istotne funkcje sprawiają, że konieczne jest projektowanie rusztowań, które przypominają konstrukcję, a także cechy mechaniczne i funkcjonalne natywnego BM3.
Jednym z najczęstszych sposobów naśladowania BM in vitro jest użycie dostępnych na rynku wkładek do hodowli tkankowych (TC-inserts). Są to zasadniczo cylindry z tworzywa sztucznego z przepuszczalną membraną, która dzieli komorę na boki wierzchołkowe i podstawno-boczne4,5. Chociaż są łatwe w użyciu, membrany w komercyjnych wkładkach są zazwyczaj sztywne, trawione i wykonane z polimerów, takich jak poli(węglan) (PC) i poli(tereftalan etylenu) (PET)3,4,6. Są elastyczne pod względem średnicy, gęstości porów i rozmiaru i mogą być powlekane w celu zwiększenia przyczepności komórek, ale brakuje im wszystkich innych istotnych cech BM, takich jak porównywalna grubość6, porowatość połączeń, architektura włóknista i odpowiedni moduł sprężystości3.
Standaryzacja wkładek TC i ich łatwość użycia zainspirowały kilka grup, w tym naszą, do zastąpienia plastikowej membrany bardziej podobnym do in vivo odpowiednikiem (omówione w Tabeli 1). Stosowane materiały obejmują polimery, takie jak polidimetylosiloksan (PDMS)7, poli(laktyd-ko-kaprolakton) (PLCL)8 i polikaprolakton (PCL)4,9,10 do materiałów białkowych, takich jak żelatyna2,11,12, collagen5,13 i rekombinowany pajęczy jedwab14,15,16,17. Membrany z tych materiałów zostały przymocowane na różne sposoby, zarówno do dostępnych na rynku wkładów, z których membrana została usunięta4,7,8,10,12,13,14,16,18,19,20,21, a także do specjalnie zaprojektowanych wkładek wyprodukowanych za pomocą druku 3D1,11,15,17,20 lub formowanie wtryskowe9,22. Jednak większość z nich nadal jest daleka od podobieństwa do natywnego BM pod względem grubości, gdzie repliki wahają się od setek11,18 do kilku mikrometrów5,10,14,21,22. Wiele z nich wymaga również złożonych metod tworzenia i/lub ręcznego dołączania1,7,13,14,18,19,21, co sprawia, że skalowanie i replikacja w innych laboratoriach jest wyzwaniem.
Tutaj prezentujemy prostą metodę formowania i dołączania jedwabnej membrany do wkładek oraz pokazujemy, jak hodować komórki po obu stronach membrany. Jedwabne błony powstają w wyniku samoorganizacji białka FN-4RepCT (FN-silk) na granicy ciecz-powietrze stałego roztworu16,17. FN-silk to rekombinacyjnie wyprodukowana krótka wersja Major Ampullulate Spidroin 1 z Euprosthenops australis, funkcjonalizowana motywem RGD pochodzącym z fibronektyny23. Wykazano, że łączy się w matryce fibrylarne, które promują adhezję, wzrost i migrację komórek15,16,17,23,24,25. Metoda mocowania membrany na wkładce opiera się na spontanicznej adhezji i została uznana za odpowiednią dla dostępnych na rynku wkładek, z których membrana została usunięta16, a także drukowanych w 3D wkładek z kwasu polimlekowego (PLA)17 i Dental LT15. W tym artykule szczegółowo opisano, w jaki sposób ta metoda jest stosowana w przypadku wkładek drukowanych z Dental LT. Po przymocowaniu membran FN-silk do wkładek, można je zasadniczo traktować jak standardowe komercyjne wkładki do hodowli tkankowych. Krótko mówiąc, przedstawiamy prostą metodę generowania bardziej odpowiednich modeli in vitro barier tkankowych poprzez zastąpienie membran z tworzywa sztucznego membraną z jedwabiu FN na bazie białka.
Protokół
1. 3D-drukowanie wkładek
- Pobierz plik . Plik projektowy STL (JoVe_Silk_Insert.stl) z pliku uzupełniającego 1.
- Przygotuj pliki do druku, otwierając je w pakiecie oprogramowania przeznaczonym do konwersji pliku . STL do pliku do wydruku używanej drukarki 3D.
- Skorzystaj z dedykowanego oprogramowania, aby dodać podpory. Konstrukcja nośna jest projektowana przez oprogramowanie, a potrzebna ilość będzie zależeć od drukarki i używanego oprogramowania. Ustaw wkładkę tak, aby ani platforma budowlana, ani podpory nie dotykały dna.
- Wydrukuj żądaną liczbę wkładek za pomocą biokompatybilnej żywicy (takiej jak Dental LT lub BioMed) lub filamentu (takiego jak PLA) odpowiedniego dla używanej drukarki 3D.
UWAGA: Upewnij się, że materiał wytrzyma odpowiedni proces sterylizacji, taki jak autoklawowanie, napromieniowanie lub zanurzenie etanolu. - Odłącz wydrukowane wkładki od platformy drukującej i usuń wydrukowaną konstrukcję nośną z gotowej części.
- Jeśli używasz drukarki żywicznej, przetwarzaj wkładki przy użyciu standardowego protokołu dostarczonego przez producenta.
UWAGA: Przetwarzanie może się różnić w zależności od użytej żywicy. Protokół zastosowany dla żywicy użytej w niniejszym dokumencie znajduje się w pliku uzupełniającym 2. - Wysterylizuj wkładki przy użyciu techniki odpowiedniej dla wybranego materiału.
UWAGA: Zalecenia to autoklawowanie, napromienianie lub zanurzanie w 70% etanolu lub ich kombinacji. W przypadku korzystania z drukarki żywicznej może być potrzebny obszerny protokół wypłukiwania, aby osiągnąć optymalną biokompatybilność. Zapoznaj się z protokołem zawartym w pliku uzupełniającym 2 w celu uzyskania zalecenia. - Upewnij się, że wkładki są całkowicie suche i przechowuj je sterylnie do czasu użycia.
2. Tworzenie membran FN-silk
- Napełnij pudełko suchym lodem i włóż je do zamrażarki o temperaturze -80 °C.
- Zebrać fiolki z jedwabiem FN z zamrażarki o temperaturze -80 °C i umieścić je w suchym lodzie na czas transportu. Przynieś fiolki z jedwabiem FN do szafki bezpieczeństwa biologicznego i tam wykonaj dalsze kroki. Umieść fiolki z jedwabiem FN w stojaku na probówki do mikrowirówek, aby rozmroziły się bez nadmiernego dotykania.
- Podczas rozmrażania jedwabiu FN rozpakuj 48-dołkową płytkę. Gdy jedwab FN całkowicie się rozmrozi, przejdź do następnego kroku w ciągu 10 minut, najlepiej jak najszybciej.
- Rozcieńczyć roztwór jedwabiu FN w schłodzonym PBS lub w temperaturze pokojowej do pożądanego stężenia, najlepiej 1,8 mg/ml. Odpipetować 550 μl roztworu jedwabiu FN bezpośrednio na dno pustego dołka na płytce 48-dołkowej. Odpipetować roztwór jedwabiu FN, aż do przygotowania żądanej liczby membran.
UWAGA: Unikaj wprowadzania pęcherzyków powietrza i natychmiast usuń wszelkie pęcherzyki powietrza za pomocą pipety. Nie należy używać studzienek w rzędzie A lub F ani w kolumnie 1 lub 8, ani sąsiednich studzienek (patrz schemat na rysunku uzupełniającym S1). - Umieść pokrywkę na 48-dołkowej płytce i umieść ją w większym, sterylnym pudełku, aby zapewnić sterylne środowisko podczas inkubacji.
- Ostrożnie wyjmij pudełko z szafy bezpieczeństwa biologicznego i pozostaw je na noc w warunkach otoczenia w niezakłóconym miejscu bez znacznego przepływu powietrza.
3. Przyleganie membran FN do wkładek
- Następnego dnia przynieś sterylne wkładki do szafy bezpieczeństwa biologicznego.
- Przynieś duże sterylne pudełko zawierające 48-dołkową płytkę z membranami z jedwabiu FN z powrotem do komory bezpieczeństwa biologicznego i tam wykonaj dalsze kroki. Ostrożnie wyjmij 48-dołkową płytkę z dużego sterylnego pudełka.
- Sprawdź wzrokowo tworzenie się membrany, obserwując zmętnienie w studzienkach i otwórz pokrywę 48-dołkowej płytki zawierającej membrany. Podnieś jedną wkładkę za pomocą sterylnej pęsety i poprowadź wkładkę w dół na membranę, aż uchwyty wkładki dotkną górnej części studzienki, jak pokazano na Rysunek 1. Utrzymuj spód wkładki równolegle do dolnej części płytki.
- Powtarzaj krok 3.3, aż wkładki zostaną opuszczone na wszystkie uformowane membrany. Umieść pokrywkę na wierzchu płytki 48-dołkowej, a następnie włóż płytkę z powrotem do sterylnego pudełka. Pozostaw płytkę w spokoju przez 2 godziny w warunkach otoczenia, aby membrany mogły przylegać do wkładek.
- Podgrzej pożywkę wzrostową lub PBS w temperaturze 37 °C.
- Rozpakuj płytkę 24-dołkową.
- Po upływie 2 godzin wyjmij płytkę 48-dołkową z pudełka i otwórz pokrywę. Za pomocą sterylnej pęsety chwyć wkładkę za uchwyty i wyjmij ją z płytki 48-dołkowej.
- Bezpośrednio po podniesieniu należy napełnić wkład podgrzaną pożywką hodowlaną lub PBS. Użyj 100 μl pożywki hodowlanej, jeśli przystępujesz do siewu po stronie podstawowej lub 200 μl, jeśli przystępujesz do siewu wierzchołkowego. Jeśli membrany mają być przechowywane do późniejszego wykorzystania, należy zamiast tego użyć 200 μl PBS.
PUNKT KONTROLNY: Jeśli ciecz zostanie zatrzymana nad membraną, podnoszenie zakończyło się pomyślnie. Jeśli płyn kapie na ławkę, membrana przecieka i należy ją zignorować. - Umieścić wkładkę w pustym dołku na płytce 24-dołkowej.
- Wyjmij wszystkie wkładki z płytki 48-dołkowej i przenieś je do płytki 24-dołkowej. Napełnij studzienki 1,000 μl pożywki wzrostowej, jeśli przystępujesz do wysiewu komórek lub PBS do przechowywania, trzymając płytkę lekko przechyloną.
UWAGA: Ważne jest, aby krawędź membrany znajdowała się poniżej poziomu cieczy (Rysunek 2). - Jeśli komórki mają być wysiane od razu, przejdź do sekcji 4 lub 5 w zależności od tego, po której stronie błony mają być wysiane komórki. Jeśli nie, przykryj pokrywką płytkę 24-dołkową i umieść ją w lodówce (4 °C) lub w inkubatorze o temperaturze 37 °C. W przypadku umieszczenia w inkubatorze należy uzupełniać PBS co drugi dzień, aby zapewnić utrzymanie wymaganej objętości.
4. Wysiewanie komórek po wierzchołkowej stronie błony
UWAGA: Jeśli membrany były przechowywane w PBS, zastąp PBS wstępnie podgrzaną pożywką hodowlaną, jak opisano w sekcji 6.
- Zbierz komórki. Przygotować zawiesinę komórkową w taki sposób, aby pożądana liczba komórek na błonę była obecna w 20-50 μl zawiesiny. Zawiesić ponownie, aby osiągnąć pożądane stężenie komórek.
- Za pomocą pipety P100 lub P200 odessać 20-50 μl zawiesiny komórek. Kierując końcówkę pipety w kierunku środka membrany, trzymaj końcówkę w odległości 1-2 mm od powierzchni pożywki hodowlanej wewnątrz wkładki i powoli naciskaj tłok pipety, aby utworzyć kroplę na krawędzi końcówki. Doprowadzić kroplę do kontaktu z pożywką hodowlaną wewnątrz wkładu.
UWAGA: Pipetę należy trzymać prostopadle do powierzchni roboczej. - Powtórz krok 4.2 dla pozostałych membran. Ponownie zawiesić zapas komórek po wysianiu pięciu błon, aby zapewnić jednorodną dystrybucję komórek. Przesuń płytkę w kształcie ósemki, aby zapewnić lepsze rozmieszczenie komórek na błonie.
- Hodowlę w warunkach normalnych (37 °C i 5% CO2 ) i zmianę pożywki co drugi dzień.
5. Wysiewanie komórek po podstawowej stronie błony
UWAGA: Jeśli membrany były przechowywane w PBS, zastąp PBS 100 μL wstępnie podgrzanej pożywki i napełnij studzienki 1 ml wstępnie podgrzanej pożywki, jak opisano w sekcji 6.
- Zebrać komórki i przygotować zawiesinę komórkową w taki sposób, aby pożądana liczba komórek na błonę była obecna w 20 μl zawiesiny. Zawiesić ponownie, aby osiągnąć pożądane stężenie komórek.
- Rozpakuj i otwórz pokrywę szalki Petriego. Upewnij się, że wysokość szalki Petriego jest wystarczająca, aby pomieścić wkładki tak, aby ich dno nie dotykało pokrywy.
- Za pomocą pęsety wyjmij wkładkę z płytki 24-dołkowej, pozostawiając pożywkę hodowlaną w dołkach. Używając zestawu pęset w każdej ręce, odwróć wkładkę tak, aby strona podstawowa była skierowana do góry, a strona wierzchołkowa skierowana w stronę obszaru roboczego. Umieść odwróconą wkładkę na szalce Petriego, jak w Rysunek 3C. Powtórz dla pozostałych inserts.
UWAGA: Nie usuwaj pożywki hodowlanej od strony wierzchołkowej. Utrzyma membranę mokrą podczas inkubacji. - Zawiesić zapas komórek, aby zapewnić równomierne rozprowadzenie komórek w roztworze, i odessać 20 μl zawiesiny komórek za pomocą pipety P100 lub P200. Kierując końcówkę pipety w stronę środka membrany, trzymaj końcówkę w odległości 1-2 mm od membrany i powoli naciskaj tłok pipety, aby utworzyć kroplę na krawędzi końcówki. Pipetę należy trzymać prostopadle do powierzchni membrany i pozwolić, aby kropla opadła na membranę. Powtórz dla pozostałych membran.
UWAGA: Ponownie zawiesić zapas komórek po wysianiu pięciu błon, aby zapewnić równomierne rozprowadzenie komórek. - Nałożyć pokrywkę na szalkę Petriego, przenieść szalkę Petriego i płytkę 24-dołkową do inkubatora i inkubować płytki z komórkami w normalnych warunkach (37 °C i 5 % CO2 ) przez 30 minut.
- Umieścić 24-dołkową płytkę zawierającą pożywkę hodowlaną i szalkę Petriego do biologicznie bezpiecznej szafki. Otwórz obie pokrywki i używając zestawu pęsety w każdej ręce, podnieś jedną wkładkę i odwróć ją tak, aby wierzchołkowa strona błony była teraz skierowana do góry, a strona podstawowa do dołu.
- Za pomocą pipety P200 dodaj 200 μl pożywki hodowlanej do wkładki. Umieść wkładkę w jednym z wstępnie wypełnionych dołków 24-dołkowej płytki i powtórz dla pozostałych membran.
- Hodowlę w warunkach normalnych (37 °C i 5% CO2 ) i zmianę pożywki co drugi dzień.
6. Średnia zmiana kultur w warunkach zanurzenia
- Przygotuj nową 24-dołkową płytkę ze świeżą pożywką hodowlaną, dodając 1 000 μl/basenik. Za pomocą pęsety wyjmij jedną wkładkę z płytki 24-dołkowej, lekko ją przechyl i usuń podłoże od strony wierzchołkowej.
- Do wkładu dodać 200 μl świeżej pożywki hodowlanej. Umieść wkładkę w studzince, która jest wstępnie wypełniona świeżą pożywką hodowlaną. Powtórz dla wszystkich membran.
7. Średnia zmiana kultur w warunkach transportu powietrznego
- Za pomocą pęsety podnieś wkładkę i umieść ją w pustym dołku na 24-dołkowej płytce. Powtórz dla czterech kolejnych membran.
- Lekko przechylić 24-dołkową płytkę i powoli dodać 1 000 μl świeżej pożywki hodowlanej do każdej płytki. Powtórz dla pozostałych membran.
8. Pomiar przeznabłonkowego oporu elektrycznego (TEER)
- Przygotować 24-dołkową płytkę z 1 000 μl pożywki hodowlanej lub PBS wewnątrz studzienek i przenieść do niej membrany. Upewnij się, że nad membraną znajduje się 200 μl odpowiedniego roztworu.
- Za pomocą zestawu pęsety dobrze ustabilizuj wkładkę wewnątrz płytki, delikatnie naciskając na ramiona wkładki. Nie wyjmując pęsety, włóż elektrodę TEER do studzienki i zapisz pomiar.
- Wyjmij elektrodę, a następnie podnieś pęsetę.
- Powtórz kroki 8.2-8.3 dla pozostałych membran.
Wyniki
Reprezentatywne zdjęcia wkładów
Zdjęcia wkładów przed i po zdjęciu z platformy drukującej przedstawiono na Rysunku 3A,B. Obraz gotowego wkładu po usunięciu struktur wspierających przedstawiono na Rysunku 3C. Wynikiem jest partia wydrukowanych w 3D wkładów, gotowych do sterylizacji i dalszego użycia.
Podnoszenie i obchodzenie się z membranami FN-silk
Ogólny schemat formowania membrany FN-silk oraz jej ręcznego podnoszenia przedstawiono na Rysunku 1. Wynikiem są inserty z przytwierdzoną membraną FN-silk. Aby zapewnić najwyższy wskaźnik sukcesu w podnoszeniu nienaruszonych membran, należy ściśle przestrzegać kroków opisanych w protokole. Rysunek 4 przedstawia zdjęcia membrany nienaruszonej (A,D) oraz po rozerwaniu (B,E,F>). Rozdarcie można zwizualizować za pomocą mikroskopii w polu jasnym (Rysunek 4E,F) i/lub poprzez wyciekanie cieczy przez membranę (Rysunek 4B). Ważne jest, aby podnosić i opuszczać inserty prostopadle do membrany, aby zapewnić równomierne przyleganie membrany i jej rozciąganie pod insertami. Adhezję membrany można zaobserwować wizualnie, jak pokazano na Rysunku 4A. Jeśli insert zostanie opuszczony zgodnie z instrukcją, a poziomy cieczy zostaną utrzymane zgodnie z Rysunkiem 2, membrana pozostanie przytwierdzona do insertu przez długie okresy hodowli.
W niniejszej pracy przyleganie błony do wkładki zostało zwalidowane poprzez przeprowadzenie eksperymentu z przenikaniem15,16,17 na błonach, które były przechowywane w standardowych warunkach hodowli komórkowej przez 9 dni. W skrócie, po dodaniu cząsteczki fluorescencyjnej na górną stronę błony i pomiarze sygnału w roztworze poniżej, profil przenikania błon jedwabnych odpowiadał profilowi dostępnej komercyjnie wkładki do hodowli tkanek (Rysunek 4C), nie wykazując żadnych przecieków w ciągu 36 h przenikania, co wskazuje, że błona pozostaje nienaruszona i przytwierdzona do wkładki. Podobne eksperymenty były wcześniej przeprowadzane z komórkami wysianymi na jedną15 lub obie strony błony jedwabnej17. Wytrzymałość adhezji wykazano wcześniej za pomocą makroindentacji16 oraz testów nadmuchiwania16,17. W ramach eksperymentów z makroindentacją wykorzystano rylec do rozciągnięcia błony, która pękła pod wpływem siły 1,4 mN, pozostając przy tym przytwierdzoną do wkładki16.
Należy zauważyć, że skuteczność podnoszenia nienaruszonych błon zależy od materiału oraz obróbki wkładów po druku. Przy zastosowaniu niniejszego protokołu 95% błon podniesionych przy użyciu wkładów wydrukowanych z zastosowanej żywicy nadawało się do wysiewu komórek, w porównaniu z 74% w przypadku użycia żywicy porównywalnej. Przypuszczamy, że adhezja jest wspomagana przez oddziaływania hydrofobowe oraz siły van der Waalsa, zatem zmiana właściwości materiału wpływa na siłę adhezji. Potwierdza to fakt, że błony nie przylegają dobrze do materiałów hydrofilowych (dane nie przedstawiono).
Reprezentatywne wyniki hodowli komórkowej na membranach z jedwabiu z FN
Obrazy immunofluorescencyjne keratynocytów (HaCaT) hodowanych na stronie apikalnej lub bazalnej membrany przedstawiono na Rysunku 5. Zaobserwowano, że przylegające komórki (Rysunek 5D.i) równomiernie pokrywały obszar hodowli w 1. dniu, wykazując typową dla keratynocytów morfologię brukowaną (Rysunek 5A.i-B.i). W 3. dniu keratynocyty utworzyły warstwę konfluencyjną (Rysunek 5A.ii-B.ii) oraz sieć połączeń ścisłych (Rysunek 5D.ii), co wskazuje na przejmowanie przez nie fizjologicznych funkcji nabłonkowych. Wysoki poziom żywotności komórek osiągnięty w macierzach z jedwabiu z FN15,17,23,24 odnotowano również w opisanym tutaj układzie hodowli z wkładką z membrany jedwabnej. Po 3 dniach hodowli keratynocyty pozostały wysoce żywotne (Rysunek 5C.i-iv). Dodatkowo nie zaobserwowano różnic w rozkładzie martwych komórek pomiędzy centrum (Rysunek 5C.i-ii) a obwodem membrany (Rysunek 5C.iii-iv), co wykazuje brak istotnego wpływu materiału wkładki na żywotność HaCaT. Ogólnie system hodowli z wkładką jedwabną zapewnił podobną (Rysunek 5i-ii, v-vi) lub nawet lepszą (Rysunek 5iii-iv, vii-viii) żywotność keratynocytów w porównaniu z komercyjnym systemem z wkładką z membrany PET.
Rycina 1: Szczegółowa ilustracja formowania i podnoszenia pojedynczych membran FN-jedwabnych. (A) Napełnij co drugą studnijkę (omijając zewnętrzne rzędy i kolumny) w płytce 48-dołkowej roztworem białka FN-jedwabnego, w którym (B) przez noc dochodzi do samoorganizacji membrany na granicy fazy ciecz-powietrze. (C) Chwyć wkładkę pęsetą i powoli opuść ją na membranę, korzystając z (D,E) prowadnic wydrukowanego w technologii 3D wkładu, aby upewnić się, że wkładka jest opuszczana prostopadle do membrany. Powiększenie adhezji membrany jedwabnej przedstawiające przekrój poprzeczny wkładki (F) bezpośrednio nad membraną oraz (G) w momencie kontaktu z membraną jedwabną. W ciągu 2 h inkubacji (H) membrana jedwabna spontanicznie przyczepia się do wkładki, która następnie jest (I) użyta do podniesienia membrany z granicy faz. Skróty: FN = fibronektyna; PBS = roztwór soli fizjologicznej buforowany fosforanowo. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rycina 2Szczegółowa ilustracja przedstawiająca sposób postępowania z membraną FN-silk po podniesieniu jej z płytki formującej. (A) Wkładka (szara) z membraną (fioletową) bezpośrednio po uniesieniu. (B) Płyn (niebieski) dodaje się po stronie apikalnej membrany, która następnie zostaje umieszczona w (Cpłyta 24-dołkowa, w której dłuższa część ramion wkładki opiera się o ścianki, a krótsza część utrzymuje wkładkę w pozycji centralnej w obrębie dołka.D) Do dołka dodaje się ciecz, upewniając się, że poziom cieczy jest wyrównany i znajduje się powyżej krawędzi membrany. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rysunek 3: Zdjęcia wkładek wydrukowanych w 3D. (A) Wkładki bezpośrednio po wyjęciu z drukarki 3D, wciąż przymocowane do platformy roboczej.(B) Jedna wkładka po zdjęciu z platformy roboczej, przed usunięciem struktur wsporczych. (C) Jedna wkładka po usunięciu struktur wsporczych. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.
Rysunek 4: Błona z FN-silk przed i po przerwaniu. (A) Zdjęcie nienaruszonej błony z 200 µL zabarwionego (na niebiesko) PBS po stronie apikalnej. Krawędź błony owinięta wokół insertu zaznaczono białymi strzałkami. (B) Zdjęcie tej samej błony po przerwaniu. PBS wycieka przez błonę. (C) Wykres przedstawiający przenikanie fluorescencyjnej cząsteczki o masie 3 kDa w ciągu 36 h przez błonę jedwabną lub dostępną komercyjnie błonę PET, utrzymywaną w standardowych warunkach hodowli komórkowej przez 9 dni. (D) Obraz w polu jasnym błony przed przerwaniem. (E) Obraz w polu jasnym tej samej błony po przerwaniu. Obszar uszkodzony zaznaczono niebieską przerywaną linią. (F) Powiększony widok przerwania pokazanego na D, gdzie krawędź przerwanej błony zaznaczono niebieskimi strzałkami. Paski skali = 1 mm (D,E), 200 µm (F). Skróty: FN = fibronektyna; PBS = roztwór soli fizjologicznej buforowany fosforanowo; PET = poli(tereftalan etylenu). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Rycina 5: Keratynocyty (HaCaT) hodowane na membranie FN-silk. W dniu 1. keratynocyty przywarły i równomiernie pokryły powierzchnię membrany po stronie apikalnej (A.i) lub bazalnej (B.i) (falloidyna, kolor zielony). W dniu 3. utworzyła się konfluentna monowarstwa po stronie apikalnej (A.ii) lub bazalnej (B.ii) (falloidyna, kolor zielony). (C) Ocena żywotności komórek na membranie jedwabnej (i-iv) w porównaniu z komercyjną membraną PET (v-viii) w centrum (i, ii, v, vi) i na peryferiach (iii, iv, vii, viii) warstwy komórkowej. Żywe komórki zaznaczono na zielono (i, iii, v, vii), a martwe komórki na czerwono (i, iii, v, vii) lub biało (ii, iv, vi, viii). Linia przerywana oznacza interfazę membrana-wkład. (D) Powiększony detal, (i) wskazujący (białe strzałki) adhezję komórek do membrany (falloidyna, kolor biały) oraz(ii) sieć połączeń ścisłych utworzoną po 3 dniach hodowli (ZO-1, kolor biały). Paski skali = 1 mm (górny rząd: A,B), 100 µm (dolny rząd: A,B,Ci, ii, v, vi), 500 µm (C iii, iv, vii, viii), 50 µm (D). Aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny, kliknij tutaj.
Tabela 1: Przegląd wcześniejszych prac, w których membrany zostały zintegrowane z wkładkami do hodowli komórkowych. Skróty: PCL = polikaprolakton; PEGDA = diakrylan poli(glikolu etylenowego); PLGA = poli(mleczan-co-kwas glikolowy); PDMS = polidimetylosiloksan; PC = poliwęglan; RSS = rekombinowane białko jedwabiu pajęczego; PLCL = poli(laktydo-ko-kaprolakton); RHSIF = rekombinowane białka filamentów pośrednich śluzu mięczaka Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać tę tabelę.
Tabela 2: Przegląd poprzednich prac podsumowujący różne typy komórek hodowlanych na membranach z FN-silk.FN-4repCT (FN-silk) to krótka wersja jedwabiu z nici pompowych Euprosthenops australis, produkowana rekombinacyjnie i funkcjonalizowana motywem RGD z fibronektyny na poziomie genetycznym. Białko to jest wykorzystywane we wszystkich przypadkach podsumowanych w niniejszym zestawieniu. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.
Tabela 3: Rozwiązywanie problemów. Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać tę tabelę.
Plik uzupełniający 1: Plik projektowy (.stl) do druku 3D wkładów. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.
Plik uzupełniający 2: Protokół drukowania, obróbki końcowej i sterylizacji przy użyciu drukarki i żywicy określonych w Tabeli Materiałów. Proszę kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.
Rycina dodatkowa S1: Schemat sugerowanego wzoru rozmieszczenia roztworu FN-silk na płytce 48-dołkowej. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.
Dyskusja
Opisany w niniejszym dokumencie protokół przedstawia prosty sposób wytwarzania biologicznie istotnych wkładów do hodowli komórkowych. Zaczyna się od wydrukowania wkładek, następnie formowania i mocowania błon z jedwabiu FN, a kończy się pokazaniem, w jaki sposób komórki mogą być wysiewane zarówno po wierzchołkowej, jak i podstawowej stronie błony. W tym protokole jest jeden naprawdę krytyczny krok, aby zapewnić długoterminowy sukces w hodowlach komórkowych, a jest nim opuszczanie i podnoszenie wkładek na membranę. Pomyślne wykonanie tych etapów pozwoli na uzyskanie systemu hodowli z wkładką z jedwabną membraną, który będzie w stanie wytrzymać hodowlę komórkową podobnie jak dostępne na rynku systemy z membranami syntetycznymi. Aby to zapewnić, po bokach specjalnie zaprojektowanych wkładów zastosowano prowadnice, aby zapobiec ich opuszczaniu pod kątem lub przesuwaniu się na boki w studni, co prowadziłoby do nierównomiernego przylegania membrany, generując słabe punkty, a następnie przeciekanie. Często zdarza się, że drobne problemy pojawiają się podczas przestrzegania protokołu po raz pierwszy. Aby pomóc nowemu użytkownikowi w ich obejściu, jeśli napotka je podczas postępowania zgodnie z powyższym protokołem, w Tabeli 3 przedstawiliśmy potencjalne problemy i ich rozwiązania.
Wykazano, że sama błona jest korzystna dla modelowania różnych tkanek barierowych (omówionych w Tabeli 2); Należy jednak podkreślić, że żywica użyta do wydrukowania wkładek nie została dokładnie przetestowana pod kątem jej wpływu na żywotność innych typów ogniw. Chociaż do tej pory nie spotkaliśmy się z takimi problemami, możliwe jest, że żywica może negatywnie wpłynąć na żywotność i wzrost niektórych wrażliwych komórek. W związku z tym zaleca się przeprowadzenie testu żywotności podobnego do przedstawionego tutaj w celu sprawdzenia kompatybilności żywicy z każdym zastosowanym typem ogniwa. W przypadku wystąpienia cytotoksyczności należy ustanowić dokładniejszy protokół utwardzania i/lub wymywania w celu zapobieżenia wypłukiwaniu nieutwardzonych monomerów z czasem i uszkodzeniu komórek. Przykład takiego protokołu, który został użyty do wydrukowania wkładek w ramach tego protokołu, można znaleźć w pliku uzupełniającym 2. Protokół ten był wcześniej stosowany do przygotowania wkładek do hodowli śródbłonka mózgu bEnd.3 na błonach jedwabnych przez okres do 8 dni15.
Główną zaletą metody przedstawionej w tej pracy jest to, że oferuje ona prosty sposób na zastąpienie obecnych plastikowych membran we wkładkach do hodowli tkankowych, a tym samym ulepszenie statycznych modeli hodowli tkankowych. Głównym ograniczeniem jest to, że użytkownik musi mieć dostęp do sprzętu do druku 3D lub wykupić czas w zakładzie na wydrukowanie swoich wkładek. Jednak w razie potrzeby można to obejść, stosując komercyjne wkładki do kultur tkankowych po usunięciu ich błon. Ponadto, chociaż membrany jedwabne mogą być zasadniczo używane jako zwykłe wkładki do kultur tkankowych, są cieńsze i mają skład białkowy, a zatem są bardziej wrażliwe niż ich obecne syntetyczne odpowiedniki komercyjne. W związku z tym wymagają one ostrożniejszego obchodzenia się z nimi przez użytkowników i muszą być mokre, aby zachować ich elastyczność. Należy zauważyć, że membrany wytrzymują rozciąganie i nadmuchiwanie16,17, dzięki czemu nadają się na przykład do naśladowania ruchu oddechowego. Mimo to prawdopodobne jest, że nowi użytkownicy uszkodzą niektóre membrany na początkowych etapach, ale wraz ze wzrostem ich doświadczenia w obsłudze membran oczekuje się, że wskaźnik sukcesu wzrośnie. Jeśli problemy nie ustąpią, użytkownik powinien zapoznać się z Tabelą 3 w celu rozwiązania problemu.
W ciągu ostatniej dekady przedstawiono kilka alternatyw dla komercyjnych wkładek z tworzywa sztucznego (tabela 1) i za każdym razem, gdy porównywano wydajność kultur komórkowych, nowe, bardziej istotne biologicznie membrany dawały lepsze wyniki niż ich komercyjne odpowiedniki z tworzyw sztucznych 2,5,6,7,14,22 . Zaobserwowano to przede wszystkim pod względem wzmocnionej funkcji bariery 2,5,6,7,14,22, ale także w tworzeniu bardziej natywnego wzrostu komórek14 i zwiększonych interakcjach przez błonę w systemach kohodowli7. Trend ten zaobserwowano już wcześniej w przypadku błon FN-silk przy ustalaniu modelu ściany naczynia krwionośnego. W tym badaniu HDMEC i komórki mięśni gładkich (SMC) hodowano po przeciwnych stronach błony. Wykazano, że SMC wydzielają grubszy ECM podczas jednoczesnej hodowli z HDMEC na membranach FN-silk w porównaniu z komercyjnymi membranami PET. Podobnie, HDMEC ustanowił ściślejszą barierę na membranach FN-silk17. Lepsze wyniki hodowli komórkowych są prawdopodobnie spowodowane poprawą komunikacji komórkowej i warunkami hodowli podobnymi do in vivo. Membrana FN-silk jest znacznie bliższa natywnej BM pod względem grubości, struktury i właściwości mechanicznych. Natywny BM ma grubość od 20 nm do 3 μm22, membrany PET 10 μm, a membrany FN-silk około 1 μm, co dobrze mieści się w zakresie natywnym. Struktura membrany FN-silk jest również nanofibrylarna16, podobnie jak natywna BM22, podczas gdy membrana PET składa się z tworzywa sztucznego z wytrawionymi torami porami, zwykle o średnicy od 0,4 μm do 8 μm7. Membrany PET są również znacznie sztywniejsze niż BM, mają moduł Younga około 2 GPa, w porównaniu do BM, który waha się od kPa do MPa, ale zwykle podaje się go w okolicach 250-500 kPa22. Membrany FN-silk mają moduł Younga wynoszący 115 kPa16, który mieści się w warunkach natywnych. Należy również zauważyć, że gdy komórki rosną na błonie, ich siła staje się czynnikiem dominującym, a nie sama błona17. Na koniec należy również zauważyć, że zintegrowana funkcjonalizacja białka jedwabiu FN zapewnia, że komórki przylegają bezpośrednio do błony i jako takie powłoka nie będzie konieczna. W przypadku membran PET często standardowym jest powlekanie białkiem ECM w celu zapewnienia prawidłowej adhezji komórek7.
Porównując membranę FN-silk z innymi podejściami stosowanymi w celu zastąpienia membrany PET (omówioną w tabeli 1), główną zaletą naszej metody jest zastosowanie rekombinacyjnie wytwarzanego funkcjonalizowanego białka jedwabiu. Zapewnia to powtarzalność i określone warunki hodowli w przeciwieństwie do innych materiałów pochodzenia zwierzęcego opartych na białku, takich jak kolagen. Należy ponownie zauważyć, że funkcjonalizacja białka zapewnia, że nie są potrzebne żadne powłoki, ponieważ komórki dobrze przylegają do błon, tak jakto jest 17. Co więcej, opisana tutaj produkcja membran na bazie jedwabiu opiera się na samoorganizacji i nie wymaga skomplikowanej konfiguracji ani stosowania ostrych chemikaliów, w przeciwieństwie do wielu innych technik, które opierają się na przykład na elektroprzędzeniu. Spontaniczne przyleganie membrany do wkładu eliminuje również potrzebę ręcznej obsługi związanej z wkładkami dwuczęściowymi, klejeniem i silikonowymi pierścieniami montażowymi, upraszczając w ten sposób skalowanie i umożliwiając łatwą odtwarzalność w każdym laboratorium. Oprócz łatwej produkcji, nasza metoda jest łatwa do dostosowania do eksperymentalnych potrzeb użytkownika, ponieważ można stosować różne materiały wkładek, a grubość membrany można dostosować, dostosowując stężenie jedwabiu w roztworze początkowym16. Wreszcie, protokół ten może zapewnić, zgodnie z naszą wiedzą, najcieńszą jak dotąd, wolnostojącą membranę przymocowaną do wkładki do hodowli tkankowej, co pozwala na najściślejsze podobieństwo do natywnej błony podstawnej.
Przedstawiony tutaj protokół tworzenia i obchodzenia się z jedwabną membraną jest prosty w użyciu dla każdego, kto jest przyzwyczajony do pracy z wkładkami do hodowli tkankowych w laboratorium hodowli komórkowych. Jest to prosty sposób na odejście od membran z tworzywa sztucznego na rzecz ich odpowiedników bardziej zbliżonych do in vivo, co pozwala na generowanie bardziej odpowiednich modeli tkanek przy użyciu różnych typów komórek (tabela 2). Błony jedwabne mogą wspierać hodowlę komórkową po ich wierzchołkowej lub podstawowej stronie, a także kohodowle różnych typów komórek obustronnie17. Modele tkanek barierowych opracowane na membranach jedwabnych mogą być wykorzystywane do tego samego zakresu zastosowań, co wkładki do kultur tkankowych, w tym do badań przesiewowych leków oraz badań nad przenikaniem i infekcjami. W przypadkach, w których interesujący jest przesłuch między różnymi typami komórek, wykazano, że przewyższają one wstawki TC ze względu na ich właściwości bardziej podobne do in vivo 17.
Oświadczenia
L.G. pracuje dla Spiber Technologies AB, firmy produkującej białko jedwabiu FN, a M.H. ma udziały w Spiber Technologies AB.
Podziękowania
Autorzy chcieliby podziękować firmie Spiber Technologies AB za dostarczenie rekombinowanego, funkcjonalizowanego białka jedwabiu pajęczego oraz Eline Freeze za wydrukowanie dużej części drukowanych w 3D wkładek.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| CHEMICALS | |||
| Alexa Fluor 488 | Invitrogen; Thermo Fisher Scientific | A-21121 | Kozia anty-mysz, Rozcieńczenie 1:500 |
| Alexa Fluor 488 Phalloidin | Invitrogen; Thermo Fisher Scientific | A12379 | Rozcieńczenie 1:400 |
| przeciwciało anty-ZO-1 (1A12) | Invitrogen; Thermo Fisher Naukowy | 33-9100 | Mysi anty-ludzki, monoklonalny, Rozcieńczenie 1:200 |
| Dekstran, Alexa Fluor 680; 3,000 MW, Anionowy | invitrogen; Thermo Fisher Scientific | D34681 | Rozcieńczony 2,5% (w/v) w 200 ul pożywki hodowlanej |
| DMEM/F-12 | Gibco; Thermo Fisher Scientific | 31330095 | Uzupełniony o 5% v/v FBS i 1% v/v Penicylina-Streptomycyna |
| Etanol | Solveco | 1326 | 70% (nr CAS 64-17-5) |
| Płodowa surowica bydlęca, kwalifikowana, inaktywowana termicznie, Stany Zjednoczone | Gibco; Thermo Fisher Scientific | 16140071 | |
| FN-silk | Spiber technologies AB | Sklep w temperaturze -80 & stopni; C | |
| Izopropanol, odczynnik analityczny EMPARTA ACS | Supelco | 1096342511 | ≥ 99,5% (nr CAS 67-63-0) |
| Żywy/martwy żywotność/cytotoksyczność Zestaw | Invitrogen; Thermo Fisher Scientific | L3224 | |
| PBS | Szwedzka Agencja Weterynaryjna / Statens veterinä rmedicinska anstalt | 992420 | bez Ca i Mg, przefiltrowana |
| penicylina-streptomycyna (10 000 U/ml) | Gibco; Thermo Fisher Scientific | 11548876 | |
| MATERIAL | |||
| Dental LT Clear Resin | Denthouse | #DLCL-01 | |
| Komórki HaCaT | CLS | 300493 | |
| Nunc Hodowla komórkowa Multinaczynia 24-dołkowe | Fisher Scientific | 10604903 | |
| Nunc Multidish poddane hodowli komórkowej 48- wel | Fisher Scientific | 10644901 | |
| TC wkładka, do płytek 24-dołkowych, PET, przezroczysta | Sarstedt | 83.3932.041 | wielkość porów: 0,4 i mikro; m |
| Wkładki do hodowli komórkowych ThinCert, membrana półprzezroczysta (PET) | Greiner | 662640 | wielkość porów: 0,4 i mikro; |
| mSPRZĘT | |||
| EVOM miernik z pałeczkami | World Precision Instruments (WPI) Niemcy, GMBH | ||
| Form 3B | FormLabs | ||
| Form Wash | FormLabs | ||
| Form Cure | FormLabs | ||
| Isotemp General Purpose Deluxe Water Baths | Fisherbrand | ||
| Odwrócony mikroskop fluorescencyjny Eclipse Ti | Nikon | ||
| Odwrócony mikroskop fluorescencyjny DMI6000 B | Okap | ||
| Ninosafe, klasa II | Labolutions | ||
| Midi CO2 Inkubator, 40 L | Thermo Scientific |
Bibliografia
- Kumar, P., Kedaria, D., Mahapatra, C., Mohandas, M., Chatterjee, K. A designer cell culture insert with a nanofibrous membrane toward engineering an epithelial tissue model validated by cellular nanomechanics. Nanoscale Adv. 3 (16), 4714-4725 (2021).
- Wang, Y., et al. Ultrathin and handleable nanofibrous net as a novel biomimetic basement membrane material for endothelial barrier formation. Colloids Surf B Biointerfaces. 219, 112775(2022).
- Jain, P., Rauer, S. B., Möller, M., Singh, S. Mimicking the natural basement membrane for advanced tissue engineering. Biomacromolecules. 23 (8), 3081-3103 (2022).
- Eom, S., Park, S. M., Han, S. J., Kim, J. W., Kim, D. S. One-step fabrication of a tunable nanofibrous well insert via electrolyte-assisted electrospinning. RSC Advances. 7 (61), 38300-38306 (2017).
- Kim, D., Eom, S., Park, S. M., Hong, H., Kim, D. S. A collagen gel-coated, aligned nanofiber membrane for enhanced endothelial barrier function. Sci Rep. 9 (1), 1-11 (2019).
- Ebrahim, N. A., et al. Porous honeycomb film membranes enhance endothelial barrier integrity in human vascular wall bilayer model compared to standard track-etched membranes. J Biomed Mater Res A. 111 (5), 701-713 (2023).
- Zakharova, M., et al. Transwell-integrated 2 µm thick transparent polydimethylsiloxane membranes with controlled pore sizes and distribution to model the blood-brain barrier. Advanced Materials Technologies. 6 (12), 2100138(2021).
- Park, S., et al. Use of elastic, porous, and ultrathin co-culture membranes to control the endothelial barrier function via cell alignment. Advanced Functional Materials. 31 (9), 2008172(2021).
- Youn, J., et al. Facile and adhesive-free method for bonding nanofiber membrane onto thermoplastic polystyrene substrate to fabricate 3D cell culture platforms. Materials Today Bio. 20, 100648(2023).
- Liu, H., et al. Electrohydrodynamic jet-printed ultrathin polycaprolactone scaffolds mimicking Bruch’s membrane for retinal pigment epithelial tissue engineering. Int J Bioprint. 8 (3), 550(2022).
- Dogan, A. A., Dufva, M. Customized 3D-printed stackable cell culture inserts tailored with bioactive membranes. Sci Rep. 12 (1), 1-12 (2022).
- Rohde, F., Danz, K., Jung, N., Wagner, S., Windbergs, M. Electrospun scaffolds as cell culture substrates for the cultivation of an in vitro blood–brain barrier model using human induced pluripotent stem cells. Pharmaceutics. 14 (6), 1308(2022).
- Slater, S. C., et al. An in vitro model of the glomerular capillary wall using electrospun collagen nanofibres in a bioartificial composite basement membrane. PLoS ONE. 6 (6), e20802(2011).
- Harris, T. I., et al. Utilizing recombinant spider silk proteins to develop a synthetic Bruch’s membrane for modeling the retinal pigment epithelium. ACS Biomater Sci Eng. 5 (8), 4023-4036 (2019).
- Hjelm, L. C., Hedhammar, M., Löfblom, J. In blood–brain barrier model based on recombinant spider silk protein nanomembranes for evaluation of transcytosis capability of biomolecules. Biochem Biophys Res Commun. 669, 77-84 (2023).
- Gustafsson, L., et al. Recombinant spider silk forms tough and elastic nanomembranes that are protein-permeable and support cell attachment and growth. Advanced Functional Materials. 30 (40), 2002982(2020).
- Tasiopoulos, C. P., Gustafsson, L., Van Der Wijngaart, W., Hedhammar, M. Fibrillar nanomembranes of recombinant spider silk protein support cell co-culture in an in vitro blood vessel wall model. ACS Biomater Sci Eng. 7 (7), 3332-3339 (2021).
- Marino, A., Baronio, M., Buratti, U., Mele, E., Ciofani, G. Porous optically transparent cellulose acetate scaffolds for biomimetic blood-brain barrier in vitro models. Front Bioeng Biotechnol. 9, 630063(2021).
- Schramm, R. A., Koslow, M. H., Nelson, D. A., Larsen, M., Castracane, J. A novel impedance biosensor for measurement of trans-epithelial resistance in cells cultured on nanofiber scaffolds. Biosensors. 7 (3), 35(2017).
- Qi, D., et al. Establishment of a human iPSC- and nanofiber-based microphysiological blood-brain barrier system. ACS Appl Mater Interfaces. 10 (26), 21825-21835 (2018).
- Rickabaugh, E., Weatherston, D., Harris, T. I., Jones, J. A., Vargis, E. Engineering a biomimetic in vitro model of Bruch’s membrane using hagfish slime intermediate filament proteins. ACS Biomater Sci Eng. 9 (8), 5051-5061 (2023).
- Choi, J. W., Youn, J., Kim, D. S., Park, T. E. Human iPS-derived blood-brain barrier model exhibiting enhanced barrier properties empowered by engineered basement membrane. Biomaterials. 293, 121983(2023).
- Widhe, M., Shalaly, N. D., Hedhammar, M. A fibronectin mimetic motif improves integrin mediated cell biding to recombinant spider silk matrices. Biomaterials. 74, 256-266 (2016).
- Johansson, U., et al. Assembly of functionalized silk together with cells to obtain proliferative 3D cultures integrated in a network of ECM-like microfibers. Sci Rep. 9 (1), 1-13 (2019).
- Widhe, M., Johansson, U., Hillerdahl, C. O., Hedhammar, M. Recombinant spider silk with cell binding motifs for specific adherence of cells. Biomaterials. 34 (33), 8223-8224 (2013).
Przedruki i uprawnienia
