Ten artykuł szczegółowo opisuje projekt, montaż i protokół dla automatycznego systemu karmienia wraz z alternatywną modyfikacją pokrywy i klatki, która może być zaimplementowana na standardowych klatkach dla gryzoni z minimalnymi modyfikacjami dla eksperymentów optogenetycznych lub fotometrii światłowodowej na uwięzi. System żywienia oferuje ekonomiczne narzędzie do karmienia w czasie i/lub ograniczania kalorii.
Artykuł metodologiczny
System "zrób to sam" do planowego karmienia gryzoni laboratoryjnych w ich domowej klatce
* These authors contributed equally
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Przerywany post i badania nad wpływem czasowego ograniczenia kalorii na regulację masy ciała i wyniki starzenia się zyskują na popularności, zarówno w społeczeństwie, jak i w laboratorium. Aby zbadać ograniczone czasowo karmienie i/lub ograniczenie kalorii w laboratorium, przydzielone ilości pokarmu są rozdzielane w zaplanowanych odstępach czasu. Obecna technologia planowego karmienia gryzoni obejmuje albo specjalistyczne klatki z bramkowanymi portami wejściowymi do żywności, cyfrowe zbiorniki z blokadą czasową, albo ręczne dostarczanie żywności. Specjalistyczny sprzęt do takich eksperymentów może być kosztowny, a ręczne karmienie często wymaga od badaczy przychodzenia późno w nocy/wczesnym rankiem, co wyklucza długotrwałe badania. Opisany tutaj zautomatyzowany system żywienia zapewnia ekonomiczne narzędzie do karmienia w czasie i/lub ograniczania kalorii, które można wdrożyć w standardowych klatkach dla gryzoni przy minimalnych modyfikacjach. Protokół wykorzystuje gotowy automatyczny podajnik, który jest wyposażony w standardową pokrywę klatki z mikroizolatorem (pokrywy klatki dla myszy, chomika, szczura lub świnki morskiej) i może podawać żądane przydziały pokarmu w zaprogramowanych odstępach czasu w klatce domowej zwierzęcia. Nasza konstrukcja może być modyfikowana, aby akceptować różne podajniki lub niewielkie różnice w wymiarach klatki. Zapewniamy projekt, montaż i protokół systemu karmienia wraz z alternatywną modyfikacją pokrywy i klatki do eksperymentów optogenetycznych na uwięzi lub fotometrii światłowodowej.
Wprowadzenie
Przerywany post jest ważnym obszarem badań nad metabolizmem i starzeniem się. Właściwe dostosowanie żywienia i rytmu okołodobowego może zmienić wpływ diety na masę ciała1,2,3,4. Co więcej, przedłużony post przerywany wiąże się ze zwiększoną długowiecznością i poprawą zaburzeń związanych z wiekiem5,6,7,8. Badania naukowe wdrażające protokoły długotrwałego postu (>20 dni) zazwyczaj wymagają specjalistycznego sprzętu. Chociaż możliwe jest ręczne dostarczanie żywności w przypadku zaplanowanych protokołów karmienia, może to wymagać obecności badacza w wielu punktach czasowych poza godzinami pracy przez dłuższy czas. Na przykład trzy pory karmienia, które są oddalone od siebie o 4 godziny, wymagałyby ręcznej dostawy o 20:00, 12:00 i 4:00; Prawdopodobnie jest to wyzwanie związane ze zgodnością, które będzie trwało dłużej niż kilka dni.
Alternatywą dla ręcznego dostarczania jedzenia dla gryzoni laboratoryjnych są 1) specjalistyczne klatki z automatycznym dostępem do karmy lub 2) cyfrowe systemy lejów, które zapewniają automatyczny i zaprogramowany dostęp do żywności, takie jak FED39. Systemy klatkowe z bramkowanym dostępem do żywności są kosztowne, a niektóre z nich nie zapewniają odpowiedniego środowiska w klatce domowej do długoterminowych badań. Na przykład tradycyjne skrzynki do kondycjonowania instrumentalnego są zdolne do automatycznego dostarczania żywności, ale mają drucianą podłogę, która nie sprzyja długotrwałemu przechowywaniu. System BioDAQ firmy Research Diets dostarcza żywność i wodę przez bramkowane porty zewnętrzne. Programowalne automatyczne bramki pozwalają na długoterminowe, zaplanowane badania karmienia lub picia, jednak system jest kosztowną inwestycją. Zmechanizowane systemy lejów samowyładowczych to kolejne narzędzie do zautomatyzowanych protokołów planowego karmienia9,10. Dwa cytowane zmechanizowane leje są wyposażone w zastrzeżenie dotyczące zmniejszenia przestrzeni życiowej w klatce domowej. Głodne zwierzęta z ograniczeniami pokarmowymi mogą gryźć urządzenia do karmienia i/lub resztki klatki mogą zakłócać działanie mechaniki leja do długoterminowych badań. Wreszcie, zmechanizowany zbiornik opracowany przez grupę badawczą Takahashi wraz z Phenome Technology został specjalnie zaprojektowany do długoterminowych badań nad zaplanowanym karmieniem3. W tym systemie zmechanizowany lej samowyładowczy jest umieszczony nad rusztem standardowej klatki z rynną podajnika żywności. System Phenome nie zapewnia jednak elastyczności dla zwierząt przywiązanych do krosowego (eksperymenty z optogenetyką/fotometrią światłowodową) i jest stosunkowo drogi w porównaniu z opisanym tutaj aparatem z automatycznym podajnikiem.
W odpowiedzi na dominujące wyzwania związane z planowymi protokołami żywieniowymi, proponujemy opłacalne rozwiązanie. Nasz zautomatyzowany system ułatwia precyzyjne dostarczanie żywności w określonych odstępach czasu. Dzięki połączeniu części drukowanych w 3D wraz z dostępnym na rynku automatycznym karmnikiem dla ryb, opracowujemy zewnętrzny system karmienia typu "zrób to sam" (DIY), który można wyposażyć w samodzielne klatki dla gryzoni z mikroizolatorami. Opisany tutaj system karmienia i części mogą być bezpośrednio stosowane do dowolnej z następujących klatek dla gryzoni: myszy, szczura, chomika lub świnki morskiej, pod warunkiem, że samodzielne klatki wykorzystują wierzchołki z mikroizolatorów. Ponieważ klatki różnią się rozmiarem, rozmieszczenie może się nieznacznie różnić, ale wydrukowane w 3D wsporniki, system karmienia i zewnętrzna konstrukcja butelki na wodę mają zwykle zastosowanie w samodzielnych klatkach dla gryzoni z pokrywami z mikroizolatora.
Profilujemy jeden przykładowy automatyczny podajnik, ale dostępnych jest wiele innych gotowych automatycznych podajników, które mogą być zamontowane w systemie modułowym z niewielkimi zmianami w częściach drukowanych w 3D. Aby ułatwić dostosowanie uchwytu wydrukowanego w 3D do alternatywnych podajników lub niewielkich różnic w wymiarach klatki, testujemy modyfikowalny, trójwymiarowy plik SolidWorks z towarzyszącym plikiem STL.
Zewnętrzne umiejscowienie automatycznego karmnika zapewnia pełną przestrzeń w klatce domowej i pozwala na odłączenie, sterylizację oraz ponowne załadowanie lub wymianę karmnika bez zakłóceń dla zwierzęcia. Zautomatyzowany system żywienia jest wydajny w przypadku długoterminowych zapisów, niedrogi i podatny na różne ograniczone czasowo protokoły karmienia i/lub ograniczenia kalorii. Dostarczamy szczegółowe rysunki techniczne zespołów klatek, projekt i protokół wdrożenia systemu karmienia wraz z przykładowymi danymi. Po drugie, udostępniamy zestaw instrukcji dotyczących modyfikacji standardowego klatki do korzystania z automatycznego podajnika ze zwierzętami, które są przywiązane do krosowego w celu eksperymentów optogenetycznych lub fotometrii światłowodowej.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Wszystkie procedury zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Korzystania ze Zwierząt Uniwersytetu Massachusetts w Amherst.
1. Montaż automatycznego podajnika na standardowej pokrywie klatki typu mikroizolator (Rycina 1)
- Używając narzędzia rotacyjnego z tarczą tnącą o średnicy 1,5", wyciąć w pokrywie klatki mikroizolatora kwadrat o wymiarach 20 x 25 mm. Otwór należy umieścić 2,75 cm od krawędzi pokrywy, centrując go nad drucianą półką (Rysunek 1B, lewo).
- Wydrukować w technologii 3D wspornik do zamocowania automatycznego podajnika do pokrywy klatki (Rysunek 1A oraz Plik uzupełniający 1). Zamocować wspornik na otwór w pokrywie klatki (krok 1.1; Rysunek 1B, środek) i wsunąć automatyczny podajnik na górną część zabezpieczonego wspornika (Rysunek 1B [prawo] ,C).
Rycina 1: Modyfikacja i montaż wspornika automatycznego podajnika i pokrywy klatki. (A) Rysunek techniczny wspornika automatycznego podajnika (skalę w 3D można znaleźć w plikach SolidWorks/STL w Pliku uzupełniającym 1). (B) Od lewej do prawej: góra klatki z otworem 20 x 25 mm; wspornik zainstalowany na górze klatki i zamontowany z automatycznym podajnikiem Petbank. (C) Zmontowany automatyczny podajnik Petbank na klatce z granulką pokarmową wypadającą na standardową drucianą kratkę z butelką z wodą. Paski skali = 25 cm). Aby wyświetlić większą wersję tej ryciny, kliknij tutaj.
2. Programowanie i użytkowanie przykładowego gotowego automatycznego podajnika pokarmu
- W przypadku eksperymentów z określonym harmonogramem czasowym, najpierw ustaw godziny karmienia, a na końcu zsynchronizuj zegar podajnika, ponieważ kolejne korekty zmienią czas wyświetlany na zegarze.
- Upewnij się, że podajnik jest wystarczająco naładowany. Naciśnij i przytrzymaj przycisk Settings, aż ustawienie godziny na ekranie zacznie migać.
- Przejdź do ustawiania czasu. Za pomocą strzałek w górę i w dół ustaw godzinę pierwszego planowanego okresu karmienia.
- Ustaw liczbę porcji dla tego punktu czasowego (oznaczoną liczbą kropek obok ustawienia karmienia). Powtórz kroki 2.2-2.4 dla maksymalnie dwóch kolejnych punktów czasowych.
- Wypełnij komory automatycznego podajnika pożądanymi porcjami standardowej karmy dla gryzoni o masie ≤1.5 g. Jeśli wymagana jest większa ilość pokarmu, ustaw podajnik tak, aby dostarczał wiele porcji w danym punkcie czasowym. Przykładowy podajnik posiada 16 komór.
UWAGA: Karmę można zamówić w odpowiednim rozmiarze lub przyciąć nożyczkami. - Oznacz jedną komorę taśmą lub farbą, aby potwierdzić zaprogramowaną rotację komór i dostarczanie pokarmu. Sprawdzaj to codziennie podczas pracy podajników.
3. Zmodyfikowany system klatekowy dla zwierząt unieruchomionych z automatycznym podajnikiem pokarmu
- Opcjonalna zamienna wkładka pokrywy dla zwierząt podłączonych do kabla pomiarowego (Rysunek 2)
- Wytnij laserowo kawałek przezroczystego akrylu o grubości 3 mm zgodnie ze specyfikacją na Rysunku 2A (patrz także Plik uzupełniający 2). Wkładka akrylowa posiada wypustki umożliwiające zatrzaśnięcie jej w górnej części klatki. Centralna szczelina (190 x 5 mm) umożliwia przeprowadzenie kabla pomiarowego. Kwadratowy otwór o wymiarach 20 x 25 mm pasuje do uchwytu automatycznego podajnika; 20 otworów wentylacyjnych zapewnia cyrkulację świeżego powietrza.
- Używając śrubokręta płaskiego lub narzędzia klinowego, podważ perforowaną pokrywę górną standardowej pokrywy mikroizolatora. Zwolnij wypustki z gniazd i usuń zarówno perforowaną wkładkę, jak i papier filtracyjny (Rysunek 2C, lewa i środkowa część).
- Pod perforowaną górną częścią i papierem filtracyjnym znajduje się wewnętrzna prążkowana kratka wspierająca. Użyj narzędzia obrotowego z tarczą tnącą 1,5 cala, aby usunąć kratkę wspierającą, postępując zgodnie ze strzałkami wskazanymi w środkowej części Rysunku 2C. Po wycięciu i usunięciu kratki wspierającej, wygładź krawędź cięcia pilnikiem.
- Zatrzaśnij zamienną płytkę akrylową (krok 3.1) w górnej części klatki. Rozpocznij instalację od wsunięcia wypustek płytki w gniazda wzdłuż jednej z krótkich krawędzi, a następnie wzdłuż jednej z długich krawędzi i delikatnie dociśnij, aż płytka wskoczy na miejsce (Rysunek 2C [prawa część], D).
- Opcjonalny zewnętrzny uchwyt butelki z wodą dla zwierząt podłączonych do kabla pomiarowego (Rysunek 3)
- Wywierć otwór dla pijarki butelki z wodą: otwór o średnicy 11 mm, 50 mm od dna, wyśrodkowany na krótkiej krawędzi klatki (Rysunek 3B oraz Plik uzupełniający 3).
- Po obu stronach otworu centralnego (± 27,5 mm) wywierć dwa otwory o średnicy 6 mm. Opcjonalnie można użyć przebijaka kwadratowego 8 mm do wykonania otworów kwadratowych (pokazanych na Rysunku 3B).
- Wydrukuj w technologii 3D zewnętrzny uchwyt butelki z wodą (Rysunek 3A oraz Plik uzupełniający 4). Zamocuj uchwyt butelki do dna klatki za pomocą śrub z łbem podkładkowym (długość 2 cm, 6 x 1 mm lub długość 0,75" 1/4 x 20; Rysunek 2B,C).
- W ramach butelki z wodą zamocuj na zewnętrznym uchwycie standardową probówkę stożkową 50 mL, zamkniętą zestawem pijarka/zatyczka (#7 Stopper W/ 3-1/2" curved sipper, patrz Tabela materiałów). Uzupełniaj wodę co 2-3 dni.
Rysunek 2: Montaż płyty akrylowej na górnej części klatki. (A,B) Rysunki techniczne płyty akrylowej i korka portu karmnika. (C) Po lewej, standardowa górna część klatki z perforowaną wkładką i filtrem. Środek, usunięcie perforowanej wkładki i filtra (prążkowana kratka musi zostać wycięta wzdłuż linii wskazanych strzałkami). Po prawej, wstawiona na miejsce płyta akrylowa. (D) Kompletny zestaw pokrywy. Paski skali = 25 cm. Aby zobaczyć większą wersję tego rysunku, kliknij tutaj.
Rycina 3: Zespół uchwytu na butelkę z wodą. (A) Rysunek techniczny wydrukowanego w 3D uchwytu na butelkę z wodą. (B) Modyfikacje klatki i montaż uchwytu na butelkę z wodą; (C) Zainstalowany uchwyt; (D) Kompletny zespół klatki. Paski skali = 10 cm. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rysunek 4: Podsumowanie kompletnego montażu klatki z automatycznym podajnikiem pokarmu. (A) Standardowa klatka z drucianą kratką, (B) zmodyfikowana klatka dla zwierząt z przymocowanym kablem. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Badanie ograniczenia kalorycznego (21 dni) w celu wywołania bezpłodności u samic myszy (projekt klatki i automatycznego podajnika, Rycina 4A)
Przewlekły niedobór energii jest wystarczający do zahamowania płodności u ssaków; odpowiedź ta jest zachowana zarówno u gryzoni, jak i u ludzi11,12. W niniejszym badaniu zastosowano ograniczenie kaloryczne w celu wywołania długotrwałego spadku masy ciała. Dorosłe samice mys...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
W przedklinicznych modelach zwierzęcych ograniczenie kalorii jest potężnym narzędziem eksperymentalnym do precyzyjnego manipulowania i badania metabolizmu. Trwała utrata masy ciała ma wpływ na otyłość, cukrzycę, starzenie się, płodność i menopauzę (rodzaj starzenia się reprodukcyjnego), z których wszystkie są ważnymi punktami końcowymi translacji. Paradygmaty ograniczenia kalorycznego mogą być jednak trudne do utrzymania przez dłuższy czas. W tym manuskrypcie proponujemy ekonomiczne rozwiązanie pozwalające osiągnąć długo...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.
Podziękowania
Jason Lê jest wspierany przez program edukacji podyplomowej finansowany przez National Institutes of Health.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| # 7 Korek W / 3-1 / 2 "zakrzywiona rurka sipper bez kulki | Labex | 2067 | |
| AN75 dno klatki dla myszy | Ancare | AN75HT | |
| Automatyczny karmnik dla ryb do akwarium | Petbank-tek.com | dystrybucji Amazon (#B0BRCWP16K) | |
| Nakładki z mikrofiltrami dla gryzoni | Ancare | N10MBTPLF | |
| Gumowe korki, jeden otwór | United Scientific | S24009 | |
| standardowa karma dla gryzoni | Prolab IsoPro 3000 |
Bibliografia
- Arble, D. M., Bass, J., Laposky, A. D., Vitaterna, M. H., Turek, F. W. Circadian timing of food intake contributes to weight gain. Obesity (Silver Spring). 17 (11), 2100-2102 (2009).
- Hatori, M., et al. Time-restricted feeding without reducing caloric intake prevents metabolic diseases in mice fed a high-fat diet. Cell Metab. 15 (6), 848-860 (2012).
- Acosta-Rodriguez, V. A., de Groot, M. H. M., Rijo-Ferreira, F., Green, C. B., Takahashi, J. S. Mice under caloric restriction self-impose a temporal restriction of food intake as revealed by an automated feeder system. Cell Metab. 26 (1), 267-277.e2 (2017).
- Gallop, M. R., Tobin, S. Y., Chaix, A. Finding balance: understanding the energetics of time-restricted feeding in mice. Obesity (Silver Spring). 31 (Suppl 1), 22-39 (2023).
- Hua, L., et al. Time-restricted feeding improves the reproductive function of female mice via liver fibroblast growth factor 21. Clin Transl Med. 10 (6), e195(2020).
- Strilbytska, O., Klishch, S., Storey, K. B., Koliada, A., Lushchak, O. Intermittent fasting and longevity: From animal models to implication for humans. Ageing Res Rev. 96, 102274(2024).
- Di Francesco, A., Di Germanio, C., Bernier, M., de Cabo, R. A time to fast. Science. 362 (6416), 770-775 (2018).
- Longo, V. D., Panda, S. Fasting, Circadian rhythms, and time-restricted feeding in healthy lifespan. Cell Metab. 23 (6), 1048-1059 (2016).
- Matikainen-Ankney, B. A., et al. An open-source device for measuring food intake and operant behavior in rodent home-cages. Elife. 10, e66173(2021).
- Sahasrabudhe, A., Guy, C. R., Greenwell, B. J., Menet, J. S. Manipulation of rhythmic food intake in mice using a custom-made feeding system. J Vis Exp. (190), (2022).
- Kreisman, M. J., Tadrousse, K. S., McCosh, R. B., Breen, K. M. Neuroendocrine basis for disrupted ovarian cyclicity in female mice during chronic undernutrition. Endocrinology. 162 (8), ebqab103(2021).
- Allaway, H. C., Southmayd, E. A., De Souza, M. J. The physiology of functional hypothalamic amenorrhea associated with energy deficiency in exercising women and in women with anorexia nervosa. Horm Mol Biol Clin Investig. 25 (2), 91-119 (2016).
- Betley, J. N., et al. Neurons for hunger and thirst transmit a negative-valence teaching signal. Nature. 521 (7551), 180-185 (2015).
- Chen, Y., Lin, Y. C., Kuo, T. W., Knight, Z. A. Sensory detection of food rapidly modulates arcuate feeding circuits. Cell. 160 (5), 829-841 (2015).
- Mandelblat-Cerf, Y., et al. Arcuate hypothalamic AgRP and putative POMC neurons show opposite changes in spiking across multiple timescales. Elife. 4, e07122(2015).
- Kahnau, P., et al. A systematic review of the development and application of home cage monitoring in laboratory mice and rats. BMC Biol. 21 (1), 256(2023).
- Eckel-Mahan, K., Sassone-Corsi, P. Phenotyping circadian rhythms in mice. Curr Protoc Mouse Biol. 5 (3), 271-281 (2015).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE
Poproś o pozwolenie