Analiza białek specyficznych dla nici łańcuchowej w replikacji nici DNA poprzez wzbogacenie i sekwencjonowanie metody DNA powiązanego z białkiem

Podsumowanie

Opracowano wzbogacanie i sekwencjonowanie nowogenetycznego DNA (eSPAN) związanego z białkiem, aby wykryć względną obfitość białka związanego z chromatyną na dwóch replikujących się niciach DNA, co ujawniło molekularne wgląd w replikację chromatyny i jej sprzężone procesy. Protokół ten opisuje procedury eSPAN w komórkach macierzystych drożdży i myszy embrionalnych (ES).

Streszczenie

Duplikacja genomu jest realizowana przez białka rerespondsome, w tym helikazy, które rozwijają podwójne DNA na poszczególne antyrównoległe pojedyncze nici, z których każda wymaga odrębnych trybów replikacji: ciągłej (prowadzącej) i nieciągłej (opóźnienia). Zrozumienie interakcji białek związanych z chromatyną z replikującymi się nici DNA in vivo jest kluczowe dla wyjaśnienia mechanizmów składania chromatyny i naprawy DNA w związku z replikacją DNA. Protokół ten przedstawia metodę wzbogacania i sekwencjonowania DNA związanego z białkiem (eSPAN), zaprojektowaną do ilościowego określania względnych poziomów białek na początkujących i opóźniających nici DNA na rozwidlach replikacyjnych. Procedura eSPAN rozpoczyna się od immunoprecipitacji chromatyny (ChIP, u drożdży) lub rozszczepienia pod celami oraz tagmentacji (CUT&Tag; w komórkach ssaków) interesującego białka, po czym następuje wzbogacenie nowo powstałego DNA powiązanego z białkiem poprzez immunoprecipitację bromodeoksyurydyny (BrdU). Sekwencjonowanie nowej generacji specyficzne dla nici jest stosowane do izolowanego ssDNA. Technika ta może być stosowana do określenia, czy białko jest wzbogacone na wiodących lub opóźnionych widełkach replikacyjnych. eSPAN zapewnia preferencję dla białek związanych z chromatyną w całym genomie, w tym histonów na rozwidlach replikacji.

Wprowadzenie

U organizmów eukariotycznych duplikacja genomu inicjuje się z wielu miejsc zwanych początkami replikacji, gdzie kompleks rozpoznawczy pochodzenia (ORC) wiąże się i inicjuje mechanizm rekrutacji białka, w tym helikazę CMG, aby zainicjować replikację DNA¹. Mechanizm odpowiadający w każdym punkcie punktu początkowym replikacji tworzy dwa rozwidlenia replikacyjne, które poruszają się dwukierunkowo ^2,3. Podwójne widły replikacyjne replikują dwie macierzyste nici DNA poprzez ciągłą syntezę wiodącej nici oraz nieciągłą syntezę opóźniającej nici. Ze względu na asymetryczny charakter każdej widełki replikacyjnej, komponenty replikacyjne, w tym polimerazy DNA na wiodącej i opóźnionej nici, są różne. Wcześniejsze analizy genetyczne oparte na mutantnych polimerazach DNA wykazały, że DNA Pol ε i DNA Pol δ są głównymi polimerazami odpowiedzialnymi za replikację wiodących i opóźnionych nici, odpowiednio ^4,5. Opracowano kilka metod wykrywania preferencji nici polimerazy DNA, w tym Pu-seq ^6,7, HydEn-seq⁸ oraz emRiboSeq lub RiboSeq ^9,10. Te metody genetyczne do analizy specyficzności nici ograniczają się do polimeraz DNA i wymagają wprowadzenia mutacji na każdym białku 4,5,11,12. Śledzenie powiązania dowolnego docelowego białka z wiodącymi i opóźniającymi się łańcuchami replikacji DNA dostarczy cennych informacji na temat replikacji DNA. W ramach tych działań najpierw opracowaliśmy technikę eSPAN (wzbogacanie i sekwencjonowanie DNA powiązanego z białkiem, Rysunek 1) w komórkach drożdży. Jako badanie dowodu zasady najpierw wykazaliśmy, że δ Pol i δ Pol są wzbogacane odpowiednio na nici prowadzące i opóźnione. Odkryliśmy także preferencje nici kluczowych komponentów replikacji DNA, w tym helikazy replikacyjnej DNA, białka wiążącego DNA z pojedynczą nicią (białko replikacyjne A) oraz lampy proliferającego antygenu jądrowego komórki (PCNA) i jej czynnika replikacyjnego ładowającego C (RFC)¹³. Co ważne, my i inni wykorzystywaliśmy tę metodę do odkrywania mechanizmów transferu histonów przez rodziców, procesu, który przez ponad 4 dekady był trudny do rozwiązania⁽14,15,16,17).

Metoda eSPAN obejmuje dwa kolejne etapy: wzbogacenie docelowego białka o ChIP¹⁸ lub CUT&Tag¹⁹ oraz wzbogacenie powstającego DNA związanego z białkiem poprzez immunoprecipitację BrdU. W standardowym szczepie drożdży (W303 lub S288C) zewnętrzny BrdU lub EdU nie może wniknąć do komórek i włączyć się do chromosomów. Te szczepy nie mają odpowiedniego transportera nukleozydowego do pobierania tymidyny oraz kinazy tymidynowej potrzebnej do fosforylacji tymidyny do TMP, która przekształca BrdU (lub EdU) w BrdUMP (EdUMP). Ekspresja ludzkiego równoważącego transportera nukleozydowego 1 (hENT1) oraz kinazy tymidynowej wirusa opryszczki pospolitej (HSV-TK) zwiększa pobieranie tymidyny oraz konwersję BrdU (lub EdU) do BrdUMP (EdUMP)²⁰. Dlatego, aby przeprowadzić eksperyment eSPAN na drożdżach, szczepy musiały zostać wprowadzone ze strukturą BrdU-Incorporating (BrdU-Inc) (HSV-TK i hENT1)^13,21.

Wcześniej dostarczaliśmy protokół eSPAN dla białek replikacji DNA u drożdży²². Niedawno zintegrowaliśmy metodę CUT&Tag z protokołem eSPAN w komórkach ssaków, aby rozwiązać technicznie wymagające etapy wymagające optymalizacji, takie jak sieciowanie, ścinanie chromatyny oraz zminimalizować liczbę komórek początkowych^17,23. Tutaj udostępniliśmy histonowy eSPAN do wizualizacji przy użyciu komórek drożdży (Rysunek 2). Metoda ta jest przede wszystkim stosowana do analizy rozkładu zmodyfikowanych form histonów na replikujących się niciach DNA. Podczas testowania kilku znaków histonowych użyliśmy H3K4me3, znaku na histonie rodzicielskim H3, jako przykład. Aby przeanalizować niektóre składniki i czynniki zaangażowane w naprawę DNA na rozwidlach replikacyjnych, zalecamy rozcięcie chromatyny na małe fragmenty za pomocą sonikacji, jak opisano w naszej pierwszej publikacji²². Dla komórek ssaków przyjęliśmy zmodyfikowane procedury Cut&Tag, aby zastąpić krok ChIP opisany u drożdży²³. Ta modyfikacja zmniejsza ilość materiału wyjściowego (komórek) i, co najważniejsze, umożliwia generowanie bibliotek eSPAN do sekwencjonowania bez użycia zestawów do przygotowania jednoniciowego DNA. W przypadku protokołu drożdżowego zdecydowaliśmy się nie stosować metody Cut&Tag, ponieważ ilość materiału startowego była wystarczająca. Co ważniejsze, odkryliśmy, że procedury Cut&Tag nie były konsekwentnie skuteczne dla komórek drożdży w naszych dłoniach.

Protokół

UWAGA: Wytyczne dotyczące przygotowania buforu i odczynników zobacz wytyczne dotyczące przygotowania buforu i odczynników (Plik Uzupełniający 1).

1. Histone eSPAN w drożdżach pączkujących

UWAGA: Większość szczepów drożdży nie posiada funkcjonalnego transportera nukleozydowego do pobierania thymidyny. Aby efektywnie oznaczać DNA za pomocą BrdU lub EdU dla eSPAN, wymagany jest szczep²¹ z kinazą tymidynową (TK+). Dodatkowo, do zatrzymania cyklu komórkowego z użyciem czynnika alfa mogą być stosowane tylko szczepy drożdży typu godowego typu 'A'.

1. Synchronizacja komórek drożdży i oznakowanie BrdU (8 h)
   1. Zaszczep pojedynczą kolonię odpowiedniego szczepu drożdży (TK+) do 10 mL podłoża YPD i rosni w temperaturze 30 °C na inkubatorze potrząsającym przez noc przy 220 obr./min.
   2. Zmierz gęstość optyczną, OD600 nm, spektrofotometrem i rozcieńcz hodowlę do świeżego 200 mL medium YPD z OD600 ~0,2-0,3.
   3. Hodować hodowlę do OD600 ~0,4-0,5 (zwykle zajmuje 3-4 godziny) w 30 °C w inkubatorze potrząsającym przy 220 obr./min.
   4. Dodaj 300 μL czynnika α-- (5 mg/mL) i hoduj przez 1,5 godziny w temperaturze 25 °C, 220 obr./min.
   5. Dodaj kolejną dawkę 300 μL α-czynnika (5 mg/mL) i zwiększ przez kolejne 1,5 godziny w temperaturze 25 °C, 220 obr./min.
   6. Przygotuj 37,5% roztwór wiązania paraformaldehydu i podgrzej podłoże (200 mL YPD + HU (hydroksymocz) + BrdU) do 30°C podczas synchronizacji komórek.
      UWAGA: Traktuj BrdU ostrożnie, ponieważ może być mutagenem i teratogenem. Przygotuj 37,5% roztwór paraformaldehydu w chemicznym okapu, aby uniknąć narażenia na szkodliwe opary, ponieważ paradehyd może być czynnikiem rakotwórczym.
   7. Sprawdź morfologię komórek (kształt pręgówka) mikroskopem świetlnym, aby upewnić się, że co najmniej 90% komórek drożdży znajduje się w fazie G1 na 15 minut przed zatrzymaniem G1 na 3 godziny. Alternatywnie, przeprowadzić analizę sortowania komórek aktywowanych fluorescencją (FACS), aby potwierdzić zatrzymanie G1²⁴.
      UWAGA: Sprawdź morfologię komórek i potwierdź zatrzymanie G1 (90% z kształtem pręgówki) w tym kroku.
   8. Zbieraj ogniwa (pellet) przez wirowanie w 1600 g przez 5 minut w temperaturze 4 °C i dwukrotnie myj granulat ogniwa 20 mL lodowato zimnej wody destylowanej.
   9. Ponownie zawiesijcie ogniwa w podgrzanej (30 °C) 200 mL YPD +HU+ BrdU.
      UWAGA: Celem uwalniania HU jest zapewnienie, że większość komórek drożdży znajduje się we wczesnej fazie replikacji S, co poprawi spójność i zapewni powtarzalność wyników. Pominięcie HU jest dopuszczalne, jeśli wymagana jest praca z ogniwami fazy logarytmu.
   10. Hodować komórki na inkubatorze wstrząsającym w temperaturze 30 °C, 220 obr./min przez 45 minut.
       UWAGA: Analiza FACS może być przeprowadzona, aby potwierdzić wczesną fazę S. Do analizy FACS ważne jest uwzględnienie próbki w fazie logariatem jako kontroli, aby dokładnie zdefiniować populację komórek G1. Dla efektywnego włączenia BrdU korzystne jest rozpoczęcie od szybko rosnących komórek. Niektórzy mutanci z defektami spowolnionego wzrostu wykazują słabą skuteczność znakowania BrdU. Efektywność włączenia BrdU i wydajność BrdU-IP ocenia się za pomocą ilościowego PCR poprzez porównanie replikowanych i niereplikowanych regionów²² , wykorzystując DNA izolowane z etapu 1.6.7.
2. Utrwalanie i zbieranie próbek (1 h)
   1. Dodaj świeżo przygotowane 6 ml 37% paraformaldehydu do końcowego stężenia 1%, dobrze wymieszaj i inkubuj w temperaturze 25 °C przez 20 minut z delikatnym potrząsaniem, 90 obr./min.
   2. Stłum utrwalenie, dodając 12 mL 2,5 M glicyny, dobrze wymieszaj i inkubuj w temperaturze 25 °C przez 5 minut, delikatnie potrząsając 90 obr./min.
   3. Rozpylaj komórki w ilości 1600 g przez 5 minut w temperaturze pokojowej (RT). Następnie dwukrotnie przemyj komórki 20 mL zimnej wody, wirując przy 1600 g przez 5 minut.
   4. Zbierz ogniwa w rurkach z nakrętką o pojemności 2 mL (50 mL ogniw/rurkę) i przechowuj je w temperaturze -80 °C.
      UWAGA: Komórki mogą być przechowywane do roku (punkt pauzy).
3. Liza komórek drożdży i fragmentacja chromatyny (5 h)
   1. Rozmroź pellety komórkowe, ponownie zawiesij przez delikatne wirowanie, a następnie przemyj 0,4 mL buforu lizyzowego ChIP z inhibitorami proteazy i mieszanką antybiotyków (zapobiegającą rozwojowi bakterii zanieczyszczających) i obróć przy 5 000 g przez 1 minutę.
   2. Dodaj 0,1 mL buforu lizyzowego ChIP zawierającego inhibitory proteazy oraz mieszankę antybiotyków, a następnie około 100 μL szklanych kulek (0,5 mm).
   3. Lizuj przez ubijanie koralików przez 3 cykle (30 sekund włącz/wyłącz, 1 minuta przerwy) w chłodni o temperaturze 4 °C.
   4. Przebij otwory na dnie tubki gorącą igłą 16 G.
      UWAGA: Aby utrzymać gorącą igłę, staraj się trzymać rurkę blisko ognia.
   5. Zbieraj lizat, wkładając probówkę do pustej rurki DNA o pojemności 1,5 mL i wiruj w 1600 g przez 2 minuty, RT.
   6. Ostrożnie aspiruj supernatant, nie naruszając granulki (chromatyna będzie obecna w frakcji zanieczyszczenia komórkowego).
      UWAGA: Uważaj, aby nie zasysać przypadkowo osadu komórkowego podczas korzystania z odkurzacza.
   7. Ponownie zawiesij osadki komórkowe, pipetując w 0,35 mL buforu trawienia MNazy, uzupełnionym 0,5 mM spermidyną i 0,1 mM 2-merkaptoetanolu.
   8. Dodaj 10 jednostek MNazy do reakcji, delikatnie wymieszaj je, odwracając 4-6 razy od razu, i inkubuj w kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C przez 20 minut.
      UWAGA: Warunki trawienia powinny być optymalizowane dla każdej partii enzymu MNazy, aby wzbogacić je o frakcje mono-, di- lub trójnukleosomowe.
   9. Schłodzić trawienie MNazy, dodając 5 μL 0,5 M EDTA, aby uzyskać końcowe stężenie 10 mM EDTA. Delikatnie mieszaj je przez inwersję i natychmiast trzymaj rurki w lodzie przez co najmniej 30 minut.
      UWAGA: Próbki można przechowywać w temperaturze 4 °C przez noc na tym etapie. Warunki trawienia MNazy powinny być optymalizowane, aby uzyskać większość frakcji mono-, di- lub trójnukleosomowych (140-450 bp)
   10. Sonikuj mieszaninę reakcji mikrorurkami bioruptorowymi (1,5 mL) przez 3 minuty (wysoka moc, 30 sekund włącz/wyłącz). Wiruj z 10 000 g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
       UWAGA: Ta krótka sonikacja pomaga uwolnić chromatynę do bufora.
   11. Przelej supernatant do nowych lamp i obrzęduj kolejne 10 minut przy 10 000 g w temperaturze 4 °C.
   12. Pobierz supernatant (około 400 μL), zachowaj 30 μL próbki jako DNA wejściowe i zamroź w temperaturze -20 °C. Wykorzystaj pozostałą (~370 μL) lizatę komórek w kolejnej immunoprzecypitacji chromatyny (krok 1.4.1).
4. Immunoprecipitacja chromatyny histonowej (w nocy)
   1. Dodaj 0,5 μg przeciwciała H3K4me3 do lizatu i nutuj na rotorze, 10 obr./min w temperaturze 4 °C przez noc.
      UWAGA: Tutaj jako przykład użyto H3K4me3. Ilość przeciwciał powinna być badana eksperymentalnie.
   2. Wiruj przy 15 800 × g przez 10 minut w temperaturze 4 °C, a następnie przelej supernatant do nowej probówki 1,5 mL.
   3. Dodaj 20 μL wcześniej umytych białkowych kulek G Sepharose (3 razy mytych buforem lizyzowym ChIP, nutuj na rotorze przez 3 minuty każdy, zbieraj koraliki przez wirowanie w 350 × g, 4 °C) i inkubuj w 4 °C przez 2 godziny.
   4. Wiruj przy 350 × g w RT i myj kulki według następującej kolejności.
      1. Myj dwa razy 1 mL lodowatego buforu lizyzowego przez 3 minuty za każdym razem przez rotację z prędkością 10 obr./min na rotatorze w RT.
      2. Przemyj raz 1 mL lodowatego bufora lizyzowego z buforem NaCl o pojemności 0,5 m przez 3 minuty przez rotację z prędkością 10 obr./min na rotatorze w RT.
      3. Umyj raz 1 mL lodowatego bufora Tris/LiCl przez 3 minuty, rotując z prędkością 10 obr./min na rotatorze w RT.
      4. Umyć jedną z 1 mL buforu RT Tris/EDTA (nie buforem TE, plik uzupełniający 1 do przepisu). Wyciągnij z pelletu całą możliwą ciecz igłą 16 g 1/2.
5. Ekstrakcja DNA (2 godziny)
   1. Dodaj 0,1 mL dobrze wymieszanej żywicy chelatującej 10% do ekstrakcji DNA do wymytych kulek (od etapu 1.4.4.4), próbki wejściowej (od etapu 1.3.12) oraz do wiru.
   2. Gotuj przez 10 minut na bloku grzewczym o temperaturze 100 °C, następnie schłodzić do RT, aby odwrócić sieć krzyżową.
      UWAGA: Zaleca się stosowanie klipsów blokujących stop-pop w rurkach wirówek, aby utrzymać szczelność zamykającą.
   3. Dodaj 5 μL proteazy K o stężeniu 20 mg/mL do kulek i inkubuj w temperaturze 55 °C przez 30 minut, potrząsając przy 400 obr./min.
   4. Gotuj kulki na bloku grzewczym 100 °C przez kolejne 10 minut, aby dezaktywować aktywność proteazy K.
      UWAGA: Zaleca się stosowanie klipsów blokujących stop-pop w rurkach wirówek, aby utrzymać szczelność zamykającą.
   5. Opuszczaj kulki przy 6000 g przez 2 minuty w RT i oszczędzaj supernatant.
   6. Dodaj 100 μL 2XTE do pelletu. Wiruj i zwalniaj obrót do 6000 g przez 2 minuty w RT.
   7. Wymieszaj i zapisz supernatanty (z kroków 1.5.5 i 1.5.6) podane powyżej (około 180 μL).
   8. Oczyść próbki 30 μL do 18 μL bufora elucijnego (EB, dołączonego do zestawu do oczyszczania PCR) przy użyciu kolumn oczyszczających DNA do przygotowania biblioteki ssDNA (od kroku 1.3.12 jako wejście i kroku 1.5.7 jako próbki H3K4me3 ChIP-seq).
      UWAGA: Próbki DNA mogą być przechowywane w temperaturze -20 °C do miesiąca (punkt przerwy).
6. Immunoprecipitacja BrdU (5 h)
   1. Gotuj próbki (około 150 μL wejściowych i H3K4me3 ChIP od kroku 1.5.7) przez 5 minut na bloku grzewczym 100 °C, a następnie natychmiast schładz w lodzie przez 5 minut. Dodaj 15 μL 10x PBS i + 1,35 mL bufora IP BrdU + 0,5 μL anty-BrdU Ab + 1 μL tRNA E. coli (10 mg/mL).
      UWAGA: To kluczowy krok. Używaj rurek wirówek o niskiej liczbie wiążących DNA, aby uniknąć niespecyficznego wiązania DNA.
   2. Nutat na wirniku przez 2 godziny w temperaturze 4 °C przy 10 obr./min.
   3. Przelej mieszaninę do probówki o pojemności 1,5 mL zawierającej 20 μL białka G kulek Sepharose (przemytej trzykrotnie 1 mL buforu IP BrdU i obracaj przez 3 minuty każdą z 10 obr./min przy każdym płukaniu w RT) i nutuj przez 1 godzinę w 4 °C na wirniku przy 10 obr./min.
   4. Wiruj przy 800 × g przez 1 minutę w RT i myj zgodnie z następującymi zasadami: trzy razy z 1 mL zimnego bufora IP BrdU, 3 minuty na rotorze i raz z 1 mL bufora TE przez 3 minuty.
   5. Wiruj przy 800 × g przez 1 minutę w RT i zasysaj supernatant.
   6. Dodaj 100 × μL buforu TE + 1% SDS do pozostałych kulek. Inkubuj w temperaturze 65 °C przez 5 minut. Wiruj z prędkością 800 × g przez 1 minutę w RT.
   7. Oczyścić supernatant do 18 μL EB za pomocą kolumn oczyszczających DNA (próbka BrdU IP i H3K4me3 eSPAN).
      UWAGA: Używaj niskowiążących rurek wirówek, aby uniknąć niespecyficznego wiązania DNA. Próbki DNA można przechowywać w temperaturze -20 °C do miesiąca (punkt przerwy).
7. Przygotowanie i sekwencjonowanie biblioteki ssDNA (3 godziny)
   1. Przygotować biblioteki jednoniciowego DNA z 15 μL oczyszczonego wejścia, próbkami BrdU IP, H3K4me3 ChIP oraz eSPAN (kroki 1.5.8 i 1.6.7) (w tym kroki adaptazy, przedłużenia i ligacji) zgodnie z instrukcjami zawartymi w zestawie ssDNA oraz niskowejściowym zestawem do biblioteki DNA oraz oczyścić uzyskany produkt ligacji do 20 μL bufora elucijnego o niskiej zawartości EDTA (dostarczonego przez DNA Library Prep Kit).
      UWAGA: Zestaw składa się z dwóch etapów oczyszczania ligacji. Protokół ten stosuje procedurę 200 bp, <1 ng.
   2. Amplifikuj bibliotekę DNA przy użyciu łącznej mieszanki reakcji 50 μL (odczynników dostarczonych przez zestaw przygotowawczy biblioteki ssDNA): 20 μL oczyszczonej biblioteki DNA, 4 μL odczynnika W2, 10 μL odczynnika W3, 1 μL enzymu W4, 1,5 μL primerów Indexes I7 (10 μM, patrz Sekwencja Oligo Supplemental) oraz 1,5 μL primeru indeksu I5 (10 μM, zobacz Sekwencję Oligo Uzupełniającą), 16 μL wolnego od DNazy ddH₂O. Podgrzej mieszankę PCR w 98 °C przez 30 s, następnie 18 cykli po 10 s w 98 °C, 30 s przy 60 °C i 1 minutę w 68 °C, oraz jeden cykl 10 minut w 68 °C.
      UWAGA: Każda biblioteka powinna wykorzystywać unikalną kombinację starterów i7 i i5. Liczba cykli amplifikacji powinna być dostosowana do ilości biblioteki, aby uniknąć nadmiernego wzmocnienia, które może skutkować artefaktami PCR. Biorąc pod uwagę zazwyczaj niską ilość DNA w próbkach eSPAN, należy użyć do 18 cykli.
   3. Oczyszcz produkty PCR, mieszając 60 μL (1,0x objętości) kulek (podgrzanych do 30 °C) (patrz Tabela materiałów).
   4. Dokładnie wymieszaj produkty PCR i koraliki.
      1. Zostaw go na RT przez 5 minut. Zwiąż koraliki na magnetycznym stojaku przez 3 minuty i myj je dwukrotnie (za każdym razem 200 μL) świeżo przygotowanym 80% etanolem.
      2. Susz kulki na powietrzu przez 2 minuty, a następnie eluuj do buforu o niskiej zawartości EDTA o pojemności 20 μL (udostępnionego w zestawie DNA Library Prep Kit).
   5. Zmierz stężenie biblioteczne i rozkład rozmiarów fragmentów za pomocą systemów elektroforezy o wysokiej rozdzielczości (patrz Tabela materiałów).
   6. Zgromadzić równą liczbę pojedynczych bibliotek, w tym wejścia, próbki H3K4me3 ChIP, BrdU IP i eSPAN, oraz wykonać równoległe sekwencjonowanie parowe na platformie sekwencjonowania Illumina. W przypadku procesu analizy danych należy odnieść się do sekcji 3.
      UWAGA: Kryteria oceny wyników kontroli jakości to: (i) Nie wykrywa się szczytów adaptera/dimera startera (poniżej 180 bp). (ii) Wszystkie biblioteki do puli mają podobny i wąski rozkład wielkości (~300 bp szerokości). Przesuszanie koralików może skutkować niską wydajnością; Użyj stanowiska roboczego DNA, aby uniknąć zanieczyszczenia. Biblioteki mogą być przechowywane w nieskończoność w temperaturze -20°C (punkt pauzy).

2. Histone eSPAN z komórką ES myszy

UWAGA: Histone eSPAN z komórką ES myszy jest zasadniczo identyczny z wcześniej opublikowanym protokołem²³.

1. Znakowanie BrdU i pobieranie próbek dla komórek ES myszy (3 h)
   1. Hodować komórki ES myszy w podłożu do hodowli komórek ES w temperaturze 37 °C z nawilżoną atmosferą o zawartości 5%_CO2 , aby osiągnąć konfluencję 70%-80%. Ogólnie rzecz biorąc, do histonowego eSPAN potrzebne było około 1 miliona komórek. Komórki nasienne na dzień przed eksperymentami, aby upewnić się, że komórki rosną wykładniczo.
   2. Zmień podłoże i inkubuj komórki z BrdU przy końcowym stężeniu 50 μM przez 30 minut w temperaturze 37 °C w atmosferze nawilżonej o zawartości 5%_CO2 .
      UWAGA: Wydajność oznakowania BrdU można monitorować za pomocą ilościowej analizy PCR. Alternatywnie, do monitorowania efektywności włączania BrdU można stosować analizę immunofluorescencji lub FACS. Komórki nieoznaczone mogą być stosowane jako środek kontroli negatywnej. Są to standardowe warunki oznaczania dla komórek ES myszy. Zaleca się odpowiednie dostosowanie warunków znakowania dla komórek o różnym tempie proliferacji i długości fazy S.
   3. Płucz komórki dwa razy delikatnie lodowatym PBS.
   4. Trypsynizuj i zbieraj komórki, osadzając je w granulacji 200 × g przez 5 minut.
   5. Delikatnie podaj komórki do medium, aby je ponownie zawiesić, a następnie je policz. Wiruj niezbędną liczbę komórek przy 500 × g przez 5 minut w stanie RT.
   6. Ponownie zawiesić pellet komórkowy w 4 mL buforu płukania przez pipetowanie i wyrzucić supernatant. Wirówka 500 × g przez 5 minut w RT.
   7. Ponownie zawiesij granulki z 4 mL bufora do płukania i wiruj przy 500 × g przez 5 minut w RT.
   8. Usuń supernatant i ponownie zawiesij komórki w buforze płukania.
   9. Umieść magnetyczne kulki powlekane ConA (użyj 10 μL kulek dla 250000 ogniw; zwiększaj skalę przy użyciu większej liczby ogniw) i ponownie zawiesij w 1 mL buforu wiążącego. Po wielokrotnych inwersjach ustaw rurki na magnetycznym stojaku, aby kulki mogły się osadzić.
   10. Używając pipety lub niskoobrotowego odkurzacza, wyrzuć supernatanty. Powtórz kroki mycia dwa razy i ponownie zawiesz koraliki w buforze wiązania.
   11. Do próbek dodaj wcześniej umyte kulki magnetyczne powlekane ConA. Dobrze wymieszaj i rotuj na RT przez 10-20 minut.
   12. Umieść rurki na stojaku magnetycznym, aby usunąć wszystkie supernatanty.
2. Tagment¹⁹ dla komórek ES myszy (2 dni)
   1. Ponownie zawiesij kulki (kulki magnetyczne powlekane ConA, związane z komórkami z etapu 2.1.10) w 200 μL buforu przeciwciał lodowatych. Dodaj IgG jako kontrolę ujemną lub odpowiednie stężenia przeciwciał pierwotnych przeciwko interesującym białkom.
   2. Dobrze wymieszaj i osuszaj w temperaturze 4 °C przez noc.
   3. Wymieszaj 2 μg przeciwciał wtórnych i odpowiednią ilość pA-Tn5 przy stosunku molowym 1:2. Zwiększ całkowitą objętość do 8 μL/próbkę przy użyciu 50% gliceru (v/v). Pipetuj kilka razy, aby dobrze wymieszać i inkubować na RT przez 1 godzinę.
   4. Umieść próbki CUT&Tag na stojaku magnetycznym na 30 sekund i wyrzuć wszystkie supernatanty. Dodaj 1 mL bufora Dig-wash do granulek koralików i odwracaj kilka razy.
      UWAGA: Następnie przechodzą do kolejnych kroków prania (kroki 2.2.5-2.2.6), inkubacja kulek w przez 3-5 minut po kroku odwracania, aby uniknąć niespecyficznego wiązania.
   5. Umieść rurki na stojaku magnetycznym i usuń wszystkie supernatanty. Dodaj 200 μL buforu Dig-300, aby ponownie zawiesować kulki, a następnie 8 μL mieszaniny przeciwciał wtórnych i pA-Tn5 do każdej próbki. Po dokładnym wymieszaniu z pipetowaniem kilkukrotnie inkubuj w RT przez 1 godzinę.
   6. Umieść rurki na stojaku magnetycznym i usuń wszystkie supernatanty. Dodaj 1 ml bufora Dig-300, aby ponownie zawiesić kulki i odwrócić kilka razy.
   7. Umieść rurki na stojaku magnetycznym i usuń wszystkie supernatanty. Powtórz ten krok prania jeszcze 3 razy.
   8. Całkowicie usuń supernatanty i dodaj 250 μL buforu tagmentacyjnego, aby ponownie zawiesować kulki i inkubować w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę.
      UWAGA: Zaleca się delikatne potrząsanie podczas procesu reakcji termomieszającego, ponieważ kulki mogą osiąść na dnie rurek.
   9. Umieść rurki na stojaku magnetycznym i usuń wszystkie supernatanty. Użyj 1 mL bufora TAPS do ponownego zawieszenia kulek i odwracaj kilka razy.
   10. Umieść rurki na stojaku magnetycznym i wyrzuć wszystkie supernatanty.
   11. Do pozostałych kulek dodaj 250 μL buforu Dig-300 zawierającego 15 mM EDTA, 0,1% (w/v) SDS oraz 0,1 mg/mL proteinazy K. Wiruj do dobrego wymieszania i inkubuj w temperaturze 37 °C przez noc z delikatnym potrząsaniem.
3. Oczyszczanie DNA genomowe i tagowanie in vitro w myszych komórkach ES (na noc)
   UWAGA: DNA genomowe z tych samych komórek do eSPAN jest ekstrahowane i przygotowywane do oznaczenia in vitro , które jest stosowane w BrdU-IP-ssSeq. Tagowanie genomowego DNA oraz następujące po nim BrdU-IP-ssSeq służą do celów normalizacji eSPAN.
   1. Ponownie zawiesić komórki w 300 μL buforu i wiru genomowego DNA z maksymalną prędkością, aż nie pojawią się żadne granulki.
   2. Dla każdej próbki dodaj RNazę A w ilości 100 μg/mL. Po połączeniu inkubuj w temperaturze 37 °C przez 10 minut.
   3. Do każdej próbki dodaj 100 μL roztworu wytrącenia białkowego. Dobrze wymieszaj przez wirowanie i wirowanie w 15 000 g w RT przez 3 minuty.
   4. Zachowaj supernatant, przelewając go do nowych probówek 1,5 mL. Dodaj izopropanol o objętości 1x do próbek i dobrze wymieszaj.
   5. Rotuj z maksymalną prędkością w RT przez 3 minuty, aby rozpylić genomowe DNA. Ostrożnie wylej supernatanty.
   6. Dodaj 1 ml świeżo przygotowanego etanolu 70% (v/v) do każdej próbki i odwróć kilka razy. Wirówka na maksymalnej prędkości przy RT przez 3 minuty.
   7. Wiruj w 15 000 g przez 1 minutę w RT, a resztę etanolu usuń pipetą P20. Pozwól wyschnąć na powietrzu przez 5-10 minut.
   8. Dodaj 50 μL_ddH2Oi krótko zawies DNA genomowego. Rozpuszczać w 65 °C przez 30 minut.
   9. Krótko wiruj i przelej supernatanty do nowych probówek 1,5 mL. Ilościowo określ stężenie DNA za pomocą spektrofotometru.
   10. Ustaw reakcję in vitro tagmentation, jak pokazano w Tabeli 1.
   11. Dobrze wymieszaj i inkubuj przez 30 minut w 37 °C z delikatnym potrząsaniem.
   12. Do każdej próbki dodaj 10 mM EDTA, 0,1% (w/v) SDS oraz 0,1 mg/mL proteinazy K. Dobrze wymieszaj przez wirowanie i inkubuj przez noc w 37 °C z potrząsaniem.
4. Ekstrakcja DNA i zastępowanie oligo (3 godziny)
   UWAGA: Do ekstrakcji DNA można stosować zarówno alkohol fenol-chloroform-izoamyl (PCI), jak i oczyszczanie kolumnowe. Przedstawiono szczegółowe procedury oczyszczania kolumn.
   1. Dodaj 1,25 mL (5x objętości) buforu wiążącego (dołączonego do zestawu do oczyszczania PCR) do próbek (kroki 2.2.11. i 2.3.12.) i dobrze wymieszaj, odwracając kilka razy.
   2. Załaduj mieszaninę do kolumn oczyszczających DNA (w probówkach zbierających 2 mL) i wiruj przez 30 sekund przy 10 000 × g w RT. Usuń przepływ przecieku.
   3. Dodaj 600 μL bufora elucijnego (dołączonego do zestawu) do kolumn i wiruj przez 1 minutę przy 10 000 × g w RT. Usuń przepływ przeciekowy.
   4. Wiruj na maksymalnej prędkości przez 2 minuty, aby całkowicie usunąć pozostały bufor. Umieść kolumny w nowych probówkach 1,5 mL z otwartymi pokrywkami i susz na powietrzu przez 1 minutę.
   5. Do środka błony należy dodać 32 μL wolnego od DNazy ddH₂O (lub 10 mM Tris·HCl, pH = 8,0) i pozostawić ją do odpoczynku przez 1 minutę. Wirówka na maksymalną prędkość przez 2 minuty, a DNA CUT&Tag jest już w roztworze.
   6. Dodaj 32 μL próbki DNA CUT&Tag do nowej probówki PCR, a następnie dodaj 2 μL mieszanki dNTP (2,5 mM każda), 4 μL buforu ampligazy 10x oraz 2 μL rep-B (10 μM). Delikatnie stukaj i mieszaj pipetowaniem.
   7. Krótko wyłącz i uruchom następujący program dla oligo replacement²³.
      50 °C, 1 minuta
      45 °C, 10 min
      Rampa do 37 °C, 0,1 °C/s
      37 °C, utrzymać
   8. W termocyklerze dodaj 1 μL polimerazy DNA T4 oraz 1 μL ampligazy do każdej probówki (ostateczna objętość: 40 μL/próbka). Mieszaj delikatnym pipetowaniem.
   9. Kontynuuj reakcję w temperaturze 37 °C w termocyklerze przez 30-60 minut.
      UWAGA: DNA może być przechowywane w temperaturze -20 °C, jeśli nie przejdzie się bezpośrednio do BrdU IP po tym kroku (bezpieczny punkt pauzy).
5. Immunoprecypitacja BrdU (zasadniczo to samo co protokół drożdżowy) (2 godziny)
   1. Przenieś próbki do probówek o niskim wiązaniu DNA o pojemności 1,5 mL. Próbki gotuj przez 5 minut na bloku grzewczym 100 °C, a następnie natychmiast schładza w lodzie przez 5 minut. Dodaj 15 μL 10x PBS i + 1,35 mL bufora IP BrdU + 0,5 μL anty-BrdU Ab + 1 μL tRNA E. coli (10 mg/mL).
   2. Nutat przez 2 godziny na wirniku w temperaturze 4 °C.
   3. Przełóż mieszankę do probówki zawierającej 20 μL białka G Sepharose (myj trzy razy 1 mL buforu IP BrdU, każdy raz przez 3 minuty).
   4. Inkubuj w temperaturze 4 °C przez 1 godzinę.
   5. Wiruj przy 800 × g przez 1 minutę i myj zgodnie z następującymi metodami: trzy razy z 1 mL zimnego bufora IP BrdU, 3 minuty na rotorze; raz z 1 mL bufora TE przez 3 minuty.
   6. Wiruj przy 800 × g przez 1 minutę i zasysaj supernatant.
   7. Dodaj 100 μL bufora TE + 1% SDS do pozostałych kulek. Inkubować w 65 °C przez 15 minut. Wiruj z 800 × g przez 1 minutę.
   8. Oczyścić supernatant do 18 μL buforu elucijnego (dołączonego do zestawu) za pomocą kolumn oczyszczających DNA (próbka BrdU IP i H3K4me3 eSPAN).
6. Amplifikacja i sekwencjonowanie PCR (1,5 h)
   1. Amplifikuj i oznaczaj próbki biblioteki jednoniciowego DNA za pomocą różnych kombinacji indeksów. Przygotować reakcję PCR, dodając następujące składniki ((oczyszczone DNA [ChIP lub ESPAN], zapalnik indeksujący I5 [1 μL], zapalnik indeksujący I7 [1 μL], NEBNext High-Fidelity 2X PCR Master Mix (2x) [10 μL], ddH_2Odo 20 μL), mieszając próbki pipetowaniem i krótko wirując.
   2. Podgrzej mieszankę PCR w temperaturze 98 °C przez 30 sekund, następnie 12-14 cykli po 10 sekund przy 98 °C i 20 sekund w 63 °C oraz jeden cykl 2 minut w 72 °C.
   3. Oczyść produkty PCR za pomocą 18 μL kulek paramagnetycznych (0,8x objętości) do 20 μL buforu o niskiej zawartości EDTA.
   4. Zmierz koncentrację biblioteczną i rozkład rozmiarów fragmentów za pomocą systemów elektroforezy o wysokiej rozdzielczości.
   5. Zgromadzić równą liczbę pojedynczych bibliotek, w tym wejścia, próbki H3K4me3 ChIP, BrdU IP i eSPAN, oraz wykonać równoległe sekwencjonowanie parowe na platformie sekwencjonowania Illumina.

3. Analiza danych eSPAN dla komórek drożdży (1 dzień)

UWAGA: Proces analizy danych dotyczy wyłącznie danych o drożdżyach; analiza danych eSPAN dla komórek ES może być śledzona zgodnie z opisem w niedawnej publikacji²³.

1. Ekstraktuj surowe pliki sekwencji, przycinaj sekwencje adaptorów za pomocą narzędzi Trim Galore oraz usuń odczyty mniejsze niż 10 bp, aby zmniejszyć rozmiar pliku wyjściowego i uniknąć awarii programów wyrównania. Upewnij się, że pliki są w formacie file1_1.fq, file1_2.fq do odczytów parowych:
   /TrimGalore-0.6.10/trim_galore file.fq-o trim --długość 10 - parowany
2. Generuj pliki indeksu muchy dla genomu referencyjnego:
   bowtie2-build genome.fa
3. Odwzoruj odczyty na odpowiadający genom referencyjny (genom Saccharomyces (sacCer3) dla drożdży) za pomocą Bowtie 2:
   Bowtie2 -X Genome -1 trim_1.fq -2 trim_2.fq --lokalny --no-swallow --no-disonant --maxins 1000 -D 20 -R 3 -N 1 -L 20 -i S,1,0.50
4. Usuń odczyty multimap za pomocą SAMtools i zduplikuj odczyty narzędziami Sambamba:
   samtools view -bhs - q 40 input.bam -o output.bam
   sambamba-1.0.1.1-linux-amd64-static markdup output.bam filtered.bam -r
5. Użyj deeptools, aby wygenerować pliki Bigwig dotyczące pokrycia odczytu na wątkach Watsona i Cricka osobno dla każdej próbki z czystych plików BAM:
   bamCoverage -b filtered.bam -o watson.bw --filterRNAstrand reverse -bs 1 - extendReads
   bamCoverage -b filter.bam -o crick.bw --filterRNAstrand forward -bs 1 - extendReads
6. Oblicz średnie bias przy każdej pozycji nukleosomu²⁵ dla każdej próbki na podstawie wzoru: log2 odczyty do przodu (nici Watsona)/odwrotne (pasmo Cricka) po pozycjonowaniu nukleosomów referencyjnych zostały rozdzielone²⁵. Skrypty R do tych obliczeń są dostępne w https://github.com/clouds-drift/eSPAN-bias. Do standardowego obliczenia użyj następujących poleceń.
   UWAGA: Ten krok dotyczy tylko danych o drożdżach; obliczenia błędu dla komórek ES można śledzić zgodnie z niedawną publikacją²³.
   Rscript cal_bias. R -w watson.bw -c crick.bw -r replication_origins.łóżko
7. Jeśli to konieczne, dostosuj polaryzację włókienek o pociąg BrdU:
   Rscript normalize_bias. R -i matrix_files -c classes_list -C condition_list --celuj target_list --kontroluj control_list
   UWAGA: "matrix_files" to lista plików generowanych przez cal_bias. Pismo R oddzielone przecinkami. np. 'plik1', 'plik2', 'plik 3'. "classes_list" to lista klas próbek odpowiadających każdemu plikowi, oddzielonych przecinkami (np. 'brdu', 'H3K4me3_eSPAN', 'H3K56ac_eSPAN'). "condition_list" to lista warunków próbkowania odpowiadających każdemu plikowi i podzielonych przecinkami. Każdy plik zostanie sparowany według klasy i warunku do korekty stronniczości. "target_list" to lista zajęć zaczerpniętych z classes_list. Zdefiniuje klasy, które będą pełnić rolę danych do regulacji przez kontrolery (np. 'H3K4me3_eSPAN', 'H3K56ac_eSPAN'). "control_list" to lista zajęć wybranych z listy zajęć. Zdefiniuje klasy, które będą pełnić rolę danych do regulacji przez sterowanie. Upewnij się, że długość listy jest taka sama jak target_list (np. 'brdu')
8. Po obliczeniach i korektach grupuj próbki i tworz wizualizacje danych.
   Rscript draw_bias. R -s' bias_matrix/file1.txt, bias_matrix/file2.txt' -o 'bias.pdf' -g grupa 1, grupa 2 --interwał=T
   -s wymaga listy plików bias generowanych przez powyższe skrypty
   -o to plik wyjściowy
   -g definiuje grupy eksperymentalne do obliczenia, czyli biologiczne replikacje do wykreślenia średniego błędu.
   --przedział T lub F, aby wyświetlić błędy standardowe na wykresach w grupach eksperymentalnych.
   UWAGA: Informacje o początkach replikacji zostały zdefiniowane na podstawie danych IP BrdU. Informacje o położeniu pojedynczego jądra pochodzą z wcześniej opublikowanego artykułu²⁵. Do analizy danych z komórek ES myszy informacje o pochodzeniu pochodziły z zestawu danych OK-seq²⁶, a obliczenie średniego błędu powinno podążać za protokołem opisanym w poprzedniej pracy²³.

Wyniki

eSPAN może być wykorzystywany do pozyskiwania informacji specyficznych dla włókna dotyczącego docelowego białka, takich jak histony i modyfikacje histonów. W tym reprezentatywnym wyniku przeprowadzono pobieranie próbek i procesy eSPAN według schematu przedstawionego na Rysunku 2, wykorzystując system drożdży pączkowych. Leczenie i pobieranie próbek odbywa się zgodnie z wczesnym warunkiem leczenia hydroksymoczowcem w fazie S, zgodnie z tym protokołem. Zastosowano dwa szczepy drożdży: WT (typ ...

Dyskusja

Wykrywanie białek związanych z wiodącymi i opóźniającymi się niciami replikacyjnymi jest istotne dla zrozumienia mechanizmów replikacji chromatyny i związanych z nimi procesów, które są bezpośrednio istotne dla badań nad rakiem u ludzi oraz mechanizmów oporności na leki. Do badania replikacji DNA i powiązanych procesów, takich jak natywna chromatynowa immunoprecipitacja (nChIP), iPOND oraz wczesne wychwytywanie chromatyny 29,30,31, zostało zastosowanych do badania replikacji DNA i powiązanych proc...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
0,5 M EDTA, pH 8,0	Thermo Fisher Scientific	15575020
1,5 mL niskowiążących rurek DNA	Eppendorf	22431021
10x bufor ampligazy	Lucygen	A1905B
10x PBS	Corning	21-040-CV
10x TBS	BioRad	1706435
16 G x 1-1/2 cala. BD PrecisionGlid Needle	BD Biosciences	305198
ACCEL-NGS 1S PLUS ZESTAW BIBLIOTECZNY DNA	Zintegrowane technologie DNA	10009817	zestaw do przygotowania bibliotek ssDNA i niskowejściowych DNA
Agilent 2100 bioanalizator	Agilent	2100 bioanaliza
Agilent DNA 1000 kit	Agilent	5607-1504
Ampligase	Lucygen	A0110K	Obchodz się z paraformaldehydem ostrożnie, jest łatwopalny i niebezpieczny.
AMPure XP	Beckman	A63881
AMPure XP SPRI Reagent	Beckman Coulter	A63882
Przeciwciało anty-BrdU	BD Biosciences	555627
Przeciwciało przeciw H3K4me3 & nbsp;	abcam	ab8580
Automatyczny licznik komórek , model TC10	BioRad	145-0001
Bacitracin	Sigma	11702
Bacto peptone	Thermo Fisher Scientific	211830
Benzamidyna chlorowodorek	Sigma	B2417	Ciała stałe palne
BrdU	Sigma	B5002	Traktuj BrdU ostrożnie, ponieważ może być potencjalnym mutagenem i teratogenem.
BSA	New England Biolabs	B9000S
CaCl2	Sigma	C4901
Inkubator hodowli komórkowych	Thermo Fisher Scientific   model Forma serii II inkubator CO2 z wodną płaszczyznką	3140
Medium hodowlane komórek
Linia komórkowa ES-E14
Chelex-100	BioRad	1422842	200– Rozmiar siatki suchej 400
Chloroform	Sigma	366919
Magnetyczne koraliki powlekane Concanavalin A (ConA) &	Nauki polinaukowe	86057-10
Digitonin	Millipore	300410-5MG
DMSO	Sigma	D8418
E. coli   tRNA	Sigma	10109541001
Etanol	Thermo Fisher Scientific	BP2818100	Obchodz się z etanolem ostrożnie, jest łatwopalny
glukoza	Sigma	G7021
Glicerol & nbsp;	Sigma	G5516
HCl	Sigma	H1758
HEPES	Sigma	H3375
Izopropanol	Thermo Fisher Scientific	BP26324	Ostrożnie obchodz się z izoproponolem, jest łatwopalny
KAPA HiFi HotStart Ready Mix	Roche	7958889001
KCl	Sigma	P9541
KOH	Sigma	221473	Ostrożnie obchodz się z KOH, jest
Próżnia przy niskich prędkościach
Stojak magnetyczny	Millipore	LSKMAGS08
Mastercycler Gradient PCR Thermal Cycler	Eppendorf	5331
MgCl2	Sigma	M8266
Nukleaza mikrokokowa   (MNase)	Worthington	LS004798
Zestaw do oczyszczania PCR MinElute	Qiagen	28006
Mini-bijak do koralików	Mini BeadBeater 24 Disruptor	607
Mini-wirówka	Eppendorf	5424R
MnCl2	Sigma	244589
Wieloplatformowy shaker	Fisherbrand	02-217-765
Wieloplatformowy inkubator shakera	Benchmark	SHAKER INCU-SHAKER 10L
Blok grzewczy wielotermiczny	Eppendorf	Termomieszacz C
N-[Tris(hydroksymetyl)metyl]-3-aminopropanosulfonowy kwas nbsp; (STUKANIE)	Sigma	T5130	200– Rozmiar siatki suchej 400
NaCl	Sigma	S9888
NaOH	Sigma	S8045	Traktuj NaOH ostrożnie, jest
NEBNext HiFi 2&razy; PCR master mix	New England Biolabs	M0541
NP-40 Igepal CA-630	Thermo Scientific	J61055. AP
Paraformaldhyd	Sigma	158127	Obchodz się z paraformaldehydem ostrożnie, jest łatwopalny i niebezpieczny.
enzym pA-Tn5 i nbsp;	Addgene	121137
Pefabloc	Sigma	11429868001
Alkohol fenol-chloroform-izoamyl	Invitrogen	15593049
Pipette P1000, P200, P20 i P2	Eppendorf	2231300004
PMSF	Sigma	10837091001
Tabletka koktajlowa inhibitora proteazy	Sigma	S8830
Tabletka koktajlowa inhibitora proteazy	Sigma	S8830
Białko G-sepharozowe koraliki	GE Healthcare	17-0618-02
Roztwór wytrącenia białek	Qiagen	848023
Roztwór wytrącenia białek	Qiagen	848023	Ostrożnie obchodz się z KOH, jest
Roztwór wytrącania białek	Qiagen	848023
Proteinaza K	Sigma	311584401
Zestaw do oczyszczania PCR QIAquick	Qiagen	28106
RNaza A	Sigma	10109169001
SDS	Sigma	L3771
Spektrofotometr	Termo naukowe.	2000/2000c
Spermidyna	Sigma	S2626
T4 DNA Pol	New England Biolabs,	M0203
Wirówka stołowa	Beckman Coulter	Allegra X-5
Tris	Sigma	11814273001
Triton X-100	Sigma	T8787
ekstrakt drożdżowy	Thermo Fisher Scientific	212730