Artykuł metodologiczny

Metody wykrywania kaszlu i zapalenia dróg oddechowych u myszy

1.9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/67122

⸱

2 sierpnia 2024

 ,  ,  , 
1State Key Laboratory of Respiratory Disease, Guangzhou Institute of Respiratory Health, The First Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University, 2Guangzhou National Laboratory

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj opisujemy pomiar kaszlu za pomocą nieinwazyjnego systemu pletyzmografii całego ciała (WBP) w czasie rzeczywistym oraz procedury normatywne pobierania próbek tkanek myszy i wprowadzamy pewne metody oceny stanu zapalnego dróg oddechowych.

Streszczenie

Przewlekły kaszel, który trwa dłużej niż 8 tygodni, jest jedną z najczęstszych dolegliwości wymagających pomocy medycznej, a pacjenci cierpią z powodu ogromnego obciążenia społeczno-ekonomicznego i wyraźnego spadku jakości życia. Modele zwierzęce mogą naśladować złożoną patofizjologię kaszlu i są ważnymi narzędziami do badań nad kaszlem. Wykrycie wrażliwości na kaszel i zapalenia dróg oddechowych ma ogromne znaczenie dla badania złożonego patologicznego mechanizmu kaszlu. W artykule opisano pomiar kaszlu za pomocą nieinwazyjnego systemu pletyzmografii całego ciała (WBP) w czasie rzeczywistym oraz procedury normatywne pobierania próbek tkanek (w tym krwi, płuc, śledziony i tchawicy) myszy. Przedstawiono w nim kilka metod oceny stanu zapalnego dróg oddechowych, w tym zmiany patologiczne w odcinkach płuc i tchawicy barwionych hematoksyliną i eozyną (HE), całkowite stężenie białka, stężenie kwasu moczowego i aktywność dehydrogenazy mleczanowej (LDH) w supernatancie płynu z płukania oskrzelowo-pęcherzykowego (BALF) oraz leukocyty i różnicowa liczba komórek BALF. Metody te są powtarzalne i służą jako cenne narzędzia do badania złożonej patofizjologii kaszlu.

Wprowadzenie

Kaszel jest ważnym zachowaniem obronnym, mającym na celu utrzymanie drożności dróg oddechowych i ochronę płuc przed potencjalnie szkodliwymi substancjami. Jednak w przypadku rozregulowania kaszel staje się stanem patologicznym1. Przewlekły kaszel, zwykle definiowany jako trwający osiem lub więcej tygodni, jest jednym z najczęstszych objawów wymagających pomocy medycznej2. Ponieważ przewlekły kaszel często utrzymuje się przez lata, pacjenci cierpią z powodu ogromnego obciążenia społeczno-ekonomicznego i wyraźnego pogorszenia jakości życia3,4,5. Przewlekły kaszel jest powszechnie uważany za zespół nadwrażliwości na kaszel i charakteryzuje się uciążliwym kaszlem, często wywoływanym przez niski poziom ekspozycji termicznej, mechanicznej lub chemicznej6. Występowanie nadwrażliwości na kaszel jest ściśle związane z zapaleniem dróg oddechowych7. Jednak mechanizmy patofizjologiczne leżące u podstaw modulacji wrażliwości na kaszel wymagają dalszego wyjaśnienia.

Modele zwierzęce mogą naśladować złożoną patofizjologię kaszlu i są ważnymi narzędziami do badań nad kaszlem8,9. Wcześniejsze badania wykazały, że infekcja wirusowa, wkraplanie interferonu γ do płuc (IFN-γ), perfuzja kwasu solnego w przełyku, narażenie na zanieczyszczenia, dym papierosowy i kwas cytrynowy mogą wywoływać kaszel u zwierząt10,11,12,13,14,15,16,17. Aby lepiej ocenić kaszel i zapalenie dróg oddechowych, w tym badaniu stworzono mysi model kaszlu przy użyciu nieśmiertelnej dawki wirusa H1N1. Do wykrywania kaszlu opracowano klinicznie niektóre narzędzia do pomiaru kaszlu, w tym metody subiektywne i obiektywne18. Subiektywne narzędzia oceny do oceny nasilenia kaszlu obejmują przede wszystkim wizualną skalę analogową, wynik kaszlu i kwestionariusze jakości życia itp19,20. Jest jednak mało prawdopodobne, aby były one wykorzystywane do oceny kaszlu u zwierząt. Ponadto kaszel można obiektywnie ocenić za pomocą testu prowokacyjnego kaszlu i monitorowania częstotliwości kaszlu. Test prowokacyjny kaszlu wykorzystujący system pletyzmografii całego ciała (WBP) jest obiektywną metodą szeroko stosowaną w badaniach na zwierzętach do pomiaru wrażliwości na kaszel i ujawniania mechanizmów leżących u podstaw kaszlu13,16. Opierając się na neuroanatomicznych cechach odruchu kaszlowego, kwas cytrynowy, kapsaicyna, 5'-trifosforan adenozyny (ATP), izotiocyjanian allilu (AITC) i mediator stanu zapalnego bradykinina są powszechnie stosowane jako środki wywołujące kaszel21,22. Kwas cytrynowy jest jednym z najwcześniejszych i najczęściej stosowanych środków przeciwkaszlowych wywołujących odruchy kaszlowe, co zostało potwierdzone do pomiaru wrażliwości na kaszel. Poza tym prowokacja kwasem cytrynowym ma dobre bezpieczeństwo, wykonalność i tolerancję i sugeruje się, aby ocenić wrażliwość odruchu kaszlowego w odpowiedzi na terapie kaszlu23. Dlatego w tym artykule zostanie opisana metoda pomiaru wrażliwości na kaszel w odpowiedzi na kwas cytrynowy u myszy przy użyciu nieinwazyjnego systemu WBP w czasie rzeczywistym.

Badania patofizjologii kaszlu wymagają próbek testowych, w tym próbek z krwi, płynu z płukania oskrzelowo-pęcherzykowego (BALF) oraz tkanek płuc i tchawicy w celu sprawdzenia zmian w poziomach kluczowych czynników24. Obecnie brakuje normatywnych procedur pobierania próbek tkanek od myszy, a powiązane badania wykorzystują różne podejścia, które komplikują ocenę zapalenia dróg oddechowych. Płukanie oskrzelowo-pęcherzykowe jest ważną metodą oceny stanu zapalnego dróg oddechowych w chorobach układu oddechowego25. Różne metody płukania oskrzelowo-pęcherzykowego prowadzą do braku porównywalności między powiązanymi badaniami. Ponadto różne metody płukania oskrzelowo-pęcherzykowego mają wpływ na komórki zapalne i cytokiny zapalne w BALF. Dlatego w tym artykule opisano stworzenie mysiego modelu kaszlu z nieśmiertelną dawką wirusa H1N1, pomiar kaszlu za pomocą systemu WBP oraz niezawodną, bezpieczną i bardzo skuteczną metodę płukania oskrzelowo-pęcherzykowego u myszy.

Protokół

Wszystkie procedury zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania Uniwersytetu Medycznego w Kantonie (20240248) i zostały przeprowadzone w ścisłej zgodności z zatwierdzonymi wytycznymi. W badaniu wykorzystano samce myszy C57BL/6 o masie 20-25 g wolne od patogenów. Wszystkie myszy trzymano w kontrolowanej temperaturze (22 ± 2 °C), wilgotności (50% ± 20%) i oświetleniu (od 6:30 do 18:30) w klatkach z solidnym dnem z jedzeniem i wodą dostępną ad libitum. Oś czasu protokołu jest pokazana w Rysunek 1.

1. Stworzenie mysiego modelu kaszlu

  1. Użyj wirusa grypy A/California/7/2009 (H1N1). Określ śmiertelną dawkę wirusa H1N1 u myszy.
    1. Krótko mówiąc, znieczulij myszy (n = 10 na grupę) 2,5% izofluranu, a następnie donosowo zainfekuj 10-krotnie seryjnie rozcieńczonym wirusem.
    2. Monitoruj zgon przez okres 15 dni. Wskaźniki przeżywalności i masę ciała myszy rejestrowano codziennie. Obliczyć medianę dawki śmiertelnej (LD50) metodą Reeda-Muencha26.
      UWAGA: Myszy zostały bezboleśnie uśłożone z powodu przedawkowania pentobarbitalu sodu, gdy osiągnęły lub przekroczyły 30% utratę masy ciała.
  2. Zainfekuj mysz wirusem H1N1.
    1. Rozpuścić 0,8 x LD50 wirusa H1N1 w 50 μl soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS).
    2. Znieczulij myszy 2,5% izofluranem.
    3. Kiedy myszy były głęboko znieczulone, umieść mysz w pozycji leżącej z nozdrzami skierowanymi do góry.
    4. Wkraść 5-10 μl roztworu wirusa H1N1 lub roztworu PBS (jako kontrolę) donosowo do jednego nozdrza myszy za pomocą pipety (Rysunek 2A).
    5. Następnie przytrzymaj usta myszy kciukiem zamknięte, aby jej nos miał twardy wdech, tak aby roztwór wirusa H1N1 w jamie nosowej został całkowicie wdychany do płuc (Rysunek 2B).
    6. Powtórz kroki 1.2.4 i 1.2.5 w drugiej jamie nosowej myszy.
    7. Gdy cały wirus H1N1 przygotowany w kroku 1.2.1 zostanie donosowo wstrzyknięty do płuc myszy, umieść go w pozycji leżącej na plecach do odpoczynku (Rysunek 2C).
  3. Zmierz wrażliwość myszy na kaszel po założeniu modelu za pomocą systemu pletyzmografii całego ciała Buxco dla małych zwierząt. W 21 dniu znieczulij mysz dootrzewnowo za pomocą pentobarbitalu sodu (150 mg·kg-1). Zbieraj i przetwarzaj tkanki krwi, śledziony, BALF, płuc i tchawicy (Rysunek 1).

2. Pomiar wrażliwości na kaszel

  1. Przygotuj kwas cytrynowy (0,4 M): Umieść 0,1537 mg kwasu cytrynowego w probówce wirówkowej o pojemności 5 ml i dodaj zwykłą sól fizjologiczną do objętości 2 ml.
  2. Inspekcja przyrządów
    1. Sprawdź kanały: Podłącz komory pletyzmografu całego ciała zgodnie z instrukcjami producenta i kliknij przycisk kalibracji - przycisk kalibracji zmieni kolor z pomarańczowego na zielony, wskazując, że kalibracja się powiodła (Rysunek 3A).
    2. Skalibruj nebulizator:
      1. Po podłączeniu nebulizatora dodaj do nebulizatora 500 μl soli fizjologicznej i kliknij przycisk nebulizacji.
      2. Gdy płyn w nebulizatorze zostanie całkowicie rozpylony, kliknij ponownie przycisk nebulizacji, aby zobaczyć moc nebulizatora, która zwykle wynosi około 0,3 ml/min. Kliknij ponownie przycisk nebulizacji, aby zaakceptować aktualną moc nebulizacji.
    3. Po sprawdzeniu kanałów upewnij się, że wartość błędu jest mniejsza niż 0.5%.
  3. Ustawianie parametrów
    1. Kliknij przycisk Create New Study (Utwórz nowe badanie), wybierz opcję Cough (Kaszel), wybierz opcję Mouse (Mysz) w obszarze Species (Gatunki) i kliknij przycisk Next (Dalej).
    2. Wybierz parametry CCnt: Ustaw czas trwania okresu aklimatyzacji na 1 min, czas reakcji na 10 min, objętość aerozolu na 1 ml, a czas podania na 10 min.
    3. Umieść przytomną, nieskrępowaną mysz w indywidualnych plastikowych, przezroczystych komorach pletyzmografu na całe ciało. Wprowadź wagę i identyfikator tematu myszy i kliknij Dalej.
      UWAGA: Myszy są tigmotaksyjne i nie muszą przyzwyczajać się do małych komór; W związku z tym habituacja nie jest wykonywana przed eksperymentem.
    4. Dodaj 1 ml roztworu kwasu cytrynowego (0,4 M) do nebulizatora i obserwuj zmiany w czasie rzeczywistym w CCnt (Rysunek 3B).
    5. Po całkowitym zużyciu kwasu cytrynowego kliknij Plik i zakończ sesję, aby zakończyć eksperyment.

3. Pobieranie krwi, śledziony, BALF, płuc i tchawicy tkanek myszy (Rysunek 4)

  1. Zbierz krew.
    1. Po wykryciu kaszlu znieczulij mysz pentobarbitalem sodu (150 mg·kg-1) przez wstrzyknięcie dootrzewnowe. Zbierz krew z oczodołów znieczulonej myszy. Zmieszać 1 ml krwi z 0,1 ml buforu przeciwzakrzepowego (9,9 mg/ml heparyny sodowej rozpuszczonej w PBS) w temperaturze 4 °C (Rysunek 4A).
      UWAGA: Metoda podoczodołowego pobierania krwi jest prosta i pozwala uzyskać dużą ilość krwi.
    2. Potrząśnij probówką do pobierania krwi, aby całkowicie wymieszać krew i antykoagulant, aby zapobiec krzepnięciu krwi.
    3. Odwirować pobraną krew o sile 800 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Zebrać supernatant, przechowywać go w temperaturze -80 °C (używany do pomiaru cytokin) i ponownie zawiesić osad w 1 ml roztworu D-Hanka. Rozprowadzić 10 μl zawiesiny krwinek na szkiełku podstawowym w celu określenia profili komórkowych.
  2. Zbierz śledzionę.
    1. Otwórz klatkę piersiową myszy, zbierz krew i wykrwawij się przez tętnicę (Ryc. 4B).
    2. Usuń lewe małżowinę uszną, a następnie przeprowadź perfuzję krążenia płucnego i ogólnoustrojowego za pomocą 5 ml soli fizjologicznej (Rysunek 4C, D). Usuń całą śledzionę z myszy za pomocą kleszczy chirurgicznych (Rysunek 4E).
    3. Po zmierzeniu wagi śledziony przekrój ją na dwie połówki. Utrwal pierwszą połowę 4% paraformaldehydem w temperaturze pokojowej (RT) do analizy histopatologicznej. Drugą połowę przechowywać w temperaturze -80 °C w celu pomiaru cytokin.
  3. Płukanie oskrzelowo-pęcherzykowe
    1. Przygotować rurkę do płukania oskrzelowo-pęcherzykowego za pomocą pipety Pasteura. Podgrzej pipetę Pasteura za pomocą lampy alkoholowej. Gdy stanie się miękki, wydłuż go, aby utworzyć cienką rurkę. Przyklej część cewnika cewnika z końcówką ślizgową do cienkiej rurki. Długość rurki do płukania oskrzelowo-pęcherzykowego wynosi 5 cm. Górna średnica wynosi 5 mm, a dolna 1 mm (Rysunek 5).
      UWAGA: Ta rurka do płukania oskrzelowo-pęcherzykowego jest realnym narzędziem do zbierania BALF.
    2. W celu pobrania BALF należy oddzielić prawe płuco, podwiązując je przy prawym oskrzelu pnia głównego. Zbierz BALF z lewych płuc, trzykrotnie przepłukując się 0,5 ml PBS wstępnie schłodzonego na lodzie. Współczynnik odzysku BALF wynosi ponad 80% (Rysunek 4F).
    3. Odwirować pobrany BALF przy 800 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Zebrać supernatant i zmierzyć całkowite stężenie białka, stężenie kwasu moczowego, aktywność LDH i stężenie cytokin.
      UWAGA: Markery stanu zapalnego, w tym całkowite stężenie białka, stężenie kwasu moczowego i aktywność LDH w supernatancie BALF, są wykrywane za pomocą zestawu testowego zgodnie z wytycznymi producenta24.
    4. Zawiesić osad w 200 μl PBS i policzyć leukocyty w BALF za pomocą szkiełka zliczającego.
    5. Aby określić profile komórek za pomocą różnicowej liczby, rozsmaruj 50 μl zawiesiny komórek na szkiełkach i pozostaw do wyschnięcia.
    6. Utrwal szkiełko 4% paraformaldehydem przez noc, a następnie zabarwij hematoksyliną-eozyną (HE). Sklasyfikuj co najmniej 400 komórek na neutrofile, makrofagi, limfocyty lub eozynofile na szkiełku.
  4. Pobieranie tkanek płuc i tchawicy do analizy histopatologicznej
    1. Po pobraniu BALF usuń i przymocuj połowę prawego płuca (Rysunek 4G) i tchawicy (Rysunek 4H) za pomocą 4% paraformaldehydu w RT do analizy histopatologicznej. Drugą połowę należy przechowywać w temperaturze -80 °C do badania metodą western blot, ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy w czasie rzeczywistym (qPCR) i testu immunoenzymatycznego (ELISA).

Wyniki

Rysunek 6 przedstawia reprezentatywne obrazy zmian patologicznych w płucach (Rysunek 6A,B), tchawicy (Rysunek 6C,D) i śledzionie (Rysunek 6E,F) barwionych HE. Zakażenie wirusem H1N1 doprowadziło do zmian zapalnych w płucach myszy, w tym do obrzęku oraz nacieku licznych limfocytów i neutrofili. Zakażenie wirusem H1N1 wywołało również zmiany zapalne w tchawicach myszy, w tym złuszczanie rzęsek oraz nacieki komórek zapalnych (liczne limfocyty i niewielka liczba neutrofili). Ponadto zakażenie istotnie zwiększyło stosunek powierzchni miazgi białej do całkowitej powierzchni śledziony myszy. Limfocyty gromadzą się w miazdze białej śledziony. Ta znormalizowana procedura pobierania próbek tkanek pozwala na lepszą ocenę stanu zapalnego dróg oddechowych.

Schemat chronologii zakażenia myszy; opisano infekcję wirusem, pomiar kaszlu oraz proces uśmiercania.
Rycina 1: Protokół tworzenia modelu kaszlu u myszy. Myszy zanieczulono pentobarbitalem sodowym i podano donosowo 0,8 x LD50 wirusa H1N1 rozpuszczonego w 50 µL PBS jednorazowo w dniu 0. Pomiar kaszlu przeprowadzono w dniu 20, a myszy uśmiercono następnego dnia. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Eksperyment na gryzoniach przedstawiający proces instylacji donosowej; obejmuje pozycje trzymania myszy.
Rysunek 2: Instylacja donosowa wirusa H1N1. (A) Instylacja donosowa 0.8 x LD50 wirusa H1N1 w 50 µL PBS. (B) Trzymanie pyska myszy zamkniętego kciukiem. (C) Ułożenie myszy w pozycji tyłem (na plecach). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Układ do pletyzmografii całego ciała do rejestracji kaszlu, z oprogramowaniem do analizy danych i nebulizatorem.
Rycina 3: Pomiar wrażliwości na kaszel. (A) Urządzenie do detekcji kaszlu u myszy i (B) krzywa odruchu kaszlowego. Liczbę epizodów kaszlu w odpowiedzi na nebulizowany roztwór kwasu cytrynowego (0.4 M) wykryto za pomocą systemu pletyzmografii całego ciała (WBP) po modelowaniu. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Procedura sekcji myszy; perfuzja serca, płukanie, izolacja organów; etapy eksperymentu biologicznego.
Rysunek 4: Reprezentatywne obrazy pobierania krwi, śledziony, BALF, płuc i tchawicy myszy. (A) Pobieranie krwi, (B) otwarcie klatki piersiowej, (C) odcięcie lewego przedsionka, (D) perfuzja krążenia płucnego, (E) pobieranie śledziony, (F) płukanie pęcherzykowo-oskrzelowe, (G) pobieranie płata płuca i (H) tchawicy do analizy histopatologicznej. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Porównanie rozmiarów końcówek mikropipety; schemat z linijką, precyzja pomiaru, sprzęt laboratoryjny.
Rysunek 5: Specyfikacja rurki do płukania oskrzelowo-pęcherzykowego. Długość rurki do płukania oskrzelowo-pęcherzykowego wynosi 5 cm. Górna średnica to 5 mm, a dolna średnica to 1 mm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Porównanie histologiczne płuc, tchawicy i śledziony; grupa kontrolna vs zakażenie H1N1; analiza mikroskopowa.
Rycina 6: Wpływ wirusa H1N1 na zmiany patologiczne w płucach, tchawicy i śledzionie myszy. (A,B) Reprezentatywne obrazy zmian patologicznych w barwionych HE przekrojach płuc w grupie (A) kontrolnej i (B) zakażonej H1N1. Symbol „↑” oznacza naciek limfocytów (czerwony) i neutrofili (niebieski). Paski skali: 50 µm. (C,D) Reprezentatywne obrazy zmian patologicznych w barwionych HE przekrojach tchawicy w grupie (C) kontrolnej i (D) zakażonej H1N1. Symbol „↑” oznacza naciek limfocytów (czerwony) i neutrofili (niebieski). Paski skali: 20 µm. (E,F) Reprezentatywne obrazy zmian patologicznych w barwionych HE przekrojach śledziony w grupie (E) kontrolnej i (F) zakażonej H1N1. Symbol „↑” oznacza miazgę białą (zielony). Paski skali: 500 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Dyskusja

Niektóre przewlekłe, oporne na leczenie i poinfekcyjne kaszle są częstymi schorzeniami związanymi z infekcją wirusową układu oddechowego27. Aby lepiej ocenić wrażliwość na kaszel i stan zapalny dróg oddechowych, w tym badaniu stworzono mysi model kaszlu przy użyciu wirusa H1N1. Do innych badań należy dobrać odpowiednie modele kaszlu myszy zgodnie z celem badania. W większości poprzednich badań wykorzystywano świnkę morską jako model zwierzęcy w badaniach mechanistycznych lub nowych próbach leków na kaszel 28,29,30. Ostatnie badania sugerują, że myszy mogą być wykorzystywane do oceny patofizjologii kaszlu ze względu na ich krótszy cykl rozrodczy, więcej odczynników i gotowość do manipulacji genetycznych, mimo że ich zachowanie kaszlu jest nadal przedmiotem dyskusji. Kwas cytrynowy był używany jako środek przeciwkaszlowy do wywoływania kaszlu w tym badaniu. Mechanizmy odruchu kaszlowego indukowanego przez kwas cytrynowy mogą być związane z aktywacją włókien C szyjnych i włókien Aδ bez dawki32. Poza tym system WBP mierzy zmiany w odruchu kaszlowym u myszy w sposób nieinwazyjny i minimalizuje skutki stresu psychologicznego. Wpływ środowiska zewnętrznego na myszy powinien być zminimalizowany po wykryciu wrażliwości na kaszel. Mysz należy umieścić w pomieszczeniu testowym, a następnie przykryć plastikową torbą, aby zmniejszyć podrażnienia spowodowane środowiskiem zewnętrznym.

Badanie to szczegółowo opisuje normatywne procedury pobierania krwi, śledziony, BALF, płuc i tchawicy myszy oraz wprowadza pewne pomiary w celu oceny stanu zapalnego dróg oddechowych. Aby wykryć stan zapalny dróg oddechowych, odcinki płuc i tchawicy są barwione hematoksyliną i eozyną w celu oceny ogólnej histopatologii24. Zwiększone stężenie białka całkowitego i kwasu moczowego w supernatancie BALF jest związane ze stanem zapalnym i uszkodzeniem komórek w drogach oddechowych33. Aktywność LDH w supernatancie BALF odzwierciedla uszkodzenie komórek i martwicę34. Leukocyty w BALF i krwi mogą odzwierciedlać stopień zapalenia choroby35. Różnicowa liczba komórek BALF jest szeroko stosowana w ocenie zapalenia dróg oddechowych w przewlekłych chorobach dróg oddechowych i dostarcza ważnych informacji w badaniu patogenezy, stawianiu diagnoz i strategiach leczenia przewlekłych chorób układu oddechowego36.

Ograniczeniem tego eksperymentu jest to, że pobranie dużej liczby próbek tkanek sprawia, że myszy są operowane przez długi czas, co może wpływać na aktywność próbek tkanek. Dlatego próbki tkanek myszy należy umieścić na lodzie natychmiast po pobraniu. Ponadto rurka do płukania oskrzelowo-pęcherzykowego użyta w tym badaniu jest odpowiednia dla myszy, ale nie dla większych zwierząt.

Podsumowując, przedstawiamy szczegółowy opis metod wykrywania kaszlu i zapalenia dróg oddechowych u myszy. Metody te dostarczają naukowcom narzędzi do badania złożonej patofizjologii kaszlu.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez Guangzhou Science and Technology Planning Project (202002030151), Major Project of Guangzhou National Laboratory (GZNL2024A02001), oraz grant State Key Laboratory of Respiratory Disease (SKLRD-Z-202202).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
4% paraformaldehydu BiosharpBL539A
Buxco System pletyzmografii całego ciała dla małych zwierząt DSI—
Bez wapnia i magnezu Hank' s Zrównoważony roztwór soliBeyotimeC0219
Kwas cytrynowySigma-AldrichC2404
Hematoksylina-EozynaBASO BiotechnologyBA-4098
Heparyna sodowa AlfaAesar A16198
Wirus grypy A/California/7/2009 (H1N1)ATCCVR-1894
IzofluranRWDR510-22
Zestaw do oznaczania dehydrogenazy mleczanowejInstytut Bioinżynierii Nanjing JianchengA020-2-2
Sól fizjologiczna zwykłaGuangzhou Zhongbo Biotechnology1234-1
PibułaPasteuraNEST318415
Pentobarbital sodowyMerckP3761
Sól fizjologiczna buforowana fosforanem MeilunbioMA0015
Zestaw do oznaczania białka całkowitegoInstytut Bioinżynierii Nanjing JianchengA045-3
Zestaw do oznaczania kwasu moczowegoThermo Fisher ScientificA22181

Bibliografia

  1. Brooks, S. M. Perspective on the human cough reflex. Cough. 7, 10(2011).
  2. Lai, K., Long, L. Current status and future directions of chronic cough in china. Lung. 198 (1), 23-29 (2020).
  3. Zeiger, R. S., et al. Patient-reported burden of chronic cough in a managed care organization. J Allergy Clin Immunol Pract. 9 (4), 1624-1637.e10 (2021).
  4. Marchant, J. M., et al. What is the burden of chronic cough for families. Chest. 134 (2), 303-309 (2008).
  5. Chamberlain, S. A., et al. The impact of chronic cough: A cross-sectional european survey. Lung. 193 (3), 401-408 (2015).
  6. Morice, A. H., et al. Expert opinion on the cough hypersensitivity syndrome in respiratory medicine. Eur Respir J. 44 (5), 1132-1148 (2014).
  7. Chung, K. F., et al. Cough hypersensitivity and chronic cough. Nat Rev Dis Primers. 8 (1), 45(2022).
  8. Deng, Z., et al. Pulmonary IFN-γ causes lymphocytic inflammation and cough hypersensitivity by increasing the number of IFN-γ-secreting t lymphocytes. Allergy Asthma Immunol Res. 14 (6), 653-673 (2022).
  9. Hiramatsu, Y., et al. The mechanism of pertussis cough revealed by the mouse-coughing model. mBio. 13 (2), e0319721(2022).
  10. Lin, L., et al. The duration of cough in patients with H1N1 influenza. Clin Respir J. 11 (6), 733-738 (2017).
  11. Deng, Z., et al. IFN-γ enhances the cough reflex sensitivity via calcium influx in vagal sensory neurons. Am J Respir Crit Care Med. 198 (7), 868-879 (2018).
  12. Chen, Z., et al. Dorsal vagal complex modulates neurogenic airway inflammation in a guinea pig model with esophageal perfusion of HCl. Front Physiol. 5, 536(2018).
  13. Zhi, H., et al. Gabapentin alleviated the cough hypersensitivity and neurogenic inflammation in a guinea pig model with repeated intra-esophageal acid perfusion. Eur J Pharmacol. 959, 176078(2023).
  14. Fang, Z., et al. Traffic-related air pollution induces non-allergic eosinophilic airway inflammation and cough hypersensitivity in guinea-pigs. Clin Exp Allergy. 49 (3), 366-377 (2019).
  15. Xiang, J., et al. Fructus mume protects against cigarette smoke induced chronic cough guinea pig. J Med Food. 23 (2), 191-197 (2020).
  16. Chen, Z., et al. A descending pathway emanating from the periaqueductal gray mediates the development of cough-like hypersensitivity. iScience. 25 (1), 103641(2022).
  17. Chen, Z., et al. Glial activation and inflammation in the nts in a rat model after exposure to diesel exhaust particles. Environ Toxicol Pharmacol. 83, 103584(2021).
  18. Mai, Y., et al. Methods for assessing cough sensitivity. J Thorac Dis. 12 (9), 5224-5237 (2020).
  19. Lee, K. K., et al. A longitudinal assessment of acute cough. Am J Respir Crit Care Med. 187 (9), 991-997 (2013).
  20. Birring, S. S., et al. Development of a symptom specific health status measure for patients with chronic cough: Leicester cough questionnaire (LCQ). Thorax. 58 (4), 339-343 (2003).
  21. Mazzone, S. B., Farrell, M. J. Heterogeneity of cough neurobiology: Clinical implications. Pulm Pharmacol Ther. 55, 62-66 (2019).
  22. Morice, A. H., Kastelik, J. A., Thompson, R. Cough challenge in the assessment of cough reflex. Br J Clin Pharmacol. 52 (4), 365-375 (2001).
  23. Nurmi, H. M., Lätti, A. M., Brannan, J. D., Koskela, H. O. Comparison of mannitol and citric acid cough provocation tests. Respir Med. 158, 14-20 (2019).
  24. Ding, W., et al. Amg487 alleviates influenza a (H1N1) virus-induced pulmonary inflammation through decreasing IFN-γ-producing lymphocytes and IFN-γ concentrations. Br J Pharmacol. 181 (13), 2053-2069 (2024).
  25. Connett, G. J. Bronchoalveolar lavage. Paediatr Respir Rev. 1 (1), 52-56 (2000).
  26. Wu, X., et al. Correlation of adhesion molecules and non-typeable haemophilus influenzae growth in a mice coinfected model of acute inflammation. Microbes Infect. 23 (8), 104839(2021).
  27. Capristo, C., Rossi, G. A. Post-infectious persistent cough: Pathogenesis and therapeutic options. Minerva Pediatr. 69 (5), 444-452 (2017).
  28. Kollarik, M., Brozmanova, M. Cough and gastroesophageal reflux: Insights from animal models. Pulm Pharmacol Ther. 22 (2), 130-134 (2009).
  29. Driessen, A. K., et al. A role for neurokinin 1 receptor expressing neurons in the paratrigeminal nucleus in bradykinin-evoked cough in guinea-pigs. J Physiol. 598 (11), 2257-2275 (2020).
  30. Ruhl, C. R., et al. Mycobacterium tuberculosis sulfolipid-1 activates nociceptive neurons and induces cough. Cell. 181 (2), 293-305.e211 (2020).
  31. Chen, L., Lai, K., Lomask, J. M., Jiang, B., Zhong, N. Detection of mouse cough based on sound monitoring and respiratory airflow waveforms. PLoS One. 8 (3), e59263(2013).
  32. Wallace, E., Guiu Hernandez, E., Ang, A., Hiew, S., Macrae, P. A systematic review of methods of citric acid cough reflex testing. Pulm Pharmacol Ther. 58, 101827(2019).
  33. Ding, W., et al. Intrapulmonary ifn-γ instillation causes chronic lymphocytic inflammation in the spleen and lung through the CXCR3 pathway. Int Immunopharmacol. 122, 110675(2023).
  34. Liu, B., et al. Anti-IFN-γ therapy alleviates acute lung injury induced by severe influenza a (H1N1) pdm09 infection in mice. J Microbiol Immunol Infect. 54 (3), 396-403 (2021).
  35. Domagała-Kulawik, J. Bal in the diagnosis of smoking-related interstitial lung diseases: Review of literature and analysis of our experience. Diagn Cytopathol. 36 (12), 909-915 (2008).
  36. Miyata, Y., et al. The effect of bronchoconstriction by methacholine inhalation in a murine model of asthma. Int Arch Allergy Immunol. 181 (12), 897-907 (2020).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Przewlek y kaszeldetekcja kaszlupletyzmografia ca ego cia ap ukanie p cherzykowo oskrzelowebarwienie hematoksylin i eozynliczba leukocyt wpomiar cytokin w ledzioniemysi model H1N1histopatologia p uc
Metody wykrywania kaszlu i zapalenia dróg oddechowych u myszy
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.