Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Kompleksowy proces oceny skuteczności erytropoezy u ludzi in vitro i ex vivo

1.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/67123

⸱

10 stycznia 2025

 ,  , 
1Centre de Lutte contre le cancer Eugène Marquis, INSERM U1242, University of Rennes, 2Barts Cancer Institute, Queen Mary University of London

W tym artykule

Podsumowanie

Modelowanie erytropoezy daje cenną szansę na zrozumienie biologicznego znaczenia aktorów w tym procesie i ocenę nowych podejść terapeutycznych, które mogą złagodzić wady różnicowania. W tym miejscu opisujemy prostą i niezawodną metodę skutecznego różnicowania hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych CD34+ ex vivo.

Streszczenie

Erytropoeza, niezwykle dynamiczny i wydajny proces odpowiedzialny za generowanie dziennego limitu czerwonych krwinek (około 280 ± 20 miliardów komórek dziennie), jest kluczowa dla utrzymania indywidualnego zdrowia. Każde zakłócenie tej ścieżki może mieć poważne konsekwencje, prowadząc do problemów zdrowotnych. Według Światowej Organizacji Zdrowia szacuje się, że 25% światowej populacji ma objawy niedokrwistości. Protokół ten opisuje, w jaki sposób generować ludzkie komórki erytroidalne zarówno in vitro, jak i krwiotwórcze komórki macierzyste i progenitorowe (HSPC) ze źródeł takich jak krew pępowinowa (UCB) lub krew pobrana od zdrowych dawców i ex vivo z HSPC wyizolowanymi ze szpiku kostnego pacjenta. Korzystając z podejścia genetycznego, interesujące geny mogą być modulowane w HSPC, a ich wpływ na erytropoezę może być monitorowany na różnych etapach procesu różnicowania. Metoda ta pozwala na badanie przesiewowe związków zaburzających, wzmacniających lub ratujących zdolność HSPC do różnicowania się w dojrzałe komórki erytroidalne oraz na badanie roli genów będących przedmiotem zainteresowania w procesie różnicowania erytroidalnego.

Wprowadzenie

Każdego dnia około 280 miliardów czerwonych krwinek (RBC) jest wytwarzanych w szpiku kostnym, aby zapewnić transport tlenu przez całe ciało1. Erytropoeza to precyzyjnie dostrojony proces różnicowania, w którym powstają dojrzałe, funkcjonalne czerwone krwinki z hematopoetycznych komórek macierzystych. Wiele chorób, zarówno nabytych, jak i wrodzonych, może wpływać na ten proces, w tym zespół mielodysplastyczny, niedokrwistość aplastyczna, talasemia i wrodzona niedokrwistość dyserytropoetyczna2.

Klinicznym objawem zaburzonej erytropoezy jest niedokrwistość, główna przyczyna zachorowalności na całym świecie. Objawy niedokrwistości wahają się od zmęczenia, duszności i zawrotów głowy po stany zagrażające życiu, takie jak niewydolność serca i zatrzymanie akcji serca3. Ponieważ niedokrwistość dotyka 1,8 miliarda ludzi na całym świecie4, modelowanie erytropoezy ex vivo w celu zbadania tych stanów i ich mechanizmów leżących u ich podstaw pozostaje globalnym priorytetem. Opisana tutaj metoda ma na celu zapewnienie prostego i solidnego modelu do badania różnicowania erytroidalnego zarówno zdrowych, jak i chorych. Model ten pozwala na rozbiór ról poszczególnych genów w tym procesie i umożliwia testowanie związków, które mogą przynieść korzyści pacjentom z anemią. Historycznie rzecz biorąc, modelowanie nieefektywnej erytropoezy wiązało się z wieloma wyzwaniami, w tym z niedoborem komórek macierzystych w niektórych chorych szpikach kostnych i trudnościami w naśladowaniu niszy szpiku kostnego.

Poprzednie badania używały podobnych lub bardziej złożonych protokołów; na przykład, Bondu i wsp. używali koktajlu cytokin, w tym erytropoetyny (EPO), czynnika komórek macierzystych (SCF) i interleukiny-6 (IL6) przez 4 dni przed usunięciem IL6 z koktajlu różnicowania erytroidalnego, natomiast Yip i wsp. dodali EPO do swojego koktajlu cytokin dopiero po 7 dniach płynnej hodowli. Elvarsdóttir i in. opracowali trójwymiarowy (3D) model hodowli komórek CD34+, aby ułatwić najwyższą ekspansję i dojrzewanie komórek erytroidalnych, w tym generowanie wysp erytroblastycznych i wyłuszczonych erytrocytów, które są ważne dla badania zjawisk takich jak syderoblasty pierścieniowe5,6,7,8. Protokół ten wykorzystuje tylko trzy cytokiny podczas namnażania komórek (tj. SCF, trombopoetynę [TPO] i kinazę tyrozynową 3 podobną do FMS [FLT3]) i trzy cytokiny utrzymywane przez cały proces różnicowania (tj. EPO, IGF1 i SCF). Jednym z kluczowych kryteriów wspólnych dla tych różnych badań jest wykorzystanie komórek CD34+. Chociaż pochodzenie tych komórek jest różne, są one konsekwentnie stosowane w tych różnych protokołach. Źródła mogą wahać się od nieinwazyjnego pobierania UCB do bardziej inwazyjnych procedur w celu uzyskania próbek szpiku kostnego dla dorosłych, które można pobrać od pacjentów zmobilizowanych za pomocą czynnika stymulującego tworzenie kolonii granulocytów (G-CSF) lub po nakłuciu szpiku kostnego. Ogólnie rzecz biorąc, modele hodowli płynnych są przenoszone przez 14 dni, podczas gdy modele 3D mogą utrzymywać komórki przez dłuższy czas. Protokoły te są niezbędne do modelowania chorób genetycznych i zakłóceń erytropoezy. Podejścia genetyczne, takie jak knockdowny krótkiego spinki RNA (shRNA), mogą być wykorzystane do wyciszenia interesujących genów i zbadania ich roli w erytropoezie. Wpływ wyciszania genów może być następnie monitorowany na różnych etapach różnicowania, dostarczając ex vivo ludzki model produkcji czerwonych krwinek do badania niedokrwistości zarówno w zdrowiu, jak i chorobie. Protokół ten obejmuje transdukcję komórek krwi pępowinowej CD34 + za pomocą shRNA, które konstytutywnie wyrażają gen reporterowy, taki jak wzmocnione białko zielonej fluorescencji (EGFP), umożliwiając sortowanie próbek przez sortowanie komórek aktywowane fluorescencją (FACS). Komórki są następnie inkubowane w pożywkach różnicujących przez 2 tygodnie i monitorowane za pomocą analizy cytometrii przepływowej i barwienia immunochemicznego.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Badania na pierwotnych próbkach zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi (REC reference: 21/EE/0133; ID projektu IRAS: 283103).

1. Produkcja lentiwirusa

UWAGA Lentiwirusy muszą być produkowane w laboratorium o poziomie bezpieczeństwa biologicznego L2 w sterylnych warunkach. Należy nosić wszystkie wymagane środki ochrony osobistej w tym laboratorium, w tym podwójne rękawice. Zanieczyszczony materiał jest odkażany wirusobójczym środkiem dezynfekującym przed wyrzuceniem do autoklawizowanego pojemnika. W tym przypadku do zilustrowania procesu wykorzystuje się mieszanie shRNA (kontrolę) zawierającą gen reporterowy EGFP.

Dzień 1

  1. Żelatynę rozgrzać w temperaturze 37 °C w łaźni wodnej, aż całkowicie się rozpuści. Rozcieńczyć żelatynę o stężeniu 0,1% w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS).
  2. Posmaruj naczynie o średnicy 150 mm 2 ml 0,1% żelatyny. Użyj 2 naczyń na wirusa. Inkubować naczynia przez 30 minut w temperaturze 37 °C.
  3. Wysiewać 5 milionów HEK293T komórek na naczyniu pokrytym żelatyną w 20 ml 10% zmodyfikowanego podłoża Dulbecco Eagle′s Medium (DMEM) i umieścić komórki w inkubatorze w temperaturze 37 °C.

Dzień 2

  1. Sprawdź, czy komórki osiągnęły około 50% konfluencji. Zmień pożywkę na 22 ml 10% DMEM bez naruszania warstwy komórkowej 2 godziny przed transfekcją.
  2. Przygotuj mieszankę do transfekcji.
    UWAGA: Na każde danie przygotowuje się jedną mieszankę transfekcyjną, ponieważ większa objętość może mieć wpływ na tworzenie się osadu fosforanu wapnia.
    1. Przygotować mieszaninę reakcyjną w probówce wirówkowej o pojemności 15 ml w następujący sposób: 32 μg plazmidu, 20 μg plazmidu PAX (pCMVdR8.74), 9 μg plazmidu VSVG (pMD.G2) i zwiększyć objętość do 1125 μl za pomocąH2O.
    2. Dodać 125 μl CaCl2 do reakcji i inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej (RT) na walcu.
    3. Przygotuj 1,25 ml 2x HEPES w osobnej probówce wirówkowej o pojemności 15 ml.
    4. Dodaj 2x HEPES kropla po kropli do mieszaniny reakcyjnej, delikatnie wirując, a następnie umieść mieszaninę na wałku na 10 minut w temperaturze pokojowej.
  3. Dozować reakcję kropla po kropli na komórki w spiralny wzór i umieścić komórki w inkubatorze w temperaturze 37 °C po delikatnym przesunięciu płytki w kształcie krzyża w celu homogenizacji podłoża.

Dzień 3

  1. Zamień pożywkę na 16 ml 10% DMEM bez naruszania warstwy komórki.

Dzień 4

  1. Zebrać sklarowany osad i przechowywać go przez noc w temperaturze 4 °C. Dodaj 16 ml świeżego DMEM do każdej płytki bez naruszania warstwy komórkowej.

Dzień 5

  1. Zebrać supernatant i połączyć go z supernatantem od 4 dnia. Filtr usuwający zanieczyszczenia za pomocą filtra 0,45 μM.
  2. Przenieść każde 30 ml (dzień 4 + dzień 5) supernatantu do stożkowej probówki do ultrawirowania. Dodaj rurki do wiadra wahadłowego, w razie potrzeby z adapterami do stożkowego dna.
  3. Zrównoważyć probówki twarzą w twarz z dokładnością do 0,02 g i ultrawirować przy 90 000 x g przez 2 godziny w temperaturze 4 °C.
  4. Odrzucić sklarowany osad i dodać 200 μl pożywki z komórek macierzystych do probówki. Zamknąć probówki parafilmem i inkubować probówkę w chłodnym pomieszczeniu przez 2-4 godziny pod mieszaniem.
  5. Przygotować 20 μl porcji każdego wirusa i przechowywać fiolki w temperaturze -80 °C. Zachować 2 μl każdego wirusa i dodać 400 μl DMEM.
    UWAGA: To rozcieńczenie będzie używane do miareczkowania.

2. Miareczkowanie lentiwirusa

UWAGA Lentiwirusy muszą być przetwarzane w laboratorium o poziomie bezpieczeństwa biologicznego L2 w sterylnych warunkach. Należy nosić wszystkie wymagane środki ochrony osobistej w tym laboratorium, w tym podwójne rękawice. Zanieczyszczony materiał jest odkażany wirusobójczym środkiem dezynfekującym przed wyrzuceniem do autoklawizowanego pojemnika.

  1. Wysiewaj HEK293T na płytce 24-dołkowej. Dodać 50 000 komórek/studzienkę w 500 μL 10% DMEM.
    UWAGA: Użyj 6 dołków na wirusa i zachowaj jedną studzienkę dla komórek nietransdukowanych.
  2. Wykonaj transdukcję. Dodać różne studzienki: 2 μl, 4 μl, 8 μl, 16 μl, 32 μl i 64 μl rozcieńczonego wirusa z kroku 1.13. Delikatnie homogenizować.
  3. Zmień pożywkę 24 godziny później, dodając 500 μL 10% DMEM.
  4. W 4 dniu po transdukcji przygotuj komórki do cytometrii przepływowej.
    1. Przygotować bufor FACS z PBS, 2% płodową surowicą bydlęcą (FBS), 1% penicyliną-streptomycyną (P/S), 2 mM kwasem etylenodiaminotetraoctowym (EDTA) i 1/2,000 4′,6-diamidyn-2-fenyloindolem (DAPI).
    2. Usunąć supernatant i dodać 500 μl buforu FACS bezpośrednio z EDTA do każdej studzienki.
    3. Odłącz komórki, pipetując w górę i w dół.
  5. Przefiltruj komórki przez sitko o wielkości 40 μm i przenieś je do probówek FACS.
  6. Określ procent komórek EGFP za pomocą cytometrii przepływowej.
  7. Skonfiguruj następujące bramy:
    1. Skonfiguruj DAPI w stosunku do rozproszonego bocznego (SSC-A), aby wykluczyć martwe komórki.
    2. Skonfiguruj wysokość SSC (SSC-H) w stosunku do obszaru SSC (SSC-A), aby wykluczyć agregacje komórek i wybrać pojedyncze komórki.
    3. Ustaw obszar rozproszenia do przodu (FSC-A) w porównaniu z SSC-A, aby zabramować komórki i usunąć zanieczyszczenia w zależności od rozmiaru.
    4. Ustaw białko zielonej fluorescencji (GFP) w porównaniu z SSC-A, aby wybrać komórki GFP+.
  8. Miano wirusa.
    1. Obliczyć stężenie cząstek (liczbę cząstek/ml) dla każdego warunku:
    2. Komórki EGFP x Czynnik rozcieńczenia wirusa (200) x Liczba wysiewanych komórek x1000)/ objętość wirusa.
      UWAGA: Na przykład, komórki traktowano 64 μl wirusa rozcieńczonego w stosunku 1/200. Po analizie cytometrii przepływowej 54% komórek miało EGFP+. W tych warunkach miano będzie wynosić (54% x 200 x 50 000 x 1000)/64 = 8,44 x 107 cząstek/ml.

3. Przenoszenie komórek CD34+ wyizolowanych z krwi pępowinowej

UWAGA Ta część jest wykonywana w sterylnych warunkach. Tutaj komórki UCB CD34 + (czystość >85%) są transdukowane jednym shRNA (kontrolnym) zawierającym reporter eGFP. Eksperyment przeprowadza się na trzech powtórzeniach technicznych. Proporcje muszą być dostosowane do liczby próbek.

Dzień 1

  1. Przygotuj następujące podłoże i bufor:
    1. Przygotować pożywkę do rozmrażania: FBS uzupełniony o 1% P/S i 10 μg/ml DNAzy
    2. Przygotuj bufor FACS: PBS uzupełniony 1% P/S i 2% FBS (± 10 μg/ml DNAse)
    3. Przygotuj pożywkę stymulacyjną (w pożywce z komórek macierzystych), dodając 150 ng/ml SCF, 150 ng/ml FLT-3, 10 ng/ml IL-6, 25 ng/mL G-CSF, 20 ng/ml TPO i 1% HEPES.
  2. Rozmrozić 100 000 komórek CD34+ UCB, zanurzając na 30 s w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C. Do każdej fiolki dodać kroplami 1 ml pożywki do rozmrażania, a następnie delikatnie zawiesić ponownie, pipetując w górę iw dół.
  3. Delikatnie przenoś zawiesinę komórek kropla po kropli w łącznej ilości 5 ml podłoża do rozmrażania.
    UWAGA: Aby uniknąć utraty komórek, należy odłożyć na bok 2 ml porcji pożywki do rozmrażania, która zostanie użyta na końcu do umycia końcówki i fiolki.
  4. Wirować przez 8 minut przy 320 x g w suchej smosji. Umyć komórki w 10 ml buforu FACS + DNAse.
  5. Wirować przez 8 minut przy 320 x g przy suchej temperaturze względnej. Zawiesić osad komórkowy w 2 ml pożywki stymulacyjnej (końcówka płucząca i probówka z podłożem stymulującym).
  6. Policz komórki, używając 5 μl zawiesiny komórek i 5 μl błękitu trypanowego.
    UWAGA: Celuj w minimum 75 000 komórek (25 000 komórek/warunek).
  7. Przenieść 2 ml zawiesiny komórkowej na płytkę 24-dołkową i inkubować przez ≥4-6 godzin w temperaturze 37 °C.
    UWAGA: Na tym etapie wszystkie komórki (75 000-100 000) są wysiewane w jednym dołku.
  8. Zebrać komórki w probówkach FACS i uzupełnić 1 ml pożywki z komórkami macierzystymi. Wirować przez 8 minut przy 320 x g przy wilgotności względnej.
  9. Rozmrozić wirusa i dodać wymaganą objętość do pożywki stymulacyjnej przy wielokrotności infekcji (MOI) wynoszącej 30.
  10. Ponownie zawiesić granulowane komórki w pożywce zawierającej wirusa w ilości 100 000 komórek na 100 μl wirusa w 1 dołku na 96-dołkowej płytce. Dodać PBS do pustych studzienek i inkubować przez noc w temperaturze 37 °C.

Dzień 2

  1. Przygotować pożywkę ekspandacyjną (w pożywce z komórek macierzystych), dodając 150 ng/ml SCF, 150 ng/ml FLT3-L i 20 ng/ml TPO.
  2. Dodać pełną objętość zawiesiny komórkowej z 96-dołkowej płytki do probówek FACS z 1 ml pożywki z komórkami macierzystymi. Umyj studzienkę i końcówkę pożywką z komórek macierzystych, co powoduje dodanie 2 ml pożywki z komórek macierzystych do zawiesiny komórek w probówce FACS.
  3. Wirować przez 8 minut przy 320 x g przy wilgotności względnej.
  4. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w 2 ml pożywki ekspandercyjnej. Dodać zawiesinę komórkową do 24-dołkowej płytki (umyć studzienkę i końcówkę w procesie, aby uzyskać w sumie 2 ml). Inkubować komórki przez 4 dni w temperaturze 37 °C.
    UWAGA: Sortowanie komórek jest następnie wykonywane w dniu 7.

4. CD34+ EGFP+ Sortowanie komórek i różnicowanie erytroidalne

UWAGA Ta część jest wykonywana w sterylnych warunkach.

  1. Przygotuj następujące podłoże i buffer.
    UWAGA: Pożywki z cytokinami muszą być przygotowane na świeżo:
    1. Przygotuj bufor FACS, uzupełniając PBS o 1% P/S i 2% FBS.
    2. Przygotować pożywkę ekspandacyjną (w pożywce z komórek macierzystych), dodając 150 ng/ml SCF, 150 ng/ml FLT3-L i 20 ng/ml TPO.
    3. Przygotuj pożywkę do różnicowania erytrocytów (w pożywce z komórek macierzystych), dodając 25 ng/ml SCF, 3 U/ml EPO i 50 ng/ml IGF1.
    4. Przygotuj 2x pożywkę różnicującą erytrocyty (w pożywce z komórek macierzystych), dodając 50 ng / ml SCF, 6 U / ml EPO i 100 ng / ml IGF1.
  2. Dodaj pełną objętość komórek do oddzielnej probówki FACS (umyj studzienkę i zakończ proces pożywką z komórek macierzystych). Wirować przez 8 minut przy 320 x g w suchej temperaturze tonacji. Zawiesić granulowane komórki w 100 μl buforu FACS.
  3. Dodać 5 μl CD34 Ab/probówkę i inkubować w ciemności w temperaturze 4 °C przez 20 minut.
  4. Zawiesić komórki w 1 ml buforu FACS za pomocą DAPI (rozcieńczenie 1/2000 w buforze FACS) i wirować przez 8 minut przy 320 x g w temperaturze pokojowej.
  5. Ponownie zawiesić komórki w 200 μl buforu FACS za pomocą DAPI (rozcieńczenie 1/2000 w buforze FACS) i przefiltrować komórki przez sitko 40 μM przed sortowaniem.
  6. Przygotuj koraliki do kontroli:
    1. Dodać 0,5 μl przeciwciała CD34 (Ab) do 1 kropli kulek w 100 μl PBS i inkubować w ciemności w temperaturze 4 °C przez 20 minut.
    2. Dodaj 1 ml PBS. Wirować przez 8 minut przy 320 x g w temperaturze pokojowej tonacji. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w 500 μl PBS.
  7. Przygotowanie linii komórek białaczkowych do kontroli GFP.
    UWAGA: Użyj dowolnej dostępnej linii komórkowej GFP+ jako kontroli; Zamiast tego można użyć koralików.
    1. Dodaj komórki GFP- (2 probówki FACS po 100 000 komórek) i GFP+ (1 probówka FACS po 100 000 komórek) w probówce FACS.
      UWAGA: W sumie 3 tuby.
    2. Umyj komórki w 1 ml buforu FACS. Wirować przez 8 minut przy 320 x g przy wilgotności względnej.
    3. Ponownie zawiesić 100 000 komórek GFP w 500 μl buforu FACS (niebarwione), 100 000 komórek GFP- w 500 μl buforu FACS z DAPI (rozcieńczenie 1/2000 w buforze FACS) (barwione DAPI) i 100 000 komórek GFP+ w 500 μl buforu FACS (komórki GFP+).
      UWAGA: Rurki kontrolne będą używane do ustawień bramkowania i kompensacji na cytometrze przepływowym. Jeśli użyte ogniwa są w 100% GFP, do probówki można dodać ogniwa GFP (50 000 komórek GFP i 50 000 ogniw GFP+).
    4. Przed sortowaniem przefiltrować komórki przez sitko o średnicy 40 μm.
  8. Skonfiguruj następujące bramy:
    1. Skonfiguruj DAPI w stosunku do rozproszonego bocznego (SSC-A), aby wykluczyć martwe komórki.
    2. Skonfiguruj wysokość SSC w stosunku do obszaru SSC (SSC-A), aby wykluczyć agregacje komórek i wybrać pojedyncze komórki.
    3. Ustaw obszar rozproszenia do przodu (FSC-A) i SSC-A, aby usunąć zanieczyszczenia na podstawie rozmiaru.
    4. Skonfiguruj GFP i SSC-A, aby wybrać komórki GFP+.
    5. Skonfiguruj CD34 (PerCP-Cy5.5) i SSC-A, aby wybrać komórki CD34+.
  9. Odwróć probówkę FACS do zbierania komórek przed pobraniem komórek, aby pokryć ścianki probówki FBS.
  10. Zbierz komórki w pożywce z komórkami macierzystymi.
    UWAGA: Celuj w 75 000-80 000 komórek (25 000 komórek x 3)
  11. Wirować przez 8 minut przy 320 x g w temperaturze pokojowej i ponownie zawiesić komórki w 3 ml pożywki do różnicowania erytroidalnego.
  12. Ponownie zawiesić, a następnie dozować 1 ml na studzienkę do 3 dołków 24-dołkowej płytki. Napełnij wszystkie zewnętrzne studzienki PBS.
  13. Wykonuj połowę wyczerpania pożywki co drugi dzień i zastąp ją 2x pożywką do różnicowania erytrocytów.
    1. Aby odświeżyć nośnik, upewnij się, że komórki są osadzone na dnie płytki. Delikatnie odchudź płytkę i wyjmij 500 μl podłoża.
    2. Odświeżyć, dodając 500 μl z 2x pożywką do różnicowania erytroidów cytokin.
    3. Przenieś komórki w dniu 6 na płytkę 12-dołkową i dodaj 1 ml pożywki, aby uzyskać końcową objętość 2 ml.

5. Analiza różnicowania erytroidalnego za pomocą cytometrii przepływowej dwa razy w tygodniu od 6 do 14 dnia

  1. Przygotuj następujące podłoże i bufor.
    1. Przygotuj bufor FACS, uzupełniając PBS o 1% P/S i 2% FBS
    2. Przygotuj pożywkę do różnicowania erytrocytów (w pożywce z komórek macierzystych), dodając 25 ng/ml SCF, 3 U/ml EPO i 50 ng/ml IGF1.
  2. Zbierz 200 μl komórek z każdej studzienki 12-dołkowej płytki i zastąp je 250 μl 2x erytroidalnych pożywek różnicujących. Dodać 1 ml buforu FACS do każdej probówki.
  3. Wirować przez 8 minut przy 320 x g w suchej temperaturze tonacji. Zawiesić granulowane komórki w 100 μl buforu FACS.
  4. Dodać 1 μl CD71 Ab (1/100), 1 μl CD34 Ab (1/100) i 1 μl CD235a Ab (1/100) i inkubować w ciemności w temperaturze 4 °C przez 20 min.
  5. Zawiesić komórki w 1 ml buforu FACS za pomocą DAPI (rozcieńczenie 1/2000 w buforze FACS). Wirować przez 8 minut przy 320 x g przy wilgotności względnej.
  6. Ponownie zawiesić komórki w 200 μl buforu FACS za pomocą DAPI (rozcieńczenie 1/2000 w buforze FACS).
  7. Przygotuj koraliki do kontroli:
    1. Dodaj 1 kroplę kompensacyjną do dwóch probówek w 100 μl PBS, a następnie dodaj 0,55 μl pojedynczego przeciwciała do każdej probówki, aby uzyskać kontrolę pojedynczego barwienia (jedna dla CD34, jedna dla CD71 i jedna dla CD235a).
      UWAGA: 1 kropla jest wystarczająca dla obu elementów sterujących.
    2. Inkubować w ciemności w temperaturze 4 °C przez 20 minut. Dodać 1 ml PBS.
    3. Wirować przez 8 minut przy 320 x g w temperaturze pokojowej tonacji. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w 500 μl PBS.
  8. Przygotuj linię komórek białaczkowych do kontroli.
    UWAGA: Komórki K562 wyrażają marker CD71 i mogą być używane jako kontrola pozytywna do ustawienia FACS.
    1. Dodaj komórki GFP (2 probówki FACS ze 100 000 komórek) i komórki GFP+ (1 probówka FACS ze 100 000 komórek) do probówki FACS.
    2. Umyj komórki w 1 ml buforu FACS. Wirować przez 8 minut przy 320 x g przy wilgotności względnej.
    3. Ponownie zawieś 100 000 komórek GFP w buforze FACS (niebarwione), 100 000 komórek GFP- w buforze FACS z DAPI (rozcieńczenie 1/2000 w buforze FACS) (barwione DAPI) i 100 000 komórek GFP+ w buforze FACS (komórki GFP+).
  9. Skonfiguruj następujące bramy:
    1. Skonfiguruj DAPI w stosunku do rozproszonego bocznego (SSC-A), aby wykluczyć martwe komórki.
    2. Skonfiguruj wysokość SSC w stosunku do obszaru SSC (SSC-A), aby wykluczyć agregacje komórek i wybrać pojedyncze komórki.
    3. Ustaw obszar rozproszenia do przodu (FSC-A) i SSC-A, aby usunąć zanieczyszczenia na podstawie rozmiaru.
    4. Skonfiguruj CD235a (APC-Cy7) w porównaniu z CD71 (PE).
    5. Skonfiguruj CD34 (PerCP-Cy5.5) w porównaniu z SSC-A.
  10. Uruchom próbkę niebarwionych ogniw GFP i w pełni wybarwionych ogniw w celu dostosowania napięcia tak, aby ogniwa znajdowały się we właściwym miejscu.
  11. Uruchom koraliki, komórki GFP+ i komórki barwione DAPI. Skompensuj i zastosuj kompensację do ustawień cytometru.
  12. Uruchom próbki i zarejestruj zdarzenia.

6. Analiza różnicowania erytroidalnego za pomocą barwienia Giemsy

  1. Przygotuj 5 słoików do barwienia szkiełek:
    1. Przygotuj słoik do barwienia szkiełek z roztworem błękitu eozynowo-metylenowego 1:1 firmy May-Grünwald i PBS.
    2. Przygotuj słoik do barwienia szkiełek z 2,5 ml bulionu Giemsa + 50 ml PBS.
    3. Przygotuj słoik do barwienia szkiełek z wodą destylowaną.
    4. Przygotuj słoik do barwienia szkiełek z PBS.
    5. Przygotuj słoik do barwienia szkiełek z lodowatym zimnym metanolem.
  2. Zbierz 100 000 komórek w celu optymalnego barwienia, dodaj 1 ml PBS i odwiruj 300 x g przez 5 minut.
  3. Wyrzucić pożywkę i ponownie zawiesić w 150 μl PBS.
  4. Przygotować szkiełka, bibułę filtracyjną i adapter stożkowy do cytowirówki i powoli wrzucać preparat komórkowy do adaptera stożkowego.
  5. Wirować z prędkością 800 x g przez 3 minuty. Wyjmij szkiełka i umieść je w słoiku ze szkiełkiem metanolowym w lodzie na 15 minut.
  6. Zanurzyć szkiełka w roztworze Maya-Grünwalda na 5 minut i od czasu do czasu mieszać, aby zapewnić prawidłowe zabarwienie.
  7. Następnie zanurz szkiełka w słoiku PBS, aż plama nie spłynie.
  8. Zanurz szkiełka w roztworze Giemsa na 20 minut i od czasu do czasu mieszaj, aby zapewnić prawidłowe zabarwienie.
  9. Ostrożnie zanurz szkiełka w PBS, aż plama nie spłynie.
  10. Pozostaw szkiełka w PBS przez dodatkowe 3 minuty.
  11. Szybko zanurz szkiełka w wodzie destylowanej i wysusz na powietrzu w temperaturze pokojowej.
  12. Dodaj kroplę żywicy syntetycznej na każde miejsce komórek i delikatnie nałóż szkiełko nakrywkowe na wierzch.
  13. Pozostaw szkiełka do wyschnięcia na 1 godzinę w temperaturze mokrej i uszczelnij szkiełko nakrywkowe lakierem do paznokci, aby zapobiec wysychaniu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Komórki CD34+ z krwi pępowinowej lub szpiku kostnego są najpierw rozmrażane, stymulowane i transdukowane shRNA wykazującym ekspresję GFP (Rycina 1A). Komórki CD34+GFP+ są sortowane 4 dni po transdukcji zgodnie ze strategią bramkowania przedstawioną na Rycynie 1B. Reprezentatywne wyniki wykazały dojrzewanie komórek CD34+ po transdukcji i sortowaniu metodą FACS. Komórki są analizowane (1) za pomocą cytometrii przepływowe...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W tym miejscu opisaliśmy skuteczną i niezawodną metodę indukowania różnicowania erytroidalnego hematopoetycznych komórek macierzystych CD34 + (HSPC) wyizolowanych ze szpiku kostnego dorosłego (BM) lub z krwi pępowinowej (UCB). Proces ten obejmuje edycję/modyfikację komórek pierwotnych w celu zbadania funkcji dowolnego genu będącego przedmiotem zainteresowania podczas procesu różnicowania erytroidalnego. Metoda ta została z powodzeniem wykorzystana do zbadania funkcjonalnego znaczenia genów, które wcześniej nie...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

C.P., S.B. i K.RP. byli wspierani przez program HARP, Barts Charity (G-002167), Kay Kendall Leukaemia Fund (KKL1149) i Akademię Nauk Medycznych (SBF004\1099). Dziękujemy dr Pantelitsa Protopapa za barwienie MGG i nabycie mikroskopii. Doceniamy również urządzenia do cytometrii przepływowej i mikroskopii Barts Cancer Institute, Queen Mary University of London. Dziękujemy brytyjskiej organizacji charytatywnej Anthony Nolan, za dostarczenie nam jednostek krwi pępowinowej użytych w tym manuskrypcie.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
2x Koraliki HEPESMerck51558
Thermo Scientific01-2222-42
CD235a APC Cy7Biolegend349115
CD34 Przeciwciało PerCP Cy5.5Przeciwciało BD Biosciences347222
CD71 PEBiolegend334106
DAPIMerckD9542
DMEMThermo Scientific41966-029
DNAseMerckD4527-200KU
DPX medium montażowe VWR1.00579.0500
FACSAria Fusion BD BiosciencesNA
FBSMerckF9665
ŻelatynaMerckG1393
Roztwór GiemsaAbcamab150670
HEPESMerckH0887-100mL
Ludzki EPOPeproTech100-64
Ludzki ligand Flt-3PeproTech300-19
Ludzki G-CSFPeproTech300-23
Ludzki IGF1PeproTech100-11
Ludzki IL-6PeproTech200-06
Ludzki SCFPeproTech300-07
Ludzki TPOPeproTechAF-300-18
LSRFortessa Analizator komórekBD BiosciencesNA
Maj-Grunwald rozwiązanie Generon26250-01
Pannoramic 250 Skaner o wysokiej przepustowości 3DHISTECHNA
Penicylina/StreptomycynaThermo Scientific15140-122
Shandon Cytospin 3 Thermo ScientificNA
Stem Cell Medium Średnietechnologie komórek macierzystych9655

Bibliografia

  1. Sender, R., Milo, R. The distribution of cellular turnover in the human body. Nat Med. 27 (1), 45-48 (2021).
  2. Cazzola, M. Ineffective erythropoiesis and its treatment. Blood. 139 (16), 2460-2470 (2022).
  3. Silverberg, D. S., Iaina, A., Wexler, D., Blum, M. The pathological consequences of anaemia. Clin Lab Haematol. 23 (1), 1-6 (2001).
  4. Safiri, S., et al. Burden of anemia and its underlying causes in 204 countries and territories, 1990-2019: results from the Global Burden of Disease Study 2019. J Hematol Oncol. 14 (1), 185(2021).
  5. Bondu, S., et al. A variant erythroferrone disrupts iron homeostasis in SF3B1-mutated myelodysplastic syndrome. Sci Transl Med. 11 (500), eaav5467(2019).
  6. Elvarsdottir, E. M., et al. A three-dimensional in vitro model of erythropoiesis recapitulates erythroid failure in myelodysplastic syndromes. Leukemia. 34 (1), 271-282 (2020).
  7. Yip, B. H., et al. Effects of L-leucine in 5q- syndrome and other RPS14-deficient erythroblasts. Leukemia. 26 (9), 2154-2158 (2012).
  8. Clough, C. A., et al. Coordinated missplicing of TMEM14C and ABCB7 causes ring sideroblast formation in SF3B1-mutant myelodysplastic syndrome. Blood. 139 (13), 2038-2049 (2022).
  9. Chao, R., Gong, X., Wang, L., Wang, P., Wang, Y. CD71(high) population represents primitive erythroblasts derived from mouse embryonic stem cells. Stem Cell Res. 14 (1), 30-38 (2015).
  10. Loken, M. R., Shah, V. O., Dattilio, K. L., Civin, C. I. Flow cytometric analysis of human bone marrow: I. Normal erythroid development. Blood. 69 (1), 255-263 (1987).
  11. Marsee, D. K., Pinkus, G. S., Yu, H. CD71 (transferrin receptor): an effective marker for erythroid precursors in bone marrow biopsy specimens. Am J Clin Pathol. 134 (3), 429-435 (2010).
  12. Berastegui, N., et al. The transcription factor DDIT3 is a potential driver of dyserythropoiesis in myelodysplastic syndromes. Nat Commun. 13 (1), 7619(2022).
  13. Mian, S. A., et al. Vitamin B5 and succinyl-CoA improve ineffective erythropoiesis in SF3B1-mutated myelodysplasia. Sci Transl Med. 15 (685), eabn5135(2023).
  14. Armes, H., et al. Germline ERCC excision repair 6 like 2 (ERCC6L2) mutations lead to impaired erythropoiesis and reshaping of the bone marrow microenvironment. Br J Haematol. 199 (5), 754-764 (2022).
  15. Hug, N., et al. A dual role for the RNA helicase DHX34 in NMD and pre-mRNA splicing and its function in hematopoietic differentiation. RNA. 28 (9), 1224-1238 (2022).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

r nicowanie erytroidalnehematopoetyczne kom rki macierzysteerytropoeza ex vivoerytropoeza in vitrocytometria przep ywowaprzeciwcia o CD34linia erytroidalnapod o e do r nicowania erytroidalnegobarwienie aneksyn V
Kompleksowy proces oceny skuteczności erytropoezy u ludzi in vitro i ex vivo
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.