Kwantyfikacja glukozy Bergmeyera dla próbek mikrobiologicznych

Podsumowanie

Kwantyfikacja glukozy Bergmeyera to spektrofotometryczna technika enzymatyczna używana głównie do testów klinicznych, które dokładnie i czule mierzą ilość glukozy. W niniejszym artykule przedstawiono protokół stosowania tej metody do próbek mikrobiologicznych.

Streszczenie

Stężenie glukozy jest kluczowym wskaźnikiem metabolizmu komórkowego i może wskazywać na całkowite tempo metabolizmu, aberrację w metabolizmie glukozy, a w niektórych przypadkach na to, jak komórki łączą metabolizm glukozy z metabolizmem energetycznym. Ponadto wewnątrzkomórkowy i zewnątrzkomórkowy poziom glukozy wskazuje na stan metaboliczny komórek. Techniki enzymatyczne, takie jak oznaczanie ilościowe glukozy metodą Bergmeyera, są dokładniejsze i bardziej czułe niż inne techniki, takie jak kwas dinitrosalicylowy lub metody fluorescencyjne, które są zwykle stosowane w mikrobiologii. Chociaż jest stosowana głównie w obszarze klinicznym, oznaczanie ilościowe glukozy Bergmeyera może być również stosowane do dowolnej komórki, ale nie zostało szczegółowo opisane w przypadku bakterii, grzybów, drożdży lub innych mikroorganizmów.

Tutaj przedstawiamy metodologię ilościowego oznaczania glukozy z próbek bakterii i drożdży za pomocą enzymatycznej metody kwantyfikacji glukozy Bergmeyera. Procedura obejmowała enzymy oksydazę glukozową, peroksydazę i dichlorowodorek o-dianizydyny inkubowane w temperaturze 37 °C przez 20 minut, a następnie dodawane były kwas siarkowy. Następnie mierzy się absorbancję przy długości fali 545 nm. Należy podkreślić, że chociaż technika ta stwarza trudności w pomiarze wysokich stężeń glukozy (powyżej 60 g/l), możliwe jest zmierzenie stężeń poniżej 50 g/l przy użyciu współczynników rozcieńczenia. To enzymatyczne podejście jest cenne dla badań i analiz w mikrobiologii i innych dziedzinach naukowych. Precyzja i czułość metody sprawiają, że jest ona pomocna w wykrywaniu nawet niskich stężeń glukozy w próbkach mikrobiologicznych.

Wprowadzenie

Glukoza służy jako główne źródło energii i węgla dla wielu mikroorganizmów, w tym bakterii, drożdży i grzybów. Mikroorganizmy te pobierają glukozę za pomocą transporterów zlokalizowanych w błonie zewnętrznej, gdzie w ramach szlaku metabolicznego glikolizy przechodzi ona serię reakcji biochemicznych, w wyniku których zostaje przekształcona w pirogronian¹. Istnieje wiele technik ilościowego oznaczania cukrów redukujących, takich jak glukoza. Można zastosować na przykład odczyn Benedicta², kwas 3,5-dinitrosalicylowy (DNS)^3,4, metodę antronu⁵ lub metodę fenolo-siarkową⁶. Metody te wykrywają jednak każdy cukier redukujący obecny w próbce, np. fruktozę i maltozę, co może wpływać na sygnał i utrudniać dokładne oznaczenie konkretnego cukru.

Ponadto wymagają one ścisłej kontroli temperatury oraz obchodzenia się z substancjami niebezpiecznymi, co może skomplikować proces i wpłynąć na dokładność. Metody te mogą być również podatne na interferencje ze strony innych związków obecnych w próbce, co utrudnia precyzyjne oznaczanie ilości glukozy. Z kolei wysokosprawna chromatografia cieczowa (HPLC) stanowi bardziej precyzyjną alternatywę, umożliwiając rozróżnienie glukozy od innych cukrów redukujących, choć wiąże się to z wyższymi kosztami operacyjnymi. Te przeciwstawne metody podkreślają stałą potrzebę opracowania dokładnych i kosztowo efektywnych technik ilościowego oznaczania glukozy⁷.

Metoda z wykorzystaniem oksydazy glukozowej, peroksydazy i kwasu siarkowego (GOX-H₂SO₄) wykorzystuje dwa enzymy: oksydazę glukozową (GOD) oraz peroksydazę (POD). GOD jest enzymem oksydoreduktazą wykazującym wysoką selektywność w utlenianiu β-D-glukozy⁸. Kompleks ten działa jako katalizator w reakcji zachodzącej w obecności tlenu i glukozy, prowadzącej do powstania kwasu glukonowego oraz nadtlenku wodoru (H₂O₂). H₂O₂ jest wykrywany za pomocą chromogennego akceptora tlenu, o-dianizydyny, która po oddziaływaniu z POD ulega utlenieniu i powoduje uwalnianie H₂O₂, co zapobiega ponownemu przekształceniu kwasu glukonowego w glukozę (patrz Rysunek 1). Otrzymany kolor jest stabilizowany poprzez dodanie kwasu siarkowego (H₂SO₄), który zatrzymuje również reakcję enzymatyczną, co pozwala uniknąć możliwych zakłóceń, które mogłyby wystąpić w przypadku kontynuacji reakcji⁹.

Rysunek 1: Przegląd metody oznaczania ilości glukozy z wykorzystaniem enzymu oksydazy glukozowej), który reaguje z glukozą, tworząc nadtlenek wodoru (H₂O₂) i kwas glukonowy. Następnie enzym peroksydaza reaguje z H₂O₂ w obecności dwuwodorku O-dianizydyny. W ostatnim kroku dodaje się kwas siarkowy (H₂SO₄), aby zatrzymać reakcję enzymatyczną, co skutkuje powstaniem różowego zabarwienia mierzonego przy 529 nm. Skróty: POD = peroksydaza; GOD = oksydaza glukozowa. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Enzymatyczna metoda GOX-H₂SO₄ jest techniką powszechnie stosowaną do pomiaru stężenia glukozy w próbkach biologicznych, z których większość ma znaczenie kliniczne. Jednakże niewiele badań dotyczyło techniki pozwalającej na oznaczanie ilości glukozy w pożywce wzrostowej w celu oceny jej zużycia. W związku z tym w niniejszym protokole przedstawiono metodologię ilościowego oznaczania glukozy za pomocą reakcji enzymatycznej z wykorzystaniem oksydazy glukozowej, peroksydazy, o-dianizydyny dihydrochlorku oraz H₂SO₄ w mikrobiologicznych próbkach w płynie, która stanowi modyfikację metody opracowanej przez Bergmeyera⁹, poprzez zastosowanie 50% (v/v) H₂SO₄ oraz mniejszych ilości odczynników.

Protokół

1. Przygotowanie roztworów

1. Przygotuj 100 ml 0,1 M buforu fosforanowego. Odważ 1,28 g wodoru fosforanu potasu (KH₂PO₄) oraz 0,1304 g fosforanu dipotasu (K₂HPO (hematoksylina i eozyna)₄) i przenieś je do szklanego zlewki. Następnie dodaj 70 ml wody dejonizowanej (H₂(H₂O) i dostosować pH do wartości 5,5, używając 1 M kwasu solnego (HCl) lub wodorotlenku potasu (KOH). Przenieść roztwór do kolby miarowej i doprowadzić do końcowej objętości 100 ml. Następnie przelać roztwór do bursztynowego pojemnika i przechowywać go w temperaturze 4-8 °C przez maksymalnie 3 miesiące.
   OSTRZEŻENIE: Przez cały czas trwania procesu przygotowania należy nosić rękawice nitrylowe, aby zapobiec kontaktowi z powierzchnią skóry i potencjalnemu zanieczyszczeniu, ponieważ dihydrochlorek o-dianizydyny jest potencjalnie rakotwórczy.
2. Przygotuj 1% (w/v) roztwór o-dihydrochlororek dianisydyny. Odważyć 0,01 g o-dianizydyny dihydrochlorowodorek i umieść go w probówce do wirowania o pojemności 2,0 ml. Za pomocą mikropipety o pojemności 1000 µl dodaj 1,0 ml H₂Aby rozpuścić związek, należy powoli wymieszać go, pipetując w górę i w dół. Należy chronić roztwór przed światłem, owijając pojemnik folią aluminiową, a następnie przechowywać go w temperaturze -20 °C w celu zachowania stabilności.
   UWAGA: Aby ułatwić podparcie probówki podczas pomiaru na wadze analitycznej, można wykorzystać zlewkę o pojemności 10 ml jako dodatkowe podparcie. Pomaga to ustabilizować probówkę, zapewniając dokładność pomiaru poprzez zminimalizowanie ryzyka przesunięcia lub przechylenia, co mogłoby zmienić wyniki uzyskane na wadze.
3. Do kolby miarowej o pojemności 100 mL wlać 10 mL roztworu buforu fosforanowego, a następnie 1 mL 1% (v/v) o- roztwór dwuchlorku dianisydyny. Następnie należy uzupełnić objętość końcową do 100 ml buforem fosforanowym, aby uzyskać stężenie końcowe 0,01% o-mieszanina buforu z dianisydyną. Przenieś roztwór do bursztynowej kolby i owiń go folią aluminiową, aby chronić go przed światłem. Przechowuj roztwór w temperaturze 4-8 °C przez okres do 3–4 miesięcy.
   UWAGA: Chłodzenie jest niezbędne, aby zapobiec rozkładowi, który mógłby naruszyć rzetelność pomiarów eksperymentalnych. Aby uniknąć degradacji o-mieszaninę buforu z dianisydyną w niewielkiej porcji 13 ml (wystarczającej dla 12 próbek) można umieścić w plastikowej probówce o pojemności 14 ml i przechowywać na lodzie do momentu użycia.
4. Przygotuj 50% H₂SO₄ roztwór. Umieścić kolbę miarową o pojemności 100 mL zawierającą 30 mL H₂umieścić w kąpieli lodowej i schładzać przez 10 min. Następnie powoli wlać 51 ml H₂SO₄ (98% v/v) po ściankach kolby, delikatnie wstrząsając w celu homogenizacji roztworu. Należy odczekać, aż mieszanina ostygnie, ponieważ reakcja jest egzotermiczna (wydziela ciepło). Doprowadzić końcową objętość do 100 ml za pomocą H₂Przenieść roztwór do bursztynowej kolby szklanej.
   UWAGA: Należy pracować pod wyciągiem i przestrzegać wszystkich protokołów bezpieczeństwa, pamiętając o stosowaniu odpowiedniego sprzętu ochronnego. Przygotować 50 ml 40% roztworu węglanu wapnia w celu neutralizacji ewentualnych rozlewów.
5. Przygotuj 50 mM roztwór octanu sodu, rozpuszczając 0,04 g octanu sodu w 5 ml H2O₂Wodę dejonizowaną (ddH2O) w zlewce. Dostosować pH do wartości 5,1, używając lodowatego kwasu octowego. Na koniec uzupełnić objętość do 10 ml wodą H2O.₂Odi.

2. Przygotowanie enzymów

1. W sterylnej mikroprobówce o pojemności 2,0 mL odważyć 0,01 g oksydazy glukozowej i zmieszać z 1 mL 50 mM octanu sodu, pH 5,0, aby uzyskać stężenie końcowe 10 mg/mL. Przykryć probówkę folią aluminiową i przechowywać w temperaturze -20 °C.
   UWAGA: Roztwór można przechowywać do 2 miesięcy w temperaturze -20 °C.
2. Obliczyć objętość roztworu enzymu V₂ niezbędną do uzyskania pożądanej aktywności enzymu w każdej plastikowej kuwecie (o całkowitej objętości 1,5 mL), korzystając z równania (1): V₁C₁ = V₂C₂, gdzie V₁ wynosi 1 500 µL, C₁ to 28,5 U aktywności enzymu, a C₂ (stężenie roztworu enzymu) wynosi 12 970 U/mL (10 mg enzymu [129 000 jednostek/g] w 1 mL H₂Odi).
   V₂ = (1 500 µL × 28,5 U)/12 970 U = 3,29 µL    (1)
   UWAGA: Dla dokładniejszego pipetowania wartość tę można zaokrąglić do 3,3 µL.
3. W nowej mikroprobówce o pojemności 2 mL odważyć 0,0031 g peroksydazy i dodać 1 mL buforu fosforanowego, pH 5,5, aby uzyskać stężenie końcowe 3,1 mg/mL. Przykryć mikroprobówkę folią aluminiową i przechowywać w temperaturze -20 °C.
4. Obliczyć objętość roztworu peroksydazy wymaganą do uzyskania pożądanej aktywności enzymu na kuwetę, korzystając z równania (1). Przyjąć całkowitą objętość kuwety 1 500 µL i docelową aktywność enzymu 1,25 U. Następnie wyznaczyć niezbędną objętość roztworu enzymu, przyjmując jego stężenie wynoszące 1 551 U.
   V₂ = (1 500 µL × 1,25 U)/1 551 U = 1,208 µL
   UWAGA: Dla dokładniejszego pipetowania wartość tę zaokrąglono do 1,20 μL.

3. Standard glukozy

1. Przygotować roztwór wzorcowy D-glukozy o stężeniu 1 g/L, dodając 0,01 g D-glukozy do 10 mL H₂Odi w kolbie miarowej. Aby rozcieńczyć roztwór do stężenia 0,5 g/L, należy pobrać 500 µL roztworu zapasu i zmieszać z 500 µL H₂Odi, aby uzyskać objętość końcową 1 mL.
   UWAGA: Proces rozcieńczania jest niezbędny do przygotowania dokładnych roztworów wzorcowych.

4. Przygotowanie krzywej standardowej

1. Do nowej mikroprobówki o pojemności 2 mL dodać objętości buforu i glukozy wskazaną w Tabeli 1.
2. Ustawić suchą kąpiel termostatyczną na 37 °C. Po ustabilizowaniu temperatury dodać 3,3 µL oksydazy glukozowej do wszystkich probówek, a następnie dodać 1,2 µL peroksydazy do każdej probówki. Inkubować probówki w temperaturze 37 °C przez 20 min.
3. Po inkubacji niezwłocznie dodać 750 µL 50% H₂SO₄ (v/v) do każdej mikroprobówki i schłodzić mieszaninę w kąpieli lodowej przez 2 min. Otrzymana końcowa objętość wyniesie 1,500 µL. Następnie przenieść roztwór do plastikowej kuwety i zmierzyć absorbancję przy 529 nm.

Tabela 1: Krzywa kalibracyjna glukozy dla metody GOX-H₂SO₄. Skróty: GOD = oksydaza glukozowa; POD = peroksydaza; H₂SO₄ = kwas siarkowy. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

5. Badanie próbek mikrobiologicznych

1. Próbkę należy uzyskać poprzez hodowlę bakterii lub drożdży w płynnej pożywce w określonych warunkach, w tym przy zachowaniu odpowiedniej temperatury, prędkości mieszania oraz czasu inkubacji. Po osiągnięciu przez kulturę pożądanej gęstości optycznej (OD) lub stężenia komórek, należy zebrać kulturę do dalszej obróbki.
   UWAGA: Pseudomonas reptilivora hodowano przy stałej prędkości mieszania 300 obr./min i 28 °C, podczas gdy Debaryomyces hansenii hodowano przy prędkości mieszania 200 obr./min w 30 °C w inkubatorze wytrząsającym. W przypadku konkretnego D. hansenii, Jadalny olej rzapkowy był również stosowany jako induktor produkcji lipazy.
2. Oczyścić obszar roboczy 70% roztworem alkoholu lub odpowiednim środkiem czyszczącym zgodnie z protokołami bezpieczeństwa biologicznego. Zapalić palnik w celu zapewnienia aseptyki.
3. Transfer 100 µL pożywki hodowlanej do mikroprobówki o pojemności 1,5 ml lub 2 ml za pomocą sterylnych końcówek.
4. Wiruj próbki przy 7 500 × g przez 7 min w temperaturze 4 °Club przy 10 000 × g przez 7 min bez kontroli temperatury. Po wirowaniu ostrożnie usunąć supernatant zawierający rozpuszczoną glukozę, a osad odrzucić.
5. Zastosowanie 0.5 µL nadpływu dla stężeń glukozy w zakresie od 1 do 20 g/L, a następnie zmieszać z 749.5 µL z Oto jest treść, którą należy przetłumaczyć. Proszę o dostarczenie tekstu źródłowego.bufor dianisydynowy, 3.3 µL Boga, a następnie 1.2 µL POD. Inkubować mikroprobówki przez 20 min w 37 °Czgodnie ze szczegółami opisanymi w kroku 4.2, a następnie natychmiast dodać 750 µL z 50% H₂SO₄ i schłodzić w łaźni lodowej przez 2 min.
   1. W przypadku stężeń powyżej 20 g/L należy przeprowadzić rozcieńczenie 1:1 za pomocą sterylnej wody H2O₂Odi przed przystąpieniem do dalszych działań.
   2. Jeśli próbki supernatantu były wcześniej mrożone w temperaturze -80 °C lub -20 °C, rozmrozić je w temperaturze pokojowej i mieszać w wstrząsarce wortex przez 30 s przed użyciem. W przypadku konieczności rozcieńczenia należy użyć sterylnej H₂Odi.
   3. W przypadku próbek o stężeniu glukozy powyżej 30 g/L należy wykonać rozcieńczenie 1:1 za pomocą sterylnej wody H2O₂Odi, co daje czynnik rozcieńczenia wynoszący 2.
6. Oblicz całkowite stężenie glukozy w każdej próbce, korzystając z równania (2) w programie arkusza kalkulacyjnego.
        ​(2)
   Gdzie:
   Proszę o dostarczenie tekstu źródłowego do tłumaczenia. = stężenie glukozy (g/L)     δ = Końcowa objętość reakcji (0,0015 L)
   y = absorbancja       SM = ilość użytej próbki*
   UWAGA: The b i m wartości pochodzą z równania modelującego linię trendu krzywej kalibracyjnej dla danej metody (y = mx + b). *Wartość M.S. musi opierać się na ilości próbki użytej do uzyskania stosunku przy odpowiadającym jej rozcieńczeniu (t.j. jeśli pobierze się 0.5 µL nadfiltratu, M.S. = 0,0000005 L = 0,5 × 10^-6 L); w przypadku zastosowania czynnika rozcieńczenia (DF), należy pomnożyć otrzymaną absorbancję przez DF.
   Na przykład, jeśli uzyskano absorbancję wynoszącą 0,5 i zastosowano DF równy 2, wynik wyniesie 1,0. Zatem y = 1,0 i wartość tę należy wprowadzić do równ. (2), zgodnie z wcześniejszym opisem.

6. Walidacja analityczna

1. Oblicz parametry walidacji analitycznej metody GOX-H₂SO₄ zgodnie z wytycznymi ustalonymi przez Narodowe Centrum Metrologii oraz Meksykańską Jednostkę Akredytacyjną¹⁰ (CENAM-ema).
   1. Oblicz precyzję jako procentowy współczynnik zmienności lub %CV = (S/x) × 100, gdzie x to średnia grupy próbek, a S to odchylenie standardowe, przy wartości akceptowalnej ≤10%.
   2. Określ liniowość poprzez dopasowanie krzywej wzorcowej do modelu liniowego z R² powyżej 0,995.
   3. Oblicz granicę oznaczalności (LOQ) korzystając z równania: LOQ = yB + 10sB, gdzie yB reprezentuje stężenie analityczne generujące sygnał równoważny sygnałowi docelowemu, a 10sB oznacza 10-krotność odchylenia standardowego próbki ślepej.
   4. Oblicz błąd systematyczny korzystając z równania: Slant = x - m, gdzie x = średnie stężenie eksperymentalne, a m to stężenie teoretyczne.
   5. Określ dokładność jako stopień zgodności między wartością rzeczywistą a wartością teoretyczną.
      Odzysk% = (CR/CV) × 100
      Gdzie CR to średnie stężenie eksperymentalne, a CV to współczynnik zmienności stężenia teoretycznego.

7. Interferencje ze strony innych cukrów redukujących

1. Osobno poddaj ocenie cztery cukry redukujące: glukozę, fruktozę, galaktozę i ksylozę z roztworu zapasu o stężeniu 0,5 g/L. Dodatkowo zastosuj trehalozę jako kontrolę negatywną. Postępuj zgodnie z protokołem dla wszystkich próbek i zmierz absorbancję przy 545 i 529 nm.

Wyniki

Analiza spektrofotometryczna GOX-H₂SO₄ wykazała pojedyncze maksimum absorbancji przy 529 nm (λmax) (Rysunek 2A), przy czym dodatkowe wartości absorbancji zaobserwowano przy 545 nm. Analizując wartości absorbancji dla różnych stężeń glukozy, uzyskano liniowość (R²) wynoszącą 0,9977 dla λ529 nm oraz R² wynoszącą 0,9967 dla λ545 nm (Rysunek 2B). Liniowość w określonym zakresie odnosi się do zdolności do uzyskiwania wyników bezpośrednio pro...

Dyskusja

Kwantyfikacja glukozy w pożywkach hodowlanych jest niezbędna do zrozumienia wzrostu drobnoustrojów i aktywności metabolicznej, ponieważ glukoza służy jako podstawowe źródło energii dla wielu mikroorganizmów. W tym badaniu zastosowaliśmy metodę GOX-H₂SO₄ do dokładnego pomiaru poziomu glukozy w pożywkach hodowlanych, mając na celu optymalizację procesów mikrobiologicznych w fermentacji bakteryjnej lub drożdżowej. Nasze ustalenia są zgodne z ustaleniami Yuena i McNeilla¹¹; Jedna...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
1,5 ml mikroprobówka	Eppendorf	-
-2,0 ml mikroprobówka	Eppendorf	-
-CaCO3	Meyer	471-34-1	Węglan wapnia
D-Glukoza	Meyer	50-99-7	D-Glukoza
Sucha kąpiel	FisherScientific	11-718-4	Numer seryjny 911NO251. Blok SxDxH mm/in: 124 x 76 x 39 / 4,9 x 3,0 x 1,5
Oksydaza glukozowa	Sigma Aldrich	G6125-50KU	Proszek enzymatyczny
H2O	-	-	Woda dejonizowana
H2SO4	Meyer	7664-93-9	Kwas siarkowy
HCl	Meyer	7647-01-0	Kwas chlorowodorowy
K2HPO4	Meyer	7758-11-4	Fosforan dipotasowy
KH2PO4	Meyer	7778-77-0	Fosforan monopotasowy
KOH	Meyer	1310-58-3	Wodorotlenek potasu
Lambda 35	PerkinElmer-Spektrofotometr
Mikrorurka wirówka	-	--
o-dichlorowodorek dianizydyny	Sigma Aldrich	D3252	Peroksydaza chromogenna
	Sigma Aldrich	P8125-50KU	Enzymatyczny
pH-metr	Hanna	1131	Hanna 1170
Octan sodu	Meyer	127-09-3
Meyer Szpatułki do ważenia	-	-	-

w proszku