Kwantyfikacja glukozy Bergmeyera dla próbek mikrobiologicznych

Summary

Kwantyfikacja glukozy Bergmeyera to spektrofotometryczna technika enzymatyczna używana głównie do testów klinicznych, które dokładnie i czule mierzą ilość glukozy. W niniejszym artykule przedstawiono protokół stosowania tej metody do próbek mikrobiologicznych.

Abstract

Stężenie glukozy jest kluczowym wskaźnikiem metabolizmu komórkowego i może wskazywać na całkowite tempo metabolizmu, aberrację w metabolizmie glukozy, a w niektórych przypadkach na to, jak komórki łączą metabolizm glukozy z metabolizmem energetycznym. Ponadto wewnątrzkomórkowy i zewnątrzkomórkowy poziom glukozy wskazuje na stan metaboliczny komórek. Techniki enzymatyczne, takie jak oznaczanie ilościowe glukozy metodą Bergmeyera, są dokładniejsze i bardziej czułe niż inne techniki, takie jak kwas dinitrosalicylowy lub metody fluorescencyjne, które są zwykle stosowane w mikrobiologii. Chociaż jest stosowana głównie w obszarze klinicznym, oznaczanie ilościowe glukozy Bergmeyera może być również stosowane do dowolnej komórki, ale nie zostało szczegółowo opisane w przypadku bakterii, grzybów, drożdży lub innych mikroorganizmów.

Tutaj przedstawiamy metodologię ilościowego oznaczania glukozy z próbek bakterii i drożdży za pomocą enzymatycznej metody kwantyfikacji glukozy Bergmeyera. Procedura obejmowała enzymy oksydazę glukozową, peroksydazę i dichlorowodorek o-dianizydyny inkubowane w temperaturze 37 °C przez 20 minut, a następnie dodawane były kwas siarkowy. Następnie mierzy się absorbancję przy długości fali 545 nm. Należy podkreślić, że chociaż technika ta stwarza trudności w pomiarze wysokich stężeń glukozy (powyżej 60 g/l), możliwe jest zmierzenie stężeń poniżej 50 g/l przy użyciu współczynników rozcieńczenia. To enzymatyczne podejście jest cenne dla badań i analiz w mikrobiologii i innych dziedzinach naukowych. Precyzja i czułość metody sprawiają, że jest ona pomocna w wykrywaniu nawet niskich stężeń glukozy w próbkach mikrobiologicznych.

Introduction

Glukoza służy jako podstawowe źródło energii i węgla dla wielu mikroorganizmów, w tym bakterii, drożdży i grzybów. Mikroorganizmy te pobierają glukozę przez transportery znajdujące się na błonie zewnątrzkomórkowej, gdzie przechodzi ona szereg reakcji biochemicznych w szlaku metabolicznym glikolizy, aby zostać przekształconym w pirogronian¹. Istnieją różne techniki ilościowego oznaczania cukrów redukujących, takich jak glukoza. Na przykład można zastosować odczynnik Benedicta², użycie kwasu 3,5-dinitrosalicylowego (DNS)^3,4, metoda anthrona⁵, lub kwas fenolowo-siarkowy⁶ metod. Metody te wykrywają jednak wszelkie cukry redukujące obecne w próbce, takie jak fruktoza i maltoza, które mogą przyczyniać się do sygnału i komplikować dokładne określenie ilościowe danego cukru.

Ponadto, wymagają ścisłej kontroli temperatury i obchodzenia się z niebezpiecznymi substancjami, co może skomplikować proces i wpłynąć na dokładność. Metody te mogą również ulegać interferencji ze strony innych związków obecnych w próbce, co utrudnia dokładne oznaczanie ilościowe glukozy. Z kolei wysokosprawna chromatografia cieczowa (HPLC) stanowi bardziej precyzyjną alternatywę, pozwalającą na rozróżnienie glukozy i innych cukrów redukujących, choć wiąże się to z wyższymi kosztami operacyjnymi. Te kontrastujące ze sobą metody podkreślają ciągłą potrzebę opracowywania dokładnych i opłacalnych technik kwantyfikacji glukozy⁷.

Metoda oksydazy-peroksydazy glukozowej-kwasu siarkowego (GOX-H₂SO₄) wykorzystuje dwa enzymy, oksydazę glukozową (GOD) i peroksydazę (POD). GOD jest enzymem oksydoreduktazy, który jest bardzo selektywny w utlenianiu β-D-glukozy⁸. Kompleks ten działa jak katalizator podczas reakcji, która zachodzi, gdy glukoza znajduje się w obecności tlenu, wytwarzając kwas glukonowy i nadtlenek wodoru (_H2O2). _H2O2 jest wykrywany za pomocą chromogennego akceptora tlenu,o-dianizydyny, który po interakcji z POD powoduje jego utlenianie i uwalnianie_H2O2, zapobiegając przekształceniu kwasu glukonowego z powrotem w glukozę (patrz Rysunek 1). Uzyskany kolor jest stabilizowany przez dodanie kwasu siarkowego (_H2SO4), który również zatrzymuje reakcję enzymatyczną, unikając w ten sposób ewentualnych zakłóceń, które mogłyby wystąpić, gdyby reakcja była kontynuowana⁹.

Rysunek 1: Przegląd metody kwantyfikacji glukozy przy użyciu enzymu oksydazy glukozowej, który reaguje z glukozą, tworząc nadtlenek wodoru (_H2O2) i kwas glukonowy. Następnie enzym peroksydazy reaguje z_H2O2w obecności dichlorowodorku O-dianizydyny. W ostatnim etapie dodaje się kwas siarkowy (_H2SO4) w celu zatrzymania reakcji enzymatycznej, w wyniku czego uzyskuje się różowy kolor, który mierzy się przy 529 nm. Skróty: POD = peroksydaza; BÓG = oksydaza glukozowa. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Metoda enzymatyczna GOX-H₂SO₄ jest techniką powszechnie używaną do pomiaru stężenia glukozy w próbkach biologicznych, z których większość ma znaczenie kliniczne. Jednak w niewielu badaniach analizowano technikę, która pozwala na ilościowe określenie ilości glukozy w pożywce wzrostowej w celu oceny jej spożycia. W związku z tym w niniejszym protokole przedstawiono metodologię ilościowego oznaczania glukozy za pomocą reakcji enzymatycznej oksydazy glukozowej, peroksydazy, dichlorowodorku o-dianizydyny i_H2SO4w mikrobiologicznych próbkach cieczy ciekłych, która powstaje jako modyfikacja pracy wykonanej przez Bergmeyer⁹, przy użyciu 50% (v/v)_H2SO4 i mniejszych ilości odczynników.

Protocol

1. Przygotowanie roztworu

1. Przygotować 100 ml 0,1 M buforu fosforanowego. Odważyć 1,28 g diwodorofosforanu potasu (KH₂PO₄) i 0,1304 g fosforanu dipotasowego (K₂HPO₄) i dodać je do szklanej zlewki. Teraz dodaj 70 ml wody dejonizowanej (H₂Odi) i dostosuj pH do 5,5 za pomocą 1 M kwasu solnego (HCl) lub wodorotlenku potasu (KOH). Przenieść roztwór do kolby miarowej i dostosować końcową objętość do 100 ml. Następnie przenieść roztwór do bursztynowego pojemnika i przechowywać roztwór w temperaturze 4-8 °C przez okres do 3 miesięcy.
   UWAGA: Przez cały proces przygotowania należy nosić rękawice nitrylowe, aby zapobiec kontaktowi ze skórą i potencjalnemu zanieczyszczeniu, ponieważ dichlorowodorek o-dianizydyny jest potencjalnie rakotwórczy.
2. Przygotować 1% m/v roztwór dichlorowodorku o-dianizydyny. Odważyć 0,01 g dichlorowodorku o-dianizydyny i umieścić go w probówce wirówkowej o pojemności 2,0 ml. Używając mikropipety o pojemności 1 000 ml, dodaj 1,0 ml H₂Odi w celu rozpuszczenia związku, a następnie mieszaj powoli, pipetując w górę iw dół. Chronić roztwór przed światłem, owijając pojemnik folią aluminiową i przechowywać go w temperaturze -20 °C, aby zachować stabilność.
   UWAGA: Aby ułatwić podparcie probówki podczas pomiaru na wadze analitycznej, jako dodatkowe podparcie można użyć zlewki o pojemności 10 ml. Pomaga to ustabilizować rurkę, zapewniając dokładny pomiar poprzez zminimalizowanie ryzyka przemieszczenia lub przechylenia, które mogłoby zmienić wyniki uzyskane na wadze.
3. Do kolby miarowej o pojemności 100 ml dodać 10 ml roztworu buforu fosforanowego, a następnie 1 ml 1% v/v roztworu dichlorowodorku o-dianizydyny. Następnie dostosować końcową objętość do 100 ml z buforem fosforanowym, aby uzyskać końcowe stężenie 0,01% mieszaniny o-dianizydyny i buforu. Przenieść roztwór do kolby bursztynowej i owinąć ją folią aluminiową, aby chronić ją przed światłem. Roztwór należy przechowywać w temperaturze 4-8 °C do 3-4 miesięcy.
   UWAGA: Chłodzenie jest niezbędne, aby zapobiec rozkładowi, który mógłby zagrozić integralności pomiarów eksperymentalnych. Aby uniknąć degradacji mieszaniny o-dianizydyny i buforu, niewielką porcję 13 ml (wystarczającą na 12 próbek) można umieścić w plastikowej tubie o pojemności 14 ml na lodzie do czasu użycia.
4. Przygotować 50% roztwór H_2SO4 . Umieścić kolbę miarową o pojemności 100 ml z 30 ml H₂Odi w łaźni lodowej i pozostawić do ostygnięcia na 10 minut. Następnie powoli wlać 51 ml_H2SO4 (98% v/v) w dół ścianek kolby, ostrożnie wstrząsając w celu homogenizacji roztworu. Poczekaj, aż mieszanina ostygnie, ponieważ reakcja jest egzotermiczna (wytwarza ciepło). Doprowadzić końcową objętość do 100 ml za pomocą H₂Odi i przenieść roztwór do szklanej kolby bursztynowej.
   UWAGA: Używaj dygestorium i przestrzegaj wszystkich protokołów bezpieczeństwa, pamiętaj o noszeniu odpowiedniego sprzętu ochronnego. Przygotuj 50 ml 40% roztworu węglanu wapnia, aby zneutralizować wszelkie możliwe wycieki, które mogą wystąpić.
5. Przygotować 50 mM roztwór octanu sodu, rozpuszczając 0,04 g octanu sodu w 5 ml H₂Odi w zlewce. Dostosuj pH do 5,1 za pomocą lodowatego kwasu octowego. Na koniec dostosuj objętość do 10 ml za pomocą H₂Odi.

2. Przygotowanie enzymów

1. W sterylnej mikroprobówce o pojemności 2,0 ml odważyć 0,01 g oksydazy glukozowej i wymieszać z 1 ml 50 mM octanu sodu o pH 5,0, aby uzyskać końcowe stężenie 10 mg/ml. Przykryj probówkę folią aluminiową i przechowuj w temperaturze -20 °C.
   UWAGA: Roztwór można przechowywać do 2 miesięcy w temperaturze -20 °C.
2. Obliczyć objętość roztworu enzymatycznego V₂ potrzebną do osiągnięcia pożądanej aktywności enzymatycznej w każdej plastikowej kuwecie (o całkowitej objętości 1,5 ml) za pomocą korektora (1): V₁C₁ = V₂C₂, gdzie V₁ wynosi 1 500 μL, C₁ wynosi 28,5 U aktywności enzymu, a C₂ (stężenie roztworu enzymu) wynosi 12 970 U/ml (10 mg enzymu [129 000 jednostek/g] w 1 ml H₂Odi).
   V₂ = (1 500 μL × 28,5 U)/12 970 U = 3,29 μL (1)
   UWAGA: Aby zapewnić dokładniejsze pipetowanie, wartość można zaokrąglić do 3,3 μl.
3. W nowej mikroprobówce o pojemności 2 ml odważ 0,0031 g enzymu peroksydazy i dodaj 1 ml buforu fosforanowego o pH 5,5, aby uzyskać końcowe stężenie 3,1 mg / ml. Przykryj mikroprobówkę folią aluminiową i przechowuj w temperaturze -20 °C.
4. Obliczyć objętość roztworu peroksydazy wymaganą do osiągnięcia pożądanej aktywności enzymatycznej na kuwetę przy użyciu równania (1). Zacznij od całkowitej objętości kuwety 1,500 μl i docelowej aktywności enzymatycznej 1,25 U. Następnie należy określić niezbędną objętość roztworu enzymu, biorąc pod uwagę jego stężenie 1,551 U.
   V₂ = (1 500 μL × 1,25 U)/1 551 U = 1,208 μL
   UWAGA: Aby zapewnić dokładniejsze pipetowanie, wartość została zaokrąglona do 1,20 μl.

3. Wzorzec glukozy

1. Przygotować wzorzec D-glukozy 1 g/l, dodając 0,01 g D-glukozy do 10 ml H₂Odi w kolbie miarowej. Aby rozcieńczyć stężenie do 0,5 g/l, należy pobrać 500 μl roztworu podstawowego i wymieszać go z 500 μl_H2Odi, aby uzyskać końcową objętość 1 ml.
   UWAGA: Ten proces rozcieńczania jest niezbędny do tworzenia dokładnych roztworów wzorcowych.

4. Przygotowanie krzywej standardowej

1. Używając nowej mikroprobówki o pojemności 2 ml, dodać bufor i objętości glukozy wskazane w Tabeli 1.
2. Ustawić suchą łaźnię termiczną na 37 °C. Gdy temperatura się ustabilizuje, dodaj 3,3 μl oksydazy glukozowej do wszystkich probówek, a następnie dodaj 1,2 μl peroksydazy do każdej probówki. Inkubować probówki w temperaturze 37 °C przez 20 minut.
3. Po inkubacji natychmiast dodać 750 μl 50% H₂SO₄ (v/v) do każdej mikroprobówki i pozostawić mieszaninę do ostygnięcia w łaźni lodowej przez 2 minuty. W ten sposób uzyskuje się końcową objętość 1 500 μl. Na koniec przenieś roztwór do plastikowej kuwety i zmierz absorbancję przy 529 nm.

Tabela 1: Krzywa kalibracji stężenia glukozy dla metody GOX-H₂SO₄. Skróty: BÓG = oksydaza glukozowa; POD = peroksydaza; H₂SO₄ = kwas siarkowy. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

5. Badanie próbek mikrobiologicznych

1. Otrzymać próbkę przez hodowlę bakterii lub drożdży w płynnym pożywce hodowlanej w określonych warunkach, w tym w temperaturze, prędkości mieszania i czasie inkubacji. Gdy kultura osiągnie pożądaną gęstość optyczną (OD) lub stężenie komórek, zbierz kulturę do dalszego przetwarzania.
   UWAGA: Pseudomonas reptilivora hodowano przy stałej prędkości mieszania 300 obr./min i temperaturze 28 °C, podczas gdy Debaryomyces hansenii hodowano z prędkością mieszania 200 obr./min w temperaturze 30 °C w wytrząsarce orbitalnej. W konkretnym przypadku D. hansenii jadalny olej rzepakowy był również stosowany jako induktor do produkcji lipazy.
2. Oczyść miejsce pracy 70% roztworem alkoholu lub odpowiednim środkiem czyszczącym zgodnie z protokołami bezpieczeństwa biologicznego. Zapal palnik, aby zapewnić aseptykę.
3. Przenieś 100 μl pożywki hodowlanej do mikroprobówki o pojemności 1,5 ml lub 2 ml za pomocą sterylnych końcówek.
4. Odwirować próbki o masie 7 500 × g przez 7 minut w temperaturze 4 °C lub przy ciśnieniu 10 000 × g przez 7 minut bez kontroli temperatury. Po odwirowaniu ostrożnie usunąć supernatant, który zawiera glukozę w roztworze, i wyrzucić osad.
5. Użyć 0,5 μl supernatantu dla stężeń glukozy w zakresie od 1 do 20 g/l, następnie wymieszać z 749,5 μl buforu o-dianizydyny, 3,3 μl GOD, a następnie 1,2 μl POD. Inkubować mikroprobówki przez 20 minut w temperaturze 37 °C, jak opisano w kroku 4.2 i natychmiast dodać 750 μl 50% H₂SO₄ i pozostawić do ostygnięcia w łaźni lodowej przez 2 minuty.
   1. W przypadku stężeń powyżej 20 g/l, przed kontynuowaniem należy przeprowadzić rozcieńczenie 1:1 sterylnym_H2Odi.
   2. Jeżeli próbki sklarowanego osadu zostały wcześniej zamrożone w temperaturze -80 °C lub -20 °C, przed użyciem należy je rozmrozić w temperaturze pokojowej i wirować przez 30 sekund. Jeśli konieczne jest rozcieńczenie, użyj sterylnego H₂Odi.
   3. W przypadku próbek o stężeniu glukozy powyżej 30 g/l należy przeprowadzić rozcieńczenie w stosunku 1:1 sterylnym_H2Odi, uzyskując współczynnik rozcieńczenia 2.
6. Oblicz całkowite stężenie glukozy w każdej próbce za pomocą równania (2) w programie arkusza kalkulacyjnego.
   (2)
   gdzie:
   x = stężenie glukozy (g/l) δ = końcowa objętość reakcyjna (0,0015 l)
   y = absorbancja MS = ilość użytej próbki*
   UWAGA: Wartości b i m pochodzą z równania, które modeluje linię trendu krzywej kalibracyjnej dla metody (y = mx + b). *Wartość MS musi być oparta na ilości próbki użytej do uzyskania stosunku przy odpowiednim rozcieńczeniu (tj. jeśli weźmiesz 0,5 μl supernatantu, MS = 0,0000005 L = 0,5 × ^10-6 L); jeżeli stosuje się współczynnik rozcieńczenia (DF), należy pomnożyć otrzymaną absorbancję przez DF.
   Na przykład, jeśli uzyska się absorbancję 0,5 i użyto DF 2, wynik wyniesie 1,0. Dlatego y = 1,0, a tę wartość należy wprowadzić do korektora (2), jak opisano wcześniej.

6. Walidacja analityczna

1. Oblicz analityczne parametry walidacji metody GOX-H₂SO₄ zgodnie z ustaleniami Narodowego Centrum Metrologii i Meksykańskiej Jednostki Akredytacyjnej¹⁰ (CENAM-ema).
   1. Obliczyć precyzję jako procent współczynnika zmienności lub %CV = (S/x) × 100, gdzie x jest średnią grupy próby, a S jest odchyleniem standardowym o wartości akceptacji ≤10%.
   2. Określ liniowość, dopasowując krzywą standardową do modelu liniowego R² powyżej 0,995.
   3. Obliczyć granicę oznaczalności (LOQ) za pomocą równania: LOQ = yB + 10sB, gdzie yB oznacza stężenie analitu, które wytwarza sygnał równoważny sygnałowi docelowemu, a 10sB oznacza 10x odchylenie standardowe ślepej próby
   4. Obliczyć błąd systematyczny, korzystając z tego równania: Skos = x - m, gdzie x = średnia stężenia doświadczalnego, a m jest stężeniem teoretycznym.
   5. Określ dokładność jako stopień zgodności między wartością rzeczywistą a wartością teoretyczną.
      Odzysk% = (CR/CV) × 100
      Gdzie CR jest średnią stężenia doświadczalnego, a CV jest współczynnikiem zmienności stężenia teoretycznego.

7. Zakłócenia powodowane przez inne cukry redukujące

1. Oceń oddzielnie cztery cukry redukujące: glukozę, fruktozę, galaktozę i ksylozę z roztworu podstawowego o stężeniu 0,5 g/l. Dodatkowo użyj trehalozy jako kontroli negatywnej. Postępować zgodnie z protokołem dla wszystkich próbek i zmierzyć absorbancję przy 545 i 529 nm.

Results

Analiza spektrofotometryczna GOX-H₂SO₄ wykazała pojedynczą maksymalną absorbancję przy 529 nm (λmax) (Rysunek 2A), z dodatkowymi wartościami absorbancji zaobserwowanymi przy 545 nm. Analizując wartości absorbancji przy różnych stężeniach glukozy, uzyskaliśmy liniowość (R²) wynoszącą 0,9977 dla λ529 nm i R² wynoszącą 0,9967 dla λ545 nm (Rysunek 2B). Liniowość, w danym zakresie, odnosi się do zdolności do dostarczania wyników wprost proporcjonalnyc...

Discussion

Kwantyfikacja glukozy w pożywkach hodowlanych jest niezbędna do zrozumienia wzrostu drobnoustrojów i aktywności metabolicznej, ponieważ glukoza służy jako podstawowe źródło energii dla wielu mikroorganizmów. W tym badaniu zastosowaliśmy metodę GOX-H₂SO₄ do dokładnego pomiaru poziomu glukozy w pożywkach hodowlanych, mając na celu optymalizację procesów mikrobiologicznych w fermentacji bakteryjnej lub drożdżowej. Nasze ustalenia są zgodne z ustaleniami Yuena i McNeilla¹¹; Jedna...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,5 ml mikroprobówka	Eppendorf	-
-2,0 ml mikroprobówka	Eppendorf	-
-CaCO3	Meyer	471-34-1	Węglan wapnia
D-Glukoza	Meyer	50-99-7	D-Glukoza
Sucha kąpiel	FisherScientific	11-718-4	Numer seryjny 911NO251. Blok SxDxH mm/in: 124 x 76 x 39 / 4,9 x 3,0 x 1,5
Oksydaza glukozowa	Sigma Aldrich	G6125-50KU	Proszek enzymatyczny
H2O	-	-	Woda dejonizowana
H2SO4	Meyer	7664-93-9	Kwas siarkowy
HCl	Meyer	7647-01-0	Kwas chlorowodorowy
K2HPO4	Meyer	7758-11-4	Fosforan dipotasowy
KH2PO4	Meyer	7778-77-0	Fosforan monopotasowy
KOH	Meyer	1310-58-3	Wodorotlenek potasu
Lambda 35	PerkinElmer-Spektrofotometr
Mikrorurka wirówka	-	--
o-dichlorowodorek dianizydyny	Sigma Aldrich	D3252	Peroksydaza chromogenna
	Sigma Aldrich	P8125-50KU	Enzymatyczny
pH-metr	Hanna	1131	Hanna 1170
Octan sodu	Meyer	127-09-3
Meyer Szpatułki do ważenia	-	-	-