Kwantyfikacja glukozy Bergmeyera dla próbek mikrobiologicznych

Summary

Kwantyfikacja glukozy Bergmeyera to spektrofotometryczna technika enzymatyczna używana głównie do testów klinicznych, które dokładnie i czule mierzą ilość glukozy. W niniejszym artykule przedstawiono protokół stosowania tej metody do próbek mikrobiologicznych.

Abstract

Stężenie glukozy jest kluczowym wskaźnikiem metabolizmu komórkowego i może wskazywać na całkowite tempo metabolizmu, aberrację w metabolizmie glukozy, a w niektórych przypadkach na to, jak komórki łączą metabolizm glukozy z metabolizmem energetycznym. Ponadto wewnątrzkomórkowy i zewnątrzkomórkowy poziom glukozy wskazuje na stan metaboliczny komórek. Techniki enzymatyczne, takie jak oznaczanie ilościowe glukozy metodą Bergmeyera, są dokładniejsze i bardziej czułe niż inne techniki, takie jak kwas dinitrosalicylowy lub metody fluorescencyjne, które są zwykle stosowane w mikrobiologii. Chociaż jest stosowana głównie w obszarze klinicznym, oznaczanie ilościowe glukozy Bergmeyera może być również stosowane do dowolnej komórki, ale nie zostało szczegółowo opisane w przypadku bakterii, grzybów, drożdży lub innych mikroorganizmów.

Tutaj przedstawiamy metodologię ilościowego oznaczania glukozy z próbek bakterii i drożdży za pomocą enzymatycznej metody kwantyfikacji glukozy Bergmeyera. Procedura obejmowała enzymy oksydazę glukozową, peroksydazę i dichlorowodorek o-dianizydyny inkubowane w temperaturze 37 °C przez 20 minut, a następnie dodawane były kwas siarkowy. Następnie mierzy się absorbancję przy długości fali 545 nm. Należy podkreślić, że chociaż technika ta stwarza trudności w pomiarze wysokich stężeń glukozy (powyżej 60 g/l), możliwe jest zmierzenie stężeń poniżej 50 g/l przy użyciu współczynników rozcieńczenia. To enzymatyczne podejście jest cenne dla badań i analiz w mikrobiologii i innych dziedzinach naukowych. Precyzja i czułość metody sprawiają, że jest ona pomocna w wykrywaniu nawet niskich stężeń glukozy w próbkach mikrobiologicznych.

Introduction

Glukoza służy jako podstawowe źródło energii i węgla dla wielu mikroorganizmów, w tym bakterii, drożdży i grzybów. Mikroorganizmy te pobierają glukozę przez transportery znajdujące się na błonie zewnątrzkomórkowej, gdzie przechodzi ona szereg reakcji biochemicznych w szlaku metabolicznym glikolizy, aby zostać przekształconym w pirogronian¹. Istnieją różne techniki ilościowego oznaczania cukrów redukujących, takich jak glukoza. Na przykład można zastosować odczynnik Benedicta², użycie kwasu 3,5-dinitrosalicylowego (DNS)^3,4, metoda anthrona⁵....

Protocol

1. Przygotowanie roztworu

1. Przygotować 100 ml 0,1 M buforu fosforanowego. Odważyć 1,28 g diwodorofosforanu potasu (KH₂PO₄) i 0,1304 g fosforanu dipotasowego (K₂HPO₄) i dodać je do szklanej zlewki. Teraz dodaj 70 ml wody dejonizowanej (H₂Odi) i dostosuj pH do 5,5 za pomocą 1 M kwasu solnego (HCl) lub wodorotlenku potasu (KOH). Przenieść roztwór do kolby miarowej i dostosować końcową objętość do 100 ml. Następnie przenieść roztwór do bursztynowego pojemnika i przechowywać roztwór w temperaturze 4-8 °C przez okres do 3 miesięcy.
   UWAGA: Przez cały proces przygotowania należy nosić ręka....

Results

Analiza spektrofotometryczna GOX-H₂SO₄ wykazała pojedynczą maksymalną absorbancję przy 529 nm (λmax) (Rysunek 2A), z dodatkowymi wartościami absorbancji zaobserwowanymi przy 545 nm. Analizując wartości absorbancji przy różnych stężeniach glukozy, uzyskaliśmy liniowość (R²) wynoszącą 0,9977 dla λ529 nm i R² wynoszącą 0,9967 dla λ545 nm (Rysunek 2B). Liniowość, w danym zakresie, odnosi się do zdolności do dostarczania wyników wprost proporcjonalnyc.......

Discussion

Kwantyfikacja glukozy w pożywkach hodowlanych jest niezbędna do zrozumienia wzrostu drobnoustrojów i aktywności metabolicznej, ponieważ glukoza służy jako podstawowe źródło energii dla wielu mikroorganizmów. W tym badaniu zastosowaliśmy metodę GOX-H₂SO₄ do dokładnego pomiaru poziomu glukozy w pożywkach hodowlanych, mając na celu optymalizację procesów mikrobiologicznych w fermentacji bakteryjnej lub drożdżowej. Nasze ustalenia są zgodne z ustaleniami Yuena i McNeilla¹¹; Jedna.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,5 ml mikroprobówka	Eppendorf	-
-2,0 ml mikroprobówka	Eppendorf	-
-CaCO3	Meyer	471-34-1	Węglan wapnia
D-Glukoza	Meyer	50-99-7	D-Glukoza
Sucha kąpiel	FisherScientific	11-718-4	Numer seryjny 911NO251. Blok SxDxH mm/in: 124 x 76 x 39 / 4,9 x 3,0 x 1,5
Oksydaza glukozowa	Sigma Aldrich	G6125-50KU	Proszek enzymatyczny
H2O	-	-	Woda dejonizowana
H2SO4	Meyer	7664-93-9	Kwas siarkowy
HCl	Meyer	7647-01-0	Kwas chlorowodorowy
K2HPO4	Meyer	7758-11-4	Fosforan dipotasowy
KH2PO4	Meyer	7778-77-0	Fosforan monopotasowy
KOH	Meyer	1310-58-3	Wodorotlenek potasu
Lambda 35	PerkinElmer-Spektrofotometr
Mikrorurka wirówka	-	--
o-dichlorowodorek dianizydyny	Sigma Aldrich	D3252	Peroksydaza chromogenna
	Sigma Aldrich	P8125-50KU	Enzymatyczny
pH-metr	Hanna	1131	Hanna 1170
Octan sodu	Meyer	127-09-3
Meyer Szpatułki do ważenia	-	-	-