Społeczności mikrobiologiczne u komarów są bardzo obiecujące dla strategii biokontroli wektorów. Większość symbiontów nie nadaje się do hodowli, co wymaga analiz metagenomicznych. Opisujemy metodę preparacji samic komarów i oddzielania jajników, jelita środkowego i gruczołów ślinowych, zapobiegając zanieczyszczeniu krzyżowemu, ułatwiając badania mikrobiomu na poziomie narządów i zwiększając zrozumienie roli mikroorganizmów w biologii komarów.
Artykuł metodologiczny
Rozwarstwienie jajników, jelita środkowego i gruczołów ślinowych komarów w celu analizy mikrobiomu na poziomie narządów
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Globalne obciążenie chorobami przenoszonymi przez komary, w tym malarią, dengą, Zachodnim Nilem, Zika, Usutu i żółtą febrą, wciąż rośnie, stanowiąc poważne zagrożenie dla zdrowia publicznego. Wraz ze wzrostem odporności na środki owadobójcze i brakiem skutecznych szczepionek pojawiają się nowe strategie, które koncentrują się na mikrobiocie komarów. Niemniej jednak większość symbiontów pozostaje odporna na uprawę. Scharakteryzowanie różnorodności i funkcji genomów bakteryjnych w próbkach komarów opiera się zatem na metagenomice oraz późniejszych strategiach składania i kategoryzowania. Uzyskanie i analiza genomów złożonych w metagenomie (MAG) z oddzielonych narządów może w szczególności dostarczyć kluczowych informacji na temat specyficznej roli drobnoustrojów związanych z komarami w jajnikach (narządach rozrodczych), jelicie środkowym (kluczowe dla trawienia pokarmu i odporności) lub gruczołach ślinowych (niezbędnych do przenoszenia chorób przenoszonych przez wektory, ponieważ patogeny muszą je skolonizować, aby dostać się do śliny i dotrzeć do krwiobiegu podczas posiłku z krwi). Te nowo zrekonstruowane genomy mogą następnie utorować drogę do opracowania nowych strategii kontroli biologicznej wektorów. W tym celu konieczne jest odizolowanie narządów komarów przy jednoczesnym unikaniu zanieczyszczenia krzyżowego między nimi lub mikroorganizmami obecnymi w innych narządach komarów. W tym miejscu opisujemy zoptymalizowany i wolny od zanieczyszczeń protokół preparacyjny do badania mikrobiomu komarów na poziomie narządów.
Wprowadzenie
Komary rozprzestrzeniają szeroką gamę patogenów powodujących choroby i stanowią poważne zagrożenie dla zdrowia publicznego. Ze względu na zwiększone rozpowszechnienie oporności na insektycydy wśród populacji komarów i brak skutecznych szczepionek przeciwko tym patogenom, pojawiają się nowe metody kontroli biologicznej, które koncentrują się na mikrobiomie komarów. W szczególności wyróżnia się wewnątrzkomórkowa bakteria Wolbachia, która może zakłócać przenoszenie patogenów i manipulować rozmnażaniem gospodarza1,2,3. Ponadto inne symbionty komarów odgrywają kluczową rolę w przetrwaniu, rozwoju lub układzie odpornościowym gospodarza, a także w infekcjach i przenoszeniu patogenów, i są bardzo obiecujące pod względem wykorzystania do zwalczania chorób przenoszonych przez wektory4,5,6,7,8.
Mikroorganizmy związane z komarami obejmują wszystkie dziedziny życia mikroorganizmów (w tym bakterie, eukarionty i grzyby), które wchodzą w bliskie interakcje ze swoim gospodarzem, ale także ze sobą nawzajem w różnych przedziałach ciała9,10. W związku z tym lepsze zrozumienie mikrobioty, jej potencjalnej zmienności sezonowej11 oraz mechanizmów, za pomocą których jej członkowie wchodzą w bezpośrednie interakcje w różnych tkankach komarów, może pomóc w opracowaniu nowych ukierunkowanych metod kontroli biologicznej lub ulepszeniu istniejących. Jednak większość symbiontów pozostaje odporna na hodowlę, co uniemożliwia ich charakterystykę.
Pojawienie się metod sekwencjonowania drugiej i trzeciej generacji, wraz z najnowocześniejszymi metodami montażu i binowania, umożliwiło rekonstrukcję genomów mikrobiologicznych oraz dostęp do różnorodności i potencjału funkcjonalnego mikrobów niehodowlanych. W tym miejscu przedstawiamy metodę preparacji jajników, jelita środkowego i gruczołów ślinowych samic komarów przy jednoczesnym zapobieganiu zakażeniu krzyżowemu. Protokół ten może być kontynuowany przez ekstrakcję genomowego DNA, a następnie metakodowanie lub sekwencjonowanie metagenomiczne typu shotgun w celu zbadania różnorodności i funkcji mikroflory komarów na poziomie narządów. Podajemy przykład danych dotyczących sekcji komarów i mikrobiomu dla próbek Culex spp., chociaż protokół ten można rozszerzyć na wektory innych rodzajów, takich jak Anopheles lub Aedes.
Protokół
UWAGA: Rysunek 1 pokazuje schemat metody podsumowującej różne kroki protokołu.
1. Przygotowanie materiału
- Przed rozpoczęciem eksperymentu należy przygotować roztwór wybielacza z 0,5% aktywnym chlorem (zalecany przez Światową Organizację Zdrowia) do dezynfekcji sprzętu i stołu warsztatowego.
- W 900 ml wody rozpuścić trzy rozpuszczalne tabletki, z których każda zawiera 1,5 g aktywnego chloru. Odczekaj 15 minut, aż tabletki całkowicie się rozpuszczą, w wyniku czego otrzymasz 0,5% roztwór wybielacza.
- Umieść 0,5% roztwór wybielacza w butelce z rozpylaczem. Następnie rozpyl roztwór na wszystkie urządzenia preparacyjne, w tym szkiełka mikroskopowe i stół warsztatowy.
UWAGA: Sprzęt i stół warsztatowy należy pozostawić do wyschnięcia na ~10 minut przed użyciem.
- Aby spłukać komary przed każdym rozbiorem, aby zapobiec zanieczyszczeniu próbek bakteriami zewnętrznymi, przygotuj cztery nowo wysterylizowane probówki o pojemności 1,5 ml: dwie zawierające 96% etanolu i dwie inne zawierające 1x bufor PBS (sól fizjologiczna buforowana fosforanami).
- Przygotuj probówki do przechowywania próbek po rozebraniu każdego komara: cztery sterylne probówki o pojemności 1,5 ml, z których każda zawiera 100 μl buforu konserwującego.
UWAGA: Przygotuj jedną rurkę na gruczoły ślinowe, jedną na jajniki, jedną na jelito środkowe i jedną na tuszę komara.
2. Kolekcja komarów
- Zbieraj i utrzymuj przy życiu dorosłe samice (z pola lub laboratorium, 4-7 dni) do sterylizacji powierzchniowej.
3. Powierzchniowa sterylizacja komarów
UWAGA: Wyczyść kleszcze i igły oraz użyj nowych, wysterylizowanych probówek między każdym organem a osobą. Jeśli wybielacz jest niedostępny, upewnij się, że dokładnie wysterylizowałeś płomieniowo kleszcze i igły preparacyjne między sekcją każdej osoby a narządem, aby zapobiec zanieczyszczeniu krzyżowemu materiału biologicznego. Narzędzia do preparacji powinny być suche, bez pozostałości wybielacza/etanolu, przed następnym użyciem.
- Aby uniknąć opróżniania treści jelitowej przez samice pod wpływem alkoholu, należy je znieczulić na zimno na lodzie lub w zamrażarce w temperaturze -20 °C (przez 4 minuty, aby tkanki i narządy nie zamarły).
- Przenieś pojedyncze komary do nowej wysterylizowanej probówki o pojemności 1,5 ml z 1 ml 96% etanolu. Wiruj delikatnie (ręcznie) przez 30 s (dobrze potrząśnij komarem w tubce, aby usunąć łuski i potencjalne zanieczyszczenia bakteryjne na powierzchni owadów). Spłukać dwukrotnie za pomocą probówek zawierających etanol.
- Przenieś komara do nowej wysterylizowanej probówki o pojemności 1,5 ml z 1 ml sterylnego roztworu 1x PBS i delikatnie wiruj (ręcznie) przez 30 sekund (aby uniknąć wytrącania się DNA etanolem). Przepłukać dwukrotnie za pomocą probówek zawierających sterylny 1x PBS.
4. Sekcja komarów
- Umieść kilka małych kropel sterylnego 1x PBS na szkiełku, aby ułatwić umieszczenie komara i płukanie wypreparowanych narządów.
UWAGA: Krople sterylnego PBS powinny być wystarczająco duże, aby pomieścić narządy komara. - Weź oczyszczonego komara i umieść go na kropli sterylnego 1x PBS na szkiełku mikroskopowym.
- Wypreparuj gruczoły ślinowe za pomocą wysterylizowanych kleszczy i igły, jak opisano poniżej.
- Przytrzymaj klatkę piersiową komara pęsetą, aby zapobiec jego ruchom. Następnie umieść igłę na szyi, poniżej głowy i delikatnie pociągnij za głowę komara, aby oddzielić ją od klatki piersiowej.
UWAGA: Gruczoły ślinowe znajdują się w górnej części klatki piersiowej i są połączone z głową przewodem ślinowym. Podczas sekcji ważne jest, aby nie przerwać tego przewodu, ponieważ gruczoły ślinowe nie pojawią się wraz z głową, gdy wyciągniesz ją z klatki piersiowej. Dlatego ważne jest, aby mieć świeżego komara, a nie mrożonego. - Kiedy głowa oddziela się od klatki piersiowej, obserwuj, jak wyłaniają się dwa gruczoły ślinowe, z których każdy składa się z trzech płatów. Przetnij gruczoły ślinowe na poziomie przewodu ślinowego, wyjmij je igłą i umieść w nowej kropli sterylnego 1x PBS, aby ją spłukać i zapobiec zanieczyszczeniom międzynarządowym.
- Pobrać gruczoły ślinowe za pomocą igły i umieścić je w nowej wysterylizowanej probówce zawierającej 100 μl buforu konserwującego.
- Przytrzymaj klatkę piersiową komara pęsetą, aby zapobiec jego ruchom. Następnie umieść igłę na szyi, poniżej głowy i delikatnie pociągnij za głowę komara, aby oddzielić ją od klatki piersiowej.
- Wypreparuj jajniki za pomocą wysterylizowanych kleszczy i igły w następujący sposób.
- Połóż komara na plecach. Używając kleszczy do trzymania komara za klatkę piersiową, aby zapobiec ruchowi podczas sekcji, nakłuj igłą trzeci segment brzucha (zaczynając od dołu).
UWAGA: Opcjonalnie usuń nogi i skrzydła komara, aby ułatwić sekcję. - Przekłuwając trzeci segment brzucha, pociągnij brzuch w dół, aby go otworzyć i odsłonić narządy wewnętrzne. Usuń wszelkie pozostałe części egzoszkieletu komara, aby ułatwić uwolnienie narządów.
UWAGA: Widoczne są narządy w jamie brzusznej, takie jak jelita, kanaliki Malpighiego i jajniki. - Wyjmij oba jajniki za pomocą wysterylizowanych kleszczy i umieść je w nowej kropli sterylnego 1x PBS na szkiełku mikroskopowym, aby je przepłukać. Chwyć jajniki i umieść je w probówce o pojemności 1,5 ml ze 100 μl buforu konserwującego.
- Połóż komara na plecach. Używając kleszczy do trzymania komara za klatkę piersiową, aby zapobiec ruchowi podczas sekcji, nakłuj igłą trzeci segment brzucha (zaczynając od dołu).
- Teraz, gdy brzuch jest otwarty, a narządy są odsłonięte, odzyskaj jelito środkowe za pomocą nowych wysterylizowanych kleszczy i/lub igły.
- Oddziel jelito środkowe od jelita przedniego i tylnego, a następnie usuń kanaliki Malpighiego z jelita środkowego. Chwyć jelito środkowe za pomocą sterylnej igły i umieść je na nowej sterylnej kropli 1x PBS, aby ją wypłukać i zapobiec zanieczyszczeniom międzynarządowym.
- Przenieś do nowego sterylnego 1x PBS kropli. Otwórz jelito środkowe za pomocą kleszczy, aby uwolnić i wzbogacić o bakterie, jak opisano w pliku uzupełniającym 1. Chwyć jelito środkowe kleszczami i odpipetuj wszystkie PBS zawierające bakterie, aby przechowywać cały materiał (płyn i tkankę) w nowej wysterylizowanej probówce o pojemności 1,5 ml ze 100 μl buforu konserwującego.
- Dodaj ponownie 5 μl 1x PBS na poprzednio używane miejsce w szkiełku mikroskopowym i bezpośrednio pipetuj PBS z powrotem do tej samej probówki o pojemności 1,5 ml, aby pobrać bakterie, które mogły przykleić się do szkiełka mikroskopowego.
- Za pomocą sterylnych kleszczy chwycić tuszę (pozostałe ciało) i przechowywać ją w nowej wysterylizowanej probówce o pojemności 1,5 ml ze 100 μl buforu konserwującego.
- Przechowywanie materiału do czasu dalszej obróbki
- Oznacz probówki z napisem "Gatunek, Organ, Data, Imię i nazwisko badacza".
- Wypreparowane jajniki, jelito środkowe, gruczoły ślinowe i tuszę należy przechowywać w temperaturze -20 °C do czasu przetworzenia.
- Śledź w arkuszu kalkulacyjnym wszystkie powiązane metadane dla próbek, w tym gatunek (lub tylko poziom rodzaju), datę pobrania, kraj, prowincję, szerokość i długość geograficzną, imię i nazwisko osoby, która przeprowadziła sekcję, gravid samica lub nie, mączkę z krwi lub nie.
Wyniki
Sekcje komarów
Zgodnie z protokołem, pobraliśmy i wyizolowaliśmy jajniki, jelito środkowe, gruczoły ślinowe oraz pozostałą część ciała (kadłub) z dwóch osobników Culex pipiens molestus (w tym z jednej samicy z jajami) pochodzących z kolonii laboratoryjnej. Poprawność sekcji potwierdzono poprzez obserwację pod stereomikroskopem całych (tj. nieuszkodzonych) i dobrze wyizolowanych organów, bez pozostałości tkanek. Całe ciało, głowę i klatkę piersiową, wypreparowane gruczoły ślinowe, jajniki i jelito środkowe osobnika Culex pipiens molestus przedstawiono na Rysunku 2. Zgodnie z oczekiwaniami, jelito środkowe i gruczoły ślinowe były o rząd wielkości mniejsze od jajników komara. Jaja samicy Culex w stanie gravidnym, wraz z jej jelitem środkowym i cewkami Malpighiego, przedstawiono na Rysunku 3. Należy zauważyć, że sekcje są bardziej podatne na niepowodzenie, gdy materiał nie jest świeży, co zwiększa prawdopodobieństwo przerwania tkanek (Rysunek 4B,C). Dlatego sugerujemy przeprowadzanie sekcji materiału niezwłocznie po pobraniu (w czasie krótszym niż 12 h), gdy tkanki są jeszcze elastyczne (Rysunek 4A). Podobnie można przeprowadzić sekcję materiału mrożonego, jednak wiąże się to z znacznie większym ryzykiem niepowodzenia i kontaminacji krzyżowej między organami ze względu na kruchość tkanek (Rysunek 4).
Dane mikrobiomu
Dodatkowo, zgodnie z tą samą procedurą, pobraliśmy i odseparowaliśmy jelita środkowe oraz jajniki od trzech osobników Culex quinquefasciatus z Noumea w Nowej Kaledonii. Z każdego organu wyizolowaliśmy DNA, przygotowaliśmy próbki do sekwencjonowania całego genomu i przeprowadziliśmy analizy danych mikrobiomu, zgodnie z opisem w Pliku uzupełniającym 1. Analiza różnorodności taksonomicznej bakterii na niezeskładanych, przefiltrowanych pod kątem jakości krótkich odczytach przy użyciu PhyloFlash12 wykazała odmienne dominujące taksony w jelitach środkowych w porównaniu z jajnikami (Rycina 5A). Co istotne, w społecznościach bakteryjnych jajników dominowały Wolbachia, z dodatkową obecnością filotypu Spirochaetaceae w jajnikach osobnika 3, podczas gdy społeczności w jelitach środkowych wykazywały szerszą różnorodność, obejmującą Gammaproteobacteria, Spirochaetaceae oraz Firmicutes. Z tych samych danych sekwencjonowania zrekonstruowaliśmy cztery genomy zmontowane z metagenomu (MAGs) o stopniu kompletności > 80% i redundancji < 5%, należące do klas Spirochaetia, Alpha- oraz Gammaproteobacteria (Tabela 1).
Zgodnie z oczekiwaniami, zrekonstruowane tutaj MAG nie objęły pełnej różnorodności taksonomicznej przewidywanej przez wyniki PhyloFlash, co wynika ze specyficznych ograniczeń rekonstrukcji genomów z wykorzystaniem krótkich odczytów metagenomicznych. MAG przypisany do Wolbachia (Ref. MAG 3 w Table 1) został wykryty we wszystkich jajnikach oraz w dwóch jelitach środkowych, przy czym w jajnikach odnotowano wyższy stopień pokrycia (Figure 5B). Zrekonstruowaliśmy również dwa MAG należące do rodziny Enterobacteriaceae, w tym do rodzaju Pantoea (Ref. MAG 1 i 2 w Table 1), w jelitach środkowych uzyskanych od osobników Culex 2 i 3, których nie wykryto w odpowiadających im jajnikach (Figure 5B). Na koniec zrekonstruowaliśmy jeden bakteryjny genom z rodziny Spirochaetaceae, Ref. MAG 4 (Table 1), przypisany do rodzaju BR149, który został pomyślnie wyizolowany z jelit środkowych Culex pipiens przez Grañę-Miraglię i współpracowników13. Co ciekawe, ten MAG został wykryty w jelitach środkowych osobników 1 i 3, a także w jajnikach osobnika 3 (Figure 5B).
Rycina 1: Schemat metody podsumowujący poszczególne etapy. Przygotowanie materiałów, odłów komarów, oczyszczanie komarów, sekcje komarów oraz przechowywanie. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rysunek 2: Culex pipiens uciążliwy żeńska (A) Całe ciało. (B) Głowa i tułów. (C) Wypreparowane gruczoły ślinowe. (D) Wypreparowane jajniki. (E) Wypreparowany przewód pokarmowy z cewkami Malpighiego. Paski skali = 500 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rycina 3: Przecięty odwłok ciążnej samicy Culex pipiens molestus. Przedstawiono jelito przednie, jelito środkowe, jelito tylne, cewki Malpighiego oraz jaja badanego osobnika. Czerwone przerywane linie wskazują miejsca nacięć w celu oddzielenia jelita środkowego od jelita przedniego i tylnego. Pasek skali = 500 µm. Skróty: F = jelito przednie; M = jelito środkowe; H = jelito tylne; E = jaja; MT = cewki Malpighiego. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rycina 4Sekcja materiału świeżego i zamrożonego Culex okazy komarów. Białe prostokąty ilustrują (A) tkanki komara z nienaruszonymi organami z nowo wypreparowanego osobnika oraz (B,C) uszkodzony materiał biologiczny z preparatów, które zostały zamrożone przed sekcją. Paski skali = 720 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rycina 5: Przykład analizy mikrobiomu trzech osobników Culex quinquefasciatus. (A) Wizualizacja różnorodności bakteryjnej oszacowanej poprzez ekstrakcję odczytów SSU rRNA za pomocą PhyloFlash12 w jelitach środkowych i jajnikach trzech okazów. (B) Średnie pokrycie zrekonstruowanych MAGs w próbkach. Skróty: MAG = Genom złożony z metagenomu (Metagenome-Assembled Genome); Ind = osobnik. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.
| MAG | Karta MAG 4 | Ref. MAG 2 | Odn. MAG 1 | Ref. MAG 3 |
| Długość (bp) | 1,287,790 | 4,910,866 | 4,751,276 | 1,298,266 |
| Liczba kontigów | 9 | 162 | 149 | 123 |
| zawartość GC % | 34.05 | 55.45 | 54.05 | 34.15 |
| Stopień ukończenia (%) | 84.5 | 97.18 | 98.59 | 91.55 |
| Redundancja (%) | 0 | 2.82 | 4.22 | 0 |
| Dziedzina | Bakterie | Bakterie | Bakterie | Bakterie |
| Typ | Spirochaetota | Proteobacteria | Proteobacteria | Proteobacteria |
| Klasa | Spirochaetia | Gammaproteobacteria | Gammaproteobacteria | Alphaproteobacteria |
| Kolejność | WRBN01 | Enterobacterales | Enterobacterales | Rickettsiales |
| Rodzina | WRBN01 | Enterobacteriaceae | Enterobacteriaceae | Anaplasmataceae |
| Rodzaj | BR149 | Pantoea | - | Wolbachia |
Tabela 1: Zrekonstruowane MAGs z trzech osobników Culex quinquefasciatus. Rozmiar genomu, liczba kontigów, zawartość GC, szacunki kompletności i redundancji na podstawie kolekcji rdzeniowych genów jednokopiowych dostępnych w Anvi'o17 oraz taksonomia uzyskana przy użyciu GTDB18.
Plik uzupełniający 1: Szczegółowy przykład procedury analizy danych mikrobiomu rozpoczynający się od pobrania próbek, ekstrakcji DNA i sekwencjonowania całego genomu, a następnie bioinformatycznego procesu rekonstrukcji genomu i szacowania proporcji odczytów prokariotycznych i eukariotycznych Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.
Dyskusja
Zalecamy zwrócenie szczególnej uwagi na kolejność rozwarstwiania narządów, zaczynając od gruczołów ślinowych. Rzeczywiście, zaobserwowaliśmy, że łatwiej było je wydobyć z klatki piersiowej okazów Culex , jeśli zachowana była integralność komara. Uszkodzenie brzucha lub klatki piersiowej może obniżyć ciśnienie w ciele komara, utrudniając zabieg. Możliwe jest jednak również przecięcie między klatką piersiową a brzuchem, a następnie wyciągnięcie gruczołów ślinowych z głowy i klatki piersiowej (A. B. Failloux, komunikacja osobista). Ponadto nabycie biegłych umiejętności preparowania może być trudne, dlatego sugerujemy ćwiczenie na odpowiedniej liczbie próbek przed eksperymentem.
Izolowanie narządów komarów przy jednoczesnym systematycznym unikaniu zakażeń krzyżowych ma kluczowe znaczenie dla szerokiego zakresu dalszych analiz mikrobioty komarów. Badanie metagenomiczne z rozdzielczością genomu przeprowadzone po sekcji pojedynczych jajników z próbek Culex pipiens w południowej Francji pozwoliło na odkrycie pierwszego plazmidu Wolbachia w Culex pipiens (pWCP14). Stosując podobne podejście, zbadaliśmy rozmieszczenie i częstość występowania pWCP w okazach Culex pipiens i Culex quinquefasciatus zarówno z obszarów kontynentalnych, jak i wyspiarskich na całym świecie, w różnych warunkach środowiskowych i laboratoryjnych. Ogólnie rzecz biorąc, dane ujawniły niezwykle konserwatywny element plazmidowy Wolbachia u komarów Culex , co sugeruje kluczową rolę tego ruchomego elementu w biologii endosymbiontów15, co uzasadnia dalszą analizę.
W tym miejscu podajemy dodatkowe przykłady analiz mikrobiomu komarów w próbkach jelita środkowego i jajników uzyskanych przy użyciu tej systematycznej procedury. Zaobserwowaliśmy wyraźną różnicę w mikrobiocie między tkankami (ryc. 5), zarówno z taksonami bakterii wspólnymi, jak i specyficznymi dla narządów. Zgodnie z oczekiwaniami, obecność Wolbachia wykryto w obu narządach, z wyższą względną liczebnością (na podstawie niezmontowanych krótkich odczytów) i średnim pokryciem MAG w jajnikach komarów w porównaniu z jelitem środkowym, co jest zgodne z obserwacją, że ten endosymbiont jest przenoszony przez jajniki, a następnie rozprzestrzenia się do tkanek somatycznych. Chociaż badanie to było ograniczone do próbek z Nowej Kaledonii, protokół ten może ułatwić badanie zmienności genomu Wolbachii w skali globalnej, a także jej roli w różnych fenotypach, w tym regulacji gęstości i ochrony wirusowej. Co więcej, praca ta jest przykładem tego, w jaki sposób przedstawiona tutaj procedura preparacji pozwala na zbadanie różnorodności taksonomicznej i potencjalnych zdolności funkcjonalnych symbiontów komarów w próbkach jelita środkowego.
Uzyskaliśmy dwa szkice genomów enterobakteryjnych, które były obecne tylko w dwóch próbkach jelita środkowego, potwierdzając brak zanieczyszczenia między narządami dla tych dwóch próbek. Jeśli chodzi o krętki, wykryte zarówno w jelicie środkowym, jak i jajnikach osobnika 3, i współpracownicy w 2020 roku zaobserwowali obecność tych bakterii na powierzchni tratw jajowych. Autorzy zasugerowali, że społeczności bakteryjne znalezione w tratwach jajowych mogą być przede wszystkim dziedziczone przez matkę z jajników, biorąc pod uwagę, że tratwy jajowe były trzymane w wodzie dejonizowanej i wolnej od bakterii. Nie mogli jednak wykluczyć możliwości kolonizacji bakteryjnej zachodzącej zaraz po złożeniu jaj i zalecili dalsze badania nad mikrobiomem jajnika16.
Chociaż początkowo został zaprojektowany dla okazów kompleksu gatunków Culex pipiens , przewidujemy możliwość zastosowania tego protokołu do szerszej społeczności entomologów medycznych badających inne wektory, takie jak Anopheles czy Aedes. Działając na poziomie pojedynczych narządów, metoda ta może umożliwić zarówno wewnątrz-, jak i międzyosobnicze porównania genomowe, oferując wgląd w zmienność genomu symbiontów w precyzyjnej skali, z potencjałem rozwoju strategii kontroli wektorów. Ta metoda preparacji i izolacji gruczołów ślinowych, jajników i jelita środkowego, zapobiegająca mikrobiologicznemu zanieczyszczeniu krzyżowemu, może być również użytecznym protokołem do badań dynamiki infekcji wirusowych w tych trzech narządach.
Oświadczenia
Autorzy oświadczają, że nie pozostają w konflikcie interesów.
Podziękowania
Dziękujemy Gilbertowi Legoffowi za nauczenie Jordana Tutagaty, jak preparować gruczoły ślinowe od komarów oraz Giuliano Mucciemu za pomoc przy zdjęciach organów komara. Dziękujemy Annie-Belli Failloux i Nonito Pages za pomocną dyskusję na temat protokołu. Prace te były wspierane przez ERC RosaLind Starting Grant "948135" dla JR. Dziękujemy platformie Vectopole (IRD, Montpellier) za zapewnienie wsparcia technicznego oraz za hodowlę i utrzymanie populacji komarów.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Alkohol 96° | Lupa naukowa Fisher | 10332562 | |
| nbsp; | |||
| Wybielacz | RAJA | 145517 | 150 tabletek po 1,5 g |
| Zestaw do przygotowania DNA | Illumina | Dostarczone przez platformę sekwencjonowania MGX | Wcześniej znany jako Nextera DNA Flex |
| DNA-RNA Shield (50 mL) | Zymo research | ZR1100-50 | Bufor konserwujący |
| DNeasy Blood and Tissue Kit | Zestaw do ekstrakcji DNA | Qiagen | 69504 |
| Końcówki filtrujące 20 i mikro; L | Starlab | S1120-3810 | |
| Końcówki filtrujące 200 &mikro; L | Starlab | S1120-8710 | |
| Końcówki filtrujące 1000 i mikro; L | Kleszcze Starlab | S1122-1730-C | |
| FST (Fine Science Tools) | 11252-20 | Kleszcze Dumont #5 | |
| Zestaw do kwantyfikacji biblioteki | Roche | Dostarczone przez platformę sekwencjonowania MGX | Biblioteka KAPA Zestawy do quanityfikacji |
| Mikropipety 2-20 i mikro; L | Eppendorf | 6.291704 | |
| Mikropipety 20-200 i mikro; L | Eppendorf | 6.291703 | |
| Mikropipety 100-1000 i mikro; L | Eppendorf | 7.648488 | |
| Szkiełka mikroskopowe | Epredia | J1800BMNZ | wymiar : 75 mm x 50 mm |
| Igły | Terumo | AN*2719R1 | |
| NGS kit | Agilent | Dostarczane przez platformę sekwencjonowania MGX | Systemy analizatorów fragmentów HS Genomic DNA 50kb Zestaw |
| NovaSeq 6000 | Illumina | Dostarczane przez platformę sekwencjonowania MGX | Sekwencer |
| PBS Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (sterylna) | Fisher scientific | 10212990 | |
| Permanentny marker | |||
| Sterylny Eppendorf | Dutscher | 33871 | 1,5 ml |
| Wspornik do igieł | FST (Fine Science Tools) | 26016-12 | Moria MC1 Uchwyt na szpilki 12 cm |
Bibliografia
- Achee, N. L., et al. Alternative strategies for mosquito-borne arbovirus control. PLOS Negl Trop Dis. 13 (1), e0006822(2019).
- Hoffmann, A. A., et al. Successful establishment of Wolbachia in Aedes populations to suppress dengue transmission. Nature. 476 (7361), 454-457 (2011).
- Porter, J., Sullivan, W. The cellular lives of Wolbachia. Nat Rev Microbiol. 21 (11), 750-766 (2023).
- Coon, K. L., Brown, M. R., Strand, M. R. Mosquitoes host communities of bacteria that are essential for development but vary greatly between local habitats. Mol Ecol. 25 (22), 5806-5826 (2016).
- Didion, E. M., et al. Microbiome reduction prevents lipid accumulation during early diapause in the northern house mosquito, Culex pipiens pipiens. J Insect Physiol. 134, 104295(2021).
- Gabrieli, P., et al. Mosquito trilogy: Microbiota, immunity and pathogens, and their implications for the control of disease transmission. Front Microbiol. 12, 630438(2021).
- Garrigós, M., Garrido, M., Panisse, G., Veiga, J., Martínez-de La Puente, J. Interactions between West Nile Virus and the microbiota of Culex pipiens vectors: A literature review. Pathogens. 12 (11), 1287(2023).
- Zheng, R., et al. Holobiont perspectives on tripartite interactions among microbiota, mosquitoes, and pathogens. ISME J. 17 (8), 1143-1152 (2023).
- Flores, G. A. M., et al. Wolbachia dominance influences the Culex quinquefasciatus microbiota. Sci Rep. 13 (1), 18980(2023).
- Hegde, S., et al. Interkingdom interactions shape the fungal microbiome of mosquitoes. Anim Microbiome. 6 (1), 11(2024).
- Suo, P., et al. Seasonal variation of midgut bacterial diversity in Culex quinquefasciatus populations in Haikou city, Hainan province, China. Biology. 11 (8), 1166(2022).
- Gruber-Vodicka, H. R., Seah, B. K. B., Pruesse, E. phyloFlash: Rapid small-subunit rRNA profiling and targeted assembly from metagenomes. mSystems. 5 (5), e00920-e00920 (2020).
- Graña-Miraglia, L., et al. Spirochetes isolated from arthropods constitute a novel genus Entomospira genus novum within the order Spirochaetales. Sci Rep. 10 (1), 17053(2020).
- Reveillaud, J., et al. The Wolbachia mobilome in Culex pipiens includes a putative plasmid. Nat Commun. 10 (1), 1051(2019).
- Ghousein, A., et al. pWCP is a widely distributed and highly conserved Wolbachia plasmid in Culex pipiens and Culex quinquefasciatus mosquitoes worldwide. ISME Commun. 3 (1), 40(2023).
- Juma, E. O., Kim, C. -H., Dunlap, C., Allan, B. F., Stone, C. M. Culex pipiens and Culex restuans egg rafts harbor diverse bacterial communities compared to their midgut tissues. Parasit Vectors. 13 (1), 532(2020).
- Lee, M. D. GToTree: a user-friendly workflow for phylogenomics. Bioinformatics. 35 (20), 4162-4164 (2019).
- Parks, D. H., et al. A complete domain-to-species taxonomy for bacteria and Archaea. Nat Biotechnology. 38 (9), 1079-1086 (2020).
Przedruki i uprawnienia
