Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Ocena niedotlenienia guza: obrazowanie tlenu in vivo 3D za pomocą elektronowego rezonansu paramagnetycznego

4.9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/67129

⸱

14 lutego 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Faculty of Biochemistry, Biophysics and Biotechnology, Department of Biophysics and Cancer Biology, Jagiellonian University, 2Doctoral School of Exact and Natural Sciences Faculty of Biochemistry, Biophysics and Biotechnology, Department of Biophysics and Cancer Biology, Jagiellonian University, 3Department of Radiation and Cellular Oncology, The University of Chicago, 4Center for EPR Imaging In Vivo Physiology, The University of Chicago, 5O2M Technologies

W tym artykule

Podsumowanie

Ilościowe mapy tlenowe 3D mysich guzów zostały zobrazowane nieinwazyjnie za pomocą pulsacyjnego rezonansu paramagnetycznego. Ultrasonografia B-mode i Power Doppler zostały wykorzystane do anatomii i struktury naczyniowej. Obrazy z obu modalności nałożono na siebie, umożliwiając wieloparametryczną analizę guza.

Streszczenie

Precyzyjny pomiar ciśnienia parcjalnego tlenu (pO2) w czasie rzeczywistym dostarcza cennych informacji w wielu chorobach, w tym w raku. Niskie pO2 guza (tj. niedotlenienie) jest związane z agresywnością guza i słabą odpowiedzią na terapię. Kwantyfikacja pO2 guza pozwala na ocenę skuteczności leczenia. Obrazowanie elektronowego rezonansu paramagnetycznego (EPRI), w szczególności impulsowe EPRI, stało się zaawansowaną trójwymiarową (3D) metodą oceny natlenienia tkanek in vivo. Ta innowacja była możliwa dzięki postępowi technologicznemu w zakresie EPR (elektronowego rezonansu paramagnetycznego) oraz zastosowaniu rozpuszczalnych w wodzie oksymetrycznych sond spinowych z rodziny triarylowych, oferujących szybkie i czułe dane dotyczące natleniania. Czas relaksacji sondy spinowej (T1 i/lub T2) dostarcza dokładnych informacji o pO2 w wybranych wokselach.

Ludzkie guzy glejaka LN229 wyrosły w międzyłopatkowym poduszce nagich myszy BALB/c. Obrazowanie ultrasonograficzne (USG) wykorzystano jako odniesienie do informacji anatomicznych guza. Aby zobrazować tkankę pO2, zwierzęta umieszczono w ustalonej pozycji w łóżku dla zwierząt z odniesieniami, umożliwiającymi rejestrację między metodami obrazowania. Po podaniu środka kontrastowego OX071 wykonano EPRI, a następnie tryb US B. Ze względu na niską toksyczność sondy spinowej, procedurę można powtórzyć podczas wzrostu guza lub leczenia. Po obrazowaniu proces rejestracji został przeprowadzony za pomocą oprogramowania napisanego w MATLAB. Ostatecznie frakcję niedotlenioną można obliczyć dla konkretnego guza, a histogram rozmieszczenia pO2 w tkance można porównać w czasie. EPRI w połączeniu z ultradźwiękami jest doskonałym narzędziem do tlenowego mapowania nowotworów w warunkach przedklinicznych.

Wprowadzenie

Zrozumienie mikrośrodowiska guza (TME), z jego złożonymi przestrzennymi i dynamicznymi interakcjami, przynosi pełniejsze zrozumienie biologii nowotworu. Niedotlenienie, czyli niski poziom tlenu, jest kluczowym składnikiem TME i odgrywa kluczową rolę w rozwoju innych stanów zagrażających życiu, w tym chorób układu krążenia, zaburzeń metabolicznych, takich jak cukrzyca i przewlekła choroba nerek1,2,3. Dotlenienie tkanek jest podstawowym czynnikiem, szczególnie w kontekście nowotworów, gdzie częściowe ciśnienie tlenu w tkankach (pO2) jest skorelowane z opornością na terapię. Poziom pO2 przekraczający 10 mm Hg wiąże się ze wzrostem skuteczności radioterapii o niskim liniowym transferze energii (LET) (efekt wzmocnienia tlenu).

Ostatnie badania z wykorzystaniem obrazowania elektronowego rezonansu paramagnetycznego (EPRI) wykazały, że radioterapia sterowana tlenem może spowodować dwukrotną poprawę wskaźników przeżycia w różnych nowotworach w modelach mysich4,5. Jest to podobne do ludzi, u których pO2 guza mierzono za pomocą wielu pomiarów elektrody Eppendorfa i stwierdzono, że mediana lub średnie wartości pO2 są poniżej 10 torr6. Oprócz radioterapii, niedotlenienie guza jest bezpośrednio skorelowane z agresywnością guza i wynikami innych terapii, takich jak terapia immunologiczna7,8. Związek ten podkreśla znaczenie precyzyjnych pomiarów tlenu w poprawie wyników terapeutycznych i zrozumieniu patofizjologii chorób.

Optymalna pulsoksymetria in vivo wymaga bezpośredniego pomiaru częściowego ciśnienia tlenu w tkankach, niezależnego od takich czynników jak perfuzja tkanek i nasycenie hemoglobiny. Zabieg powinien być nieinwazyjny, z krótkim i precyzyjnym czasem obrazowania, aby uniknąć potencjalnego wpływu na organizm, takiego jak przedłużone znieczulenie, zmiany temperatury tkanek lub znaczące zmiany ciśnienia w tkankach i pH. Oksymetria tkankowa powinna wykazywać się wysoką dokładnością i wiarygodnością, zapewniając spójne pomiary niezależnie od zmian w mikrośrodowisku tkankowym, w tym różnic w pH i stanie redoks. Dla skutecznego planowania terapii kluczowa jest rekonstrukcja danych obrazowych w czasie rzeczywistym i prosta interpretacja. Wiąże się to nie tylko z osiągnięciem rozdzielczości przestrzennej najlepiej mniejszej niż 1 mm, ale także z umożliwieniem szybkiego gromadzenia danych w celu monitorowania dynamicznych zmian stanu tlenu w tkankach, takich jak cykliczne niedotlenienie.

W tym kontekście, opracowano różne techniki pomiaru tlenu cząsteczkowego lub oceny niedotlenienia, z których każda ma unikalne zastosowanie i zalety. Elektroda platynowa, uważana za "złoty standard" w oksymetrii tkanek komórkowych i żywych zwierząt, zapewnia spójne pomiary dzięki precyzyjnemu wprowadzaniu do tkanek. Inne podejścia, takie jak metody optyczne wykorzystujące sondy fluorescencyjne, fotoakustyka, monitorowanie skutków hipoksji poprzez ekspresję genów lub białek lub testy komet, są łatwe w użyciu, ale są pośrednie lub ograniczone przez ścieżkę optyczną w tkankach. Obiecującymi alternatywami do oceny niedotlenienia i/lub natlenienia wydają się być obrazowanie metodą rezonansu magnetycznego (MRI)-OE-MRI10 -- lub MOBILE11, pozytonowa tomografia emisyjna (PET) z różnymi sondami wrażliwymi na niedotlenienie12, lub elektronowy rezonans paramagnetyczny (EPR).

EPR ma długą historię w dziedzinie biomedycyny. Samo zjawisko zostało po raz pierwszy opisane w 1944 roku i zostało szeroko przyjęte jako narzędzie do analizy struktur chemicznych, a ostatnio do systemów biologicznych i materiałów z niesparowanymi elektronami13. Spektroskopia EPR została wykorzystana do badania dynamiki i struktury układów biologicznych, takich jak fotosynteza, metaloproteiny, enzymy rodnikowe i błony fosfolipidowe14,15,16. Spektroskopia i tomografia elektronowego rezonansu paramagnetycznego (EPR) stały się kluczowymi nieinwazyjnymi metodami badania natlenienia guza i mikrośrodowiska z rozdzielczością przestrzenną ~1 mm, rozdzielczością czasową 1-10 min i rozdzielczością pO2 1-3 torr5,17,18.

Metody EPR fali ciągłej (CW) są nadal szeroko stosowane w większości zastosowań ze względu na prostotę rejestracji i interpretacji widm. Interakcje tlen-spin sondy działają poprzez ocenę zmian w intensywności sygnału EPR lub kształcie linii, dostarczając wglądu w poziom tlenu w próbce. CW EPR ma zauważalną przewagę pod względem czułości na szerszy zakres pO2 w porównaniu z metodami impulsowymi. Stosując różne sekwencje impulsów, można uzyskać informacje takie jak czasy relaksacji spinu i spinu elektronu, czasy relaksacji spinu i sieci spinowej oraz interakcje z sąsiednimi spinami18,19. Techniki impulsowego EPR, takie jak odzyskiwanie inwersji z odczytem echa spinowego elektronów (IRESE), mierzą szybkość relaksacji sieci spinowej, unikając artefaktu z relaksacji spowodowanej relaksacją sondy spinowej przy niskich stężeniach tlenu19,20. EPR może być stosowany do monitorowania zmian stężenia tlenu z wysoką rozdzielczością czasową i przestrzenną; jednak w oksymetrii przy wysokich stężeniach tlenu impulsowy EPR napotyka ograniczenia ze względu na krótkie czasy relaksacji namagnesowania poprzecznego mierzone za pomocą elektronowego echa spinowego (ESE). Ostatecznie CW i impulsowy EPR są komplementarne, a wiarygodne zrozumienie systemu wirowania wymaga zastosowania obu metod.

Techniki pulsoksymetrii EPR opierają się na liniowej zależności między poziomami tlenu a siecią spinową, jak również na szybkościach relaksacji spin-spin w roztworze. Wszystkie sondy pulsoksymetryczne są często podzielone na dwa typy: sondy wirowe rozpuszczalne i cząstek stałych. Wybór właściwej sondy spinowej zależy od konfiguracji eksperymentalnej i potrzebnych informacji21,22,23. Rozpuszczalne sondy spinowe, takie jak nitroksydy lub pochodne trytylu24,25, takie jak OX063 i jego deuterowana forma OX071, rozmieszczone w tkance, dostarczają informacji z całej objętości. Alternatywnie, do pomiarów jednopunktowych oraz do długotrwałych i powtarzających się ocen tlenu, można użyć sond półprzewodnikowych, takich jak LiPc, LiBuO lub pochodne węgla (patrz Tabela 1)22,23,26.

Ultrasonografia Obrazowanie w trybie B jest szeroko stosowane w klinice do obrazowania tkanek miękkich. Rozdzielczość zależy od zastosowanej częstotliwości przetwornika, a w przypadku badań przedklinicznych 18 MHz i więcej zapewnia wystarczającą rozdzielczość w płaszczyźnie i głębi obrazu. Dodatkowym atutem ultrasonografii jest możliwość uzyskania funkcjonalnych obrazów naczyń krwionośnych w trybie Power Doppler. W tym miejscu przedstawiamy obrazowanie tlenem metodą elektronowego rezonansu paramagnetycznego (EPROI) jako metodę generowania 3D map tlenowych nowotworów u żywych myszy. Odpowiednia ultrasonografia umożliwia niezbędne odniesienie anatomiczne do zdefiniowania guza w EPROI. Dla każdego zwierzęcia możliwe są wielokrotne sesje obrazowania. Ostatnim krokiem jest analiza, w tym rekonstrukcja obrazu i rejestracja między modalnościami w celu uzyskania histogramu pO2 z objętości guza.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Myszy zostały pozyskane z zatwierdzonego ośrodka hodowli zwierząt, a wszystkie eksperymenty zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi etycznymi (w naszym przypadku - Zezwolenie nr 165/2023, Pierwsza Lokalna Komisja Etyczna, Kraków, Polska).

1. Zwierzęta i linia nowotworowa

UWAGA: Myszy były trzymane w standardowych warunkach laboratoryjnych: Jasne/ciemne: 12 h/12 h, wilgotność: 60%, temperatura: 23 °C. Zapewniono im standardową dietę żywieniową z bezpłatnym dostępem do wody pitnej w klatkach społecznych.

  1. Hodowla linii komórkowej glejaka mysiego wielopostaciowego LN229
    1. Hodowla komórek LN229 w kolbach do hodowli tkankowych o długości 25cm2 w pożywce DMEM uzupełnionej 10% inaktywowaną termicznie płodową surowicą bydlęcą (FBS) i penicyliną-streptomycyną w stężeniach odpowiednio 10 U/ml i 0,1 mg/ml.
    2. Utrzymuj komórki w wilgotnej atmosferze zawierającej 5% CO2 w temperaturze 37 °C, pasując co 48 godzin przy użyciu 0,25% trypsyny-EDTA i PBS bez jonów magnezu i wapnia (pH 7,4).
  2. Inokulacja guza
    1. Na tydzień przed inokulacją należy codziennie obchodzić się z myszami, aby zapoznać je z badaczem.
    2. W dniu zaszczepienia zważyć myszy.
    3. Zawieś 200 000 komórek LN229 w 50 μl macierzy zewnątrzkomórkowej bez czynników wzrostu. Za pomocą igły 29 G zaszczepić mieszankę komórek podskórnie w śródłopatkowej poduszce tłuszczowej 16-tygodniowych nagich myszy BALB/c (N = 5).

2. Obrazowanie dopplerowskie USG

Ogólny harmonogram obrazowania nowotworów jest pokazany w Rysunek 1. Obrazowanie ultrasonograficzne jest używane zarówno do obrazowania naczyń krwionośnych za pomocą Doppler US, jak i Anatomy US jako odniesienie tuż przed EPROI (Ryc. 2). Obrazowanie anatomiczne w trybie B jest niezbędne do analizy utlenowania guza za pomocą EPR i jest opisane w sekcji 3. Chociaż obrazowanie ultrasonograficzne Doppler (sekcja 2) nie jest obowiązkowe dla pomyślnego przeprowadzenia rejestracji, to jednak dostarcza cennych informacji na temat optymalnego okna czasowego dla badania EPR i pozwala na określenie aktywnego unaczynienia w obszarze guza.

  1. Przygotowanie myszy
    1. Poczekaj, aż guzy osiągną około 30 mm3. W razie potrzeby należy ogolić myszy ręcznie wokół miejsca guza.
    2. Wywołaj znieczulenie za pomocą 2% izofrubanu i utrzymuj je za pomocą 1-1,5% izofluranu.
    3. Przenieść zwierzę z komory anestezjologicznej do poduszki grzewczej, aby utrzymać temperaturę ciała na poziomie 37 °C podczas przygotowania (w oparciu o sondę temperatury doodbytniczą). Ustabilizuj temperaturę zwierzęcia, aby uzyskać odpowiednią informację zwrotną o parametrach fizjologicznych.
  2. Usg
    1. Użyj systemu ultrasonograficznego z głowicą 57-25 MHz do obrazowania przedklinicznego (Rysunek 2, krok 1).
    2. Pobieraj pomiary 3D w trybie B do wizualizacji morfologii guza w kierunku strzałkowym. Użyj kroku co 0,1 mm.
      UWAGA: Nie przesuwaj zwierzęcia ani przetwornika, aby zachować dokładnie te same ustawienia.
    3. Zastosuj tryb Power Doppler do wizualizacji funkcjonalnego unaczynienia guza o następujących parametrach: Prędkość: 1,5 kHz, Filtr ścienny: niski, Priorytet: 75%, Trwałość: średnia, Rozmiar kroku 0,10 mm.
    4. Obrócić przetwornik, aby powtórzyć kroki 2.2.2 i 2.2.3 w kierunku osiowym.
    5. Wykonaj analizę danych za pomocą oprogramowania dostarczonego przez producenta ultrasonografów. Zaznacz granicę guza, prześlij ją na obraz 3D i oblicz objętość guza oraz procent unaczynienia.

3. EPROI

  1. Przygotowanie sondy
    1. Rozpuścić proszek OX071 przechowywany w temperaturze -80 °C w wstrzykiwanymH2Odo końcowego stężenia 1 g/10 ml (~70 mM).
  2. Przygotowanie myszy
    1. Znieczulij myszy 1%-3% izofluranem zmieszanym z powietrzem w pomieszczeniu i umieść je na uchwycie na zwierzęta.
    2. Podawać podskórnie 1 ml soli fizjologicznej w celu utrzymania prawidłowego poziomu nawodnienia.
    3. Monitoruj częstość oddechów zwierzęcia (80 ± 20 uderzeń na minutę) i temperaturę (37 ± 1 °C) za pomocą czujnika poduszki oddechowej i termometru powierzchniowego przymocowanego do skóry myszy. Monitorować temperaturę w odbycie jako punkt odniesienia (37 °C ± 1 °C).
    4. Wprowadzić rurkę z politetrafluoroetylenu (PTFE) (średnica zewnętrzna 0,7 mm) dootrzewnowo w celu podania sondy spinowej. Zabezpiecz kaniulę za pomocą polisiloksanu winylowego (VPS), aby zapobiec jej wypadnięciu z jamy brzusznej.
    5. Wprowadzić cewnik moczowy (24 G) w celu zebrania wydalanej sondy wirowej.
    6. Zabezpiecz mysz w łóżku dla zwierząt za pomocą glinki dentystycznej VPS do unieruchomienia (Rysunek 2A).
  3. Anatomiczne obrazowanie USG do rejestracji
    1. Włącz stół sterowany w 3D i wypoziomuj łóżko. Ustaw temperaturę platformy na 60 °C, tak aby temperatura zwierzęcia odizolowanego przez plastikowy uchwyt na łóżko była utrzymywana na poziomie 37 °C.
    2. Umieść legowisko dla zwierząt z unieruchomionym zwierzęciem w uchwycie na łóżko i przenieś je na stół kontrolowany przez 3D w celu obrazowania anatomicznego przed pomiarem EPR (Rysunek 2B). Upewnij się, że zwierzę jest zabezpieczone w uchwycie łóżka i nie dotyka platformy grzewczej.
    3. Ustal pozycję uchwytu łóżka w trzech wymiarach, aby zapobiec obracaniu, szczególnie obrotowi XZ (płaszczyzny strzałkowej), co ma kluczowe znaczenie dla dokładnej rejestracji.
    4. Umieść znacznik pozycji (drut wędkarski na taśmie o średnicy 0,35 mm) na uchwycie łóżka, oznaczając początek rezonatora.
    5. Obrazowanie w trybie B należy przeprowadzić ręcznie z krokiem 1 mm zarówno w kierunku osiowym, jak i strzałkowym w kierunku osi Y.
    6. Zobrazuj strukturę guza za pomocą następujących parametrów zależnych od określonej częstotliwości przetwornika; dla przetwornika 18 MHz, głębokość 20 mm, zakres dynamiki 84 dB, moc 8 dB, wzmocnienie 80%; dla przetwornika 40 MHz, głębokość 20 mm, zakres dynamiki 32 dB, wzmocnienie 100%; dla przetwornika 57 MHz, głębokość 13 mm, wzmocnienie 6 dB, moc 100%. Dostosuj ustawienie ostrości przetwornika do konkretnej lokalizacji guza.
    7. Pod koniec obrazowania anatomicznego zetrzyj nadmiar żelu z myszy i wyjmij unieruchomioną mysz w łóżku dla zwierząt z uchwytu łóżka.
  4. Obrazowanie tlenowe EPR
    1. Wykorzystaj kamerę tlenową do impulsowego EPR, działającą na częstotliwościach radiowych w zakresie od 685 MHz do 735 MHz. Do konfiguracji użyj cewek offsetowych do obrazowania 3D i analizy czasów relaksacji. Użyj rezonatora poziomego o wymiarach 32 mm x 35 m.
    2. Unieruchomioną mysz w łóżku dla zwierząt należy niezwłocznie przenieść do aparatu do obrazowania EPR po anatomicznym badaniu ultrasonograficznym (Rysunek 2C). Ostrożnie utrzymuj pozycję łóżka zwierzęcia, aby zminimalizować obroty w rezonatorze, podobnie jak w procedurze opisanej w sekcji 3.3.
    3. Podłącz ponownie sondę temperatury, aby zapewnić ciągłe monitorowanie i utrzymanie temperatury zwierzęcia, korelując ją z temperaturą wewnątrz rezonatora.
    4. W oprogramowaniu spektrometru EPR wykonaj strojenie rezonatora za pomocą pokrętła strojenia, aby wyśrodkować częstotliwość około 725 MHz (Rysunek 3A).
      UWAGA: Dobrze dopasowany rezonator powinien mieć spadek 25 dB lub lepszy.
    5. Zoptymalizuj moc mikrofal, aby uzyskać szczyt przy 60 ns (Rysunek 3B), dostosowując wartość tłumienia od 20 dB do 3 dB.
    6. Nastroić instrument tak, aby zanik swobodnej indukcji (FID) powierników umieszczonych w łóżku zwierzęcia był wyśrodkowany w polu magnetycznym i fazowany (Rysunek 3C).
    7. Podać 100 μl OXO71 dootrzewnowo przez wcześniej wprowadzoną kaniulę, a następnie przepłukać 50-100 μl roztworu soli fizjologicznej.
    8. Korzystając z zaprogramowanej sekwencji kolejki, uzyskaj pomiary z ustawionymi parametrami; typowa sekwencja zawiera T1, czasy relaksacji T2, echo spinowe elektronów 3D (ESE) dla obrazów odniesienia i echo spinowe elektronów z odzysku inwersji 4D (IRESE) dla obrazu zwierzęcego. Zbierz obrazowanie IRESE z gradientem 1,5 G/cm, czasem powtarzania 55 μs, wyzwalaniem wstępnym -250 ns, t90 wynosi 60 ns, a tau 400 ns; Całkowity czas akwizycji ~12 min. Powtórz obrazowanie IRESE co najmniej przez 30-40 minut (3-4 razy) po wstrzyknięciu sondy.
    9. Po wykonaniu obrazowania przenieś mysz z legowiska dla zwierząt na poduszkę grzewczą. Podawać podskórnie 1 ml soli fizjologicznej w celu utrzymania prawidłowego poziomu nawodnienia. Monitoruj, aż mysz odzyska pionową lokomocję.

4. Analiza danych

  1. Analiza rekonstrukcji 4D w "ProcessGUI"
    1. Przed rekonstrukcją należy zastosować korektę linii bazowej do projekcji, wybierając scenariusz "PulseRecon.scn" i ładując plik parametrów "IRESE_64pts_mouse_STANDARD_CHIRALITY.par" w celu analizy surowych danych IRESE.
    2. Przefiltruj każdą projekcję za pomocą filtra Gaussa o szerokości 4 punktów, co jest ustawieniem domyślnym dla wybranego scenariusza.
    3. Wykonaj podpróbkowanie przefiltrowanych projekcji do 64 punktów (rozmiar matrycy), co jest ustawieniem domyślnym dla wybranego scenariusza.
    4. Następnie przefiltruj projekcje za pomocą filtra Ram-Lak z apodyzacją na częstotliwości 0,6 razy większej od częstotliwości Nyquista (kliknij parametr Rekonstrukcja | FiltrOdcięcie).
    5. Rzutuj wstecz przefiltrowane projekcje, aby uzyskać obraz spektralno-przestrzenny 4D.
    6. Wykorzystaj algorytm dopasowywania, aby wyodrębnić szerokość linii pakietu spinowego z widma w każdym wokselu. Sekcja Ustawienia parametrów dopasowania: Przedłużacz ostatniego punktu - 3, metoda dopasowania - domyślnie.
    7. Użyj domyślnych ustawień parametrów w procedurze dopasowania, w tym amplitudy widma, fazy, środka widma i szerokości linii pakietu spinu widmowego.
  2. Rejestracja między anatomicznym US a EPROI w "ArbuzGUI" (Rysunek 4)
    UWAGA: Do przeprowadzenia rejestracji wykorzystano procedurę MATLAB "ArbuzGUI" opracowaną przez Borisa Epela z University of Chicago. Oprogramowanie jest dostępne na stronie EPR-IT https://github.com/o2mdev/eprit. Przybornik rejestracji został wyjaśniony wcześniej w innym miejscu27. Zapoznaj się z instrukcją obsługi, aby uzyskać szczegółowe instrukcje krok po kroku28.
    1. Wczytuj amerykańskie obrazy 2D jako stos z krokiem 1 mm (krok jest ściśle związany z akwizycją klatek w obrazowaniu w trybie B, punkt 3.3.7), aby utworzyć obrazy 3D US.
    2. Dodaj zebrane obrazy pO2 (zrekonstruowane w kroku 4.1) jako typ obrazu 3D ustawiony jako dane "PO2_pEPRI". Przechowywanie danych w projekcie.
    3. Utwórz sekwencję rejestracji i transformację, wybierając pozycję Specjalne | Rejestracja MRI-EPRI.
    4. Wybierz obraz, który ma zostać dostosowany do danych EPRI (np. US axial 3D), wybierając opcję Sekwencja | dodaj akcję. Użyj etapu 5:T2, aby uzyskać najlepszą wydajność. W rezultacie przed nazwą wybranego obrazu pojawi się symbol plusa.
    5. Otwórz obraz US w SliceMaskEditPLG. Dostosuj skalę obrazu US na podstawie linijki przedstawionej na obrazach. Zaznacz znacznik pozycji w USA, kontur zwierzęcia i pozycję guza na podstawie wybranych klatek.
    6. W SliceMaskEditPLG zaznacz kontur mapy pO2 i punkt odniesienia na zrekonstruowanych obrazach 4D pO2.
    7. Korzystając z przeglądarki figur i przybornika RotateImagePLG, obróć obraz USA zgodnie ze znacznikiem pozycji USA w stosunku do pozycji odniesienia, aby zarejestrować mapę pO2 z konturem USA.
    8. Przekształć maskę guza z obrazu USA na mapę pO2.
    9. Wizualizuj maskę guza na mapie pO2 myszy i eksportuj wartości pO2 dla każdego woksela.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Reprezentatywny przekrój poprzeczny z obrazu ultrasonograficznego guza LN229 rosnącego w podłopatkowej tkance tłuszczowej, wraz z układem naczyniowym, przedstawiono na Rysunku 5. Część naczyń krwionośnych widoczna jest poza granicami guza. Co nieoczekiwane, procentowa objętość unaczynienia guza nie uległa zmniejszeniu i pozostała stabilna wraz ze wzrostem nowotworu.

Zgodnie z przedstawionym na Rysunku 2, krok 2 polega na unieruchomien...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W opisanym protokole obrazowania znajduje się kilka krytycznych kroków. Po pierwsze, aby zarejestrować obrazy anatomiczne z mapami tlenu, rezonans magnetyczny może być lepszym wyborem niż ultradźwięki ze względu na lepszą rozdzielczość i możliwość dostarczania szczegółowych danych 3D19. Ultrasonografia z przetwornikiem wysokiej częstotliwości zapewnia doskonałą rozdzielczość i wystarczającą głębokość obrazowania do badań przedklinicznych. Jednak zarówno rezonans magnetyczny, jak i USG wymagają uży...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Prof. H. Halpern i B. Epel są współzałożycielami O2M Technologies. Pozostali autorzy: G. Dziurman, A. Bienia, A. Murzyn, B. Płóciennik, J. Kozik, G. Szewczyk, M. Szczygieł, M. Krzykawska-Serda i M. Elas nie mają do stwierdzenia konfliktu interesów.

Podziękowania

Dziękujemy O2M Technology za łaskawe wsparcie techniczne. Uznaje się granty Narodowego Centrum Nauki nr 2020/37/B/NZ4/01313 (obrazownik Jiva-25) oraz NCBiR: ENM3/IV/18/RXnanoBRAIN/2022 (koszty zwierząt). Zakup ultrasonografu VevoF2 został wsparty przez Wydział Biochemii, Biofizyki i Biotechnologii w ramach Programu Strategicznego Inicjatywa Doskonałości Uniwersytetu Jagiellońskiego.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
aqua pro injectionePolpharma
1280610-ArbuzGUI O2M Technologies–dostępne w repozytorium github
fosforan disodowyPOCH S.A.
′ s Zmodyfikowany Orzeł i liczba pierwsza; s Medium - high glucoseMerck Life ScienceD56484500 mg/L glukozy i L-glutaminy
płodowa surowica bydlęca Gibco, Thermo Fisher Scientific10500064-drut
wędkarskiGood FishA-55A-035US znacznik pozycji - 0,35 mm
GeltrexGibco, Thermo Fisher ScientificA1413302matryca membrany podstawnej o obniżonym współczynniku wzrostu
ibGUIO2MTechnologies-dostępnew repozytorium github
injectio natrii chlorati isotonicaPolpharmaUżyto wielu elementów9 mg/ml
igieł insulinowych 29 G Użyto wielu elementówBecton, Dickinson and Company-
Jiva 25O2M Technologies-EPROI
MATLABMathWorks-wersja R2021b
penicylina-streptomycynaMerck Life ScienceP4333z 10 000 jednostek penicyliny i 10 mg streptomycyny/ml
chlorku potasuPOCH S.A.
potasuPOCH S.A.
O2M Technologies-dostępne w repozytorium github
Rurki PTFE Cole Palmer Instrument Co06412-11-chlorek
soduPOCH S.A.
FEMI Instruments-wersja3.4 CS 64bit
Surflash I.V. CewnikTerumoSR*FF2419rozmiar: 24G x ¾ "
taśma3M użyto wielu elementówmikroporowych
Trypsyna-EDTA Gibco, Thermo Fisher Scientific
25200072-UltrasonografiaTelemed-AnatomicalUS
żel KONIXNUG-0019-Vetflurane
Virbac1373171000 mg/g
Vevo F2FujiFilms, Visual Sonics-B-modei glina
dentystyczna Doppler winylowo-polisiloksan Użyto wielu elementów3M ESPE:
799280115-Dulbecco 739740114-diwodorofosforan 742020112-ProcessGUI 794121116-SpecMan4EPR

Bibliografia

  1. Chen, P. -S. Pathophysiological implications of hypoxia in human diseases. J Biomed Sci. 27, 63(2020).
  2. Lopez-Pascual, A., Trayhurn, P., Martínez, J. A., González-Muniesa, P. Oxygen in metabolic dysfunction and its therapeutic relevance. Antioxid Redox Signal. 35 (8), 642-687 (2021).
  3. Vaupel, P., Mayer, A., Höckel, M. Tumor hypoxia and malignant progression. Methods Enzymol. 381, 335-354 (2004).
  4. Gertsenshteyn, I., et al. Absolute oxygen-guided radiation therapy improves tumor control in three preclinical tumor models. Front Med (Lausanne). 10, 1269689(2023).
  5. Epel, B., et al. Oxygen-guided radiation therapy. Int J of Radiat Oncol Biol Phys. 103 (3), 977-984 (2019).
  6. Hockel, M., et al. Association between tumor hypoxia and malignant progression in advanced cancer of the uterine cervix. Cancer Res. 56 (19), 4509-4515 (1996).
  7. Semenza, G. L. Intratumoral hypoxia and mechanisms of immune evasion mediated by hypoxia-inducible factors. Physiology (Bethesda). 36 (2), 73-83 (2021).
  8. Dewhirst, M. W., Mowery, Y. M., Mitchell, J. B., Cherukuri, M. K., Secomb, T. W. Rationale for hypoxia assessment and amelioration for precision therapy and immunotherapy studies. J Clin Invest. 129 (2), 489-491 (2019).
  9. Tatum, J. L., et al. Hypoxia: importance in tumor biology, noninvasive measurement by imaging, and value of its measurement in the management of cancer therapy. Int J Radiat Biol. 82 (10), 699-757 (2006).
  10. O'Connor, J. P. B., et al. Oxygen-enhanced MRI accurately identifies, quantifies, and maps tumor hypoxia in preclinical cancer models. Cancer Res. 76 (4), 787-795 (2016).
  11. Colliez, F., et al. Oxygen mapping within healthy and acutely infarcted brain tissue in humans using the NMR relaxation of lipids: A proof-of-concept translational study. PLoS One. 10 (8), e0135248(2015).
  12. Gouel, P., et al. Advances in PET and MRI imaging of tumor hypoxia. Front Med (Lausanne). 10, 1055062(2023).
  13. Płonka, P. M. Paramagnetomics. Electron Spin Resonance Spectroscopy in Medicine. , 189-221 (2019).
  14. Kavetskyy, T. S., et al. EPR study of self-organized magnetic nanoparticles in biomaterials. Semiconductor Physics, Quantum Electronics and Optoelectronics. 25, 146-156 (2022).
  15. Eaton, G. R., Eaton, S. S., Ohno, K. EPR Imaging and in Vivo EPR. , CRC Press. (2018).
  16. Berliner, L. J. The evolution of biomedical EPR (ESR). Biomed Spectrosc Imaging. 5 (1), 5-26 (2017).
  17. Matsumoto, K. -I., et al. EPR-based oximetric imaging: a combination of single point-based spatial encoding and T1 weighting. Magn Reson Med. 80 (5), 2275-2287 (2018).
  18. Kishimoto, S., et al. Pulsed electron paramagnetic resonance imaging: Applications in the studies of tumor physiology. Antioxid Redox Signal. 28 (5), 1378-1393 (2018).
  19. Epel, B., Halpern, H. J. In vivo pO2 imaging of tumors: Oxymetry with very low-frequency electron paramagnetic resonance. Methods Enzymol. 564, 501-527 (2015).
  20. Epel, B., et al. Absolute oxygen R1e imaging in vivo with pulse electron paramagnetic resonance. Magn Reason Med. 72 (2), 362-368 (2014).
  21. Ahmad, R., Kuppusamy, P. Theory, instrumentation, and applications of electron paramagnetic resonance oximetry. Chem Rev. 110 (5), 3212-3236 (2010).
  22. Kuppusamy, P. Sense and sensibility of oxygen in pathophysiology using EPR oximetry. Measuring oxidants and oxidative stress in biological systems. Berliner, L. J., Parinandi, N. L. , Springer. Cham (CH). (2020).
  23. Flood, A. B., Satinsky, V. A., Swartz, H. M. Comparing the effectiveness of methods to measure oxygen in tissues for prognosis and treatment of cancer. Adv Exp Med Biol. 923, 113-120 (2016).
  24. Ardenkjær-Larsen, J. H., et al. EPR and DNP properties of certain novel single electron contrast agents intended for oximetric imaging. J Magn Reason. 133, 1-12 (1998).
  25. Reddy, T. J., Iwama, T., Halpern, H. J., Rawal, V. H. General synthesis of persistent trityl radicals for EPR imaging of biological systems. J Org Chem. 67 (14), 4635-4639 (2002).
  26. Kmiec, M. M., Tse, D., Kuppusamy, P. Oxygen-sensing paramagnetic probes for clinical oximetry. Adv Exp Med Biol. 1269, 259-263 (2021).
  27. Pandian, R. P., Parinandi, N. L., Ilangovan, G., Zweier, J. L., Kuppusamy, P. Novel particulate spin probe for targeted determination of oxygen in cells and tissues. Free Radic Biol Med. 35 (9), 1138-1148 (2003).
  28. O2M Technologies LLC. JIVA-25 Oxygen Imager User Manual. , (2024).
  29. Epel, B., et al. Electron paramagnetic resonance oxygen imaging of a rabbit tumor using localized spin probe delivery. Med Phys. 37 (6 Part1), 2553-2559 (2010).
  30. Epel, B., Viswakarma, N., Sundramoorthy, S. V., Pawar, N. J., Kotecha, M. Oxygen imaging of a rabbit tumor using a human-sized pulse electron paramagnetic resonance imager. Mol Imaging Biol. 26 (3), 403-410 (2023).
  31. Epel, B., Redler, G., Tormyshev, V., Halpern, H. J. Towards human oxygen images with electron paramagnetic resonance imaging. Adv Exp Med Biol. 876, 363-369 (2016).
  32. Elas, M., et al. EPR oxygen images predict tumor control by a 50% tumor control radiation Dose. Cancer Res. 73 (17), 5328-5335 (2013).
  33. Elas, M., et al. Electron paramagnetic resonance oxygen images correlate spatially and quantitatively with Oxylite oxygen measurements. Clin Cancer Res. 12 (14), 4209-4217 (2006).
  34. Redler, G., Epel, B., Halpern, H. J. Principal component analysis enhances SNR for dynamic electron paramagnetic resonance oxygen imaging of cycling hypoxia in vivo. Magn Reson Med. 71 (1), 440-450 (2014).
  35. Naz, S., Kishimoto, S., Mitchell, J. B., Krishna, M. C. Imaging metabolic processes to predict radiation responses. Semin Radiat Oncol. 29 (1), 81-89 (2019).
  36. Yamamoto, K., et al. Molecular imaging of the tumor microenvironment reveals the relationship between tumor oxygenation, glucose uptake, and glycolysis in pancreatic ductal adenocarcinoma. Cancer Res. 80 (11), 2087-2093 (2020).
  37. Kawai, T., et al. Continuous monitoring of postirradiation reoxygenation and cycling hypoxia using electron paramagnetic resonance imaging. NMR Biomed. 35 (10), e4783(2022).
  38. Takakusagi, Y., et al. Pyruvate induces transient tumor hypoxia by enhancing mitochondrial oxygen consumption and potentiates the anti-tumor effect of a hypoxia-activated prodrug TH-302. PLoS One. 9 (9), e107995(2014).
  39. Li, T., et al. Evaluations of an early change in tumor pathophysiology in response to radiotherapy with oxygen enhanced electron paramagnetic resonance imaging (OE EPRI). Mol Imaging Biol. 26 (3), 448-458 (2024).
  40. Schaner, P. E., et al. First-in-human study in cancer patients establishing the feasibility of oxygen measurements in tumors using electron paramagnetic resonance with the OxyChip. Front Oncol. 11, 743256(2021).
  41. Swartz, H. M., et al. How best to interpret measures of levels of oxygen in tissues to make them effective clinical tools for care of patients with cancer and other oxygen-dependent pathologies. Physiol Rep. 8 (15), 14541(2020).
  42. Tseytlin, M., et al. A combined positron emission tomography (PET)-electron paramagnetic resonance imaging (EPRI) system: initial evaluation of a prototype scanner. Phys Med Biol. 63 (10), 105010(2018).
  43. Kim, H., et al. Development of a PET/EPRI combined imaging system for assessing tumor hypoxia. J Instrum. 16 (03), P03031(2021).
  44. Shen, J., et al. Development of isoindoline nitroxides for EPR oximetry in viable systems. Appl Magn Reason. 22, 357-368 (2002).
  45. Alecci, M., Ferrari, M., Quaresima, V., Sotgiu, A., Ursini, C. L. Simultaneous 280 MHz EPR imaging of rat organs during nitroxide free radical clearance. Biophys J. 67 (3), 1274-1279 (1994).
  46. Hyde, J. S., Subczynski, W. K. Simulation of ESR spectra of the oxygen-sensitive spin-label probe CTPO. J Magn Reson (1969). 56 (1), 125-130 (1984).
  47. Sarna, T., Dulȩba, A., Korytowski, W., Swartz, H. Interaction of melanin with oxygen. Arch Biochem Biophys. 200 (1), 140-148 (1980).
  48. Bratasz, A., Kulkarni, A. C., Kuppusamy, P. A highly sensitive biocompatible spin probe for imaging of oxygen concentration in tissues. Biophys J. 92 (8), 2918-2925 (2007).
  49. Gluth, T. D., et al. Biocompatible monophosphonated trityl spin probe, HOPE71, for in vivo measurement of pO2, pH, and [Pi] by electron paramagnetic resonance spectroscopy. Anal Chem. 92 (2), 946-954 (2022).
  50. Gluth, T. D., et al. Large-scale synthesis of a monophosphonated tetrathiatriarylmethyl spin probe for concurrent in vivo measurement of pO2, pH and inorganic phosphate by EPR. RSC Adv. 11 (42), 25951-25954 (2022).
  51. Vahidi, N., et al. In vivo and in vitro EPR oximetry with fusinite: A new coal-derived, particulate EPR probe. Magn Reson Med. 31 (2), 139-146 (1994).
  52. Gallez, B., et al. Small particles of fusinite and carbohydrate chars coated with aqueous soluble polymers: preparation and applications for in vivo EPR oximetry. Magn Reson Med. 40 (1), 152-159 (1998).
  53. James, P. E., et al. Gloxy: An oxygen-sensitive coal for accurate measurement of low oxygen tensions in biological systems. Magn Reson Med. 38 (1), 48-58 (1997).
  54. Goda, F., et al. In vivo oximetry using EPR and India ink. Magn Reson Med. 33 (2), 237-245 (1995).
  55. Liu, K. J., et al. Lithium phthalocyanine: a probe for electron paramagnetic resonance oximetry in viable biological systems. Proc Natl Acad Sci. USA. 90 (12), 5438-5442 (1993).
  56. Ilangovan, G., Zweier, J. L., Kuppusamy, P. Mechanism of oxygen-induced EPR line broadening in lithium phthalocyanine microcrystals. J Magn Reason. 170 (1), 42-48 (2004).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Impulsowy EPRIutlenowanie tkanekobrazowanie ultrad wi koweoksymetria z u yciem sond spinowychmapowanie tlenu w 3Dmikro rodowisko nowotworupomiar czasu relaksacji
Ocena niedotlenienia guza: obrazowanie tlenu in vivo 3D za pomocą elektronowego rezonansu paramagnetycznego
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.