Technika pływania poziomego w kształcie litery U do przygotowywania wysokiej jakości plemników o niskim wskaźniku fragmentacji DNA

Podsumowanie

Ten protokół opisuje metodę badania przesiewowego wysokiej jakości plemników o niskim wskaźniku fragmentacji DNA poprzez wykorzystanie cech ruchliwości plemników i thigmotaxis. Metoda wykorzystuje poziomy tor pływacki w kształcie litery U, dzięki czemu wysokiej jakości plemniki docierają do przeciwnej strony przez kropelki buforowe, przy jednoczesnym wykluczeniu martwych plemników, szczątków komórek i zanieczyszczeń.

Streszczenie

Nasienie ludzkie to złożona mieszanina składająca się z plemników o ruchliwej ruchliwości, plemników o nieruchliwym ruchu, nieruchomych plemników, szczątków komórkowych i lepkiego osocza nasienia. Wysokiej jakości plemniki odnoszą się do stopniowo ruchliwych plemników o normalnej morfologii, które często wykazują niższy wskaźnik fragmentacji DNA (DFI) i wyższy potencjał zapłodnienia. Przygotowanie wysokiej jakości nasienia jest kluczowym krokiem w technologii wspomaganego rozrodu człowieka. Tradycyjna metoda przygotowania nasienia, nieciągłe wirowanie w gradiencie gęstości (DGC), jest czasochłonna i pracochłonna. Wielokrotne wirowanie może uszkodzić DNA plemników, wpływając w ten sposób na późniejsze zapłodnienie i rozwój zarodka. W pracy przedstawiono metodę pływania poziomego w kształcie litery U (UHS) do przygotowania plemników do iniekcji docytoplazmatycznej plemnika (ICSI), która znacznie eliminuje szkodliwy wpływ wirowania na DNA plemników. Metoda UHS polega na utworzeniu toru UHS przy użyciu pożywki do nawożenia w naczyniu operacyjnym ICSI. Mikrokropelkę pożywki do nawożenia o pojemności 10 μl umieszcza się w punkcie początkowym po lewej stronie pasa UHS w celu przechowywania nasienia. Dwie dodatkowe kropelki buforowe pożywki nawozowej o pojemności 10 μl umieszcza się w odstępach wzdłuż lewej środkowej części pasa, przy czym wszystkie kropelki są połączone pożywką nawozową. Następnie naczynie przykrywa się olejem hodowlanym i inkubuje przez noc w temperaturze 37 °C z 6% CO_{2 w} celu zrównoważenia. Następnie w punkcie początkowym do mikrokropelki dodaje się 3 μl nasienia. Wysokiej jakości plemniki przepływają na prawą stronę pasa UHS, co ułatwia ich zasysanie do igły iniekcyjnej ICSI. Martwe plemniki, szczątki komórek i inne lepkie zanieczyszczenia w dużej mierze pozostają w punkcie początkowym lub w kropelkach buforowych. Równolegle przetworzyliśmy 21 próbek nasienia przy użyciu technik UHS i DGC i porównaliśmy ich DFI. Wyniki pokazały, że DFI w grupie DGC wynosił 5,5% ± 3,2%, podczas gdy DFI w grupie UHS wynosił 1,7% ± 1,1%. Różnica między obiema grupami była istotna statystycznie (P < 0,05).

Wprowadzenie

Optymalizacja nasienia i techniki przygotowania plemników odgrywają kluczową rolę w uzyskiwaniu frakcji komórkowych wzbogaconych o strukturalnie i funkcjonalnie lepsze plemniki, co jest kluczowym krokiem w technologii wspomaganego rozrodu przez człowieka¹. Celem optymalizacji nasienia jest: (1) Zmniejszenie lub usunięcie prostaglandyn, komórek immunologicznych, przeciwciał przeciwplemnikowych, nieruchomych plemników niskiej jakości, bakterii i zanieczyszczeń w osoczu nasienia; (2) Zmniejsz lub wyeliminuj lepkość nasienia; oraz (3) Promuj kapacytację plemników i zwiększaj zdolność zapłodnienia. Idealna technika przygotowania nasienia powinna przywrócić wysoce funkcjonalną populację plemników, która zachowuje integralność DNA i nie wywołuje dysfunkcji poprzez produkcję reaktywnych form tlenu (ROS) przez plemniki i leukocyty².

Obecnie najczęściej używaną technologią przygotowania nasienia jest metoda DGC. Zaletami tej metody są wysoki współczynnik odzysku³ oraz łatwa standaryzacja. W praktycznym zastosowaniu można go elastycznie dobierać w zależności od jakości próbki do metody gradientu o podwójnej gęstości ⁴, metody mini-DGC lub metody wirowania gradientowego jednowarstwowego⁵. Ta metoda może być stosowana do przygotowania wysokiej jakości nasienia o dobrej żywotności, wolnego od resztek komórkowych, zanieczyszczonych białych krwinek, komórek nierozrodczych i zdegenerowanych komórek rozrodczych. Jednak wadą tej metody jest to, że wymaga ona odwirowania, co może spowodować uszkodzenie DNA plemników⁶.

Metoda przedstawiona tutaj została zaadaptowana z oryginalnego badania przeprowadzonego przez Baldini et al.⁷, które skupiało się na poziomej migracji plemników w naczyniach iniekcyjnych. Ta zmodyfikowana metoda obejmuje poziomy pas w kształcie litery U w celu oddzielenia wysokiej jakości plemników o dużej żywotności. Zapobiega uszkodzeniom DNA spowodowanym wirowaniem i minimalizuje wpływ martwych plemników, resztek komórkowych i innych lepkich zanieczyszczeń podczas zabiegów docytoplazmatycznego wstrzykiwania plemników (ICSI).

Specyficzne podejście polega na użyciu pożywki do nawożenia w celu stworzenia pasa UHS w czaszy operacyjnej ICSI. Mikrokropelkę pożywki do nawożenia o pojemności 10 μl umieszcza się w lewym punkcie początkowym pasa UHS w celu przechowywania nasienia. Dwie dodatkowe kropelki buforowe pożywki nawozowej o pojemności 10 μl są umieszczane w odstępach w lewej środkowej części pasa UHS, a wszystkie kropelki są połączone pożywką nawozową. Po pokryciu zestawu olejem uprawowym, naczynie inkubuje się przez noc w temperaturze 37 °C z 6% CO₂ w celu zrównoważenia. Następnie do mikrokropelki dodaje się 3 μl nasienia w punkcie początkowym po lewej stronie pasa UHS. Wysokiej jakości plemniki podpływają do toru po prawej stronie pasa UHS, ułatwiając ich pobranie za pomocą igły do wstrzykiwań ICSI. Martwe plemniki, szczątki komórek i inne lepkie zanieczyszczenia pozostają głównie w pierwotnym miejscu lub w kropelkach buforowych.

Mikroprzepływowy chip symuluje proces naturalnej selekcji w żeńskim układzie rozrodczym, umożliwiając optymalną izolację wysokiej jakości plemników z nasienia bez wirowania. Ma to kluczowe znaczenie dla poprawy ruchliwości plemników⁸, zmniejszenia wskaźnika fragmentacji DNA plemników⁹ i poprawy wyników ciąży¹⁰. Jednak produkcja takich urządzeń jest złożona, kosztowna i trudna do wdrożenia na szeroką skalę.

Protokół opisany tutaj oferuje nowatorską, prostą i wykonalną alternatywę. Wykorzystując charakterystykę ruchliwości plemników, metoda ta pozwala osiągnąć wyniki porównywalne z wynikami technologii mikroprzepływowej. Przygotowane plemniki charakteryzują się dużą witalnością, niskimi wskaźnikami fragmentacji DNA i doskonale nadają się do stosowania w ICSI.

Protokół

To badanie zostało zatwierdzone przez Komisję Etyki Medycznej Pierwszego Szpitala Ludowego Uniwersytetu Medycznego w Nankinie (numer zatwierdzenia: KY-2024-181-01). Uzyskano świadomą zgodę od pacjentów, których próbki wykorzystano w tym badaniu. Zabieg powinien być przeprowadzony przez doświadczony personel zgodnie z dobrymi praktykami laboratoryjnymi i wytycznymi klinicznymi^11,12. Szczegółowe informacje na temat stosowanych odczynników i sprzętu znajdują się w Tabeli materiałów.

1. Przygotowanie naczynia operacyjnego ICSI

1. Użyj pożywki nawozowej o pojemności 20 μl, aby utworzyć ścieżki w kształcie litery U w naczyniu operacyjnym ICSI (Rysunek 1). Długość lewej toru toru w kształcie litery U powinna wynosić około 30 mm, a długość prawego toru również powinna wynosić około 30 mm.
2. Odessać 10 μl pożywki nawozowej za pomocą pipety i utworzyć okrągłą kroplę w lewym punkcie początkowym ścieżki w kształcie litery U. Połącz go z lewym punktem początkowym ścieżki w kształcie litery U, aby dodać roztwór podstawowy nasienia.
3. Utworzyć dwie kropelki buforowe pożywki nawozowej o pojemności 10 μl w odstępach po lewej środkowej części pasa UHS. Połącz wszystkie kropelki z pożywką nawozową.
4. Utwórz długi pasek kropli cieczy po prawej stronie pasa w kształcie litery U, używając 2,5 μl poliwinylopirolidonu (PVP). Upewnij się, że pas PVP jest równoległy do prawego pasa pasa w kształcie litery U.
5. Przygotuj sześć mikrokropel, używając pożywki do przetwarzania oocytów po prawej stronie paska PVP, po 20 μl na kroplę.
6. Dodaj 7 ml oleju hodowlanego do naczynia, upewniając się, że olej zakrywa najwyższy punkt kropli. Umieść go na noc w inkubatorze o temperaturze 37 °C i 6% CO₂ dla zrównoważenia.

2. Pobieranie próbek nasienia

1. Przekaż pacjentom jasne, pisemne i ustne instrukcje dotyczące pobrania próbki nasienia. Upewnij się, że pobieranie próbki zostało zakończone i poinstruuj pacjentów, aby powstrzymali się od wytrysku przez 3-7 dni przed pobraniem.
2. Zbierz nasienie poprzez masturbację do jednorazowego, sterylnego i nietoksycznego specjalistycznego kubka do pobierania nasienia. Upewnij się, że zebrano cały ejakulat i poinstruuj osobę, aby zgłosiła wszelkie straty jakiejkolwiek frakcji próbki.
3. Zweryfikuj imiona i nazwiska, ważne dokumenty tożsamości i odciski palców małżonka pacjenta. Zaznacz imię i nazwisko oraz numer dokumentacji medycznej małżonka pacjenta na korpusie i wieczku kubka do pobierania nasienia.
4. Po pobraniu nasienia przez pacjenta płci męskiej należy przekazać próbkę twarzą w twarz personelowi i pacjentowi. Pobrać niewielką ilość próbki nasienia do pakowania i przechowywania. Upewnij się, że pacjent złożył podpisy w obszarze pakowania.
5. Ponumeruj i przechowuj zamknięte próbki przez 2 lata. Zapisuj informacje o pacjencie, numer identyfikacyjny oraz podpisy biorcy i świadków w dzienniku przetwarzania nasienia.
6. Jeśli którykolwiek z pracowników centrum reprodukcyjnego odkryje podejrzaną tożsamość pacjenta, przestań otrzymywać próbkę i ponownie zweryfikuj tożsamość pacjenta. Nie należy przyjmować dwóch lub więcej próbek w tym samym czasie. Jeśli istnieje podejrzenie pomyłki w próbkach, przestań je otrzymywać.

3. Analiza próbki nasienia

1. Obserwuj kolor próbek nasienia.
   UWAGA: Normalne nasienie po upłynnieniu wydaje się jednorodne i szarobiałe. Nasienie o bardzo niskim stężeniu plemników może wydawać się przezroczyste. Jeśli obecne są czerwone krwinki, nasienie może wydawać się czerwonawo-brązowe. Jeśli pacjent ma żółtaczkę lub przyjmuje pewne witaminy, nasienie może wydawać się żółte.
2. Zmierz objętość nasienia metodą ważenia z dokładnością do 0,1 ml.
3. Umieścić próbkę nasienia w temperaturze 37 °C na 15-30 minut. Zassać ją do jednorazowej pipety z tworzywa sztucznego o szerokim otworze (około 1,5 mm średnicy), pozwalając nasieniu opuścić się grawitacyjnie. Obserwuj długość dowolnego gwintu.
   UWAGA: Normalny upłynniony ejakulat tworzy małe, dyskretne krople. Jeśli lepkość jest nieprawidłowa, kropla utworzy nić dłuższą niż 2 cm.
4. Jeśli nasienie nadal nie upłynnia się w ciągu 60 minut, dodaj równą ilość pożywki nawozowej. Następnie kilkakrotnie wdychaj i wydychaj mieszaninę za pomocą jednorazowej plastikowej pipety do przenoszenia, aż do całkowitego upłynnienia.
5. Zmierz wartość pH nasienia za pomocą precyzyjnego papieru testowego pH (pH 6,0-10,0).
6. Weź 10 μl całkowicie upłynnionego nasienia i wlej je do komory liczącej Maklera. Oceń ruchliwość plemników w polu 200x za pomocą mikroskopu optycznego. Obserwuj obecność aglutynacji plemników i komórek nieplemnikowych.
7. Oceń stężenie plemników w polu 200x za pomocą mikroskopu optycznego.

4. Pobieranie oocytów

1. Przygotuj naczynie do pobrania komórek jajowych (OPD) na dzień przed pobraniem komórek jajowych. Dodać 2,5 ml pożywki do przetwarzania oocytów do sterylnego naczynia hodowlanego o średnicy 35 mm. Następnie dodaj 1,5 ml oleju i umieść naczynie w inkubatorze o temperaturze 37 °C na noc w celu zrównoważenia.
2. Przygotuj dwie potrawy do hodowli oocytów (OCD) na dzień przed pobraniem oocytów. Dodać 1 ml pożywki nawozowej do wewnętrznego pierścienia sterylnego naczynia do hodowli w studzience centralnej, a następnie dodać 1 ml oleju. Dodać 4 ml pożywki nawozowej do pierścienia zewnętrznego. Umieścić naczynie w inkubatorze o temperaturze 37 °C, 6% CO₂ w celu zrównoważenia przez noc.
3. Włącz wszystkie grzałki i płyty grzewcze i zmierz temperaturę 30 minut przed pobraniem oocytów.
4. Umyj ręce środkiem do dezynfekcji rąk i dokładnie spłucz bieżącą wodą. Nosić czyste, sterylne i wolne od kurzu rękawice.
5. Rozgrzej sterylne naczynie do hodowli na platformie grzewczej o temperaturze 37 °C.
6. Dokładnie zweryfikuj tożsamość pacjentki przed pobraniem komórek jajowych.
7. Wdychaj płyn pęcherzykowy do sterylnych probówek pod podciśnieniem, a następnie natychmiast przekaż go embriologom laboratoryjnym.
8. Wlej cały płyn pęcherzykowy do sterylnych naczyń hodowlanych i poszukaj kompleksów wzgórka korony oocytów (OCCC) pod mikroskopem stereoskopowym o małym powiększeniu. Pobrać OCCC za pomocą pipety i umieścić je w OPD w celu tymczasowego przechowywania w temperaturze 37 °C.
9. Zapisz ilość, kolor, liczbę mieszków włosowych i liczbę OCCC w płynie pęcherzykowym.
10. Po pobraniu komórek jajowych przenieś OCCC do OCD za pomocą sterylnej pipety Pasteura. Szybko umieść je w inkubatorze kultur (37 °C, 6% CO₂ , 5% O₂ i wilgotność nasycona) na 2 godziny.
11. Przygotuj naczynie z czterema dołkami, dodaj 0,5 ml roztworu hialuronidazy do pierwszego dołka i 1 ml pożywki do przetwarzania oocytów do każdej z pozostałych trzech studzienek. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę.
12. Użyj pipety Pasteura, aby przenieść OCCC z kroku 4.10 do dobrze zawierającej się hialuronidazy przez 30 sekund. Następnie przenieś OCCC do dobrze zawierającej pożywki do przetwarzania oocytów.
13. Użyj probówki do usuwania oocytów o średnicy 150 μm, aby wydmuchać i zassać OCCC w celu usunięcia komórek ziarnistych. Następnie użyj nowej pipety Pasteura, aby przenieść oocyty do pożywki do przetwarzania oocytów w celu przemycia. Przenieś je do innego wstępnie zrównoważonego OCD i umieść w inkubatorze o temperaturze 37 °C, 6% CO₂ .

5. Selekcja plemników i operacja ICSI

1. Dodać 5 μl nasienia do mikrokropli pożywki nawozowej w lewym punkcie początkowym toru w kształcie litery U w naczyniu operacyjnym ICSI, które zostało przygotowane od kroku 1.1 do kroku 1.6.
2. Umieścić naczynie operacyjne ICSI w inkubatorze w temperaturze 37 °C, 6% CO₂ na 30-60 minut.
3. Otwórz odwrócony mikroskop, system operacyjny mikroskopu i stage ogrzewania sceny, aby upewnić się, że wszystkie elementy sterujące zostały przywrócone do pierwotnego kontrolowanego zakresu, co pozwala na płynną i wygodną obsługę.
4. Zamontować igłę ICSI w uchwycie igły. Zamocuj uchwyt igły na mikromanipulatorze, wyreguluj igłę przytrzymującą i igłę iniekcyjną w soczewce obiektywu 4x, a następnie sekwencyjnie wyreguluj ich kąty i pozycje, tak aby obie igły były względne i równoległe do stolika. Sprawdź zakres ruchu igły operacyjnej pod soczewką obiektywu × 20.
5. Dostosuj kąt i położenie igły przytrzymującej oocyty i igły do wstrzykiwań pod soczewką obiektywu 4x, tak aby dwie główki igły były względne i równoległe do stolika. Przesuń igłę roboczą do przodu, do tyłu, w lewo i w prawo. Sprawdź zakres ruchu igły operacyjnej pod obiektywami 10x i 20x.
6. Podnieś igłę do trzymania oocytów i igłę do wstrzykiwań, aby upewnić się, że wysokość między stołem operacyjnym a stołem grzewczym pozwala na łatwe umieszczenie naczynia operacyjnego bez dotykania igły operacyjnej.
7. Po dwukrotnym sprawdzeniu przenieś wybrane oocyty z kroku 4.12 do mikrokropelek pożywki do przetwarzania oocytów w naczyniu operacyjnym ICSI, po jednej na kroplę.
8. Umieść naczynie operacyjne zawierające oocyt na gorącym stoliku przygotowanego operatora mikroskopu.
9. Dostosuj ogniskową mikroskopu pod soczewką obiektywu 10x, aby krawędzie mikrokropel wewnątrz naczynia operacyjnej były wyraźne i widoczne.
10. Opuścić igłę iniekcyjną do paska PVP czaszy operacyjnej ICSI. Wyreguluj mikroskop tak, aby igła do wstrzykiwań była wyraźnie widoczna, a jednocześnie wdychaj niewielką ilość PVP do igły iniekcyjnej.
11. Umieścić igłę do wstrzykiwań w długim pasku po prawej stronie toru w kształcie litery U i pobrać wysokiej jakości plemniki o dobrej morfologii i ruchliwości postępowej.
12. Przenieś plemniki do paska PVP po prawej stronie i umieść nasienie na dnie naczynia operacyjnego.
13. Delikatnie naciśnij igłę do wstrzykiwań w środkową lub dolną część ogona plemnika, szybko pociągnij igłę do wstrzykiwań z powrotem i podrap nasienie, aby przestało.
14. Wdychać plemniki od ogona do głowy do igły do wstrzykiwań.
15. Przenieść igłę do wstrzykiwań do kropelki pożywki do przetwarzania oocytów, zawierającej oocyt po prawej stronie.
16. Opuść igłę trzymającą oocyt i delikatnie przesuń oocyt, aby ustawić pierwsze ciało biegunowe na godzinie 12, zabezpieczając oocyt.
17. Dopasuj igłę mikrochirurgiczną i błonę oocytów do tej samej płaszczyzny poziomej. Przyciśnij plemniki do końcówki igły do wstrzykiwań.
18. Przejść pionowo przez osłonkę przejrzystą na godzinie 3 na oocycie i kontynuować wstrzykiwanie igły, aż dotrze do środka oocytu lub nieznacznie przekroczy pozycję środkową, z lekkim wycofaniem igły do wstrzykiwań.
    UWAGA: Kiedy w cytoplazmie i plemnikach występuje gwałtowny refluks, oznacza to, że błona oocytów została przerwana i aspiracja została zatrzymana.
19. Powoli wstrzyknij plemniki do cytoplazmy oocytu i wyjdź z igły do wstrzykiwań. Głębokość wstrzyknięcia plemnika do cytoplazmy powinna wynosić około 50%-75% średnicy oocytu.
20. Po wyjęciu igły do wstrzykiwań należy wyregulować podciśnienie igły do przytrzymywania oocytów, aby uwolnić oocyty.
21. Powtarzaj powyższe kroki, aż wszystkie dojrzałe oocyty zostaną wstrzyknięte.
22. Przenieś szalkę ICSI z płyty grzejnej mikroskopu do mikroskopu preparacyjnego.
23. Wyjąć naczynie do hodowli łupliwości z inkubatora.
24. Przenieś wstrzyknięty oocyt plemnika do mikrokropelki w naczyniu do hodowli rozszczepienia.
25. Umieścić naczynie do hodowli rozszczepialnika z powrotem w inkubatorze o temperaturze 37 °C, 6% CO_{2 i} 5% O_{2 .}

6. Przygotowanie nasienia metodą DGC

1. Dodaj 1,5 ml roztworu wirującego o gradiacji gęstości 45% do sterylnej probówki ze stożkowym dnem o pojemności 15 ml.
2. Powoli dodaj 1,5 ml roztworu wirującego o gradiacji gęstości 90% na dno roztworu wirującego o gradiacji gęstości 45%, zachowując granicę faz między dwiema cieczami.
3. Delikatnie dodać upłynnione nasienie do gradientowego roztworu wirującego i odwirować przy 300 x g przez 15 minut (w temperaturze pokojowej).
4. Usunąć supernatant i dodać około 0,5 ml pozostałego osadu plemników do 3 ml pożywki do zapłodnienia. i dobrze wymieszaj.
5. Wirować w temperaturze pokojowej przy 200 x g przez 5 min.
6. Odpipetować supernatant i pozostawić około 0,2 ml osadu.
7. Dodaj odpowiednią ilość pożywki do nawożenia, aby ponownie zawiesić osad, policzyć stężenie i żywotność plemników oraz zarejestrować. Umieścić w inkubatorze o temperaturze 37°C i 6% CO2 do późniejszego użycia.

7. Wykrywanie integralności jądrowego DNA plemników (metoda dyspersji chromatyny plemników, SCD)

1. Ustaw temperaturę w pomieszczeniu na 20-28 °C przed przeprowadzeniem eksperymentu. Wyjmij zestaw odczynników i pozwól mu zachować równowagę w temperaturze pokojowej przez 30-60 minut.
2. Przygotuj roztwór denaturujący: Weź 0,8 ml stężonego roztworu denaturującego i dodaj go do 100 ml wody destylowanej.
3. Przygotuj 70% roztwór etanolu: Weź 26,65 ml wody destylowanej i 70,35 ml bezwodnego etanolu, aby przygotować 70% roztwór etanolu.
4. Przygotuj 90% roztwór etanolu: Weź 9,55 ml wody destylowanej i 90,45 ml bezwodnego etanolu, aby przygotować 90% roztwór etanolu.
5. Rurkę z agarozą o niskiej temperaturze topnienia (zawierającą 25 μl roztworu agarozy o niskiej temperaturze topnienia) umieścić w łaźni wodnej o temperaturze 90-100 °C na 1-2 minuty, aż żel agarozowy całkowicie się rozpuści. Następnie umieść probówkę w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C na 5 minut, aż temperatura będzie stała.
6. Weź 3-10 μl nasienia przed zabiegiem optymalizacyjnym i zawiesinę nasienia po leczeniu optymalizacyjnym. Dodaj je do różnych probówek agarozowych o niskiej temperaturze topnienia, a następnie dokładnie wymieszaj.
7. Pobrać 30 μl zawiesiny agarozy o niskiej temperaturze topnienia zawierającej plemniki i wrzucić ją na szkiełko podstawowe poddane obróbce w pozycji poziomej.
8. Delikatnie przykryj szkiełko nakrywkowe (o wymiarach 22 mm x 11 mm) szkiełkiem szkiełkowym, unikając w jak największym stopniu tworzenia się pęcherzyków.
9. Umieścić wstępnie obrobione szkiełko szkiełkowe w lodówce w temperaturze 2-8 °C na 4 minuty, utrzymując szkiełko w pozycji poziomej przez cały proces. Wyjmij szklane szkiełko z lodówki i delikatnie przesuń, aby wyjąć szkło nakrywkowe.
10. Szybko zanurz wstępnie obrobione szkiełko szkiełkowe w roztworze denaturującym na 7 minut.
11. Wyjmij wstępnie obrobione szkiełko szkiełkowe i zanurz je w wodzie destylowanej na 5 sekund.
12. Zdejmij wstępnie obrobione szkiełko szklane i ustaw je pionowo. Użyj bibuły filtracyjnej, aby wchłonąć wszelkie kropelki wody na powierzchni szkiełka i unikaj dotykania obszaru próbki.
13. Zanurz wstępnie obrobione szkiełko w buforze do lizy i reaguj dokładnie przez 20 minut.
14. Zanurz wstępnie obrobione fragmenty w roztworze myjącym na 3 minuty, aby zmyć roztwór do lizy
.
15. Wyjmij wstępnie obrobione szkiełko i zanurz je w 70% roztworze etanolu na 2 minuty.
16. Wyjmij wstępnie obrobione szkiełko i zanurz je w 90% roztworze etanolu na 2 minuty.
17. Wyjmij wstępnie obrobione szkiełko i zanurz je w bezwodnym roztworze etanolu na 2 minuty.
18. Usuń wstępnie obrobione szkiełko szkiełkowe i pozostaw do naturalnego wyschnięcia na powietrzu.
19. Przygotuj roztwór A i roztwór B barwnika Wrighta w brązowej pustej butelce w stosunku 1:1.
20. Umieść szkiełko szklane poddane obróbce poziomo i dodaj zmieszany roztwór barwnika na szkiełko, upewniając się, że roztwór barwnika pokrywa całe szkiełko (około 0,5-1 ml roztworu barwnika).
21. Po barwieniu przez 5 minut delikatnie spłucz szkiełko wodą destylowaną 10-15 razy, aby usunąć nadmiar środka barwiącego.
22. Pozostaw szkiełko do naturalnego wyschnięcia i obserwuj je pod mikroskopem optycznym w temperaturze 400×. Policz ponad 200 plemników i określ procent nieprawidłowych plemników z małymi pierścieniami halo, brakiem pierścieni halo i zwyrodnieniem.

8. Analiza statystyczna

1. Wykonuj analizy statystyczne za pomocą dostępnego na rynku oprogramowania.
2. Porównaj DFI (%) między pierwotnym nasieniem, DGC i UHS za pomocą testu Friedmana.
   UWAGA: Aby porównać parami dwie metody, użyj testu rangi ze znakiem Wilcoxona. Uznajmy, że wartość p ≤ 0,05 jest statystycznie istotna.

Wyniki

Metody UHS i DGC zostały użyte do optymalizacji leczenia 21 próbek i porównania wskaźnika fragmentacji DNA plemników między tymi dwiema metodami. Metoda wykorzystująca ścieżkę UHS w czaszy ICSI może zastąpić DGC, co może spowodować uszkodzenie plemników. Wysokiej jakości plemniki o dobrej ruchliwości progresywnej płynnie pływają wzdłuż krawędzi toru w kształcie litery U (Rysunek 2), ułatwiając igle ICSI uchwycenie ich indywidualnie. Wysokiej jakości plemniki wyizolowane za pomocą ścieżki UHS mają niżs...

Dyskusja

Kluczowym krokiem w separacji wysokiej jakości plemników za pomocą metody UHS opisanej w tym artykule jest ustanowienie toru UHS z kropelkami buforowymi. Zarówno tor UHS, jak i kropelki buforowe są tworzone przy użyciu przemytego i pobranego nasienia. Pas UHS prowadzi wysokiej jakości plemniki, aby swobodnie pływały i gromadziły się wzdłuż krawędzi toru, co ułatwia ich zbieranie. Kropelki buforowe zmniejszają lepkość nasienia, odfiltrowując martwe plemniki, resztki komórek i inne zanieczyszczenia. Odległość między prawą ...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
7% roztwór poliwinylopirolidonu	Vitrolife Szwecja AB	10111	Aspirator ICSI
	LABOTECT-Aspirator
Biologiczny czysty stół warsztatowy	Suzhou Antai	-	Biologiczny czysty stół warsztatowy
Pożywka do hodowli blastocyst	Vitrolife Szwecja AB	10132	Pożywka do hodowli blastocyst
Pożywka do hodowli rozszczepienia	Vitrolife Sweden AB	10128	Pożywka do hodowli dekoltów
Inkubator CO2	Inkubator	Thermo	Scientific-CO2
Olej hodowlany	Vitrolife Szwecja AB	10029	OVOIL
Jednorazowa plastikowa pipeta transferowa	BD	Jednorazowa plastikowa pipeta transferowa	357575
nawożenia	Vitrolife Szwecja AB	10136	G-IVF PLUS
ICSI miska operacyjna	BD Falcon	351006	szalka Petriego
Hialuronidaza instant	Vitrolife Szwecja AB	10017	Hialuronidaza błyskawiczna
Mikroskop odwrócony	NIKON	-	Mikroskop odwrócony
Stacja robocza IVF	Dania K-SYSTEM-IVF		Stacja
robocza Komora licząca Makler	Sefi Medical Instruments		Komora licząca
Makler Mikro system operacyjny	NIKON	-	Mikro system operacyjny
Pożywka do przetwarzania oocytów	Vitrolife Szwecja AB	10130	G-MOPS PLUS
Mikroskop optyczny	OLYMPUS-Mikroskop		optyczny
Mikroskop z kontrastem fazowym	Mikroskop kontrastowy	fazowy NIKON&
Tablica do liczenia plemników	Markler-Tablica		do liczenia plemników
Rozwiązanie do separacji gradientu plemników	Vitrolife Szwecja AB	10138	SpermGrad
Zestaw do integralności DNA jądra plemnika	Shenzhen HuaKang	-	Zestaw integralności DNA jądra plemnika (SCD)
Mikroskop stereoskopowy			NIKON-Mikroskop stereoskopowy
Wirówka stołowa	HETTICH-Wirówka		stołowa
Termostatyczny stojak na probówki	GRANT-Termostatyczny		stojak na probówki
Inkubator trójgazowy	ASTEC-Inkubator		trójgazowy