Method Article

Oczyszczanie oparte na systemie MultiBac i biofizyczna charakterystyka ludzkiej miozyny-7a

DOI:

10.3791/67135

⸱

August 23rd, 2024

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biochemistry & Molecular Medicine, School of Medicine, West Virginia University, 2Microscope Imaging Facility, West Virginia University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół szczegółowo opisuje procedury rekombinacyjnego wytwarzania ludzkiego holoenzymu miozyny-7a za pomocą systemu MultiBac Baculovirus oraz badania jego ruchliwości za pomocą dostosowanego testu ślizgowego in vitro.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Miozyna-7a to białko motoryczne na bazie aktyny, niezbędne dla procesów słuchowych i wzrokowych. Mutacje w miozynie-7a prowadzą do zespołu Ushera typu 1, najczęstszej i najcięższej postaci głuchoślepoty u ludzi. Przypuszcza się, że miozyna-7a tworzy transbłonowy kompleks adhezyjny z innymi białkami Ushera, niezbędny dla strukturalno-funkcjonalnej integralności fotoreceptorów i komórek rzęsatych ślimaka. Jednak ze względu na wyzwania związane z uzyskaniem czystego, nienaruszonego białka, dokładne mechanizmy funkcjonalne ludzkiej miozyny-7a pozostają nieuchwytne, a dostępne badania strukturalne i biomechaniczne są ograniczone. Ostatnie badania wykazały, że miozyna-7a ssaków jest multimerycznym kompleksem motorycznym składającym się z łańcucha ciężkiego i trzech typów łańcuchów lekkich: regulatorowego łańcucha lekkiego (RLC), kalmoduliny i białka podobnego do kalmoduliny 4 (CALML4). W przeciwieństwie do kalmoduliny, CALML4 nie wiąże się z jonami wapnia. Zarówno wrażliwe, jak i niewrażliwe kalmoduliny są krytyczne dla miozyny 7a u ssaków dla prawidłowego dostrojenia jej właściwości mechanicznych. W tym miejscu opisujemy szczegółową metodę wytwarzania rekombinowanego ludzkiego holoenzymu miozyny-7a przy użyciu systemu ekspresji białka MultiBac Baculovirus. W ten sposób uzyskuje się miligramowe ilości białka o pełnej długości o wysokiej czystości, co pozwala na jego charakterystykę biochemiczną i biofizyczną. Ponadto przedstawiamy protokół oceny jego właściwości mechanicznych i ruchliwych za pomocą dostosowanych testów ruchliwości in vitro i mikroskopii fluorescencyjnej. Dostępność nienaruszonego ludzkiego białka miozyny-7a, wraz ze szczegółowym protokołem charakterystyki funkcjonalnej opisanym tutaj, toruje drogę do dalszych badań nad molekularnymi aspektami miozyny-7a w widzeniu i słuchu.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Miozyny to molekularne białka motoryczne, które oddziałują z aktyną, napędzając liczne procesy komórkowe1,2,3,4. Ludzie posiadają 12 klas i 39 genów miozyny5, które są zaangażowane w szeroki zakres funkcji fizjologicznych, takich jak skurcz mięśni6 i procesy sensoryczne7. Każda cząsteczka miozyny jest multimerycznym kompleksem złożonym z łańcucha ciężkiego i łańcuchów lekkich. Ciężki łańcuch jest podzielony na obszary głowy, szyi i ogona. Głowa zawiera miejsca wiążące aktyny i nukleotydy, które są odpowiedzialne za hydrolizę ATP i generowanie siły na włóknach aktyny2. Szyja jest utworzona przez kilka α-spiralnych motywów IQ, w których związany jest określony zestaw lekkich łańcuchów. Razem działają jako ramię dźwigni, aby wzmocnić zmiany konformacyjne silnika w duże ruchy8,9,10. Ogon zawiera subdomeny specyficzne dla klasy i odgrywa rolę regulacyjną w dostrajaniu aktywności motorycznej miozyny i pośredniczeniu w interakcjach z partnerami wiązania komórkowego2,11.

Ludzka miozyna-7a, członek miozyny klasy 7, jest niezbędna dla procesów słuchowych i wzrokowych12,13. Motywy IQ ludzkiej miozyny-7a są związane z unikalną kombinacją łańcuchów lekkich, w tym regulatorowego łańcucha lekkiego (RLC), kalmoduliny i białka podobnego do kalmoduliny 4 (CALML4)14,15,16. Oprócz stabilizacji ramienia dźwigni, te lekkie łańcuchy regulują właściwości mechaniczne miozyny-7a w odpowiedzi na sygnalizację wapniową, cechę, która wydaje się być unikalna dla ssaków isoform14.

Defekty w genie kodującym ciężki łańcuch miozyny-7a (MYO7A/USH1B) są odpowiedzialne za zespół Ushera typu 1, najcięższą formę połączonego ubytku wzroku i słuchu u ludzi17. Dodatkowo, gen łańcucha lekkiego CALML4 jest jednym z genów kandydujących zmapowanych tak, aby zawierały allel sprawczy dla USH1H, innego wariantu zespołu Ushera typu 115,18. W siatkówce miozyna-7a ulega ekspresji w nabłonku barwnikowym siatkówki i komórkach fotoreceptorowych13. Ma to związek z lokalizacją melanosomów w nabłonku barwnikowym siatkówki (RPE)19 i fagocytozą dysków zewnętrznych segmentów fotoreceptorów przez komórki RPE20. W uchu wewnętrznym miozyna-7a znajduje się przede wszystkim w rzęskach stereocilia, gdzie odgrywa kluczową rolę w tworzeniu wiązek włosów i bramkowaniu procesu transdukcji mechano-elektrycznej12,21,22.

Chociaż znaczenie miozyny-7a w komórkach czuciowych jest dobrze znane, jej mechanizmy funkcjonalne na poziomie molekularnym pozostają słabo poznane. Ta luka w wiedzy wynika częściowo z wyzwań związanych z oczyszczaniem nienaruszonego białka, zwłaszcza izoformy ssaków. Ostatnio poczyniono znaczne postępy przy użyciu systemu MultiBac do rekombinowanej ekspresji kompletnego ludzkiego holoenzymu miozyny-7a14. Postęp ten umożliwił strukturalną i biofizyczną charakterystykę tego białka motorycznego, prowadząc do odkrycia kilku unikalnych właściwości ludzkiej miozyny-7a, które są specjalnie przystosowane do funkcji słuchowych ssaków14,23.

System MultiBac to zaawansowana platforma komórek bakukulowirusa/owadów zaprojektowana specjalnie do ekspresji eukariotycznych kompleksów multimerycznych24,25. Kluczową cechą tego systemu jest jego zdolność do hostowania wielu kaset ekspresji genów, z których każda koduje podjednostkę kompleksu, w obrębie jednego bakulowirusa MultiBac. Składanie kaset ekspresji wielogenowej jest ułatwione dzięki tak zwanemu modułowi namnażania: miejscu endonukleazy samonaprowadzającej (HE) i dopasowanemu zaprojektowanemu miejscu BstXI flankującemu wiele miejsc klonowania (MCS). Moduł ten umożliwia iteracyjny montaż pojedynczej kasety ekspresji poprzez ograniczenie/ligację, wykorzystując fakt, że miejsca restrykcji HE i BstXI są eliminowane po ich ligacji. W tym artykule ludzki łańcuch ciężki miozyny-7a, RLC, kalmodulina i CALML4 są klonowane do modułu namnażania w wektorze pACEBac1 (Rysunek 1A), które są następnie składane w wielogenową kasetę ekspresyjną w procesie iteracyjnym ( Rysunek 1B). Kaseta wielogenowa miozyny-7a jest zintegrowana z genomem bakulowirusa (bakmid) poprzez transpozycję elementu mini-Tn7 z wektora pACEBac1 do miejsca docelowego mini-attTn7 w genomie (Rysunek 1C). Zgodnie z procedurami oczyszczania bakcydu, produkcji bakulowirusa i amplifikacji (Rysunek 1D, E)), rekombinowany bakulowirus miozyny-7a MultiBac jest przygotowywany i może być stosowany do produkcji białek na dużą skalę (Rysunek 1F). Dodatkowo, łańcuchy lekkie miozyny-7a mogą być produkowane oddzielnie w E. coli i oczyszczane za pomocą rozszczepialnego znacznika His6-SUMO26,27,28. Oczyszczone łańcuchy lekkie są przydatne do badania ich dynamiki wiązania i regulacji miozyny-7a.

Oczyszczone białko miozyny-7a może być poddane badaniom strukturalnym, biochemicznym i biofizycznym, aby uzyskać wgląd w strukturalno-funkcjonalną regulację tego białka motorycznego. Dodatkowo, jego interakcje z siecią aktynową i innymi białkami wiążącymi29 mogą być badane przy użyciu różnych podejść do rekonstytucji in vitro. Wyniki tych analiz poinformują o właściwościach biofizycznych tej miozyny, prowadząc do mechanistycznego zrozumienia, w jaki sposób miozyna-7a napędza zmiany cytoszkieletu i ostatecznie kształtuje unikalną morfologię i funkcję komórek czuciowych. W tym artykule szczegółowo opisujemy przebieg pracy w teście ślizgania się włókien aktynowych, który został specjalnie dostosowany do miozyny 7a ssaków. Test ślizgania włókien aktynowych to solidny test ruchliwości in vitro, który ilościowo bada ruch fluorescencyjnych włókien aktyny napędzanych przez dużą liczbę silników miozyny unieruchomionych na powierzchni szkiełka nakrywkowego30,31,32. Zaletami tego testu są prostota konfiguracji, minimalne wymagania sprzętowe (szerokokątny mikroskop fluorescencyjny wyposażony w kamerę cyfrową) oraz wysoka odtwarzalność. Dodatkowo, ponieważ ruch włókien aktynowych jest napędzany przez klaster unieruchomionych silników miozyny, test ten jest szczególnie przydatny do badania ruchliwości miozyn monomerycznych, takich jak miozyna-7a14,33. Protokoły obejmują kilka modyfikacji, od procedur eksperymentalnych po analizę obrazową, specjalnie dostosowanych do unikalnych właściwości ruchliwych miozyny-7a u ssaków. Dzięki dostępności nienaruszonego białka miozyny-7a i przedstawionemu tutaj protokołowi charakterystyki funkcjonalnej, praca ta kładzie podwaliny pod dalsze badania nad molekularnymi rolami miozyny-7a zarówno w procesach fizjologicznych, jak i patologicznych.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

UWAGA: Tutaj opisujemy protokół syntezy nienaruszonego ludzkiego holoenzymu miozyny-7a i charakteryzowania jego ruchliwości in vitro. Protokół ten jest podzielony na trzy sekcje: po pierwsze, ekspresja ludzkiej miozyny-7a przy użyciu systemu ekspresji białka bakulowirusa MultiBac; Po drugie, oczyszczanie łańcuchów lekkich miozyny-7a oddzielnie za pomocą systemu E.coli His6-SUMO; I wreszcie, badanie ruchliwości ludzkiej miozyny-7A za pomocą testu ślizgowego filamentu aktynowego.

1. Produkcja kompleksu miozyny-7a w oparciu o system MultiBac

  1. Tworzenie wielogenowej kasety bakulowirusa do ekspresji ludzkiego kompleksu miozyny-7a (16 dni)
    UWAGA: Wymaga jednego cyklu klonowania (4 dni) w celu wstawienia cDNA podjednostek miozyny-7a do wektorów pACEBac1 i trzech cykli klonowania, aby zakończyć krok po kroku ligację wszystkich modułów namnażania wymaganych do ekspresji kompleksu miozyny-7a, co daje w sumie 16 dni.
    1. Sklonuj cDNA kodujące łańcuch ciężki miozyny-7a (HC), kalmodulinę, CALML4 i RLC do wektorów pACEBac1 za pomocą komercyjnego zestawu zgodnie z protokołami producenta (patrz Tabela materiałów; Rysunek 1A). Znacznik FLAG jest umieszczany na C-końcu miozyny-7a HC, aby pomóc w oczyszczaniu.
      UWAGA: Miozyna-7a ssaków jest wytwarzana jako dwie izoformy splicingowe, różniące się tylko segmentem 11 aminokwasów na N-końcu23. To krótkie N-końcowe rozszerzenie odgrywa kluczową rolę w regulacji aktywności ATPazy miozyny-7a14. Wykazano, że dodanie znacznika N-końcowego może zakłócić normalną regulację przez to N-końcowe rozszerzenie i znacznie zmniejszyć aktywność enzymatyczną i ruchliwość silnika14. W związku z tym stosuje się C-końcowy znacznik FLAG, aby uniknąć zakłócenia naturalnej regulacji białka.
    2. Skonstruuj kasetę ekspresji wielogenowej dla holoenzymu miozyny-7a za pomocą namnażania endonukleazy naprowadzającej/BstXI, jak opisano poniżej (Rysunek 1B).
      UWAGA: Endonukleaza naprowadzająca I-CeuI wytwarza spójne końce, które są kompatybilne z końcami generowanymi przez trawienie BstXI. Po podwiązaniu tworzy się miejsce restrykcyjne endonukleazy naprowadzającej/hybrydy BstXI, które nie może zostać przecięte przez żaden enzym. Tę samą procedurę można powtórzyć, aby zintegrować więcej modułów mnożenia. Jeżeli na konstruktach wstawionych lub wektorowych występuje wiele miejsc ograniczających dla I-CeuI i BstXI, te dodatkowe miejsca muszą zostać wyeliminowane za pomocą mutagenezy ukierunkowanej na miejsce, aby zapewnić, że miejsca cięcia I-CeuI i BstXI są niepowtarzalne.
    3. Przygotowanie wstawiania: Trawić konstrukt insercji (np. pACEBac-M7a HC) za pomocą endonukleazy naprowadzającej I-CeuI (patrz tabela materiałów), a następnie oczyścić zlinearyzowany plazmid za pomocą zestawu do oczyszczania PCR (patrz tabela materiałów). Następnie trawić zlinearyzowany plazmid za pomocą BstXI (patrz Tabela materiałów), oddzielać fragment zawierający kasetę ekspresji genu za pomocą elektroforezy żelowej i oczyszczać za pomocą zestawu do ekstrakcji żelu (patrz Tabela materiałów).
      UWAGA: I-CeuI i BstXI wymagają różnych warunków buforowych, zgodnie z protokołami producenta, aby osiągnąć 100% aktywności. Ponadto pełne cięcie za pomocą I-CeuI wymaga minimum 3 godzin, podczas gdy BstXI wymaga tylko 15 minut czasu inkubacji. W związku z tym trawienie musi być przeprowadzane sekwencyjnie.
    4. Przygotowanie wektora: Linearyzacja konstruktu wektorowego (np. pACEBac-CaM) poprzez trawienie BstXI. Fosfataza alkaliczna jest zawarta w preparacie wektorowym, aby zapobiec ligacji plazmidu wektora do siebie (patrz Tabela materiałów). Otrzymać produkt trawienia przez elektroforezę i oczyścić go za pomocą zestawu do ekstrakcji żelu.
    5. Podwiązanie: Zwiąż wstawkę potraktowaną I-CeuI/BstXI i wektor potraktowany BstXI ligazą DNA T4 (patrz tabela materiałów). Przeprowadzać reakcje ligacji w temperaturze pokojowej (20 °C -25 °C) przez 10 minut w stosunku 1:1 masy wstawionego DNA do DNA wektora, utrzymując całkowitą masę bliską 100 ng w każdej reakcji ligacji.
    6. Transformacja i analiza plazmidowa: Przekształć mieszaniny ligacyjne w komórki DH5α (patrz tabela materiałów) zgodnie z zaleceniami producenta i przebadać dodatnie kolonie pod kątem oporności na gentamycynę. Oczyść plazmidy za pomocą komercyjnego zestawu (patrz Tabela materiałów) i sprawdź prawidłowe klony (np. plazmidy zawierające zarówno M7a HC, jak i CaM) w oparciu o określone wzorce trawienia restrykcyjnego i sekwencjonowanie DNA wstawek.
    7. Integracja wielu kaset ekspresji genów: Powtórz kroki od 1.1.2 do 1.1.6, aby zintegrować dodatkowe kasety genów eksprymujące inne podjednostki miozyny-7a.
  2. Wytwarzanie i oczyszczanie rekombinowanego DNA bakmidu (4 dni; Rysunek 1C).
    UWAGA: Dzień 1 - Transformacja bakteryjna i wzrost przekształconych kolonii. Dni 2-3 - Hodowla rodzin pojowych i badania przesiewowe pod kątem udanej transformacji. Dzień 3 - Selekcja i rozszczepianie dodatnich kolonii, rozpoczęcie nocnej inokulacji. Dzień 4 - Oczyszczanie DNA bakmidu.
    1. Przekształć kompetentne komórki DH10Bac (patrz tabela materiałów) za pomocą 1 ng sekwencjonowanego plazmidu pACE-M7aHC-RLC-CALML4-CaM zgodnie z zaleceniami producenta.
    2. Umieścić 20-200 μl komórek na płytce agarowej zawierającej 50 μg/ml kanamycyny, 7 μg/ml gentamycyny, 10 μg/ml tetracykliny, 100 μg/ml chlorowcowanego indolilo-β-galaktozydu i 40 μg/ml IPTG (patrz tabela materiałów) i inkubować płytkę w temperaturze 37°C przez 48 godzin, aby umożliwić rozwój ciemnoniebieskiego koloru u klonów ujemnych.
      UWAGA: Fluorowcowany indolyl-β-galaktozyd barwi kolonie, które nadal wykazują ekspresję LacZ (co wskazuje, że transpozycja się nie powiodła), umożliwiając wybór białych kolonii, w których transpozycja się powiodła.
    3. Ostrożnie wybierz izolowaną białą kolonię i hoduj komórki przez noc w 5 ml pożywki LB zawierającej 50 μg/ml kanamycyny, 7 μg/ml gentamycyny i 10 μg/ml tetracykliny w temperaturze 37 °C w wytrząsarce orbitalnej przy 225 obr./min.
    4. Odwirować kulturę o stężeniu 2,465 x g przez 10 minut, aby osadzać E. coli. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w 300 μl buforu P1 z zestawu.
      UWAGA: Chociaż stosowane są tutaj z zestawu Miniprep, protokół oczyszczania produktu bakimowego różni się od protokołu dostarczonego z zestawem.
    5. Dodać 300 μl buforu P2 z zestawu. Wymieszaj, kilkakrotnie odwracając probówki, a następnie inkubuj w temperaturze pokojowej przez 3 minuty.
    6. Dodać 300 μl buforu N3 z zestawu i wymieszać przez odwrócenie, aby zatrzymać reakcję lizy. Wirować przy 17,885 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
    7. Przenieść supernatant do czystej, sterylnej probówki i powtarzać wirowanie przez kolejne 10 minut.
    8. Przenieść 800 μl supernatantu do innej sterylnej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,7 ml (patrz tabela materiałów) i dodać 600 μl zimnego izopropanolu (patrz tabela materiałów), mieszając przez rygorystyczne odwrócenie. Następnie odwirować przy 17,885 x g przez 20 minut w temperaturze 4 °C.
    9. Odrzucić supernatant i zlokalizować małą, białą osadkę. Przemyć osad 800 μl zimnego 70% etanolu (patrz tabela materiałów) i odwirować przy 17 885 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Ostrożnie dodać etanol wzdłuż ścianki probówki, aby uniknąć naruszenia osadu.
    10. Wyrzucić sklarowany osad i powtórzyć płukanie etanolem jeden raz. Suszyć pellet na powietrzu w temperaturze pokojowej przez 5 minut. W razie potrzeby ostrożnie zassać nadmiar płynu.
    11. Rozpuścić osad w 20 μl buforu EB z zestawu. Upewnij się, że granulka jest całkowicie rozpuszczona, przesuwając probówkę lub delikatnie mieszając przez pipetowanie. Oznaczyć stężenie za pomocą spektrofotometru (patrz tabela materiałów).
    12. W razie potrzeby dostosować objętość buforu, aby stężenie bakimu wynosiło około 1 μg/μl. DNA bakimów należy przechowywać w temperaturze 4 °C, aż będzie gotowe do produkcji wirusa P0.
      UWAGA: Oczyszczony bakcyd może być przechowywany w temperaturze 4 °C i pozostaje skuteczny przez kilka miesięcy. Widzieliśmy udane transfekcje z produktami bakcydowymi w wieku do 1 roku. Alternatywnie, bakmid może być porcjowany i przechowywany w temperaturze -20 °C. Należy unikać wielokrotnych cykli zamrażania/rozmrażania, ponieważ zmniejszają one skuteczność transfekcji.
  3. Transfekcja komórek owadów Sf9 z bakcydem w celu wytworzenia rekombinowanego bakulowirusa (6 dni; Rysunek 1D)
    UWAGA: Dzień 1 - Transfekcja komórek z bakmidowym DNA. Dni 2-6 - Obserwuj wzrost i ekspresję komórek. Dzień 6 - Zebranie wirusa P0.
    1. Dodać komórki Sf9 w pożywkach hodowlanych (patrz tabela materiałów) do płytki 6-dołkowej o stężeniu 0,33 x 106 komórek/ml z 3 ml na studzienkę. Pozostaw płytkę w temperaturze pokojowej na 30 minut, aby komórki mogły przyczepić się do dna płytki.
    2. Dla każdej studzienki należy przygotować mieszaninę transfekcji, łącząc 10 μl odczynnika do transfekcji kationowych lipidów (patrz tabela materiałów) z 250 μl ulepszonej pożywki o minimalnej ilości niezbędnych pożywek (MEM) (patrz tabela materiałów) w sterylnej probówce do mikrowirówki. Wymieszać metodą odwrócenia i inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut.
    3. Dodać 1 μg (na podstawie stężenia oznaczonego w kroku 1.2.12) nierozcieńczonego bakterii miozyny-7A do mieszaniny transfekcyjnej. Wymieszać metodą odwrócenia i inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut.
    4. Równomiernie rozprowadź całą mieszaninę DNA-lipid kroplami do studzienek. Pozostaw jedną studzienkę dla komórek nietransfekowanych jako kontrolę negatywną.
    5. Uszczelnić płytkę 6-dołkową folią (patrz tabela materiałów) i inkubować w temperaturze 27 °C przez 6 dni. Obserwuj wzrost i oderwanie przez cały ten czas. Jeśli na konstrukcji znajduje się znacznik fluorescencyjny, sprawdź rozwój fluorescencji (Rysunek 2).
    6. Gdy transfekowane komórki wykazują oznaki późnego stadium infekcji, przenieść pożywkę zawierającą wirusa z zakażonych studzienek do stożkowej probówki o pojemności 15 ml i wirować przy 805 x g przez 10 minut.
    7. Przenieść supernatant do czystej stożkowej probówki o pojemności 15 ml, zawinąć w folię aluminiową i przechowywać w temperaturze 4 °C. Z naszego doświadczenia wynika, że ten produkt jest teraz wirusem P0 i może być skutecznie przechowywany i używany przez okres do czterech miesięcy.
  4. Amplifikacja zapasu bakulowirusa (3-5 dni ; Rysunek 1E)
    1. Przygotować 100 ml (lub pożądaną objętość) komórek Sf9 o stężeniu 2 x 106 komórek/ml w pożywce do hodowli komórek Sf9 w kolbie Erlenmeyera o pojemności 250 ml (patrz tabela materiałów).
    2. Dodać zapas wirusa P0 w stosunku 1:100 (v/v) do hodowli zawiesiny komórek Sf9 i inkubować w temperaturze 27 °C w wytrząsarce orbitalnej z prędkością 135 obr./min.
    3. Monitoruj wzrost co 24 godziny, aż komórki osiągną ~90% śmierci komórki. Po osiągnięciu tego zakresu odwirować zawiesinę komórkową o stężeniu 500 x g przez 10 minut i zebrać supernatant zawierający wirusa P1.
    4. Przefiltrować supernatant za pomocą filtracji próżniowej 0,22 μm (patrz tabela materiałów). Przefiltrowany produkt należy przechowywać w ciemności i przechowywać w temperaturze 4 °C. Ten produkt to teraz wirus P1.
      UWAGA: Miano wirusa zmniejsza się przy długotrwałym przechowywaniu w temperaturze 4 °C. Rozważ utworzenie nowego zapasu wirusa, jeśli był przechowywany dłużej niż 4 miesiące, lub określenie miana wirusa przed użyciem w wyrażeniu34.
  5. Ekspresja białka (60 -72 godzin między rozpoczęciem ekspresji a zebraniem osadu komórkowego; Rysunek 1E)
    1. Przygotować komórki Sf9 rosnące w fazie logarytmicznej o stężeniu 2 x 106 komórek/ml i dodać wirusa P1 w stosunku 12 ml wirusa do 300 ml zawiesiny komórkowej.
      UWAGA: Wydajność białka wynosi około 1 mg/L. Do ekspresji tego białka zaleca się stosowanie co najmniej 1,5 l zawiesiny komórkowej.
    2. Hodować komórki w temperaturze 27 °C w wytrząsarce orbitalnej z prędkością 135 obr./min przez około 60 h.
      UWAGA: Małe próbki można pobierać w różnych punktach czasowych i analizować za pomocą żeli SDS w celu oceny poziomu ekspresji białka. Dodatkowo, jeśli białka są połączone ze znacznikami fluorescencyjnymi, poziomy ekspresji można ocenić za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Komórki powinny zostać pobrane nie później niż na początku śmierci komórki.
    3. Odwirować zawiesinę komórkową o stężeniu 3,735 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C w celu osadzenia komórek. Granulki mogą być przechowywane w temperaturze -80 °C do czasu dalszego użycia lub konserwowane do długotrwałego przechowywania. Zazwyczaj używamy granulek komórkowych w ciągu kilku tygodni, ale odzyskaliśmy aktywne białko kilka miesięcy po zamrożeniu.
  6. Oczyszczanie białka (2 dni ; Rysunek 1F)
    UWAGA: Dzień 1 - Ekstrakcja i oczyszczanie białek za pomocą chromatografii powinowactwa FLAG. Dzień 2 - Porcjowanie i zamrażanie próbek po całonocnej dializie. Opisany poniżej protokół służy do oczyszczania miozyny-7a z 1,5 l granulek komórek.
    1. Przygotować bufor główny zawierający 10 mM MOPS (pH 7,2), 500 mM NaCl, 10 mM MgCl2, 1 mM EGTA, 1 μg/ml leupeptyny i 100 μg/ml fluorku fenylometylosulfonylu (PMSF). Przefiltrować go za pomocą filtra o wielkości porów 0,22 μm i przechowywać bufor w temperaturze 4 °C (patrz tabela materiałów).
      UWAGA: PMSF jest niestabilny w roztworach wodnych. Przygotować roztwór podstawowy PMSF w postaci 1 M w 100% etanolu i przechowywać w temperaturze -20 °C przez okres do 6 miesięcy.
    2. Przygotować 75 ml buforu ekstrakcyjnego, uzupełniając bufor główny 3 tabletkami inhibitora proteazy bez EDTA, 2 mM ATP i 0,1 mM ditiotreitolu (DTT; patrz tabela materiałów).
    3. Dodaj 75 ml buforu ekstrakcyjnego do osadu, gdy jest jeszcze zamrożony. Pozostaw osad w buforze ekstrakcyjnym na lodzie do momentu rozmrożenia. Użyj pipety serologicznej, aby rozbić osad, aby przyspieszyć proces rozmrażania.
    4. Za pomocą końcówki 1/2 cala (13 mm) sonikować zawiesinę na lodzie przez 10 minut przy amplitudzie 50%, 5 s włączenia, 5 s wyłączenia.
    5. Odwirować całkowity lizat przy 33,746 x g przez 30 minut w temperaturze 4 °C. Podczas wirowania przygotować 1,5 ml żywicy FLAG, przemywając 3 ml 50% zawiesiny żywicy powinowactwa Anti-FLAG (patrz tabela materiałów) 40 ml PBS. Granulować żywicę, odwirowując przy 800 x g przez 2 minuty w temperaturze 4 °C. Ostrożnie usunąć PBS, nie naruszając żywicy.
    6. Dodać supernatant z odwirowania lizatu do przemytej żywicy i inkubować z ciągłym obrotem w temperaturze 4 °C przez 1 godzinę.
    7. Żywicę osadzać przez odwirowanie w temperaturze 800 x g przez 2 minuty w temperaturze 4°C. Nie naruszając żywicy, usuń supernatant.
    8. Zawiesić żywicę w 40 ml buforu głównego i odwirować przy 800 x g przez 2 minuty w temperaturze 4 °C. Ostrożnie usunąć supernatant, nie naruszając żywicy. Powtórz pranie 1x.
    9. Przenieś umytą żywicę do dwóch polipropylenowych kolumn wirujących (patrz Tabela materiałów). Przemyć każdą kolumnę 1x 2 ml buforu głównego. Usunąć bufor główny, odwirowując kolumnę o sile 1 400 x g przez 2 minuty w temperaturze 4 °C. Żywica zostanie zapakowana na dnie.
    10. Przygotować bufor elucyjny, dodając 100 μg/ml peptydu FLAG (patrz Tabela Materiałów) do buforu głównego.
    11. Dodać 300 μl buforu elucyjnego do żywicy upakowanej w każdej kolumnie i delikatnie wymieszać pipetując, aby upewnić się, że żywica jest całkowicie uwodniona przez bufor elucyjny. Pozwól żywicy inkubować z buforem elucyjnym na lodzie przez 10 minut.
    12. Odwirować kolumny o stężeniu 1 400 x g przez 2 minuty w temperaturze 4 °C. Przenieść przepływany płyn do czystej probówki do mikrowirówki i trzymać go na lodzie. To jest pierwsza frakcja.
    13. Powtórz kroki 1.6.11-1.6.12 tak, aby z każdej kolumny zebrano 4 frakcje.
    14. Wykonaj elektroforezę żelową SDS-PAGE35 z frakcjami elucji, aby określić ich względne stężenia. Podczas pracy żelu przygotuj bufor dializacyjny zawierający 500 mM NaCl, 10 mM MOPS, 2 mM MgCl2, 0,1 mM EGTA i 1 mM DTT.
    15. Połącz najbardziej skoncentrowane frakcje. Przenieść próbkę do kasety dializacyjnej 10K MWCO (patrz tabela materiałów) i dializować przez noc w temperaturze 4 °C. Użyć 1 l buforu dializacyjnego na około 500 μl białka. Wykonać co najmniej trzy zmiany buforu dializacyjnego.
      UWAGA: Kolumna wirowa i metoda elucji przez wirowanie pozwalają na elucję białek w wysokich stężeniach (0,5-1 mg/ml). Dalsze kroki koncentracji zwykle nie są wymagane. Jeśli jednak pożądane są bardziej skoncentrowane białka, należy załadować próbki do probówek zagęszczających 100 000 MWCO (patrz tabela materiałów) i odwirować przy 1 400 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Powtarzaj ten proces, aż do uzyskania pożądanej objętości roztworu białkowego.
    16. Następnego dnia ostrożnie wyjmij próbkę z kasety dializy. Podaniec 15 μl na probówkę PCR i wrzuć probówki do pojemnika z ciekłym azotem w celu błyskawicznego zamrożenia. Zamrożone białka mogą być przechowywane w temperaturze -80 °C do wykorzystania w przyszłości (Rysunek 3A).
      UWAGA: Wydajność miozyny-7a przy użyciu tej metody wynosi zwykle od 0,5 do 1 mg/L.

2. Oczyszczanie łańcuchów świetlnych RLC i CALML4 za pomocą systemu E. coli His6-SUMO (7 dni)

UWAGA: Dni 1-4 - Klonowanie i oczyszczanie plazmidów. Dzień 5 - Przemiana bakteryjna. Dni 6-7 - Oczyszczanie, porcjowanie i zamrażanie końcowych białek.

  1. Sklonuj cDNA kodujące RLC i CALML4 do wektora pET-SUMO, który zawiera sekwencję His6 przed sumo, aby pomóc w oczyszczaniu. W razie potrzeby domena His6-SUMO może zostać odcięta od białka fuzyjnego za pomocą proteazy SENP226,36.
  2. Dla każdego białka łańcucha lekkiego przekształć kompetentne komórki BL21 E. coli (patrz tabela materiałów) za pomocą plazmidu i rozpocznij 5 ml płynnej hodowli przez noc z przekształconymi komórkami.
  3. Następnego dnia zaszczepij 5 ml nocnej kultury w 1 l bulionu Luria-Bertani (LB) zawierającego 50 μg/ml kanamycyny. Pozostawić kulturę do wzrostu w temperaturze 37 °C z ciągłym wytrząsaniem przy 270 obr./min, aż gęstość optyczna (ÖD) osiągnie 0,6 - 1,0,
    UWAGA: Wartość średnicy zewnętrznej podwaja się mniej więcej co 20 minut, gdy osiągnie 0,2. Często monitoruj średnicę zewnętrzną.
  4. Zainicjować ekspresję białka przez dodanie 250 μM izopropylo-D-1-tiogalaktopiranozydu (IPTG) do hodowli. Inkubować przez 3-5 godzin w temperaturze 37 °C lub 16 °C przez noc z ciągłym wytrząsaniem przy 270 obr./min.
  5. Opastylizować E. coli, odwirowując zawiesinę komórkową o sile 4,347 x g, przez 15 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant.
  6. Przygotować bufor do reprodukcji zawierający 50 mM Tris-HCl, 1 M NaCl, 5 mM Imidazolu i 10% glicerolu, pH 7,4 (patrz tabela materiałów). Trzymaj na lodzie.
  7. Zawiesić osad w 15-25 ml buforu do sporządzania zawiesiny i przenieść zawiesinę do czystej zlewki, dostosowując całkowitą objętość do 35 ml. Dodać DNazę i RNazę do zawiesiny w stosunku 1:1000 (v/v), aby uzyskać końcowe stężenie odpowiednio 1 μg/ml i 2 μg/ml. Dodać jedną tabletkę inhibitora proteazy bez EDTA, 4 mM 2-merkaptoetanolu i 1% Triton X do zawiesiny (patrz tabela materiałów). Trzymaj na lodzie przez 20 minut.
  8. Sonikuj zawiesinę granulek w lodowatej wodzie przez 1 s i 1 s wyłącz, łącznie przez 1 minutę przy 100% amplitudzie. Pozostawić homogenizowany lizat w temperaturze 4 °C z ciągłym obracaniem przez 2 godziny
    UWAGA: Dodatek Triton X pomaga w lizie komórek w przygotowaniu do sonikacji.
  9. Odwirować lizaty przy 26 900 x g przez 45 minut w temperaturze 4 °C. W tym czasie zacznij przygotowywać żywicę kobaltową (patrz Tabela materiałów). Użyj 500 μl żywicy kobaltowej na 1 l kultury E. coli. Przemyć żywicę 2x ultraczystą wodą i raz buforem zawiesiny, wirując w temperaturze 4,347 x g przez 2 minuty w temperaturze 4 °C.
  10. Po odwirowaniu lizatu połączyć supernatant z przemytą żywicą i delikatnie rozdrabniać w temperaturze 4 °C przez 30 minut.
  11. Odwirować zawiesinę lizatu i żywicy o sile 4,347 x g przez 2 minuty w temperaturze 4 °C. Żywica zostanie zapakowana na dnie tuby. Nie naruszając żywicy, usuń supernatant.
  12. Przemyć żywicę buforem do rekonspensji przez odwirowanie w stężeniu 4,347 x g przez 2 minuty w temperaturze 4 °C. Usunąć supernatant. Powtarzaj mycie, aż supernatant stanie się bezbarwny.
  13. Przygotować bufor elucyjny zawierający 50 mM Tris HCl, 300 mM NaCl, 5 mM Imidazolu, 10% glicerolu, 4 mM 2-merkaptoetanolu i 0,25 μM proteazy SENP2 (patrz Tabela materiałów). Trzymaj go na lodzie.
  14. Zawiesić żywicę w 1 ml buforu do sporządzania zawiesiny i inkubować ją przez noc w temperaturze 4 °C z ciągłą rotacją.
  15. Następnego dnia odwirować przy 4,347 x g przez 2 minuty w celu osadzenia żywicy. Zebrać supernatant, który zawiera rozszczepione białko łańcucha lekkiego i proteazę.
  16. Dodać 1 ml buforu elucyjnego do żywicy. Powtórzyć wirowanie i zebrać supernatant.
  17. Usunąć proteazę za pomocą szybkiej chromatografii cieczowej białek (FPLC). Krótko przygotuj kolumnę wykluczającą wielkość (patrz tabela materiałów) z buforem zawierającym 50 mM Tris-HCl, 300 mM NaCl, 10% glicerolu i 5 mM DTT (pH 7,4). Zagęścić supernatant do 500 μl za pomocą probówki zagęszczającej o mocy 10 000 MWCO. Załadować zagęszczoną próbkę do kolumny podłączonej do automatycznego systemu chromatograficznego za pomocą strzykawki, przepuścić przez nią bufor zawierający 50 mM Tris-HCl, 300 mM NaCl, 10% glicerolu i 5 mM DTT (pH 7,4). Monitorować zebrane frakcje za pomocą spektrofotometrii ultrafioletowej. Zebrać frakcje białkowe o masie cząsteczkowej odpowiadającej łańcuchom lekkim.
    UWAGA: Proteazę można również usunąć za pomocą chromatografii powinowactwa, jeśli znacznik oczyszczający (np. znacznik GST) jest zmodyfikowany w proteazie.
  18. Uruchom żel SDS-PAGE z frakcjami elucji, aby określić czystość i względne stężenia białek łańcucha lekkiego w każdej frakcji. Pożądane frakcje to te, które zawierają skoncentrowane białka łańcucha lekkiego bez widocznych prążków proteazy. Połącz pożądane frakcje białkowe i zagęść je za pomocą rurki do koncentratu 10 000 MWCO35.
  19. Błyskawiczne zamrożenie porcji białka w ciekłym azocie i natychmiastowe przeniesienie do temperatury -80 °C w celu długotrwałego przechowywania (Rysunek 3B).
    UWAGA: Wydajność RLC i CALML4 przy użyciu systemu E. coli His6-SUMO wynosi około 1-2 mg/L.

3. Test ślizgania włókien aktynowych dostosowany do miozyny-7a (3 godziny)

UWAGA: Metody użyte w tej sekcji są podobne do tych opisanych dla innych miozyn31, z głównymi modyfikacjami polegającymi na inkubacji i zastosowaniu miozyny w buforze o wysokiej sile jonowej oraz długim odstępie czasu wymaganym do osiągnięcia dokładnego pomiaru przemieszczeń między klatkami.

  1. Przygotować 20 μM nitkowatą aktynę (F-aktynę) przez polimeryzację globularnej aktyny (G-aktyny) w buforze polimeryzacyjnym (50 mM KCl, 25 mM MOPS, 2 mM MgCl2, 1 mM DTT (pH 7,0)) w temperaturze 4 °C przez noc. Oznaczyć F-aktynę, dodając 1,2x molowy nadmiar rodaminy-falloidyny (patrz Tabela materiałów). Przykryj folią aluminiową i inkubuj na lodzie przez co najmniej 2 godziny
    UWAGA: G-aktynę można kupić od komercyjnych sprzedawców (patrz Tabela materiałów) lub oczyścić z acetonu z mięśni królika w proszku31,37. Znakowana F-aktyna może być przechowywana w temperaturze 4 °C do 2 miesięcy w tym stężeniu.
  2. Przygotuj komorę przepływową zgodnie z wcześniejszym opisem31. Na krótko umieść dwa paski taśmy dwustronnej w odległości 2-3 mm od siebie na oczyszczonym i poddanym nitrocelulozie szkiełku mikroskopowym (patrz Tabela materiałów). Połóż szkiełko nakrywkowe nitrocelulozową stroną do dołu na paski, tworząc komorę przepływową o przybliżonej objętości 10 μL (Rysunek 4).
  3. Przeprowadzanie testu ślizgania się włókien aktynowych
    1. Do komory przepływowej dodać jedną objętość komory 0,2 mg / ml oczyszczonego ludzkiego białka miozyny-7a w 500 mM buforze ruchliwości NaCl (500 mM NaCl, 20 mM MOPS, 5 mM MgCl2, 0,1 mM EGTA (pH 7,4)). Pozostawić do inkubacji na 5 minut w temperaturze pokojowej.
      UWAGA: Bardzo ważne jest dodanie miozyny-7a do buforu o wysokiej zawartości soli, ponieważ łagodzi to stan autoinhibicji i pozwala miozynie-7a przylegać do powierzchni w aktywowanej konformacji.
    2. Przemyć komorę przepływową trzykomorowymi objętościami 1 mg/ml BSA (patrz tabela materiałów) w 150 mM buforze ruchliwości NaCl (150 mM NaCl, 20 mM MOPS, 5 mM MgCl2, 0,1 mM EGTA, 1 mM DTT (pH 7,4)) przeciągając ciecz za pomocą czystej ściereczki na wylocie w celu wchłonięcia nadmiaru cieczy. Inkubować przez 1 minutę po 3praniu.
    3. Przepłynąć przez komorę przepływową jedną objętość 10 nM F-aktyny znakowanej faloidyną rodaminą w buforze ruchliwości NaCl o stężeniu 150 mM. Monitoruj wiązanie filamentów aktynowych z powierzchnią pod mikroskopem fluorescencyjnym z obiektywem 100x. Gęstość filamentów aktynowych powinna być optymalna (Rysunek 5A), zapewniając wystarczającą ilość włókien w polu widzenia do śledzenia, a jednocześnie wystarczająco rzadką, aby zapobiec nakładaniu się wielu filamentów, co komplikuje śledzenie.
    4. Przemyć komorę przepływową trzykomorowymi objętościami 150 mM buforu ruchliwości NaCl w celu usunięcia niezwiązanych włókien aktynowych i nadmiaru rodaminy-falloidyny.
    5. Zainicjuj ruchliwość, dodając jedną objętość komory buforu końcowego (200 mM NaCl, 20 mM MOPS, 5 mM MgCl2, 0,1 mM EGTA, 50 mM DTT, 2 mM ATP, 2,5 mg/ml glukozy, 100 μg/ml oksydazy glukozowej, 2 μM RLC, 2 μM CaM, 2 μM CALML4).
    6. Rejestruj obrazy pod mikroskopem fluorescencyjnym przy użyciu wzbudzenia 561 nm, aby uwidocznić aktynę znakowaną faloidyną rodaminą. Znajdź obszar na szkiełku o żądanej gęstości aktyny (Rysunek 5A) i rejestruj obrazy co 30 sekund przez 30 min.
      UWAGA: Prędkość miozyny-7a u ssaków wynosi około 5 nm/s. Podczas ustawiania liczby klatek na sekundę akwizycji ważne jest, aby upewnić się, że przemieszczenia włókien między klatkami są wystarczająco długie (więcej niż jeden piksel), aby umożliwić dokładne śledzenie. Ruchy subpikseli między klatkami mogą powodować przeszacowanie szybkości. Szybkość odświeżania wynosząca 30 s pozwala włóknom aktynowym przemieszczać się między ramkami o około 150 nm, co odpowiada więcej niż dwóm pikselom pod mikroskopem. Należy jednak zwrócić uwagę, aby na używanym mikroskopie można było zaobserwować znaczne przemieszczenie. Jeśli jest to możliwe, zapis wielopozycyjny może być wykorzystany do jednoczesnego zbierania kilku pól widzenia do analizy.
  4. Analiza ruchu filamentów aktynowych za pomocą programu FAST (zainstalowanego na komputerze Mac)38.
    UWAGA: Zastosowany tutaj program FAST jest tylko jedną z wielu opcji ilościowego określania ruchu filamentu. Zdecydowaliśmy się na korzystanie z FAST, ponieważ jest zautomatyzowany, szybki i nie wymaga płatnego oprogramowania. Inne opcje obejmują algorytmy oparte na MATLAB, takie jak FIESTA, metody oparte na ImageJ/FIJI, takie jak MTrack2 i Manual Tracking, oraz metody oparte na Pythonie, takie jak Philament39.
    1. Pobierz i zainstaluj program FAST (github.com/NeilBillington/FASTrack3 - wersja kompatybilna z python3 z dodatkowym modułem do konwersji plików nd2. Uwaga: Oryginalną wersję python2 można znaleźć pod adresem github.com/turalaksel/FASTrack).
    2. Uruchom program FAST zgodnie z opisem w38, używając wartości tolerancji 33, aby zachować tylko płynnie poruszające się filamenty.
      UWAGA: Jeśli obrazy zawierają dryf z powodu problemów mechanicznych ze sceną lub z jednoczesnego zbierania kilku serii, filmy powinny być najpierw ustabilizowane. W tym celu polecamy wtyczkę FIJI Image Stabilizer, dostępną do pobrania pod adresem - (https://www.cs.cmu.edu/~kangli/code/Image_Stabilizer.html).
    3. Użyj programu FAST, aby przeanalizować nowo utworzone obrazy .tif, najpierw ustawiając wartości -xmax i -ymax. Ustawiają one parametry wykresu punktowego wyprowadzanego przez program i reprezentują najdłuższą długość włókna (w nm) oraz maksymalną prędkość żarnika (w nm/s). W tym przykładzie użyliśmy 20 000 nm dla -xmax i 20 nm/s dla -ymax, aby upewnić się, że wszystkie dane zostały przechwycone (Rysunek 5D).
    4. Użyj -px, aby ustawić rozmiar piksela pozyskanego obrazu, który tutaj będzie wynosił 65 nm, i -minv, aby ustawić minimalną prędkość (w nm/s) wymaganą od filamentu do uwzględnienia w analizie. Dla niskiej prędkości miozyny-7a w tym przykładzie należy użyć 0,1 nm/s.
    5. Użyj -maxd, aby ustawić maksymalną dozwoloną odległość między ramkami, aby połączyć filamenty. Jest to ustawione tak, aby uniknąć łączenia oddzielnych żarników między ramkami i w tym przykładzie używamy domyślnego 2000 nm.
    6. Użyj-pt, aby ustawić tolerancję dla wahań prędkości filamentu i uwzględniać tylko filamenty o płynnych ruchach. W tym przykładzie użyto progu tolerancji wynoszącego 33%. Oznacza to, że filamenty o odchyleniu standardowym prędkości większym niż 33% średniej prędkości zostaną wyłączone z dalszej analizy.
    7. Na koniec użyj -d, aby wskazać folder zawierający stosy .tif do analizy. Cały ciąg poleceń z podanymi parametrami i wartościami będzie wyglądał następująco: fast -xmax 20000 -ymax 20 -px 65 -minv 0.1 -maxd 2000 -pt 33 -d [nazwa folderu zawierającego filmy].
      UWAGA: Program FAST wygeneruje wykresy rozrzutu (Rysunek 5D) wraz z powiązanymi z nimi surowymi danymi, które można wyodrębnić do analizy i wizualizacji w innych programach (Rysunek 5C). Wyświetli również wykres ścieżek śledzonych włókien (Rysunek 5B), który powinien być użyty do sprawdzenia, czy śledzenie działa zgodnie z oczekiwaniami. Przykłady wykresów i innych możliwych wizualizacji danych znajdują się poniżej.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Oczyszczony kompleks miozyny-7a i białka łańcucha lekkiego mogą być oceniane za pomocą elektroforezy żelowej SDS-PAGE, jak pokazano w Rysunek 3. Pasmo powyżej znacznika 200 kDa odpowiada ciężkiemu łańcuchowi miozyny-7a (255 kDa). Trzy pasma migrujące między znacznikami 22 i 14 kDa od góry do dołu to odpowiednio RLC (20 kDa), kalmodulina i CALML4. Podczas gdy kalmodulina i CALML4 mają podobną masę cząsteczkową około 17 kDa, oba białka można rozdzielić za pomocą 16% żelu Tris-Glycine.

Wideo 1 i Rysunek 5 przedstawia charakterystyczny test ślizgania włókien aktynowych z miozyną ssaków-7a. Natychmiastową cechą ujawnioną przez ten test jest powolna ruchliwość miozyny-7a. Film jest odtwarzany z 500-krotnością normalną prędkością, aby lepiej zobrazować ruch włókien aktynowych napędzanych przez tę miozynę. Test ten można zmodyfikować w celu dalszego badania, w jaki sposób czynniki zewnętrzne, takie jak temperatura, siła jonowa i lepkość roztworu, wpływają na aktywność miozyny-7a. Dodatkowo, białka wiążące miozynę-7a mogą być wprowadzane do komórki przepływowej w celu zbadania ich wpływu na interakcje i ruchliwość aktomiozyny.

figure-results-1
Rysunek 1: Przepływ pracy dla produkcji holoenzymu miozyny-7a opartej na systemie MultiBac. (A) Wstaw cDNA kodujące łańcuch ciężki miozyny-7a, RLC, CALML4 i kalmodulinę do wielu miejsc klonowania (MCS) wektora pACEBac1. (B) Skonstruuj kasetę ekspresji wielogenowej do kodowania kompleksu miozyny-7a poprzez iteracyjną ligację wektorów pACEBac1, które zawierają cDNA łańcucha ciężkiego miozyny-7a, RLC, CALML4 i kalmoduliny. (C) Zintegrować wielogenową kasetę miozyny-7a z genomem bakulowirusa poprzez transpozycję elementu mini-Tn7 z wektora pACEBac1 do miejsca docelowego mini-attTn7 w genomie. (D) Wytwarzanie bakulowirusów wykazujących ekspresję kompleksu miozyny-7a poprzez transfekcję komórek Sf9 za pomocą rekombinowanego bakmidu zawierającego kasetę wielogenową miozyny-7a. (E) Bakulowirus może być amplifikowany przez inokulację wirusa P0 w kulturze zawiesiny komórek Sf9 i zebranie supernatantu. Uzyskany w ten sposób produkt, wirus P1, może być stosowany do ekspresji białek na dużą skalę. (F) Przepływ pracy dla oczyszczania kompleksu miozyny-7a w oparciu o kolumnę powinowactwa FLAG. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Reprezentatywne obrazy fluorescencyjne komórek Sf9 transfekowanych bakmidem eksprymującym miozynę-7a z C-końcowym znacznikiem GFP. Obrazy pokazują normalny postęp infekcji bakulowirusem: komórki zaczynają wyrażać miozynę-7a około 4 dnia po transfekcji, przy czym prawie wszystkie komórki ulegają zakażeniu w ciągu jednego tygodnia. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3: SDS-żele z oczyszczonego kompleksu miozyny-7a i białek o łańcuchu lekkim. (A) Oczyszczony ludzki holoenzym miozyny-7a o pełnej długości przy użyciu systemu MultiBac. Wskazano łańcuch ciężki (HC) i łańcuchy lekkie. (B) Oczyszczone RLC i CALML4 przy użyciu systemu His6-SUMO. Kalmodulina (CaM) jest kupowana (patrz Tabela Materiałów) i oczyszczana z mózgu bydlęcego. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rysunek 4: Przebieg pracy przy montażu komory przepływowej i testach ślizgu aktyny. Szkiełko nakrywkowe nasączone nitrocelulozą jest mocowane do szkiełka mikroskopowego za pomocą dwóch kawałków taśmy dwustronnej. W ten sposób powstaje komora przepływowa o objętości około 10 μl. Białka są dodawane sekwencyjnie do komory, podczas gdy nadmiar roztworów jest odprowadzany przez kanał za pomocą bibuły. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-5
Rysunek 5: Reprezentatywne wyniki testów włókien aktynowych i analizy śledzenia. (A) Przykładowa klatka z nagrania poklatkowego pokazująca ruch filamentu aktynowego napędzany przez silniki miozyny-7a ozdobione powierzchnią. (B) Wyjście obrazu śledzenia filamentu z programu FAST dla tego samego pola widzenia, jak pokazano w (A). (C) Reprezentatywny histogram prędkości ślizgania się aktyny generowanej przez miozynę ssaków-7a: 4,2 ± 1,4 nm/s (średnia ± odchylenie standardowe; liczba ścieżek = 550). (D) Przykład automatycznie wygenerowanego wyjścia z programu FAST pokazującego obliczoną długość i prędkości żarnika. %STUCK pokazuje procent filamentów, które są uważane za zablokowane na podstawie podanego przez użytkownika odcięcia minimalnej prędkości. MVEL reprezentuje średnią prędkość wszystkich niesklejonych filamentów. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Wideo 1: Test ślizgania włókien aktynowych przeprowadzony z miozyną-7a. Oczyszczona ludzka miozyna-7a na całej długości jest przyczepiona do powierzchni. Ten film został zarejestrowany przy 1 klatce co 30 s z ekspozycją 200 ms. Kliknij tutaj, aby pobrać ten film.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawiono szczegółowy protokół produkcji rekombinowanego ludzkiego białka miozyny-7a z komórek owadów. Chociaż system Sf9 / bakulowirus został wykorzystany do produkcji różnych miozyn 40,41,42,43, dopiero niedawno miozyna-7a ssaków została pomyślnie oczyszczona przy użyciu systemu bakulowirusa MultiBac 14. Stwierdzono, że miozyna-7a u ssaków wiąże się z trzema typami łańcuchów lekkich, z których wszystkie są niezbędne dla strukturalnej i funkcjonalnej integralności białka14. Jest to przeciwieństwo homologu bezkręgowców i większości innych miozyn, które zazwyczaj wiążą się tylko z jednym lub dwoma typami łańcuchów lekkich44,45. Oznacza to, że aby zsyntetyzować ludzki holoenzym miozyny-7a, co najmniej cztery różne geny muszą być wyrażane jednocześnie w każdej komórce Sf9. W tym przypadku system MultiBac oferuje znaczące korzyści w porównaniu z koinfekcją wieloma bakulowirusami, ponieważ zapewnia powtarzalne proporcje podjednostek kompleksu miozyny-7a w każdej zakażonej komórce. W rzeczywistości Belyaev i wsp. wykazali to statystycznie: wraz ze wzrostem liczby typów wirusa, prawdopodobieństwo otrzymania przez komórki takiego samego stosunku wirusa dramatycznie spada46. Na przykład w przypadku dwóch typów wirusów tylko 12,78% komórek osiąga równy stosunek, podczas gdy odsetek ten spada do 0,29%, gdy używane są cztery typy wirusów, przy założeniu, że każdy typ wirusa jest rozmieszczony między komórkami niezależnie. Ta zmienność może być problematyczna, gdy białka podjednostkowe muszą łączyć się w stałym stosunku, aby uzyskać maksymalną wydajność kompleksu. Chociaż niniejsza praca koncentruje się na miozynie-7a u ssaków, coraz bardziej oczywiste jest, że system MultiBac oferuje bardziej zoptymalizowane podejście do wytwarzania kompleksów multimerycznych niż metoda koinfekcji, szczególnie w przypadku białek z większą liczbą podjednostek i wytwarzanych z niską wydajnością.

Kilka czynników ma kluczowe znaczenie dla osiągnięcia wysokiej wydajności produkcji białka miozyny-7a przy użyciu tej metody. Po pierwsze, ważne jest, aby określić optymalny czas na pobranie komórek Sf9 . Pozwala to na maksymalną produkcję białka przy jednoczesnym zminimalizowaniu szkodliwych skutków lizy i śmierci komórek spowodowanych przez wirusa. Produkcja kompleksów białkowych opartych na MultiBac często wykazuje opóźniony szczyt ekspresji w porównaniu z monocistronicznymi systemami bakulowirusowymi lub podczas ekspresji mniejszych białek. Odkryliśmy, że najlepszy czas na pobranie komórek zakażonych wirusem MultiBac miozyny-7a to okres od 60 do 65 godzin po zakażeniu. Zdecydowanie zaleca się ciągłe monitorowanie poziomu ekspresji białka w całym procesie. Można to osiągnąć za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej, jeśli znacznik białka fluorescencyjnego jest połączony, lub poprzez analizę SDS-PAGE w inny sposób. Ponadto ważne jest, aby jednocześnie monitorować żywotność komórek, aby określić optymalny czas na osiągnięcie najwyższej wydajności białka przy minimalnej śmierci komórki.

Miozyna-7a jest dużą monomeryczną miozyną podatną na degradację białek14. Aby zapobiec degradacji podczas procesu oczyszczania, ważne jest, aby zapewnić, że wszystkie są wstępnie schłodzone, a wszystkie procedury są przeprowadzane w temperaturze 4 °C. Ponadto kluczowe znaczenie ma zminimalizowanie narażenia miozyny-7a na proteazy. Oprócz stosowania koktajli inhibitorów proteazy, zalecamy utrzymanie inkubacji lizatu komórkowego z żywicą FLAG do zaledwie 1 godziny. Nie wykazano, aby wydłużenie tego czasu znacząco poprawiło wiązanie żywicy lub zwiększyło całkowitą wydajność białka i może stwarzać większe ryzyko degradacji białka.

Charakterystyczną cechą miozyny-7a ssaków, w porównaniu z izoformami z niższych gatunków44, jest połączenie unikalnych składników łańcucha lekkiego. Te łańcuchy lekkie odgrywają ważną rolę regulacyjną w funkcji miozyny-7a. Na przykład kalmodulina dynamicznie oddziałuje z łańcuchem ciężkim od miozyny w sposób zależny od Ca2+ 47, modulując jego ruchliwość i moc mechaniczną, mechanizm, który wydaje się być specyficznie przystosowany do słuchowych komórek rzęsatychssaków 14. Chociaż dokładne powinowactwo wiązania kalmoduliny z poszczególnymi motywami IQ nie zostało jeszcze określone w kontekście całej cząsteczki, zaobserwowaliśmy, że niektóre kalmoduliny stopniowo dysocjują, gdy nadmiar łańcuchów lekkich w lizacie komórkowym jest usuwany podczas oczyszczania. Może to zmienić właściwości mechaniczne miozyny-7a. Aby temu zapobiec, stosujemy kolumny wirowe połączone z delikatnym wirowaniem na etapie elucji. Pozwala to na elucję białek w małej objętości i przy wysokim stężeniu, co może wyeliminować potrzebę stopniowego zagęszczania. Praktyka ta skraca całkowity proces oczyszczania białek i minimalizuje ryzyko dysocjacji łańcucha lekkiego. W testach ślizgania aktyny włączamy nadmiar białek łańcucha lekkiego do końcowego buforu, aby zapewnić, że natywne łańcuchy lekkie pozostaną związane z łańcuchem ciężkim miozyny-7a.

Wymóg nadmiaru łańcuchów lekkich stanowi jedną z kilku różnic między testem ślizgania aktyny z miozyną-7a a testem innych dobrze przebadanych miozyn, takich jak miozyna-2. Testy miozyny-2 są zwykle wykonywane przy niskiej sile jonowej (np. 50 mM). Gdy siła jonowa wzrasta w kierunku fizjologicznej (150 mM), włókna aktyny mają tendencję do odrywania się, a ruchliwość zwalnia. W przypadku miozyny-7a ruchliwość jest zatrzymana przy niskiej sile jonowej, a poślizg obserwuje się tylko przy prędkości większej lub równej 150 mM. Ze względu na autoinhibicję miozyny 7a o pełnej długości, nakłada się ją na szkiełko nakrywkowe w roztworze o wysokiej sile jonowej w sposób podobny do tego, w jaki sposób włókna miozyny są rozpuszczane przed aplikacją, aby umożliwić wiązanie białek w orientacji i konformacji, która umożliwia późniejszy ślizg.

Niska prędkość obserwowana w testach ślizgania aktyny z miozyną-7a stwarza pewne wyzwania w pozyskiwaniu i analizowaniu danych dotyczących ruchliwości. Rzeczywiście, translokacja jest o kilka rzędów wielkości wolniejsza w porównaniu z miozyną mięśni szkieletowych, która była używana, gdy pierwotnie opracowano ten test30. Ta niska prędkość może prowadzić do trudności w dokładnym pomiarze i przeszacowania prędkości, która skaluje się z liczbą klatek na sekundę48. Precyzja lokalizacji każdej metody śledzenia jest skończona i nawet statyczny obiekt ma pozorną zmianę położenia między kolejnymi obrazami. Wraz ze wzrostem częstotliwości próbkowania prowadzi to do sztucznie zawyżonej wartości prędkości. Efekt ten jest prawdziwy dla każdego rodzaju testu ruchliwości, ale efekt względny jest bardzo mały w przypadku testów, w których występuje duży ruch kilku pikseli między klatkami. Pobierając punkty danych w bardzo długich odstępach czasu (co 60 s, 90 s itd.), można sprawdzić, czy zmierzona prędkość jest dokładna, ponieważ częstotliwość próbkowania nie powinna mieć wpływu na wartość. Ponieważ interwał nagrywania dla miozyny-7a jest tak długi, opóźnienie można wykorzystać do nagrywania z kilku pozycji podczas tej samej akwizycji. Pozwala to skutecznie na nagrywanie kilku filmów jednocześnie. Wadą tej metody jest to, że niedoskonałości mechaniczne ze stopniem doprowadzą do dodatkowego dryfu z powodu zamiany pozycji. Można to wytłumaczyć za pomocą stabilizacji obrazu, jak opisano powyżej.

W oryginalnej wersji oprogramowania FAST (github.com/turalaksel/FASTrack) w języku Python2 każdy wyjściowy punkt danych reprezentuje prędkość filamentu w oknie N-frame (domyślnie 5 klatek). Zmodyfikowana wersja oprogramowania Python3 (github.com/NeilBillington/FASTrack3) zawiera dodatkowe wyjście, w którym punkty danych są na zasadzie filament po włóknie. Domyślne wykresy tworzone przez oprogramowanie są oparte na zestawie danych typu okno N. Oba typy danych wyjściowych są równie ważne i chociaż oryginalne dane wyjściowe wygenerują o wiele więcej punktów danych na film, zazwyczaj używamy danych opartych na włóknach, ponieważ są one bardziej bezpośrednio porównywalne z istniejącymi metodami ilościowego określania ślizgania się włókien i dostarczają bardziej intuicyjnych informacji o liczbie włókien o określonych prędkościach w danym filmie. Zauważ, że nawet w tej analizie typu filamentu liczba punktów danych nie będzie dokładnie odpowiadać prawdziwej liczbie włókien, ponieważ śledzenie zatrzymuje się, gdy włókna przecinają ścieżki, a nowe ścieżki są wykrywane, gdy pojawiają się po skrzyżowaniu.

Ograniczenia metod opisanych w tej pracy polegają na tym, że białko ssaków ulega ekspresji w komórkach owadów. Chociaż wiele takich białek, w tym to, zostało z powodzeniem wyrażonych w ten sposób, istnieją inne systemy ekspresji, które mogą bardziej naśladować rodzime środowisko białka. Systemy ekspresji ssaków mogą wprowadzać ważne modyfikacje potranslacyjne białka, które są nieobecne w układzie owadów. To samo odnosi się w jeszcze większym stopniu do ekspresji w systemie bakteryjnym, który jest tutaj używany do produkcji łańcuchów lekkich miozyny. Niemniej jednak uważamy, że względna prostota i wysoka wydajność w tych przypadkach przeważają nad potencjalnymi ograniczeniami. Test ruchliwości in vitro , który jest używany do scharakteryzowania białka, jest ograniczony pod względem ilości informacji, jakie może dostarczyć o białku. Na przykład wiele aspektów regulacji miozyny jest maskowanych lub obchodzonych przez test, a zatem nie można ich zbadać za pomocą tej techniki. Istnieje wiele innych typów testów, takich jak ruchliwość pojedynczych cząsteczek, pułapkowanie optyczne oraz techniki biochemiczne i biofizyczne, w celu zbadania właściwości miozyny in vitro, ale test ślizgania się włókien jest tutaj wybierany jako metoda pomiaru aktywności miozyny, ponieważ wymaga mniej białka niż wiele testów biochemicznych, jest prosty do wykonania i w którym można wykazać pomyślną ruchliwość, mówi nam, że białko jest aktywne zarówno biochemicznie, jak i mechanicznie.

Opisany tutaj przebieg pracy reprezentuje szereg metod wytwarzania wysokiej jakości białka miozyny-7a i charakteryzowania jego właściwości mechanicznych. Chociaż metody te są specjalnie dostosowane do tej klasy miozyny, procedury ekspresji i oczyszczania są bardziej ogólnie przydatne jako wytyczne dotyczące wytwarzania tego typu labilnego białka, składającego się z kilku odrębnych polipeptydów i mającego tendencję do dysocjacji i degradacji. Ponadto metody charakterystyki są przydatne dla wszystkich typów białek motorycznych, a w szczególności rozważania dotyczące parametrów pozyskiwania i analizy danych mają być przydatne dla każdego, kto mierzy szybkość translokacji silników molekularnych o niskiej prędkości.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy Zakładowi Obrazowania Mikroskopowego oraz Ośrodkowi Funkcji Wizualnych i Morfologii Uniwersytetu Zachodniej Wirginii za dyskusję i pomoc w analizie obrazu. Praca ta jest wspierana przez fundusze startowe z West Virginia University School of Medicine do R.L. Prace te są również wspierane przez National Institute of General Medical Sciences (NIGMS) Visual Sciences Center of Biomedical Research Excellence (Vs-CoBRE) (P20GM144230) oraz NIGMS West Virginia Network of Biomedical Research Excellence (WV-INBRE) (P20GM103434).

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Probówki do mikrowirówek 1,7 mlVWR87003-294
1X FLAG PeptideGenScriptN/ANiestandardowa synteza peptydów
22x22mm Szkiełka nakrywkowe nr 1,5VWR48366-227
250 ml Stożkowe probówkiNunc376814
250 ml Wentylowana kolba wytrząsarska ErlenmyerIntelixBioDBJ-SF250VP
2-merkaptoetanolVWRM131
75x25x1 mm Szkiełka mikroskopowe VistavisionVWR16004-42
Białko aktynowe (>99% czyste)CytoszkieletAKL99
Filtr odśrodkowy Amicon Ultra-0,5Millipore SigmaUFC510024
Filtr odśrodkowy Amicon Ultra-4Millipore Sigma UFC801024
ANTI-FLAG M2 Affinity GelMillipore SigmaA2220
ATPMillipore SigmaA7699
ATPMillipore SigmaA7699
Bio-Spin Jednorazowa kolumna chromatograficznaBio-Rad732-6008
BL21 Kompetentny E. coliNew England BiolabsC2530H
Bluo-GalThermo Fisher
Surowica bydlęca AlbuminaMillipore Sigma5470
BstXI EnzymNew England BiolabsR0113S
KalmodulinaMilipore Sigma208694
Katalaza MilliporeSigmaC40
Champion pET-SUMO System ekspresjiThermo FisherK30001
cKompletny, wolny od EDTA koktajl inhibitorów proteazyRoche Diagnostics5056489001
Cutsmart BufferNew England BiolabsB6004S
DL-DithiothreitolMillipore SigmaDO632
Millipore SigmaDO632
DNaza I, Spectrum ChemicalFisher Scientific18-610-304
Taśma dwustronnaDepot909955
EGTA, Klasa biologii molekularnejMillipore Sigma324626-25GM
EGTA, Biologia molekularnaMillipore Sigma324626-25GM
EtanolThermo FisherBP2818
Odczynnik do transfekcji ExpiFectamine SfGibcoA38915
Program FASThttp://spudlab.stanford.edu/fast-for-automatic-motility-measurements; 
Marka rybacka  Model 505 Sonic DismembratorFisher ScientificFB505110
Roztwór odczynnika gentamycynyGibco15710-06410 mg / ml w wodzie destylowanej
Glikoza Millipore SigmaG5767
Oksydaza glukozowaMillipore SigmaG2133
GlicerolInvitrogen15514-011
Żywicakobaltowa HisPurThermo Fisher89966
CeuI EnzymeNew England BiolabsR0699S
obrazuhttps://www.cs.cmu.edu/~kangli/code/Image_Stabilizer.html
ImageJ FIJIhttps://imagej.net/Fiji/Downloads
ImidazoleMillipore SigmaI2399
In-Fusion Snap Assembly Master MixTaKaRa638948
IPTGThermo Fisher15529019
IsopropanolFisher ScientificA451SK
KanamycynaFisher ScientificAAJ67354AD
Końcówki do pipet z dużym otworemFisher Scientific02-707-1341-200uL
LB Agar, gotowy proszekThermo FisherJ75851-A1
Inhibitor proteazy leupeptynyThermo Fisher78435
Chlorek magnezuThermo FisherJ61014.=E1M
Chlorek magnezuThermo FisherJ61014.=E1M
Max Wydajność DH10Bac Kompetentne komórkiGibco10361012
Probówki do mikrowirówek, 1,7 mlVWR87003-294
Probówki do mikrowirówek, 1,7 mlVWR87003-294
Probówki do mikrowirówek, 1,7 mlMikroskop VWR87003-294
Model firmy Nikon: Eclipse Ti z systemem H-TIRF z obiektywem
Kamera mikroskopowaORCA-Fusion BT
Jednostka laserowamikroskopu iXon Ultra
Miller' s LB BulionCorning46-050-CM
MOPSMillipore SigmaM3183
MOPSMillipore SigmaM3183
NanoDrop One/OneC Mikroobjętość Spektrofotometr UV-VisThermo FisherND-ONE-W
NanoDrop One/OneC Mikroobjętość Spektrofotometr UV-VisThermo FisherND-ONE-W
NEB 5-alpha Kompetentny E.coli (wysoka wydajność)New England BiolabsC2987H
NEBuffer r3.1New England BiolabsB6003S
NIS ElementsNikon
NIS-ElementsNikon
NitrocelulozaLADD Research Industries53152
Opti-MEM I Zredukowane podłoże w surowicyGibco31985070
pACEBac1 VectorGeneva Biotech
ParafilmMillipore SigmaP7793
PMSFMillipore Sigma78830
PureLink RNaza A (20 mg / ml)Invitrogen12091021
QIAprep Spin Miniprep Zestaw do ekstrakcji żelu (250)QIAGEN27106
QIAquick Zestaw do ekstrakcji żelu (50)QIAGEN28704
QIAquick Zestaw do oczyszczania PCR (50)QIAGEN28104
SzybkiNew England BiolabsM0525S
Rodamina falloidynaInvitrogenR415
S.O.C. MediumProteaza
SENP2PMID:17591783Oczyszczony w laboratorium
Ogniwa Sf9Thermo Fisher11496015
Sf-900 III SFM (1X) - Complete Serum Free MediaGibco12658-027
Kasety dializacyjne Slide-A-Lyzer G3, 10K MWCO, 3 mLThermo FisherA52971
Chlorek soduMillipore SigmaS7653
Stericup Quick Release Jednorazowy system filtracji napędzany próżniąMillipore SigmaS2GPU01RE
Superdex 75 Increase 10/300 GLCytiva29148721
Ligaza DNAT4 New England BiolabsM0202S
T4 DNA Ligaza - 10X z 10mM ATPNew England BiolabsB0202A
Chlorowodorek tetracyklinyMillipore SigmaT7660-5G
TrisMillipore Sigma10708976001
Triton XAmerykański bioanalityczny9002-93-1
wirówkowe 15519028DL-Dithiothreitol Office klasy Wtyczka stabilizatora 100X TIRF Invitrogen 15544034 Chlorek sodu Millipore Sigma S7653

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hartman, M. A., Spudich, J. A. The myosin superfamily at a glance. J Cell Sci. 125 (Pt 7), 1627-1632 (2012).
  2. Sellers, J. R. Myosins: a diverse superfamily. Biochim Biophys Acta. 1496 (1), 3-22 (2000).
  3. Titus, M. A. Myosin-driven intracellular transport. Cold Spring Harb Perspect Biol. 10 (3), a021972(2018).
  4. Quintanilla, M. A., Hammer, J. A., Beach, J. R. Non-muscle myosin 2 at a glance. J Cell Sci. 136 (5), jcs.260890(2023).
  5. Peckham, M. Coiled coils and SAH domains in cytoskeletal molecular motors. Biochem Soc Trans. 39 (5), 1142-1148 (2011).
  6. Batters, C., Veigel, C., Homsher, E., Sellers, J. R. To understand muscle you must take it apart. Front Physiol. 5, 90(2014).
  7. Friedman, T. B., Sellers, J. R., Avraham, K. B. Unconventional myosins and the genetics of hearing loss. Am J Med Genet. 89 (3), 147-157 (1999).
  8. Geeves, M. A., Holmes, K. C. The molecular mechanism of muscle contraction. Adv Protein Chem. 71, 161-193 (2005).
  9. Batters, C., Veigel, C. Mechanics and activation of unconventional myosins. Traffic. 17 (8), 860-871 (2016).
  10. Houdusse, A., Sweeney, H. L. How myosin generates force on actin filaments. Trends Biochem Sci. 41 (12), 989-997 (2016).
  11. Odronitz, F., Kollmar, M. Drawing the tree of eukaryotic life based on the analysis of 2,269 manually annotated myosins from 328 species. Genome Biol. 8 (9), R196(2007).
  12. Moreland, Z. G., Bird, J. E. Myosin motors in sensory hair bundle assembly. Curr Opin Cell Biol. 79, 102132(2022).
  13. Williams, D. S., Lopes, V. S. The many different cellular functions of MYO7A in the retina. Biochem Soc Trans. 39 (5), 1207-1210 (2011).
  14. Hollo, A., et al. Molecular regulatory mechanism of human myosin-7a. J Biol Chem. 299 (10), 105243(2023).
  15. Choi, M. S., et al. The small EF-hand protein CALML4 functions as a critical myosin light chain within the intermicrovillar adhesion complex. J Biol Chem. 295 (28), 9281-9296 (2020).
  16. Ebrahim, S., et al. Stereocilia-staircase spacing is influenced by myosin III motors and their cargos espin-1 and espin-like. Nat Commun. 7, 10833(2016).
  17. Whatley, M., et al. Usher syndrome: Genetics and molecular links of hearing loss and directions for therapy. Front Genet. 11, 565216(2020).
  18. Ahmed, Z. M., et al. USH1H, a novel locus for type I Usher syndrome, maps to chromosome 15q22-23. Clin Genet. 75 (1), 86-91 (2009).
  19. Liu, X., Ondek, B., Williams, D. S. Mutant myosin VIIa causes defective melanosome distribution in the RPE of shaker-1 mice. Nat Genet. 19 (2), 117-118 (1998).
  20. Gibbs, D., Kitamoto, J., Williams, D. S. Abnormal phagocytosis by retinal pigmented epithelium that lacks myosin VIIa, the Usher syndrome 1B protein. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (11), 6481-6486 (2003).
  21. Houdusse, A., Titus, M. A. The many roles of myosins in filopodia, microvilli and stereocilia. Curr Biol. 31 (10), R586-R602 (2021).
  22. Schwander, M., Kachar, B., Muller, U. Review series: The cell biology of hearing. J Cell Biol. 190 (1), 9-20 (2010).
  23. Li, S., et al. Myosin-VIIa is expressed in multiple isoforms and essential for tensioning the hair cell mechanotransduction complex. Nat Commun. 11 (1), 2066(2020).
  24. Fitzgerald, D. J., et al. Protein complex expression by using multigene baculoviral vectors. Nat Methods. 3 (12), 1021-1032 (2006).
  25. Sari, D., et al. The MultiBac baculovirus/insect cell expression vector system for producing complex protein biologics. Adv Exp Med Biol. 896, 199-215 (2016).
  26. Courtney, K. C., et al. Synaptotagmin-7 outperforms synaptotagmin-1 to promote the formation of large, stable fusion pores via robust membrane penetration. Nat Commun. 14 (1), 7761(2023).
  27. Courtney, K. C., et al. The complexin C-terminal amphipathic helix stabilizes the fusion pore open state by sculpting membranes. Nat Struct Mol Biol. 29 (2), 97-107 (2022).
  28. Courtney, K. C., et al. Synaptotagmin 1 oligomerization via the juxtamembrane linker regulates spontaneous and evoked neurotransmitter release. Proc Natl Acad Sci U S A. 118 (48), e2113859118(2021).
  29. Yu, I. M., et al. Myosin 7 and its adaptors link cadherins to actin. Nat Commun. 8, 15864(2017).
  30. Kron, S. J., Spudich, J. A. Fluorescent actin filaments move on myosin fixed to a glass surface. Proc Natl Acad Sci U S A. 83 (17), 6272-6276 (1986).
  31. Sellers, J. R. In vitro motility assay to study translocation of actin by myosin. Curr Protoc Cell Biol. Chapter 13, 13.2(2001).
  32. Tripathi, A., Bond, C., Sellers, J. R., Billington, N., Takagi, Y. Myosin-specific adaptations of in vitro fluorescence microscopy-based motility assays. J Vis Exp. (168), e62180(2021).
  33. Yang, Y., et al. A FERM domain autoregulates Drosophila myosin 7a activity. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (11), 4189-4194 (2009).
  34. Jorio, H., Tran, R., Kamen, A. Stability of serum-free and purified baculovirus stocks under various storage conditions. Biotechnol Prog. 22 (1), 319-325 (2006).
  35. JoVE Science Education Database. Separating protein with SDS-PAGE. Basic methods in cellular and molecular biology. , JoVE, Cambridge, MA. (2023).
  36. Mikolajczyk, J., et al. Small ubiquitin-related modifier (SUMO)-specific proteases: profiling the specificities and activities of human SENPs. J Biol Chem. 282 (36), 26217-26224 (2007).
  37. Pardee, J. D., Spudich, J. A. Purification of muscle actin. Methods Enzymol. 85 Pt B, 164-181 (1982).
  38. Aksel, T., Choe Yu, E., Sutton, S., Ruppel, K. M., Spudich, J. A. Ensemble force changes that result from human cardiac myosin mutations and a small-molecule effector. Cell Rep. 11 (6), 910-920 (2015).
  39. Bowser, R. M., Farman, G. P., Gregorio, C. C. Philament: A filament tracking program to quickly and accurately analyze in vitro motility assays. Biophys Rep. 4 (1), 100147(2024).
  40. Bird, J. E., et al. Chaperone-enhanced purification of unconventional myosin 15, a molecular motor specialized for stereocilia protein trafficking. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (34), 12390-12395 (2014).
  41. Billington, N., Wang, A., Mao, J., Adelstein, R. S., Sellers, J. R. Characterization of three full-length human nonmuscle myosin II paralogs. J Biol Chem. 288 (46), 33398-33410 (2013).
  42. Billington, N., et al. Myosin 18A coassembles with nonmuscle myosin 2 to form mixed bipolar filaments. Curr Biol. 25 (7), 942-948 (2015).
  43. Lu, W., et al. Competition between kinesin-1 and myosin-V defines Drosophila posterior determination. Elife. 9, 54216(2020).
  44. Liu, R., et al. A binding protein regulates myosin-7a dimerization and actin bundle assembly. Nat Commun. 12 (1), 563(2021).
  45. Heissler, S. M., Sellers, J. R. Myosin light chains: Teaching old dogs new tricks. Bioarchitecture. 4 (6), 169-188 (2014).
  46. Belyaev, A. S., Hails, R. S., Roy, P. High-level expression of five foreign genes by a single recombinant baculovirus. Gene. 156 (2), 229-233 (1995).
  47. Li, J., et al. Ca(2+)-induced rigidity change of the myosin VIIa IQ motif-single alpha helix lever arm extension. Structure. 25 (4), 579-591.e4 (2017).
  48. Persson, M., Bengtsson, E., ten Siethoff, L., Mansson, A. Nonlinear cross-bridge elasticity and post-power-stroke events in fast skeletal muscle actomyosin. Biophys J. 105 (8), 1871-1881 (2013).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Myosin 7a PurificationMultiBac SystemBiophysical CharacterizationHuman Myosin 7aActin Based MotorUsher SyndromeProtein ExpressionIn Vitro MotilityFluorescence MicroscopyMotor Protein Complex

Related Articles