Zautomatyzowana metoda mrużenia oczu dla zachowania synchronizacji czasu i dynamiki mózgu w badaniach bólu myszy

Summary

Ten protokół zapewnia metodę śledzenia automatycznego mrużenia oczu u gryzoni w czasie w sposób zgodny z blokowaniem czasu na pomiary neurofizjologiczne. Oczekuje się, że protokół ten będzie przydatny dla naukowców badających mechanizmy zaburzeń bólowych, takich jak migrena.

Abstract

Spontaniczny ból był trudny do śledzenia w czasie rzeczywistym i ilościowego określenia w sposób, który zapobiega ludzkim uprzedzeniom. Jest to szczególnie prawdziwe w przypadku wskaźników bólu głowy, takich jak zaburzenia takie jak migrena. Zez oka stał się ciągłą zmienną metryką, którą można mierzyć w czasie i jest skuteczna w przewidywaniu stanów bólowych w takich testach. W artykule przedstawiono protokół użycia DeepLabCut (DLC) do automatyzacji i ilościowego określania zeza oka (euklidesowej odległości między powiekami) u skrępowanych myszy z swobodnie obracającymi się ruchami głowy. Protokół ten umożliwia bezstronne określenie ilościowe zeza oka i bezpośrednie porównanie go z pomiarami mechanistycznymi, takimi jak neurofizjologia. Zapewniamy ocenę parametrów treningu AI niezbędnych do osiągnięcia sukcesu, zgodnie z definicją rozróżniania okresów zeza i bez zeza. Wykazujemy zdolność do niezawodnego śledzenia i różnicowania zeza w fenotypie podobnym do migreny wywołanym przez CGRP w rozdzielczości poniżej sekundy.

Introduction

Migrena jest jednym z najbardziej rozpowszechnionych zaburzeń mózgu na świecie, dotykającym ponad miliard ludzi¹. Przedkliniczne mysie modele migreny pojawiły się jako informacyjny sposób badania mechanizmów migreny, ponieważ badania te mogą być łatwiej kontrolowane niż badania na ludziach, umożliwiając w ten sposób badanie przyczynowe zachowań związanych z migreną². Takie modele wykazały silną i powtarzalną odpowiedź fenotypową na związki wywołujące migrenę, takie jak peptyd związany z genem kalcytoniny (CGRP). Utrzymuje się potrzeba solidnych pomiarów zachowań związanych z migreną w modelach gryzoni, zwłaszcza tych, które można połączyć z metrykami mechanistycznymi, takimi jak obrazowanie i podejścia elektrofizjologiczne.

Migrenowe stany mózgu charakteryzują się fenotypowo obecnością awersji do światła, allodynii łap, hiperalgezji twarzy na szkodliwe bodźce i grymasu twarzy³. Takie zachowania są mierzone całkowitym czasem spędzonym w świetle (awersja do światła) oraz progami wrażliwości na dotyk łap lub twarzy (allodynia łap i hiperalgezja twarzy) i są ograniczone do pojedynczego odczytu w dużych okresach czasu (minuty lub dłużej). Zachowania podobne do migreny mogą być wywoływane u zwierząt poprzez dawkowanie związków wywołujących migrenę, takich jak CGRP, naśladując objawy doświadczane przez pacjentów z migreną³ (tj. wykazując trafność twarzy). Takie związki wywołują również objawy migreny, gdy są podawane ludziom, co dowodzi trafności konstruktu tych modeli⁴. Badania, w których fenotypy behawioralne były osłabione farmakologicznie, doprowadziły do odkryć związanych z leczeniem migreny i dostarczają dalszego uzasadnienia tych modeli (tj. wykazując trafność predykcyjną)^5,6.

Na przykład, wykazano, że monoklonalne przeciwciało anty-CGRP (ALD405) zmniejsza zachowania awersyjne wobec światła⁵ i grymas twarzy u myszy ⁶ leczonych CGRP, a inne badania wykazały, że leki antagonistyczne CGRP zmniejszają zachowania podobne do migreny wywołane podtlenkiem azotu u zwierząt7^,8. Ostatnie badania kliniczne wykazały sukces w leczeniu migreny poprzez blokowanie CGRP^9,10, co prowadzi do powstania wielu zatwierdzonych przez FDA leków ukierunkowanych na CGRP lub jego receptor. Przedkliniczna ocena fenotypów związanych z migreną doprowadziła do przełomu w wynikach klinicznych i dlatego jest niezbędna do zrozumienia niektórych z bardziej złożonych aspektów migreny, które są trudne do bezpośredniego zbadania u ludzi.

Pomimo licznych zalet, eksperymenty wykorzystujące te odczyty behawioralne migreny u gryzoni są często ograniczone w ich możliwościach próbkowania punktów czasowych i mogą być subiektywne i podatne na ludzkie błędy eksperymentalne. Wiele testów behawioralnych ma ograniczoną zdolność do uchwycenia aktywności w bardziej precyzyjnych rozdzielczościach czasowych, co często utrudnia uchwycenie bardziej dynamicznych elementów, które występują w skali czasowej poniżej sekundy, takich jak poziom aktywności mózgu. Okazało się, że trudno jest określić ilościowo bardziej spontaniczne, naturalnie występujące elementy zachowania w czasie przy znaczącej rozdzielczości czasowej dla badania mechanizmów neurofizjologicznych. Stworzenie sposobu na identyfikację aktywności podobnej do migreny w szybszych skalach czasowych pozwoliłoby na zewnętrzną walidację stanów mózgu podobnych do migreny. To z kolei może być zsynchronizowane z aktywnością mózgu, aby stworzyć bardziej solidne profile aktywności mózgu migreny.

Jeden z takich fenotypów związanych z migreną, grymas na twarzy, jest używany w różnych kontekstach jako pomiar bólu u zwierząt, który może być mierzony natychmiast i śledzony w czasie¹¹. Grymas twarzy jest często używany jako wskaźnik spontanicznego bólu w oparciu o ideę, że ludzie (zwłaszcza ludzie niewerbalni) i inne gatunki ssaków wykazują naturalne zmiany w wyrazie twarzy podczas odczuwania bólu¹¹. W badaniach mierzących grymas twarzy jako wskaźnik bólu u myszy w ciągu ostatniej dekady wykorzystano skale, takie jak Skala Grymasu Myszy (MGS), aby ujednolicić charakterystykę bólu u gryzoni¹². Zmienne wyrazu twarzy MGS obejmują zaostrzenie oczodołu (zez), wybrzuszenie nosa, wybrzuszenie policzka, ułożenie uszu i zmianę wąsów. Mimo że wykazano, że MGS niezawodnie charakteryzuje ból u zwierząt¹³, jest notorycznie subiektywny i opiera się na dokładnej punktacji, która może się różnić w zależności od eksperymentatora. Ponadto MGS jest ograniczony, ponieważ wykorzystuje nieciągłą skalę i brakuje mu rozdzielczości czasowej potrzebnej do śledzenia naturalnie występujących zachowań w czasie.

Jednym ze sposobów walki z tym jest obiektywne określenie ilościowe spójnych cech twarzy. Zez jest najbardziej konsekwentnie śledzoną cechą twarzy⁶. Zez odpowiada za większość całkowitej zmienności danych, gdy uwzględnia się wszystkie zmienne MGS (zez, wybrzuszenie nosa, wybrzuszenie policzka, pozycja ucha i zmiana wąsów)⁶. Ponieważ mruz oka ma największy wpływ na ogólny wynik uzyskany za pomocą MGS i niezawodnie śledzi odpowiedź na CGRP^6,14, jest to najbardziej niezawodny sposób śledzenia spontanicznego bólu w modelach myszy migrenowych. To sprawia, że mrużenie oczu jest wymiernym zachowaniem niehomeostatycznym wywołanym przez CGRP. Kilka laboratoriów wykorzystało cechy mimiki twarzy, w tym zeza, do przedstawienia potencjalnego spontanicznego bólu związanego z migreną^6,15.

Pozostało kilka wyzwań związanych z przeprowadzaniem automatycznych skanów w sposób, który można połączyć z mechanistycznymi badaniami migreny. Na przykład trudno było niezawodnie śledzić zeza bez polegania na ustalonej pozycji, która musi być kalibrowana w ten sam sposób podczas wszystkich sesji. Kolejnym wyzwaniem jest możliwość przeprowadzania tego typu analiz w skali ciągłej, a nie w skali dyskretnej, jak w MGS. Aby złagodzić te wyzwania, naszym celem było zintegrowanie uczenia maszynowego w postaci DeepLabCut (DLC) z naszym procesem analizy danych. DLC to model uczenia maszynowego do szacowania pozycji, opracowany przez Mathisa i współpracowników, który został zastosowany do szerokiego zakresu zachowań¹⁶. Korzystając z ich oprogramowania do szacowania pozycji, byliśmy w stanie wytrenować modele, które potrafiły dokładnie przewidywać punkty na oku myszy z dokładnością zbliżoną do ludzkiej. Rozwiązuje to problemy z powtarzającym się ręcznym ocenianiem, jednocześnie drastycznie zwiększając rozdzielczość czasową. Co więcej, tworząc te modele, stworzyliśmy powtarzalne metody do oceniania, mrużenia oczu i szacowania aktywności mózgu podobnej do migreny w większych grupach eksperymentalnych. W tym miejscu przedstawiamy rozwój i walidację tej metody śledzenia zachowań zeza w sposób, który można zablokować w czasie z innymi pomiarami mechanistycznymi, takimi jak neurofizjologia. Nadrzędnym celem jest katalizowanie badań mechanistycznych wymagających ograniczonych czasowo zachowań zeza w modelach gryzoni

.

Protocol

UWAGA: Wszystkie zwierzęta wykorzystane w tych eksperymentach były traktowane zgodnie z protokołami zatwierdzonymi przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) Uniwersytetu Iowa.

1. Przygotuj sprzęt do zbierania danych

1. Upewnij się, że wszystkie niezbędne sprzęty są dostępne: upewnij się, że zalecany sprzęt do uruchamiania DLC ma co najmniej 8 GB pamięci. Zobacz Spis materiałów, aby uzyskać informacje dotyczące sprzętu i oprogramowania.
   UWAGA: Dane mogą być zbierane w dowolnym formacie, ale przed analizą muszą zostać przekonwertowane do formatu możliwego do odczytania przez DLC. Najpopularniejsze formaty to AVI i MP4.
2. Skonfiguruj co najmniej jedną kamerę tak, aby można było wykryć jedno oko zwierzęcia. Jeśli oba oczy są widoczne, wykonaj dodatkowe filtrowanie, ponieważ może to spowodować zakłócenia w śledzeniu. Przykład takiego filtrowania dla podanych tutaj danych znajduje się w sekcji 10.
3. Zainstaluj DLC, korzystając z pakietu znajdującego się na stronie Deeplabcut.github.io/DeepLabCut/docs/installation.
4. W konfiguracji kamery dołącz pojedynczą kamerę pod kątem bocznym (~90°) do myszy. Aby podążać za tym przykładem, próbkuj z częstotliwością 10 Hz, przy czym myszy są skrępowane, ale mają swobodny dostęp do pełnego zakresu ruchów głowy w stosunku do ciała. Zachowaj odległość od 2 do 4 cali od aparatu do zwierzęcia.

2. Konfiguracja DLC

1. Po zainstalowaniu DLC stwórz środowisko, w którym będziesz pracować. Aby to zrobić, przejdź do folderu, do którego zostało pobrane oprogramowanie DLC, korzystając z katalogu zmian za pomocą następującego polecenia.
   cd folder_name
   UWAGA: W tym miejscu znajduje się plik DEEPLABCUT.yaml.
2. Uruchom pierwsze polecenie, aby utworzyć środowisko i włącz je, wpisując drugie polecenie.
   conda env create -f DEEPLABCUT.yaml
   conda aktywuj Deeplabcut
   UWAGA: Upewnij się, że środowisko jest aktywowane przed każdym użyciem DLC.
   Po aktywacji środowiska otwórz graficzny interfejs użytkownika (GUI) za pomocą następującego polecenia i rozpocznij tworzenie modelu.
   python -m deeplabcut

3. Utwórz model

1. Po otwarciu GUI rozpocznij tworzenie modelu, klikając Utwórz nowy projekt na dole.
2. Nazwij projekt czymś znaczącym i unikalnym, aby zidentyfikować go później, a następnie wprowadź nazwę jako eksperymentator. Sprawdź sekcję Lokalizacja, aby zobaczyć, gdzie projekt zostanie zapisany.
3. Wybierz pozycję Przeglądaj foldery i znajdź filmy wideo, aby wytrenować model. Wybierz opcję Kopiuj filmy do folderu projektu, jeśli filmy wideo nie mają być przenoszone z ich oryginalnego katalogu.
4. Wybierz pozycję Utwórz, aby wygenerować nowy projekt na komputerze.
   UWAGA: Filmy muszą obejmować pełen zakres zachowań, które będziesz obserwować (tj. mrużenie oczu, brak zeza i wszystkie zachowania pomiędzy). Model będzie w stanie rozpoznać tylko zachowanie podobne do tego w danych treningowych, a jeśli brakuje niektórych składników zachowania, model może mieć problemy z jego rozpoznaniem.

4. Konfiguracja ustawień

UWAGA: To jest miejsce, w którym można zdefiniować szczegóły, takie jak to, co wskazuje na śledzenie, ile klatek należy wyodrębnić z każdego filmu szkoleniowego, domyślny rozmiar kropki etykiety i zmienne związane z tym, jak model będzie trenował.

1. Po utworzeniu modelu edytuj ustawienia konfiguracji, wybierając pozycję Edytuj config.yaml. Wybierz opcję Edytuj, aby otworzyć plik ustawień konfiguracyjnych w celu określenia kluczowych ustawień związanych z modelem.
2. Zmodyfikuj części ciała, aby uwzględnić wszystkie części oka do śledzenia, a następnie zmodyfikuj numframes2pick na liczbę klatek potrzebnych na film szkoleniowy, aby uzyskać łącznie 400 klatek. Na koniec zmień rozmiar kropki na sześć, aby domyślny rozmiar podczas etykietowania był wystarczająco mały, aby można go było dokładnie umieścić wokół krawędzi oka.

5. Wyodrębnij ramki treningowe

1. Po skonfigurowaniu przejdź do karty Wyodrębnij ramki w górnej części graficznego interfejsu użytkownika i wybierz pozycję Wyodrębnij ramki w prawym dolnym rogu strony.
2. Monitoruj postęp za pomocą paska ładowania u dołu graficznego interfejsu użytkownika.

6. Etykietowanie ramek treningowych

1. Przejdź do zakładki Etykiety ramek w graficznym interfejsie użytkownika i wybierz opcję Oznacz ramki. Znajdź nowe okno, w którym wyświetlane są foldery dla każdego z wybranych filmów szkoleniowych. Wybierz pierwszy folder, a otworzy się nowy graficzny interfejs użytkownika etykietowania.
2. Oznacz punkty zdefiniowane podczas konfiguracji dla każdej klatki wybranego wideo. Po oznaczeniu wszystkich klatek zapisz je i powtórz proces dla następnego filmu.
3. Aby odpowiednio oznaczyć zeza, użyj dwóch punktów jak najbliżej największego szczytu oka (środka) i wskaż pozycje góra/dół dla każdego punktu. Przybliżony zez jako średnia z tych dwóch długości.
   UWAGA: Podczas oznaczania DLC nie zapisuje automatycznie postępów. Zaleca się okresowe zapisywanie, aby uniknąć utraty danych oznaczonych etykietami.

7. Tworzenie zestawu danych treningowych

1. Po ręcznym etykietowaniu przejdź do karty Train network (Trenowanie sieci) i wybierz pozycję Train network (Trenowanie sieci), aby wyświetlić monit o rozpoczęcie trenowania modelu.
2. Monitoruj postęp w oknie poleceń.

8. Oceń sieć

1. Po zakończeniu trenowania sieci przejdź do karty Ocena sieci i wybierz pozycję Oceń sieć. Poczekaj chwilę, aż niebieskie kółko ładowania zniknie, wskazując, że zakończył się samoocena i model jest gotowy do użycia.

9. Analizuj dane/generuj filmy oznaczone etykietami

1. Aby przeanalizować filmy wideo, przejdź do karty Analizuj filmy . Wybierz pozycję Dodaj więcej filmów i wybierz filmy wideo do analizy.
2. Wybierz opcję Zapisz wyniki jako plik csv, jeśli dane wyjściowe w formacie csv są wystarczające.
3. Po pobraniu wszystkich filmów wybierz pozycję Analizuj filmy u dołu, aby rozpocząć analizę filmów.
   UWAGA: ten krok należy wykonać przed wygenerowaniem filmów oznaczonych etykietami w kroku 9.5
4. Po przeanalizowaniu filmów przejdź do karty Utwórz filmy i wybierz analizowane filmy.
5. Wybierz opcję Utwórz filmy, a oprogramowanie rozpocznie generowanie filmów wideo oznaczonych etykietami, które reprezentują dane wyświetlane w odpowiednim .csv.

10. Przetwarzanie danych końcowych

1. Zastosuj makra znajdujące się na stronie https://research-git.uiowa.edu/rainbo-hultman/facial-grimace-dlc, aby przekonwertować surowe dane na format używany do tej analizy (tj. odległość euklidesowa).
2. Zaimportuj i zastosuj makra oznaczone etykietami Krok 1 i Krok 2 do pliku CSV, aby odfiltrować wszystkie nieoptymalne punkty danych i przekonwertować dane na uśrednioną odległość euklidesową dla najbardziej środkowych punktów u góry i u dołu oka.
3. Uruchom makro o nazwie Krok 3, aby oznaczyć każdy punkt jako 0 bez zeza i 1 zez na podstawie wartości progowej w skrypcie, która jest ustawiona na 75 pikseli.
   UWAGA: Parametry tych makr mogą wymagać dostosowania w zależności od konfiguracji eksperymentalnej (patrz dyskusja). Próg zeza i automatyczny filtr dla maksymalnej wartości oka to parametry, które mogą się zmieniać w zależności od wielkości zwierzęcia i odległości od kamery. Można również dostosować wartości używane do usuwania nieoptymalnych punktów w zależności od tego, jak selektywnie dane mają być filtrowane.

Results

Tutaj oferujemy metodę niezawodnego wykrywania zeza w wysokiej rozdzielczości czasowej za pomocą DeepLabCut. Zoptymalizowaliśmy parametry treningu i zapewniamy ocenę mocnych i słabych stron tej metody (Rysunek 1).

Po przeszkoleniu naszych modeli, sprawdziliśmy, że są one w stanie poprawnie oszacować górne i dolne punkty powieki (Rysunek 2), które służą jako punkty współrzędnych dla euklidesowej miary odległości. Odległość euklidesowa jest definiowana jako średnia długość odległości między dwoma górnymi i dolnymi punktami oka. Nasz model był w stanie wykryć przypadki zeza bez zeza (Rysunek 2A) i zez (Rysunek 2B). Niebieskie kropki wskazują punkty używane do określania odległości euklidesowej dla każdej klatki. Zielone, żółte, pomarańczowe i fioletowe kropki zostały użyte, aby pomóc modelowi w prawidłowym oszacowaniu odległości euklidesowej i zmniejszeniu wartości prawdopodobieństwa, gdy głowa znajduje się w nieoptymalnej pozycji (tj. biorąc pod uwagę ruchy głowy i zmiany pozycji w trakcie sesji). Następnie sprawdziliśmy dokładność modelu przy użyciu wielu różnych metod.

Aby sprawdzić idealną liczbę ramek używanych w modelu, wytrenowaliśmy i przetestowaliśmy cztery modele o różnych rozmiarach ramek próbki (Rysunek 3). Najpierw porównaliśmy wartości błędu średniokwadratowego (RMSE) między danymi testowymi i treningowymi, aby sprawdzić, jak dobrze modele mogą dokładnie przewidywać dane testowe, na których nie zostały wytrenowane. To porównanie pokazało, że zmienność między punktami oznaczonymi ręcznie a punktami oznaczonymi modelem wyrównała się po 300 klatkach. Trend ten korelował ze średnimi raportowanymi prawdopodobieństwami, które również wydawały się stabilizować po 300 oznaczonych klatekach. Użyliśmy tych zgłoszonych wartości prawdopodobieństwa, aby odfiltrować punkty, które były mniejsze niż 0,92. Te wartości prawdopodobieństwa wskazują, jak pewny jest model, że dany punkt został poprawnie oznaczony na podstawie danych treningowych. Uśredniliśmy te wartości dla punktów, które składają się na metrykę odległości euklidesowej, aby zbadać, jak dobrze modele działały względem siebie. Chociaż nie było znaczącej różnicy między 300 a 400 klatkami, użyliśmy 400 klatek, ponieważ średnia wartość prawdopodobieństwa przekraczała 0,95, co zbliża się do naszego progu ręcznego filtrowania i jest zgodna z progiem stosowanym w podobnych modelach do szacowania pozycji¹⁶.

Innym sposobem, w jaki sprawdziliśmy dokładność modelu, było porównanie ręcznie opisanych ramek z ramkami oznaczonymi DLC. Dwie niewidome osoby ręcznie opisały 300 klatek tego samego oka w ośmiu filmach. Wykorzystaliśmy te dane do skonstruowania macierzy pomyłek do oceny wyników prawdziwie i fałszywie dodatnich i ujemnych (Rysunek 4), w której ręcznie ocenione dane zostały użyte jako prawda podstawowa. W przypadku DLC dodatnia wartość zeza została zarejestrowana, gdy odległość euklidesowa została zarejestrowana jako mniejsza niż 75 pikseli (tj. zwierzę mruży oczy), a wartość ujemna została zarejestrowana dla wartości większych niż 75 pikseli (tj. zwierzę nie mruży oczu). Znaleźliśmy dodatnią wartość predykcyjną wynoszącą 96,96%, czyli procent czasu, w którym model dokładnie przewiduje zez w stosunku do ręcznie opisanego zeza. Znaleźliśmy ujemną wartość predykcyjną wynoszącą 99,66%, czyli procent czasu, w którym model dokładnie przewiduje brak zeza w stosunku do ręcznie opisanego zeza. Pokazują one proporcję wartości ujemnych i dodatnich, które zostały poprawnie oznaczone. Znaleźliśmy również wskaźnik prawdziwie dodatni wynoszący 98,1% i wskaźnik prawdziwie ujemny wynoszący 99,46%, które reprezentują dokładne przewidywanie wartości dodatnich i ujemnych w stosunku do wszystkich wartości dodatnich i ujemnych odpowiednio. Nasz współczynnik korelacji Matthewsa, czyli MCC, wynosił 93,8%, co wskazuje na współczynnik korelacji między wartościami obserwowanymi i przewidywanymi.

Gdy byliśmy pewni, że nasz model niezawodnie śledzi zeza, porównaliśmy tę metodę DLC z poprzednio opublikowaną metodą śledzenia zeza przy użyciu przedklinicznego zestawu danych dotyczących migreny¹⁴. Tę drugą metodę będziemy nazywać "modelem zeza obszarowego (ASM)", ponieważ została ona opracowana przy użyciu otwartego obszaru oka jako ciągłej zmiennej mierzącej zeza¹⁴. Model zeza obszaru wykorzystuje wyszkolone oprogramowanie do wykrywania twarzy w połączeniu z niestandardowym skryptem MATLAB do analizy średniego obszaru pikseli oka, wykluczając klatki ze wskaźnikiem błędów śledzenia >15%¹⁴. Jednym z głównych ograniczeń jest to, że "ASM" nie jest open source, a zatem nie jest powszechnie dostępny. DLC pozwala na zwiększoną optymalizację i adaptację bez konieczności znacznego zakupu oprogramowania i sprzętu.

Użyliśmy zestawu danych 10 samic i 10 samców myszy CD1. Eksperymentalnie wszystkie zwierzęta były aklimatyzowane w delikatnych ograniczeniach przez 30 minut przez łącznie 3 dni przed rozpoczęciem nagrań. Każde zwierzę było rejestrowane przez 5 minut w stosunku do wartości wyjściowej, a następnie 5 minut w przypadku zapisów leczenia. Podczas sesji terapeutycznych zwierzętom podawano dootrzewnowo PBS (nośnik) lub 0,1 mg/kg CGRP (leczenie) w celu wywołania stanu podobnego do migreny. Dane zostały zebrane w dobrze oświetlonym pomieszczeniu za pomocą kamer wyposażonych w światło podczerwone do oświetlania twarzy, zapewniając dokładne wykrywanie punktów orientacyjnych. W skład kamery termowizyjnej wchodził obiektyw Kowa LM35JC 2/3" 35 mm F1.6 z manualną przysłoną C-mount o ogniskowej 254 mm i odpowiednio wyregulowanej przysłonie. Po zebraniu danych wykorzystaliśmy ASM i DLC do analizy danych. Ponieważ ręczna ocena była tradycyjnie wykorzystywana w terenie do ilościowego określania grymasu twarzy, przy czym zez był jednym ze składników grymasu twarzy¹⁴, porównaliśmy również nasze dane z danymi ocenianymi ręcznie.

Na podstawie wcześniejszych ustaleń, że obwodowe wstrzyknięcie CGRP wywołuje reakcję zeza u myszy, spodziewaliśmy się zaobserwować znaczące różnice w reakcji na zeza między nośnikiem a leczeniem CGRP^6,14. Porównaliśmy metody ASM, ręczne i DLC i stwierdziliśmy, że nasz model solidnie wykrył fenotyp zeza, podobnie jak metody ręczne i ASM (Rysunek 5). Należy zauważyć, że model ASM został wykorzystany do oceny bólu i zeza wywołanego CGRP. W tym badaniu Rea i wsp. porównali reakcję zeza po CGRP z reakcją zeza po wstrzyknięciu formaliny do tylnej łapy jako "bardziej tradycyjny" test indukcji bólu¹⁴. Co więcej, CGRP jest dobrze udokumentowane jako indukujące nadwrażliwość na dotyk u myszy za pomocą von Frey^3,17. Zgodnie z terenem, znormalizowaliśmy średni zez podczas sesji terapeutycznej do 5-minutowej wartości wyjściowej przed leczeniem dla każdego zwierzęcia i porównaliśmy zwierzęta PBS (n = 10) z CGRP (n = 11). Analizy statystyczne grup PBS w porównaniu z grupami leczonymi CGRP są następujące. Odkryliśmy, że zwierzęta poddane działaniu CGRP wykazywały zmniejszoną średnią powierzchnię pikseli przy użyciu metody śledzenia obszaru zeza (p = 0,012, Rysunek 5A) i wykazywały zmniejszoną odległość euklidesową po ręcznej ocenie (p = 0,0007, Rysunek 5B) i przy użyciu naszego modelu DLC (p = 0,007, Rysunek 5C). Kiedy porównaliśmy każdą metodę w czasie u jednego reprezentatywnego zwierzęcia, zaobserwowano ten sam wzorzec (Rysunek 5). Zwierzę to wykazywało bardzo wyraźny fenotyp zeza w odpowiedzi na leczenie CGRP, ale nie na PBS. Wszystkie modele były w stanie wykryć te różnice, ale dane były najwyraźniej reprezentowane w naszym modelu DLC (Rysunek 5). Precyzyjne i dokładne wskaźniki są szczególnie ważne, gdy dane muszą być analizowane w dokładniejszych rozdzielczościach, w których uśrednianie nie wskazuje na pełny odczyt behawioralny (np. aktywność mózgu). Metoda DLC wykrywania zeza u myszy pozwala nam zbierać dane w milisekundowej skali czasowej i blokować je czasowo do pomiarów aktywności mózgu (np. lokalnych potencjałów pola), co zachodzi w milisekundowej skali czasowej. Następnie możemy wykorzystać tę technikę do zbudowania bardziej solidnego profilu stanu mózgu wskazującego na spontaniczny ból w kontekście migreny i innych złożonych zaburzeń mózgu.

Rysunek 1: Przegląd procedury generowania wyszkolonej sieci z DLC. Ogólny schemat procesu, w którym cechy oczu zwierzęcia są śledzone, a następnie analizowane za pomocą uczenia maszynowego. Skrót: DLC = DeepLabCut. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Przykład automatycznego śledzenia mrużenia oczu w reprezentatywnej myszy CD1. (A) Przykład ramki przedstawiającej śledzenie DLC zeza (kolorowe kropki) na konturze oka w dniu leczenia, gdy mysz nie mruży oczu. (B) Przykład klatki przedstawiającej automatyczne wykrywanie zeza w dniu zabiegu, przy użyciu naszego modelu DLC. Odległość euklidesowa została zmierzona za pomocą średniej odległości między B i C, niebieskimi kropkami, na górze i na dole oka. Niebieskie zestawy kropek na górze i na dole oka są używane podczas śledzenia odległości euklidesowej. Pozostałe punkty (zielony, żółty, pomarańczowy, fioletowy) to punkty orientacyjne ramowe, które pomagają modelowi oszacować euklidesowe punkty odległości i odfiltrować nieoptymalne ułożenie głowy po zebraniu danych. Skrót: DLC = DeepLabCut. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Uzasadnienie liczby klatek używanych do trenowania modelu. (A) Analiza błędu średniokwadratowego wskazuje średnią odległość między wartościami przewidywanymi a obserwowanymi dla zbiorów danych testowych i kolejowych. Zestaw danych treningowych reprezentuje ramki próbkowane podczas trenowania modelu, a zestaw danych testowych reprezentuje ramki niezwiązane z trenowaniem używane do sprawdzania, jak dobrze model może identyfikować podobne, ale różne obrazy. Użyliśmy pięciu zestawów danych treningowych i testowych i stwierdziliśmy, że wartości RMSE wyrównały się około 300 klatek dla grupy testowej. (B) Prawdopodobieństwo, że dany punkt jest poprawnie oznaczony (średnia + SEM). Okazało się, że 400 ręcznie oznaczonych ramek było idealnych, ponieważ surowe zestawy danych miały średnio ponad 0,95 prawdopodobieństwa, a jednocześnie miały wynik RMSE najbliższy wynikowi danych treningowych. Oznaczało to, że model był w stanie dokładnie przybliżyć punkty, na których został wytrenowany, a jednocześnie raportować większość klatek z dużym prawdopodobieństwem. Skrót: RMSE = błąd średniokwadratowy. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4: Macierz pomyłek dla pomiarów zeza DLC. Pobraliśmy próbki 300 s z ośmiu filmów (pięć CGRP i trzy PBS) i porównaliśmy te punkty z ręcznie oznaczonym binarnym wynikiem tak lub nie dla zeza. Określiliśmy ilościowo przewidywane wartości jako te zidentyfikowane przez DLC, a rzeczywiste wartości jako te ocenione ręcznie przez człowieka. Następnie porównaliśmy to z ręcznie ocenianymi danymi, aby zobaczyć, jak często zez był prawidłowo identyfikowany w stosunku do ręcznie ocenianego binarnego tak lub nie zeza. Skróty: DLC = DeepLabCut; CGRP = peptyd związany z genem kalcytoniny; PBS = sól fizjologiczna buforowana fosforanami; TP = wyniki prawdziwie dodatnie; FP = wyniki fałszywie dodatnie; FN = wyniki fałszywie ujemne; TN = wartości prawdziwie ujemne; PPV = dodatnia wartość predykcyjna; NPV = ujemna wartość predykcyjna; TPR = wskaźnik prawdziwie dodatni; TNR = wskaźnik prawdziwie ujemny; MCC = współczynnik korelacji Mateusza. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 5: Fenotyp zeza w trzech różnych modelach wykrywania zeza. Dwa górne rzędy zawierają to samo reprezentatywne zwierzę z każdym warunkiem (PBS lub CGRP) w trzech różnych modelach wykrywania zeza. Dolny wiersz odzwierciedla średnie dla wszystkich zwierząt. (A) Nastąpił spadek średniej powierzchni pikseli (średnia ogólna powierzchnia piksela / linia wyjściowa) u myszy traktowanych CGRP w porównaniu z myszami traktowanymi PBS (t(18) = 2,805, p = 0,012) po przetworzeniu wszystkich danych przy użyciu wcześniej opublikowanego i zwalidowanego modelu zeza obszarowego¹⁴. (B) Podobna odpowiedź wystąpiła w danych ocenianych ręcznie (t(18) = 4,064, p = 0,0007). (C) Myszy leczone CGRP wykazywały zmniejszoną średnią odległość od powieki do powieki (odległość euklidesowa / odległość euklidesowa przed leczeniem, wartość wyjściowa) niż myszy leczone PBS (t (18) = 3,040, p = 0,007 przy użyciu DLC do przetwarzania wszystkich danych. N = 20 (10 samic, 10 mężczyzn). Słupki błędów wskazują średnią ± SEM. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Discussion

Protokół ten zapewnia łatwo dostępną, dogłębną metodę korzystania z narzędzi opartych na uczeniu maszynowym, które mogą rozróżniać zeza z dokładnością zbliżoną do ludzkiej, zachowując tę samą (lub lepszą) rozdzielczość czasową poprzednich podejść. Przede wszystkim sprawia, że ocena automatycznego zeza jest łatwiej dostępna dla szerszego grona odbiorców. Nasza nowa metoda oceny automatycznego zeza ma kilka ulepszeń w porównaniu z poprzednimi modelami. Po pierwsze, zapewnia bardziej solidną metrykę niż ASM, wykorzystując mniej punktów, które faktycznie przyczyniają się do kwantyfikacji zeza. Zmniejsza to prawdopodobieństwo wyników fałszywie dodatnich i ujemnych, ponieważ analiza opiera się na mniejszej liczbie punktów podczas generowania wartości oznaczających zeza. Innymi słowy, model DLC sprawia, że każdy punkt wokół oka jest niezbędny, ale niewystarczający do uwzględnienia punktu czasowego. Dzięki temu możemy filtrować nieoptymalne dane przy użyciu tej samej liczby punktów co ASM bez konieczności polegania na większej zmienności wynikającej z polegania na tak wielu punktach składowych. Dodatkowo ograniczyliśmy potencjalny błąd ludzki, projektując modele, które nie polegają całkowicie na dokładności przeszkolonych osób.

Podczas przetwarzania danych stwierdziliśmy, że nasza metoda dokładnie filtrowała punkty nieoptymalne i punkty odstające, które były większe niż było to możliwe, biorąc pod uwagę maksymalny rozmiar oka myszy (sekcja 10 protokołu). Wykorzystaliśmy makra, które sprawdzały, czy każdy z 10 punktów otaczających oko z osobna miały wartość prawdopodobieństwa większą niż 0,92 i filtrowaliśmy je poniżej tej wartości. W przyszłości można to dostosować tak, aby przetwarzane dane były mniej lub bardziej selektywne. Makra przefiltrowały również wszelkie wartości odległości euklidesowej większe niż 200 pikseli, ponieważ odkryliśmy, że największa możliwa odległość między górną a dolną częścią oka wynosiła 150 pikseli. Może to wymagać zmiany w zależności od konfiguracji eksperymentalnej. Jeśli kamera nie znajduje się w tej samej odległości od oka, maksymalna wartość może być znacznie większa lub mniejsza. Siłą tych makr jest to, że pozwoliły nam wyodrębnić pomiary między górną i dolną częścią oka w sposób, który był zależny od modelu zgłaszającego większe prawdopodobieństwo dla wszystkich punktów składowych otaczających oko.

Zarówno DLC, jak i ASM są ograniczone, ponieważ polegają na tym, że mysz znajduje się w stałej pozycji w określonej odległości od kamery, aby umożliwić spójne skalowanie powiększenia między warunkami wyjściowymi a warunkami leczenia. W związku z tym ruch samego zwierzęcia, nieprawidłowe ułożenie w aparacie lub zmiana procedury eksperymentalnej zagroziłyby zdolności modelu do wykrycia całkowitej powierzchni oka. Nasz model nieco poprawia te ograniczenia, wykorzystując odległość euklidesową, czyli odległość w górę i w dół długości oka, co pozwala na lepsze śledzenie pomimo różnic w kątach kamery, ruchu zwierzęcia i zmienności eksperymentalnej w różnych sesjach bez konieczności dodatkowej ponownej kalibracji. Zdajemy sobie jednak sprawę, że poprawa normalizacji w celu uwzględnienia ruchów głowy może skutkować jeszcze lepszym śledzeniem zeza u poruszających się zwierząt.

Innym ograniczeniem naszej metody jest to, że odfiltrowała ona punkty, w których odległość euklidesowa zbliżała się do zera, co oznaczało zamknięcie oka. Pomimo filtrowania tych istotnych czynników przyczyniających się do zeza, nadal byliśmy w stanie wykryć reakcję zeza wywołaną przez CGRP bardziej solidnie niż poprzednie metody (p = 0,007). Usunięcie tego składnika zeza staje się szczególnie ograniczające, gdy próbujesz porównać go z dodatkowymi punktami zainteresowania, takimi jak aktywność mózgu. Uważamy, że znalezienie znaczenia podczas usuwania tych punktów pokazuje solidność tej metody, ale przyznajemy, że usunięcie tych składników zeza nie jest idealne. Przyszłe badania wykorzystujące tę metodę powinny obejmować większą liczbę ramek odstających, aby lepiej trenować modele w rozpoznawaniu zeza, gdy zbliża się do zera. Ogólnie rzecz biorąc, opracowanie metody niezawodnego śledzenia automatycznego zeza może umożliwić badania mające na celu powiązanie ważnych cech naturalnie występującego zachowania ze stanem mózgu, co pozwoli na solidne badanie profili aktywności mózgu, np. w kontekście migreny.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Zestaw narzędzi CUDA 11.8
cuDNN SDK 8.6.0
Komputery Intel z systemem Windows 11, 13. generacji
Dodatkowy moduł LabFaceX 2D Eyelid Tracker do myszy swobodnie wędrującej:	FaceX LLC	NA	Każda kamera, która może nagrywać oko zwierzęcia, jest wystarczająca, ale to jest nasz sprzęt do śledzenia oczu.
Sterownik karty graficznej NVIDIA w wersji 450.80.02 lub nowszej
NVIDIA RTX A5500, 24 GB DDR6	NVIDIA[	490-BHXV]	Wystarczy dowolny procesor graficzny, który spełnia minimalne wymagania określone dla Twojej wersji DLC, obecnie 8 GB. Użyliśmy karty graficznej NVIDIA GeForce RTX 3080 Ti
Python 3.9-3.11
TensorFlow w wersji 2.10