Ten protokół zapewnia metodę śledzenia automatycznego mrużenia oczu u gryzoni w czasie w sposób zgodny z blokowaniem czasu na pomiary neurofizjologiczne. Oczekuje się, że protokół ten będzie przydatny dla naukowców badających mechanizmy zaburzeń bólowych, takich jak migrena.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Zautomatyzowana metoda mrużenia oczu dla zachowania synchronizacji czasu i dynamiki mózgu w badaniach bólu myszy
* These authors contributed equally
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Spontaniczny ból był trudny do śledzenia w czasie rzeczywistym i ilościowego określenia w sposób, który zapobiega ludzkim uprzedzeniom. Jest to szczególnie prawdziwe w przypadku wskaźników bólu głowy, takich jak zaburzenia takie jak migrena. Zez oka stał się ciągłą zmienną metryką, którą można mierzyć w czasie i jest skuteczna w przewidywaniu stanów bólowych w takich testach. W artykule przedstawiono protokół użycia DeepLabCut (DLC) do automatyzacji i ilościowego określania zeza oka (euklidesowej odległości między powiekami) u skrępowanych myszy z swobodnie obracającymi się ruchami głowy. Protokół ten umożliwia bezstronne określenie ilościowe zeza oka i bezpośrednie porównanie go z pomiarami mechanistycznymi, takimi jak neurofizjologia. Zapewniamy ocenę parametrów treningu AI niezbędnych do osiągnięcia sukcesu, zgodnie z definicją rozróżniania okresów zeza i bez zeza. Wykazujemy zdolność do niezawodnego śledzenia i różnicowania zeza w fenotypie podobnym do migreny wywołanym przez CGRP w rozdzielczości poniżej sekundy.
Wprowadzenie
Migrena jest jednym z najbardziej rozpowszechnionych zaburzeń mózgu na świecie, dotykającym ponad miliard ludzi1. Przedkliniczne mysie modele migreny pojawiły się jako informacyjny sposób badania mechanizmów migreny, ponieważ badania te mogą być łatwiej kontrolowane niż badania na ludziach, umożliwiając w ten sposób badanie przyczynowe zachowań związanych z migreną2. Takie modele wykazały silną i powtarzalną odpowiedź fenotypową na związki wywołujące migrenę, takie jak peptyd związany z genem kalcytoniny (CGRP). Utrzymuje się potrzeba solidnych pomiarów zachowań związanych z migreną w modelach gryzoni, zwłaszcza tych, które można połączyć z metrykami mechanistycznymi, takimi jak obrazowanie i podejścia elektrofizjologiczne.
Migrenowe stany mózgu charakteryzują się fenotypowo obecnością awersji do światła, allodynii łap, hiperalgezji twarzy na szkodliwe bodźce i grymasu twarzy3. Takie zachowania są mierzone całkowitym czasem spędzonym w świetle (awersja do światła) oraz progami wrażliwości na dotyk łap lub twarzy (allodynia łap i hiperalgezja twarzy) i są ograniczone do pojedynczego odczytu w dużych okresach czasu (minuty lub dłużej). Zachowania podobne do migreny mogą być wywoływane u zwierząt poprzez dawkowanie związków wywołujących migrenę, takich jak CGRP, naśladując objawy doświadczane przez pacjentów z migreną3 (tj. wykazując trafność twarzy). Takie związki wywołują również objawy migreny, gdy są podawane ludziom, co dowodzi trafności konstruktu tych modeli4. Badania, w których fenotypy behawioralne były osłabione farmakologicznie, doprowadziły do odkryć związanych z leczeniem migreny i dostarczają dalszego uzasadnienia tych modeli (tj. wykazując trafność predykcyjną)5,6.
Na przykład, wykazano, że monoklonalne przeciwciało anty-CGRP (ALD405) zmniejsza zachowania awersyjne wobec światła5 i grymas twarzy u myszy 6 leczonych CGRP, a inne badania wykazały, że leki antagonistyczne CGRP zmniejszają zachowania podobne do migreny wywołane podtlenkiem azotu u zwierząt7,8. Ostatnie badania kliniczne wykazały sukces w leczeniu migreny poprzez blokowanie CGRP9,10, co prowadzi do powstania wielu zatwierdzonych przez FDA leków ukierunkowanych na CGRP lub jego receptor. Przedkliniczna ocena fenotypów związanych z migreną doprowadziła do przełomu w wynikach klinicznych i dlatego jest niezbędna do zrozumienia niektórych z bardziej złożonych aspektów migreny, które są trudne do bezpośredniego zbadania u ludzi.
Pomimo licznych zalet, eksperymenty wykorzystujące te odczyty behawioralne migreny u gryzoni są często ograniczone w ich możliwościach próbkowania punktów czasowych i mogą być subiektywne i podatne na ludzkie błędy eksperymentalne. Wiele testów behawioralnych ma ograniczoną zdolność do uchwycenia aktywności w bardziej precyzyjnych rozdzielczościach czasowych, co często utrudnia uchwycenie bardziej dynamicznych elementów, które występują w skali czasowej poniżej sekundy, takich jak poziom aktywności mózgu. Okazało się, że trudno jest określić ilościowo bardziej spontaniczne, naturalnie występujące elementy zachowania w czasie przy znaczącej rozdzielczości czasowej dla badania mechanizmów neurofizjologicznych. Stworzenie sposobu na identyfikację aktywności podobnej do migreny w szybszych skalach czasowych pozwoliłoby na zewnętrzną walidację stanów mózgu podobnych do migreny. To z kolei może być zsynchronizowane z aktywnością mózgu, aby stworzyć bardziej solidne profile aktywności mózgu migreny.
Jeden z takich fenotypów związanych z migreną, grymas na twarzy, jest używany w różnych kontekstach jako pomiar bólu u zwierząt, który może być mierzony natychmiast i śledzony w czasie11. Grymas twarzy jest często używany jako wskaźnik spontanicznego bólu w oparciu o ideę, że ludzie (zwłaszcza ludzie niewerbalni) i inne gatunki ssaków wykazują naturalne zmiany w wyrazie twarzy podczas odczuwania bólu11. W badaniach mierzących grymas twarzy jako wskaźnik bólu u myszy w ciągu ostatniej dekady wykorzystano skale, takie jak Skala Grymasu Myszy (MGS), aby ujednolicić charakterystykę bólu u gryzoni12. Zmienne wyrazu twarzy MGS obejmują zaostrzenie oczodołu (zez), wybrzuszenie nosa, wybrzuszenie policzka, ułożenie uszu i zmianę wąsów. Mimo że wykazano, że MGS niezawodnie charakteryzuje ból u zwierząt13, jest notorycznie subiektywny i opiera się na dokładnej punktacji, która może się różnić w zależności od eksperymentatora. Ponadto MGS jest ograniczony, ponieważ wykorzystuje nieciągłą skalę i brakuje mu rozdzielczości czasowej potrzebnej do śledzenia naturalnie występujących zachowań w czasie.
Jednym ze sposobów walki z tym jest obiektywne określenie ilościowe spójnych cech twarzy. Zez jest najbardziej konsekwentnie śledzoną cechą twarzy6. Zez odpowiada za większość całkowitej zmienności danych, gdy uwzględnia się wszystkie zmienne MGS (zez, wybrzuszenie nosa, wybrzuszenie policzka, pozycja ucha i zmiana wąsów)6. Ponieważ mruz oka ma największy wpływ na ogólny wynik uzyskany za pomocą MGS i niezawodnie śledzi odpowiedź na CGRP6,14, jest to najbardziej niezawodny sposób śledzenia spontanicznego bólu w modelach myszy migrenowych. To sprawia, że mrużenie oczu jest wymiernym zachowaniem niehomeostatycznym wywołanym przez CGRP. Kilka laboratoriów wykorzystało cechy mimiki twarzy, w tym zeza, do przedstawienia potencjalnego spontanicznego bólu związanego z migreną6,15.
Pozostało kilka wyzwań związanych z przeprowadzaniem automatycznych skanów w sposób, który można połączyć z mechanistycznymi badaniami migreny. Na przykład trudno było niezawodnie śledzić zeza bez polegania na ustalonej pozycji, która musi być kalibrowana w ten sam sposób podczas wszystkich sesji. Kolejnym wyzwaniem jest możliwość przeprowadzania tego typu analiz w skali ciągłej, a nie w skali dyskretnej, jak w MGS. Aby złagodzić te wyzwania, naszym celem było zintegrowanie uczenia maszynowego w postaci DeepLabCut (DLC) z naszym procesem analizy danych. DLC to model uczenia maszynowego do szacowania pozycji, opracowany przez Mathisa i współpracowników, który został zastosowany do szerokiego zakresu zachowań16. Korzystając z ich oprogramowania do szacowania pozycji, byliśmy w stanie wytrenować modele, które potrafiły dokładnie przewidywać punkty na oku myszy z dokładnością zbliżoną do ludzkiej. Rozwiązuje to problemy z powtarzającym się ręcznym ocenianiem, jednocześnie drastycznie zwiększając rozdzielczość czasową. Co więcej, tworząc te modele, stworzyliśmy powtarzalne metody do oceniania, mrużenia oczu i szacowania aktywności mózgu podobnej do migreny w większych grupach eksperymentalnych. W tym miejscu przedstawiamy rozwój i walidację tej metody śledzenia zachowań zeza w sposób, który można zablokować w czasie z innymi pomiarami mechanistycznymi, takimi jak neurofizjologia. Nadrzędnym celem jest katalizowanie badań mechanistycznych wymagających ograniczonych czasowo zachowań zeza w modelach gryzoni
.Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
UWAGA: Wszystkie zwierzęta wykorzystane w tych eksperymentach były traktowane zgodnie z protokołami zatwierdzonymi przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) Uniwersytetu Iowa.
1. Przygotuj sprzęt do zbierania danych
- Upewnij się, że wszystkie niezbędne sprzęty są dostępne: upewnij się, że zalecany sprzęt do uruchamiania DLC ma co najmniej 8 GB pamięci. Zobacz Spis materiałów, aby uzyskać informacje dotyczące sprzętu i oprogramowania.
UWAGA: Dane mogą być zbierane w dowolnym formacie, ale przed analizą muszą zostać przekonwertowane do formatu możliwego do odczytania przez DLC. Najpopularniejsze formaty to AVI i MP4. - Skonfiguruj co najmniej jedną kamerę tak, aby można było wykryć jedno oko zwierzęcia. Jeśli oba oczy są widoczne, wykonaj dodatkowe filtrowanie, ponieważ może to spowodować zakłócenia w śledzeniu. Przykład takiego filtrowania dla podanych tutaj danych znajduje się w sekcji 10.
- Zainstaluj DLC, korzystając z pakietu znajdującego się na stronie Deeplabcut.github.io/DeepLabCut/docs/installation.
- W konfiguracji kamery dołącz pojedynczą kamerę pod kątem bocznym (~90°) do myszy. Aby podążać za tym przykładem, próbkuj z częstotliwością 10 Hz, przy czym myszy są skrępowane, ale mają swobodny dostęp do pełnego zakresu ruchów głowy w stosunku do ciała. Zachowaj odległość od 2 do 4 cali od aparatu do zwierzęcia.
2. Konfiguracja DLC
- Po zainstalowaniu DLC stwórz środowisko, w którym będziesz pracować. Aby to zrobić, przejdź do folderu, do którego zostało pobrane oprogramowanie DLC, korzystając z katalogu zmian za pomocą następującego polecenia.
cd folder_name
UWAGA: W tym miejscu znajduje się plik DEEPLABCUT.yaml. - Uruchom pierwsze polecenie, aby utworzyć środowisko i włącz je, wpisując drugie polecenie.
conda env create -f DEEPLABCUT.yaml
conda aktywuj Deeplabcut
UWAGA: Upewnij się, że środowisko jest aktywowane przed każdym użyciem DLC.
Po aktywacji środowiska otwórz graficzny interfejs użytkownika (GUI) za pomocą następującego polecenia i rozpocznij tworzenie modelu.
python -m deeplabcut
3. Utwórz model
- Po otwarciu GUI rozpocznij tworzenie modelu, klikając Utwórz nowy projekt na dole.
- Nazwij projekt czymś znaczącym i unikalnym, aby zidentyfikować go później, a następnie wprowadź nazwę jako eksperymentator. Sprawdź sekcję Lokalizacja, aby zobaczyć, gdzie projekt zostanie zapisany.
- Wybierz pozycję Przeglądaj foldery i znajdź filmy wideo, aby wytrenować model. Wybierz opcję Kopiuj filmy do folderu projektu, jeśli filmy wideo nie mają być przenoszone z ich oryginalnego katalogu.
- Wybierz pozycję Utwórz, aby wygenerować nowy projekt na komputerze.
UWAGA: Filmy muszą obejmować pełen zakres zachowań, które będziesz obserwować (tj. mrużenie oczu, brak zeza i wszystkie zachowania pomiędzy). Model będzie w stanie rozpoznać tylko zachowanie podobne do tego w danych treningowych, a jeśli brakuje niektórych składników zachowania, model może mieć problemy z jego rozpoznaniem.
4. Konfiguracja ustawień
UWAGA: To jest miejsce, w którym można zdefiniować szczegóły, takie jak to, co wskazuje na śledzenie, ile klatek należy wyodrębnić z każdego filmu szkoleniowego, domyślny rozmiar kropki etykiety i zmienne związane z tym, jak model będzie trenował.
- Po utworzeniu modelu edytuj ustawienia konfiguracji, wybierając pozycję Edytuj config.yaml. Wybierz opcję Edytuj, aby otworzyć plik ustawień konfiguracyjnych w celu określenia kluczowych ustawień związanych z modelem.
- Zmodyfikuj części ciała, aby uwzględnić wszystkie części oka do śledzenia, a następnie zmodyfikuj numframes2pick na liczbę klatek potrzebnych na film szkoleniowy, aby uzyskać łącznie 400 klatek. Na koniec zmień rozmiar kropki na sześć, aby domyślny rozmiar podczas etykietowania był wystarczająco mały, aby można go było dokładnie umieścić wokół krawędzi oka.
5. Wyodrębnij ramki treningowe
- Po skonfigurowaniu przejdź do karty Wyodrębnij ramki w górnej części graficznego interfejsu użytkownika i wybierz pozycję Wyodrębnij ramki w prawym dolnym rogu strony.
- Monitoruj postęp za pomocą paska ładowania u dołu graficznego interfejsu użytkownika.
6. Etykietowanie ramek treningowych
- Przejdź do zakładki Etykiety ramek w graficznym interfejsie użytkownika i wybierz opcję Oznacz ramki. Znajdź nowe okno, w którym wyświetlane są foldery dla każdego z wybranych filmów szkoleniowych. Wybierz pierwszy folder, a otworzy się nowy graficzny interfejs użytkownika etykietowania.
- Oznacz punkty zdefiniowane podczas konfiguracji dla każdej klatki wybranego wideo. Po oznaczeniu wszystkich klatek zapisz je i powtórz proces dla następnego filmu.
- Aby odpowiednio oznaczyć zeza, użyj dwóch punktów jak najbliżej największego szczytu oka (środka) i wskaż pozycje góra/dół dla każdego punktu. Przybliżony zez jako średnia z tych dwóch długości.
UWAGA: Podczas oznaczania DLC nie zapisuje automatycznie postępów. Zaleca się okresowe zapisywanie, aby uniknąć utraty danych oznaczonych etykietami.
7. Tworzenie zestawu danych treningowych
- Po ręcznym etykietowaniu przejdź do karty Train network (Trenowanie sieci) i wybierz pozycję Train network (Trenowanie sieci), aby wyświetlić monit o rozpoczęcie trenowania modelu.
- Monitoruj postęp w oknie poleceń.
8. Oceń sieć
- Po zakończeniu trenowania sieci przejdź do karty Ocena sieci i wybierz pozycję Oceń sieć. Poczekaj chwilę, aż niebieskie kółko ładowania zniknie, wskazując, że zakończył się samoocena i model jest gotowy do użycia.
9. Analizuj dane/generuj filmy oznaczone etykietami
- Aby przeanalizować filmy wideo, przejdź do karty Analizuj filmy . Wybierz pozycję Dodaj więcej filmów i wybierz filmy wideo do analizy.
- Wybierz opcję Zapisz wyniki jako plik csv, jeśli dane wyjściowe w formacie csv są wystarczające.
- Po pobraniu wszystkich filmów wybierz pozycję Analizuj filmy u dołu, aby rozpocząć analizę filmów.
UWAGA: ten krok należy wykonać przed wygenerowaniem filmów oznaczonych etykietami w kroku 9.5 - Po przeanalizowaniu filmów przejdź do karty Utwórz filmy i wybierz analizowane filmy.
- Wybierz opcję Utwórz filmy, a oprogramowanie rozpocznie generowanie filmów wideo oznaczonych etykietami, które reprezentują dane wyświetlane w odpowiednim .csv.
10. Przetwarzanie danych końcowych
- Zastosuj makra znajdujące się na stronie https://research-git.uiowa.edu/rainbo-hultman/facial-grimace-dlc, aby przekonwertować surowe dane na format używany do tej analizy (tj. odległość euklidesowa).
- Zaimportuj i zastosuj makra oznaczone etykietami Krok 1 i Krok 2 do pliku CSV, aby odfiltrować wszystkie nieoptymalne punkty danych i przekonwertować dane na uśrednioną odległość euklidesową dla najbardziej środkowych punktów u góry i u dołu oka.
- Uruchom makro o nazwie Krok 3, aby oznaczyć każdy punkt jako 0 bez zeza i 1 zez na podstawie wartości progowej w skrypcie, która jest ustawiona na 75 pikseli.
UWAGA: Parametry tych makr mogą wymagać dostosowania w zależności od konfiguracji eksperymentalnej (patrz dyskusja). Próg zeza i automatyczny filtr dla maksymalnej wartości oka to parametry, które mogą się zmieniać w zależności od wielkości zwierzęcia i odległości od kamery. Można również dostosować wartości używane do usuwania nieoptymalnych punktów w zależności od tego, jak selektywnie dane mają być filtrowane.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
W niniejszym materiale przedstawiamy metodę niezawodnego wykrywania zeza z wysoką rozdzielczością czasową przy użyciu oprogramowania DeepLabCut. Zoptymalizowaliśmy parametry treningowe oraz przedstawiamy ocenę mocnych i słabych stron tej metody (Rycina 1).
Po przeszkoleniu naszych modeli zweryfikowaliśmy, że są one w stanie prawidłowo oszacować górny i dolny punkt powieki (Rysunek 2), które służą jako punkty współrzędnych dla pomiaru ...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Protokół ten zapewnia łatwo dostępną, dogłębną metodę korzystania z narzędzi opartych na uczeniu maszynowym, które mogą rozróżniać zeza z dokładnością zbliżoną do ludzkiej, zachowując tę samą (lub lepszą) rozdzielczość czasową poprzednich podejść. Przede wszystkim sprawia, że ocena automatycznego zeza jest łatwiej dostępna dla szerszego grona odbiorców. Nasza nowa metoda oceny automatycznego zeza ma kilka ulepszeń w porównaniu z poprzednimi modelami. Po pierwsze, zapewnia bardziej solidną metrykę niż ASM, wykorzystując m...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Nie mamy żadnych konfliktów interesów, które moglibyśmy ujawnić. Poglądy zawarte w tym dokumencie nie są reprezentatywne dla VA ani rządu Stanów Zjednoczonych.
Podziękowania
Podziękowania dla Rajyashree Sen za wnikliwe rozmowy. Podziękowania dla McKnight Foundation Neurobiology of Disease Award (RH), NIH 1DP2MH126377-01 (RH), Roy J. Carver Charitable Trust (RH), NINDS T32NS007124 (MJ), Ramon D. Buckley Graduate Student Award (MJ) oraz VA-ORD (RR&D) MERIT 1 I01 RX003523-0 (LS).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Zestaw narzędzi CUDA 11.8 | |||
| cuDNN SDK 8.6.0 | |||
| Komputery Intel z systemem Windows 11, 13. generacji | |||
| Dodatkowy moduł LabFaceX 2D Eyelid Tracker do myszy swobodnie wędrującej: | FaceX LLC | NA | Każda kamera, która może nagrywać oko zwierzęcia, jest wystarczająca, ale to jest nasz sprzęt do śledzenia oczu. |
| Sterownik karty graficznej NVIDIA w wersji 450.80.02 lub nowszej | |||
| NVIDIA RTX A5500, 24 GB DDR6 | NVIDIA[ | 490-BHXV] | Wystarczy dowolny procesor graficzny, który spełnia minimalne wymagania określone dla Twojej wersji DLC, obecnie 8 GB. Użyliśmy karty graficznej NVIDIA GeForce RTX 3080 Ti |
| Python 3.9-3.11 | |||
| TensorFlow w wersji 2.10 |
Bibliografia
- Disease, G. B. D., Injury, I., Prevalence, C. Global, regional, and national incidence, prevalence, and years lived with disability for 354 diseases and injuries for 195 countries and territories, 1990-2017: A systematic analysis for the global burden of disease study 2017. Lancet. 392 (10159), 1789-1858 (2018).
- Russo, A. F. Cgrp as a neuropeptide in migraine: Lessons from mice. Br J Clin Pharmacol. 80 (3), 403-414 (2015).
- Wattiez, A. S., Wang, M., Russo, A. F. Cgrp in animal models of migraine. Handb Exp Pharmacol. 255, 85-107 (2019).
- Hansen, J. M., Hauge, A. W., Olesen, J., Ashina, M. Calcitonin gene-related peptide triggers migraine-like attacks in patients with migraine with aura. Cephalalgia. 30 (10), 1179-1186 (2010).
- Mason, B. N., et al. Induction of migraine-like photophobic behavior in mice by both peripheral and central cgrp mechanisms. J Neurosci. 37 (1), 204-216 (2017).
- Rea, B. J., et al. Peripherally administered cgrp induces spontaneous pain in mice: Implications for migraine. Pain. 159 (11), 2306-2317 (2018).
- Kopruszinski, C. M., et al. Prevention of stress- or nitric oxide donor-induced medication overuse headache by a calcitonin gene-related peptide antibody in rodents. Cephalalgia. 37 (6), 560-570 (2017).
- Juhasz, G., et al. No-induced migraine attack: Strong increase in plasma calcitonin gene-related peptide (cgrp) concentration and negative correlation with platelet serotonin release. Pain. 106 (3), 461-470 (2003).
- Aditya, S., Rattan, A. Advances in cgrp monoclonal antibodies as migraine therapy: A narrative review. Saudi J Med Med Sci. 11 (1), 11-18 (2023).
- Goadsby, P. J., et al. A controlled trial of erenumab for episodic migraine. N Engl J Med. 377 (22), 2123-2132 (2017).
- Mogil, J. S., Pang, D. S. J., Silva Dutra, G. G., Chambers, C. T. The development and use of facial grimace scales for pain measurement in animals. Neurosci Biobehav Rev. 116, 480-493 (2020).
- Whittaker, A. L., Liu, Y., Barker, T. H. Methods used and application of the mouse grimace scale in biomedical research 10 years on: A scoping review. Animals (Basel). 11 (3), 673(2021).
- Langford, D. J., et al. Coding of facial expressions of pain in the laboratory mouse. Nat Methods. 7 (6), 447-449 (2010).
- Rea, B. J., et al. Automated detection of squint as a sensitive assay of sex-dependent calcitonin gene-related peptide and amylin-induced pain in mice. Pain. 163 (8), 1511-1519 (2022).
- Tuttle, A. H., et al. A deep neural network to assess spontaneous pain from mouse facial expressions. Mol Pain. 14, 1744806918763658(2018).
- Mathis, A., et al. Deeplabcut: Markerless pose estimation of user-defined body parts with deep learning. Nat Neurosci. 21 (9), 1281-1289 (2018).
- Wattiez, A. S., et al. Different forms of traumatic brain injuries cause different tactile hypersensitivity profiles. Pain. 162 (4), 1163-1175 (2021).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
